CN102140503A - 一种发卡结构介导的测定5′端侧翼未知序列的方法 - Google Patents
一种发卡结构介导的测定5′端侧翼未知序列的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102140503A CN102140503A CN2010105509058A CN201010550905A CN102140503A CN 102140503 A CN102140503 A CN 102140503A CN 2010105509058 A CN2010105509058 A CN 2010105509058A CN 201010550905 A CN201010550905 A CN 201010550905A CN 102140503 A CN102140503 A CN 102140503A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- sequence
- hairpin structure
- hso
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明是一种涉及限制性内切酶酶切、发卡结构连接和巢式PCR扩增等技术，基于已知DNA序列测定其5′端侧翼未知DNA序列的方法。该方法通过合成一条易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列；选用单一限制性内切酶酶切基因组DNA，纯化后与发卡结构连接；利用引物设计软件选定发卡结构上的一段特异性序列作为5′端引物、两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的互补序列作为3′端引物；以发卡结构连接物为模板，采用设计的引物进行巢式PCR扩增以获取已知DNA序列5′端侧翼的未知序列。本发明具有操作简便、应用范围广、操作限制少、引物特异性强、结果验证简捷、未知序列长度不限和成本低廉等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，是一种涉及限制性内切酶(Restriction Endonuclease)酶切、发卡结构(Hairpin Structure)连接和巢式PCR(Nest Polymerase Chain Reaction)扩增等技术，基于已知DNA(Deoxyribonucleic Acid)序列测定其5′端侧翼未知DNA序列的方法。
背景技术
随着基因工程技术及互联网的发展，越来越多的基因序列被公布并可为广大科研工作者所利用，但是报道的基因中有相当一部分只获得了部分DNA序列。当我们不了解某个基因完整的DNA序列时，就无法对该基因进行结构和功能的深入研究。在分子生物学及微生物育种研究中，经常需要克隆已知DNA序列的侧翼区域，如分离基因的调控区、获得基因的排布信息、分析转基因的插入位点、构建图位克隆中的重叠群等。目前根据已知DNA序列鉴定其两端未知序列的方法极其有限，从而使这项工作变得繁重和棘手。随机测序法是通过大量地随机测定DNA序列并借助计算机进行排序的方法来获取目的DNA序列。该方法存在很大的偶然性，通常会耗费很大的人力和物力。3′-和5′-RACE(3′and 5′Rapid Amplification of cDNA Ends)法是在已知部分mRNA序列的情况下获取目的基因完整的mRNA序列。RACE法只能获取目的基因的可转录序列部分，而不能确定其上下游调控元件序列。另外，该方法步骤较繁琐，mRNA又极其不稳定，反转录还特别容易受到丰度低和高级结构的影响，因此效果也不是很理想。而利用同位素或生物素标记探针对基因组或DNA文库进行杂交筛选的方法，则更是费时费力。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、应用范围广、成本低廉、高效准确、发卡结构介导的PCR扩增方法，能够基于已知DNA序列确定其5′端侧翼未知DNA序列。
本发明的技术方案：①选用限制性内切酶单酶切基因组DNA；②将纯化的酶切产物与发卡结构进行连接；③选定发卡结构上的一段特异性序列作为5′端引物、两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的特异性序列作为3′端引物；④以发卡结构连接物为模板，用设计的引物进行巢式PCR扩增，并对其扩增片段进行克隆和测序。具体步骤如下：
(1)引物及发卡结构的设计：基于已知DNA序列设计两条3′端特异性引物，命名为Primer-R1和Primer-R2(18-22bp)；Primer-R2的3′端距待测序列要保留30bp以上长度，比 Primer-R1接近待测定的未知序列(见图1和图3)；设计一条易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列，命名为HSO(41bp)；基于HSO设计一条5′端特异性引物，命名为HSO-F(18bp)。
HSO：5′-NNNNCTACTGGCATGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAG-3′或5′-CTACTGGCATGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAGNNNN-3′，
