CN111778345A

CN111778345A - 一种简单高效马铃薯多r基因聚合辅助育种方法

Info

Publication number: CN111778345A
Application number: CN202010442969.XA
Authority: CN
Inventors: 刘勋; 刘程; 王世尧; 史伟玲; 蒋锐; 赵勇; 唐道彬; 张凯; 吕典秋; 王季春
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2020-10-16

Abstract

本发明提供一种简单高效马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，具体包括：晚疫病抗性筛选引物序列组RB、R8、Rx1、Ry_adg和GBSS，以及利用该引物组构建多重PCR反应体系对晚疫病持久抗性以及PVX和PVY病毒病抗性基因聚合育种选择。该方法检测的特异性高、对DNA模板的质量和浓度有很好的容忍度，方便适应大规模育种中间材料的分子标记的筛选鉴定。本申请为晚疫病和病毒病多抗基因聚合育种提供了简单高效的技术和多抗新品种的选育提供了技术方案。

Description

一种简单高效马铃薯多R基因聚合辅助育种方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种简单高效马铃薯多R基因聚合辅助育种方法。

背景技术

中国是世界最大的马铃薯生产国，总产量和人均消费量一直稳步增长，马铃薯产业的可持续发展对保障粮食安全和促进区域经济发展具有重要意义。然而，马铃薯生产一直受到病虫害的威胁，严重影响马铃薯安全生产。尤其以晚疫病爆发和病毒积累引起的种薯退化等最为严重，也是限制马铃薯产业发展的主要瓶颈。目前防控晚疫病以化学药剂为主，但由于化学药剂成本以及抗药性和环境安全等问题，使用受到限制。病毒在细胞水平上侵染马铃薯植株，很难用化学药剂防治，生产上主要通过使用脱毒种薯和控制病毒传播媒介(如蚜虫等)来防治病毒病，然而这些防治方法的效果需要严格的组织管理和高昂的投入来保证。马铃薯生产中种植抗病品种仍是防控马铃薯晚疫病、病毒病等最经济有效和环境友好的途径。因此，选育同时抗晚疫病和抗病毒病的品种显得尤为重要，也是目前重要的育种目标。

马铃薯传统育种技术是在双亲杂交产生的子代基础上，进行多代无性世代性状评价和选择，进而培育出优良品系和品种的过程，整个过程耗时长、工作量大、选择效率低(徐建飞与金黎平，2017)。抗病性鉴定是抗病育种的首要工作，常规鉴定方法费时费力，易受环境及人为主观因素影响，且难以对多个抗性同时进行鉴定。在实际育种中，如何在大量群体植株中选择出目标单株是一项艰巨的工作，利用分子标记辅助选择技术可在植株生长的任何时期进行辅助选择，尤其是在抗病育种中人工接种病菌失败或没发病的情况下，更能体现其优越性，被育种家争相应用到育种中(姚姝等，2017)。抗病(R)基因的定位克隆是开发分子标记用于育种辅助选择的基础。越来越多的R基因相继在不同的马铃薯种中发现并定位或克隆，例如已克隆了晚疫病小种特异抗性基因R1、R2、R3a和R3b等，并开发了相应的分子标记应用抗病育种辅助选择(徐建飞和金黎平，2017)。近年来发现，小种特异抗性基因已不断被新进化的小种克服，含有这些R基因的马铃薯品种也逐渐丧失了晚疫病田间抗性，利用小种特异R基因标记辅助选择晚疫病抗性效率也大大降低，广谱抗性基因RB和R8的应用逐渐表现更高效(刘勋等，2019)。在田间条件下有8种病毒和1种类病毒对栽培马铃薯危害较严重，在世界范围内分布也很广泛(聂碧华等，2012)。其中PVY、PVX等表现尤为突出，它们引起马铃薯植株花叶、褪绿、矮缩等症状，特别是复合侵染时可使产量损失高达73.5％，同时还会严重影响块茎品质和商品性(范国权等，2019)。利用分子标记辅助选择进行多基因聚合，需要利用与目的基因分子标记对每个基因进行一次检测，工作量很大，成本高。开发多重PCR检测体系能进一步提高分子标记辅助选择在多基因聚合育种中效率和节约成本。

现有技术存在的问题：现有技术中未见报道能针对晚疫病持久抗性基因RB和R8以及来源S.tuberosum ssp.andigena中的PVX抗性基因Rx1和PVY抗性基因Ry_adg多重PCR的报道。本申请以马铃薯GBSS基因特异引物GBSS-981监控PCR反应体系有效扩增，利用RxAP-1230和RYSC3-321标记以及设计RB-692和R8-1832标记建立了同时检测Rx1、Ry_adg、RB和R8的多重PCR方法体系。结合农艺性状选择，通过该方法体系鉴定出同时含有上述4个R基因标记的高代品系4个。该开发的多重PCR检测体系能高效的辅助选择晚疫病持久抗性以及PVX和PVY病毒病抗性基因聚合育种选择，能广泛的应用马铃薯育种的程序。

发明内容

本发明要解决的关键技术问题在于提供多R基因聚合辅助鉴定马铃薯品种系晚疫病和病毒病抗性。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

1.晚疫病抗性筛选引物序列组，包括：

(1)RB标记引物如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

(2)R8标记引物如序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

(3)Rx1标记引物如序列表SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

(4)Ry_adg标记引物如序列表SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

(5)GBSS标记引物如序列表SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。

2.马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，采用R8、RB、Rx1和Ry_adg的多重PCR检测予以实现，具体如下：

(1)材料选择与DNA提取

(2)马铃薯资源材料Rx1和Ry_adg标记检测

(3)引物设计及单R基因PCR检测

(4)PCR产物的克隆与序列分析

(5)多重PCR反应体系的建立与优化

3.多重PCR体系在多基因聚合育种辅助选择中的应用。

本发明至少存在以下有益效果：

(1)本申请提供了马铃薯晚疫病和马铃薯病毒病X和Y抗性基因同时检测方法，采用R8、RB、Rx1和Ry_adg的多重PCR检测予以实现。

(2)选择了GBSS特异引物GBSS-981监控PCR体系假阴性结果，提高检测的准确性。

(3)本申请依据RB和R8基因序列分别设计了与Rx1和Ry_adg标记引物Tm相近的特异引物RB-629和R8-1832，解决了多重PCR体系对引物Tm的要求。

(4)检测的特异性高：本申请选择了分别含有RB和Rx1以及R8和Ry_adg基因的DNA混合为模板，对上述4个R基因标记分别与GBSS-981在推荐PCR反应条件下进行PCR检测，结果发现4个R基因标记均能与GBSS-981兼容并特异扩增相应的片段长度，并且对重新合成的RB和R8引物扩增的片段进行了测序验证，说明RB和R8基因标记引物均能特异扩增。对上述5对引物的多重PCR技术体系参数进行优化，建立了R8、RB、Rx1、Ry_adg和GBSS标记的多重PCR检测体系。

(5)本申请的多重PCR技术在我们育种过程中，根据资源材料中R8、RB、Rx1和Ryadg组成，以互补原则组配了多R基因聚合为目标的杂交组合，选择了农艺性状和产量等优良的品系。利用建立的多重PCR体系对这些品系进行R基因聚合筛查，结果显示，4个品系含有Rx1、Ry_adg、RB和R8 4个R基因(图4A，C)。并且该体系对DNA模板的质量和浓度有很好的容忍度(图4B)，方便适应大规模育种中间材料的分子标记的筛选鉴定。

(6)我们建立了晚疫病水平抗性基因R8和RB、PVX和PVY极端抗性基因Rx1和Ry_adg的高效的多重PCR体系，并成功创制到聚合Rx1、Ry_adg、RB和R8的优良品系，为晚疫病和病毒病多抗基因聚合育种提供了简单高效的技术和多抗新品种的选育奠定基础。

附图说明

图1为马铃薯资源材料中Rx1和Ry_adg标记检测；

其中，A：Rx1标记检测电泳图；B:Ry_adg标记检测电泳图；C：资源材料中RB、R8、Rx1和Ry_adg标记组成。M：M：DNA标准分子量DL2000 plus；泳道1-12：部分检测的资源材料。

图2为马铃薯4个R基因分别与GBSS标记PCR扩增；

其中，M：DNA标准分子量DL2000 plus；泳道N：负对照；泳道1-5：分别为GBSS、GBSS和R8、GBSS和Rx1、GBSS和Ry_adg、GBSS和RB标记组合。

图3为多重PCR检测体系优化电泳结果；

其中，A:多重PCR延伸温度优化；B:多重PCR R8引物浓度优化；M：DNA标准分子量DL2000 plus。

图4为多重PCR检测马铃薯高代品系结果；

其中，A：多重PCR检测马铃薯高代品系电泳图；B：粗DNA样品检测结果；C；马铃薯高代品系中RB、R8、Rx1和Ry_adg标记组成；M：M：DNA标准分子量DL2000 plus；泳道1-12：部分检测的马铃薯高代品系。

具体实施方法

本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供了晚疫病持久抗性基因RB和R8，PVX抗性基因Rx1和PVY抗性基因Ry_adg序列，包括：

(1)RB全长CDS片段序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

(2)R8全长CDS片段序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

实施例2

本实施例提供了晚疫病抗性筛选引物序列组，包括：

(1)RB标记引物如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

(2)R8标记引物如序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

(3)Rx1标记引物如序列表SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

(4)Ry_adg标记引物如序列表SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

(5)GBSS标记引物如序列表SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。

实施例3

本实施例提供了马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，采用R8、RB、Rx1和Ry_adg的多重PCR检测予以实现，具体如下：

(1)材料选择与DNA提取

我们前期采集的218份马铃薯资源材料DNA用于Rx1和Ryadg单标记检测(刘勋等，2019)。马铃薯育种高代品系分别种植西南大学薯类生物学与遗传育种重庆重点实验室重庆北碚和重庆巫溪育种基地，出苗4周后取1-2片幼嫩叶片用于DNA的提取。

(2)马铃薯资源材料Rx1和Ry_adg标记检测

前期在218份马铃薯资源中检测晚疫病小种特异的R1、R2 family和R3a/b以及持久抗性基因RB和R8标记的组成(刘勋等，2019)。为了对这些资源的Rx1和Ry_adg抗性标记组分有进一步的了解，分别用他们的标记RxAP-321和RYSC3-1230进行了分析。结果显示，在218份材料中含有Rx1和Ry_adg的标记的分别有49和125份，同时含有两个标记的有38个。结合晚疫病持久抗性基因RB和R8标记组成，发现同时含有RB、Rx1和Ry_adg3标记的仅仅2份材料，未检出都同时含有RB、R8、Rx1和Ry_adg标记的资源，说明收集的资源材料中多R基因聚合的材料较少(如附图1)。

(3)引物设计及单R基因PCR检测

通过查询GenBank中马铃薯晚疫病持久抗性基因R8和RB基因序列，设计其特异引物，同时设计了马铃薯GBSS基因特异引物，以此监控PCR体系成功扩增。Rx1和Ry_adg标记参考已报道的文献。相关抗病基因标记信息见表1，引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。利用相关特异性引物进行PCR扩增，单基因PCR反应体系：10μL 2×PCR Taq PlusMaster Mix(ABM，Canada)，1μL 50ngμL^-1DNA模板，1μL 10μmolL^-1Primers，ddH₂O补足20μL。扩增程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min)30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物通过1.0％琼脂糖凝胶电泳观察。

表1马铃薯R8、RB、Rx1和Ry_adg标记引物

(4)PCR产物的克隆与序列分析

将RB和R8的PCR产物进行回收，克隆并测序，进一步验证扩增产物与对应的参考序列是否具有一致性，确定所用引物对的特异性，并对所产生的结果进行数据分析，验证扩增产物与对应的参考序列的一致性。

根据引物Tm值接近(58-60℃)、无明显互补性，且引物对扩增目的片段大小能明显区分的原则，选择和设计R标记引物。选择已报道的Rx1和Ry_adg标记RxAP-321和RYSC3-1230和重新设计了R8和RB标记引物，同时设计马铃薯GBSS基因特异引物监控PCR体系成功扩增(表1)。以分别含有Rx1和R8以及Ry_adg和RB标记的两个马铃薯基因型等量DNA混合为模板(50ngμL^-1)，在55℃退火温度的PCR程序下进行单R与GBSS标记(引物浓度均为0.5μmol L^-1)组合分别进行PCR扩增，发现单R标记均能扩增出相应理论预期大下条带，并且与GBSS基因引物无相互干扰现象(图2)，暗示这些标记能特异扩增目标序列。为了进一步验证对应条带产物的特异性，对新合成的RB和R8标记扩增的PCR产物进行回收，克隆并测序。测序结果发现扩增产物与对应的参考序列一致性均在99％以上，再次验证所用引物对的特异性。综合这些标记引物的特异性和相似Tm以及可区分的PCR产物，具备适合多重PCR检测的基本条件。

(5)多重PCR反应体系的建立与优化

将分别含有Rx1和RB以及Ry_adg和R8基因的两个马铃薯基因型等量DNA混合，作为多重PCR反应的模板，建立多重PCR反应体系，之后改变PCR体系中的延伸温度(72℃、70℃、68℃、66℃、64℃)及相应R8引物浓度(0.25μmolL^-1、0.75μmolL^-1、1.00μmolL^-1、1.25μmolL^-1、1.50μmolL^-1、1.75μmolL^-1)等条件因素进行多重PCR反应体系的优化。

首先，按照上述单R基因PCR条件参数条件下，同时加入0.5μmol L^-1浓度的引物进行多重PCR反应，结果发现无任何条带检出，说明在该PCR条件下标记引物间干扰严重。然后，对PCR反应体系的延伸温度(72℃、70℃、68℃、66℃和64℃)进行测试，发现在70℃时仅能检测到GBSS条带，在68℃时能检测到GBSS和Rx1两个条带，在66℃时能检测到GBSS、Rx1和Ry_adg 3个条带，在64℃时能检测到GBSS、Rx、Ry_adg和RB 4个特异片段，均未能检测到R8特异条带(图3A)。最后，在64℃延伸的条件下，对R8引物浓度(0.25μmol L^-1、0.75μmol L^-1、0.10μmol L^-1、1.25μmol L^-1、1.50μmol L^-1和1.75μmol L^-1)进行测试，结果发现在R8引物浓度为1.00μmol L^-1和1.25μmol L^-1时能有效扩增出5个基因特异条带(图3B)。综合上述测试结果，多重PCR反应总体系：10μL 2x PCR Taq plus Master Mix(ABM，Canada)，1μL50ngμL^- ¹DNA模板，GBSS、Rx、Ry_adg和RB标记引物浓度0.5μmolL^-1，R8引物浓度1.00μmol L^-1，最后ddH₂O补足20μL。扩增程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s，55℃退火45s，64℃延伸2min)30个循环，72℃延伸10min。建立了以GBSS为监测，同时检测R8、Rx、Ry_adg和RB 4个R基因标记的多重PCR体系。

实施例4

本实施例提供了最佳多重PCR反应体系，包括：

(1)最佳引物浓度：GBSS、Rx、Ry_adg和RB标记引物浓度0.5μmolL^-1，R8引物浓度1.00μmol L^-1；

(2)最佳延伸温度：64℃；

(3)最佳退火温度：55℃。

实施例5

本实施例提供了多重PCR体系在多基因聚合育种辅助选择中的应用，采用前述实施例的方法，具体如下：

利用上述建立的多重PCR检测体系，分别对田间易感晚疫病和病毒病的费乌瑞它和田间表现抗晚疫病的鄂马铃薯5号品种以及我们选育的36份马铃薯高代品系的样品进行检测。结果显示，费乌瑞它未检测到上述4个R基因标记，鄂马铃薯5号检测到R8和Ry_adg标记。在高代品种(系)中，不同程度的检测到R8、Rx、Ry_adg和RB等标记，其中4个品系同时检测到全部4个R标记(图4A，C)。这些结果说明，该体系能有效检测R基因标记，可适用于相应病害抗性分子标记聚合辅助选择。

为了测试该体系是否对简单快速抽提的DNA样品能有效检测，以便后续应用中更简单方便，我们选择3个同时含有Rx、Ry_adg、R8和RB标记样品叶片，每个样品2次独立重复，采用碱裂解法进行DNA粗提，以1μL粗DNA为模板进行多重PCR检测。结果显示，与用CTAB提取的DNA为模板测试结果一致，均能有效检测到4个R基因标记(图4B)，说明该体系对DNA质量有较好的容忍度，适用于碱裂解法粗提DNA样品的快速检测，无需对DNA样品纯化和浓度调整等。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

参考文献及引用的实验方法：

[1]刘勋,张娇,沈昱辰,等.基于光合系统参数建立马铃薯耐荫性综合评价体系[J].植物学报,2019,54(03):360-370.

<110> 西南大学

<120> 一种简单高效马铃薯多r基因聚合辅助育种方法

<160> 12

<210> 1

<211> 2912

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 1

1 tggctgaagc tttcattcaa gttctgctag acaatctcac ttctttcctc aaaggggaac

61 ttgtattgct tttcggtttt caagatgagt tccaaaggct ttcaagcatg ttttctacaa

121 ttcaagccgt ccttgaagat gctcaggaga agcaactcaa caacaagcct ctagaaaatt

181 ggttgcaaaa actcaatgct gctacatatg aagtcgatga catcttggat gaatataaaa

241 ccaaggccac aagattctcc cagtctgaat atggccgtta tcatccaaag gttatccctt

301 tccgtcacaa ggtcgggaaa aggatggacc aagtgatgaa aaaactaaag gcaattgctg

361 aggaaagaaa gaattttcat ttgcacgaaa aaattgtaga gagacaagct gttagacggg

421 aaacaggttc tgtattaacc gaaccgcagg tttatggaag agacaaagag aaagatgaga

481 tagtgaaaat cctaataaac aatgttagtg atgcccaaca cctttcagtc ctcccaatac

541 ttggtatggg gggattagga aaaacgactc ttgcccaaat ggtcttcaat gaccagagag

601 ttactgagca tttccattcc aaaatatgga tttgtgtctc ggaagatttt gatgagaaga

661 ggttaataaa ggcaattgta gaatctattg aaggaaggcc actacttggt gagatggact

721 tggctccact tcaaaagaag cttcaggagt tgctgaatgg aaaaagatac ttgcttgtct

781 tagatgatgt ttggaatgaa gatcaacaga agtgggctaa tttaagagca gtcttgaagg

841 ttggagcaag tggtgcttct gttctaacca ctactcgtct tgaaaaggtt ggatcaatta

901 tgggaacatt gcaaccatat gaactgtcaa atctgtctca agaagattgt tggttgttgt

961 tcatgcaacg tgcatttgga caccaagaag aaataaatcc aaaccttgtg gcaatcggaa

1021 aggagattgt gaaaaaaagt ggtggtgtgc ctctagcagc caaaactctt ggaggtattt

1081 tgtgcttcaa gagagaagaa agagcatggg aacatgtgag agacagtccg atttggaatt

1141 tgcctcaaga tgaaagttct attctgcctg ccctgaggct tagttaccat caacttccac

1201 ttgatttgaa acaatgcttt gcgtattgtg cggtgttccc aaaggatgcc aaaatggaaa

1261 aagaaaagct aatctctctc tggatggcgc atggttttct tttatcaaaa ggaaacatgg

1321 agctagagga tgtgggcgat gaagtatgga aagaattata cttgaggtct tttttccaag

1381 agattgaagt taaagatggt aaaacttatt tcaagatgca tgatctcatc catgatttgg

1441 caacatctct gttttcagca aacacatcaa gcagcaatat ccgtgaaata aataaacaca

1501 gttacacaca tatgatgtcc attggtttcg ccgaagtggt gtttttttac actcttcccc

1561 ccttggaaaa gtttatctcg ttaagagtgc ttaatctagg tgattcgaca tttaataagt

1621 taccatcttc cattggagat ctagtacatt taagatactt gaacctgtat ggcagtggca

1681 tgcgtagtct tccaaagcag ttatgcaagc ttcaaaatct gcaaactctt gatctacaat

1741 attgcaccaa gctttgttgt ttgccaaaag aaacaagtaa acttggtagt ctccgaaatc

1801 ttttacttga tggtagccag tcattgactt gtatgccacc aaggatagga tcattgacat

1861 gccttaagac tctaggtcaa tttgttgttg gaaggaagaa aggttatcaa cttggtgaac

1921 taggaaacct aaatctctat ggctcaatta aaatctcgca tcttgagaga gtgaagaatg

1981 ataaggacgc aaaagaagcc aatttatctg caaaagggaa tctgcattct ttaagcatga

2041 gttggaataa ctttggacca catatatatg aatcagaaga agttaaagtg cttgaagccc

2101 tcaaaccaca ctccaatctg acttctttaa aaatctatgg cttcagagga atccatctcc

2161 cagagtggat gaatcactca gtattgaaaa atattgtctc tattctaatt agcaacttca

2221 gaaactgctc atgcttacca ccctttggtg atctgccttg tctagaaagt ctagagttac

2281 actgggggtc tgcggatgtg gagtatgttg aagaagtgga tattgatgtt cattctggat

2341 tccccacaag aataaggttt ccatccttga ggaaacttga tatatgggac tttggtagtc

2401 tgaaaggatt gctgaaaaag gaaggagaag agcaattccc tgtgcttgaa gagatgataa

2461 ttcacgagtg cccttttctg accctttctt ctaatcttag ggctcttact tccctcagaa

2521 tttgctataa taaagtagct acttcattcc cagaagagat gttcaaaaac cttgcaaatc

2581 tcaaatactt gacaatctct cggtgcaata atctcaaaga gctgcctacc agcttggcta

2641 gtctgaatgc tttgaaaagt ctaaaaattc aattgtgttg cgcactagag agtctccctg

2701 aggaagggct ggaaggttta tcttcactca cagagttatt tgttgaacac tgtaacatgc

2761 taaaatgttt accagaggga ttgcagcacc taacaaccct cacaagttta aaaattcggg

2821 gatgtccaca actgatcaag cggtgtgaga agggaatagg agaagactgg cacaaaattt

2881 ctcacattcc taatgtgaat atatatattt aa

<210> 2

<211> 3738

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 2

1 atgaatgaaa atgaaattga ggaaatgtta gatcacctaa gaaggatcaa aattgaaggt

61 aacctggatt tcttcaagat tcgtcgtatt ggggatcttg atattgtgct aagagttttt

121 agaaccttta taaagtatca tgttctttta cctgattgtt ttgtcaaact cacaatgaat

181 gccgaatgga ctgtggaaat gcttcaccgg gtatttgatg ggatatcaga tgaatgtaaa

241 actaacctta atttggaaag gctagaatca catttgttgg aattctttga aggtaactcc

301 agtttaagtt acaattatga gttgaatgat tttgatctgt cgaaatatat ggattgtctg

361 gaaaaaattc taaatgatgt actaatgatg ttcctggaaa agggtaggtc ctgttatccc

421 atagaaaaac ttgcaataca gctatctata aagaaactga aaattgttca aaagaaaatg

481 atatttttga gatacatata taccacagag ataaatggta acgtcaacta tgagaagctg

541 gaatgtttgg agactcgaat tcagttcatt gctaacactg tgggacaatt ttgtttggcc

601 gtattagatt atgttgctga tattgaattt agtgataata atgatatctt taatatacct

661 ccgtatctat tatcattgat tgtgtttgtg gagctggaaa tgaagaagat ttttcatggt

721 gaactaaagg tgtcaaagtt tactcaatca aaaactttca aggacaagaa attaccaaaa

781 gaattttcag atcttctcca atatctgttg atgtatctca gaaacgaaaa actcgagaac

841 tttcctaata atatctctgc tcaaaatatt gatgtggcaa tagaattctt gttggttttc

901 cttgatgctg atgtgtcaaa tcacgttatt aatggtaact ggttgaatga ggtcttgtta

961 aaggttggag ctatagcggg tgatattcta tatgtaattc aaaagcttct tcctagatct

1021 ataaacaaag atgacactag caaaataagt ttttgctcga tacagatatt ggagaagact

1081 aaagatctga aggcacaagt tgagacgtac tacaaatcct taaaatttac tccatctcag

1141 ttccccacct ttggtggatt gagctttctg gattctcttt taaggaaact gaatgagatg

1201 tcgaaatcta agtctggttt agatttcctg atgaaacctc ttttagggaa tttggagaaa

1261 gagttatcat ctcttacatc cattttagag aaggagctat catccatttt cagagatgtc

1321 gtgcaccacg aacataaaat tcctaaagat cttcagagac gtaccatcaa tttggcatat

1381 gaggctgagg ttgccattga ctctattctt gctcagtata atgctttttt gcatattttt

1441 tgctcacttc ctacaatttt aaaagagatc aagcaaatta atgcagaggt gactgagatg

1501 tggtcagcaa acattcctct taatcctcgc tacgtggctg ctccatttaa acatctgcca

1561 gctcgacata gcaatcttgt gactgatgag gaggtagtgg gttttgagaa taaagcagaa

1621 aaactaattg gttatctgat tagaggtaca aatgagctag acgtcatccc aattgtaggc

1681 atggggggac aagggaaaac gacaattgct agaaagttgt acaataatga catcattgtt

1741 tctcgcttta atgttcgagc atggtgcatc atttctcaaa catatagccg aagagagcta

1801 ttacaagaga ttttcagtca agttacgggc tccaaggaca aggaagatga ggtaggcaaa

1861 cttgctgaca ggttgaggaa aagcctaatg ggaaagagat atctcattgt attggatgat

1921 atgtgggatt gtatggtatg ggatgactta aggctttctt ttccagatga tggaatcaga

1981 agtagaatag tcgtaacaac tcgacttgaa gaagtgggta agcaagtcaa gaaccatact

2041 gatccttatt ctcttccatt cctcacaaca aaagagagtt gccaattgct gcagaaaaaa

2101 gtgtttcaaa aggaagattg cccgcctgaa ctacaatatg tgagtcaagc agttgcagaa

2161 aaatgcaaag gactgcccct agtggttgtc ttggtagctg gaataatcaa aaaaaggaaa

2221 atggaagaat cttggtggaa tgaggtgaaa gatgctttat ttgactatct tgacagtgag

2281 ttcgaagaat acagtctagc gactatgcag ttgagttttg ataacctagc tgattgttta

2341 aagccttgtc ttctttatat ggggatgttt ctggaggacg caagaattcc agtgtctaaa

2401 ttgataagct tatggattgc tgaaggattc gtggagaaca ctgaatctgg gagattaatg

2461 gaagaggaag ctgaaggtta cttgatggat ctcattagca gtaacgtggt aattgtttca

2521 aagaaaggtt ataatggtaa agtcaaatgc tgccaggttc atgatgttgt gcatcacttt

2581 tgcttgaaga agagtagaga agaaaagttt atgcttgcag tgaagggtca atatatccag

2641 tttcaaccgt tggattggaa gggaagtcga gtgagcttca gtttcagtga agagctttcc

2701 aagtttgcat ctctggtttc caaaacacag aagcctttcc accaacactt gaggtctctg

2761 ataacggcta atggtggaga atctattgat gtgattcccg tctgtcagat taatgaattg

2821 cgacttctta aggtcttgga tttgagttct tattatgtgg agtctttgtg gttagctaga

2881 ttaaacccac ttaatcagct gaagtacctc gcagtttggg caggtacttt ctattttgat

2941 ccacaatcac atctgcccca tatagaaact ttaattgtga cgagttgttt ttatggtgta

3001 cggttaccag tgtctttttg ggaaatggaa aaattaaggc atgttcattt tgctggcgct

3061 ggttttgcta tgcagggact ctttgaagga tcctctaaat tggaaaattt gaggatatta

3121 aagaaaattg aggaatttcc aattgatagg ctggatgtgt tatcaaggag gtgtcctaat

3181 cttcaacaac ttcaaatcac atttgaggat gatgtagagc ctttttgtcc caaattggag

3241 agtcttaccc agcttcaaga acttcaactt tcctttgtgc atccccgcat tctatccggg

3301 ttacagttgc cttcaaattt aaacaaattg gtacttaaag gaattcatat ggaaagtgct

3361 atttccttca ttgcggaact accaagcctg gagtatctcc aattactaga tgtgtgtttt

3421 cctcaatcag aagagtggtg ccttggagat atcacgttcc ataaacttaa gttgttgaaa

3481 ctggtgcagt taaatatctc aaagtgggat gcctcggagg aatcatttcc cttgcttgaa

3541 acacttgtta taaaaaagtg tgatgacctt gaggagatcc cacttagctt tgctgatatt

3601 ccatcattga aacagattaa gttgattggg tcttggaaag tatctatgga ggcttcagct

3661 gtgagaatta aggaagaagt cgaagagatt gaaggatgtg accgtataga cctcgtaaga

3721 agaagtcgaa gagattga

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 3

gaatcaaattatccaccccaacttttaaat

<210>4

<211> 24

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 4

caagtattgggaggactgaaaggt

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 5

ggagaacactgaatctgggaga

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 6

actctgtattcggaggggact

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 7

atcttggtttgaatacatgg

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 8

cacaatattggaaggattca

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 9

atacactcatctaaatttgatgg

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 10

aggatatacggcatcatttttccga

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 11

gtgcgaagaatatagtctggc

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 12

gtgcgaagaatatagtctggc

Claims

1.马铃薯晚疫病抗性以及PVX和PVY病毒病抗性筛选引物序列组，其特征在于，所述引物序列组包括：(1)RB标记引物如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；(2)R8标记引物如序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；(3)Rx1标记引物如序列表SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所示。；(4)Ry_adg标记引物如序列表SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；(5)GBSS标记引物如序列表SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。

2.如权利要求1所述的引物序列组在多重PCR体系多基因聚合育种辅助选择中的应用。

3.马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，采用R8、RB、Rx1和Ry_adg的多重PCR检测予以实现，具体如下：(1)材料选择与DNA提取；(2)马铃薯资源材料Rx1和Ry_adg标记检测；(3)引物设计及单R基因PCR检测；(4)PCR产物的克隆与序列分析；(5)多重PCR反应体系的建立与优化。

4.根据权利要求3所述的马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，步骤(1)材料选择与DNA提取，具体为：采集218份马铃薯资源材料DNA用于Rx1和Ryadg单标记检测，出苗4周后取1-2片幼嫩叶片用于DNA的提取。

5.根据权利要求3所述的马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，步骤(2)马铃薯资源材料Rx1和Ry_adg标记检测，具体为：在218份马铃薯资源中检测晚疫病小种特异的R1、R2 family和R3a/b以及持久抗性基因RB和R8标记的组成。

6.根据权利要求3所述的马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，步骤(3)引物设计及单R基因PCR检测，具体为：通过查询GenBank中马铃薯晚疫病持久抗性基因R8和RB基因序列，设计其特异引物，同时设计了马铃薯GBSS基因特异引物，以此监控PCR体系成功扩增。

7.根据权利要求3所述的马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，步骤(4)PCR产物的克隆与序列分析，具体为：将RB和R8的PCR产物进行回收，克隆并测序，进一步验证扩增产物与对应的参考序列是否具有一致性，确定所用引物对的特异性，并对所产生的结果进行数据分析，验证扩增产物与对应的参考序列的一致性。

8.根据权利要求3所述的马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，步骤(5)多重PCR反应体系的建立与优化，具体为：将分别含有Rx1和RB以及Ry_adg和R8基因的两个马铃薯基因型等量DNA混合，作为多重PCR反应的模板，建立多重PCR反应体系，之后改变PCR体系中的延伸温度及相应R8引物浓度条件因素进行多重PCR反应体系的优化。

9.马铃薯晚疫病抗性以及PVX和PVY病毒病抗性检测多重PCR反应体系，其特征在于，包括：(1)最佳引物浓度：GBSS、Rx、Ry_adg和RB标记引物浓度0.5μmolL^-1，R8引物浓度1.00μmolL^-1；(2)最佳延伸温度：64℃；(3)最佳退火温度：55℃。