HSO-F：ATCCGCCCATGCCAGTAG-3’，
其中：NNNN为随机寡聚核苷酸，其位置、序列和长度需要根据步骤(2)选用的限制性内切酶的特性而定。
(2)限制性内切酶的选择：分析已知DNA序列上的限制性内切酶位点，选用从Primer-R1到待测的未知序列之间没有酶切位点的内切酶。本发明可供选择常用的产生5′末端突出四个碱基的限制性内切酶有EcoRⅠ、HindⅢ、BglⅡ、SalⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等，产生3′末端突出四个碱基的有AatⅡ、PstⅠ、SacⅠ和SphⅠ等，产生5′末端突出两个碱基的有ClaⅠ、MspⅠ和NdeⅠ等。
(3)发卡结构的制备：对合成的寡聚核苷酸序列HSO进行94℃热变性，随后缓慢降温至25℃并保持一定时间，即可形成发卡结构。
(4)PCR模板的构建：采用步骤(2)选择的内切酶对基因组DNA进行单酶切，纯化的酶切产物与步骤(3)获得的发卡结构连接，即可作为PCR模板。
(5)巢式PCR扩增：以步骤(4)的发卡结构连接物为模板，用HSO-F和Primer-R1为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，用HSO-F和Primer-R2为引物进行第二轮PCR扩增。将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据巢式PCR原理可快速验证其扩增的产物是否为目的片段。
本发明与现行的方法相比，具有如下的优点：
(1)操作简便。与随机测序法相比，避免了对基因组进行大规模的测序，也无需进行繁琐的计算和排序工作，从而节省了大量的人力、时间和财力。
(2)应用范围广。在已知部分DNA序列的基础上，发卡结构介导的PCR扩增可应用于各种不同基因的5′端侧翼未知序列的测定。
(3)操作限制少。只要有90bp左右的已知DNA序列就足够操作，而且可供选择的限制性内切酶较多。
(4)引物特异性强。本发明通过利用发卡结构介导的PCR方法，把随机引物的扩增转变成特异性引物的扩增，大幅度提高了PCR扩增的特异性和效率。
(5)结果验证简捷。巢式PCR扩增可快速验证其扩增的产物是否为目标DNA片段，具有简捷、准确和实用性强等特点。
(6)未知序列长度不限。由于基因组DNA的酶切位点是随机分布的，本发明可获取未知序列长达几Kb的片段，而且序列的准确性和真实性不会因长度的增加而影响。
(7)成本低廉。本发明的核心还是简单的PCR扩增，所以无需昂贵的仪器和试剂盒。
附图说明
图1：3′粘性末端的5′端侧翼未知DNA序列克隆示意图
宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001基因组DNA经产生3′粘性末端的限制性内切酶PstⅠ酶切，纯化后与发卡结构连接构建PCR模板。
图2：宇佐美曲霉E001第10家族木聚糖酶基因(xyn10A)5′端侧翼的测序结果
图3：5′粘性末端的5′端侧翼未知DNA序列克隆示意图
宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001基因组DNA经产生5′粘性末端的限制性内切酶MspⅠ酶切，纯化后与发卡接头连接构建PCR模板。
图4：宇佐美曲霉E001第11家族木聚糖酶基因(xyn11A)5′端侧翼的测序结果
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1
宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 xyn10A启动子序列的测定。
(1)DNA酶切产物的制备：选用PstⅠ对宇佐美曲霉基因组DNA进行单酶切。构建如下酶切体系：10×H Buffer 2μl，PstⅠ 2μl，基因组DNA 10μl，无菌水6μl；将上述体系在37℃水浴中反应4h。酶切纯化产物(20μl)命名为xyn10AP。
(2)发卡结构的制备：HSO(100μmol/L)2μl，无菌水8μl，充分混匀；94℃变性3min，缓慢降温(1℃/s)至25℃后恒温退火30min。
(3)xyn10AP与发卡结构的连接：10×T4 DNA Ligase Buffer 1ul，HSO 3μl，xyn10AP 5μl，T4 DNA Ligase 1μl；16℃连接过夜。
(4)xyn10A启动子第一轮PCR扩增：10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 1.5μl，HSO连接物2μl，HSO-F 0.5μl，Xyn10A-R1 0.5μl，无菌水17.75μl，Taq酶0.25μl；94℃ 5min，30个循环(94℃30s，56℃ 30s，72℃ 1min)，72℃ 10min。目的产物命名为xyn10AP-Out。
(5)xyn10A启动子第二轮PCR扩增：10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 1.5μl，xyn10AP-Out 0.5μl，HSO-F 0.5μl，Xyn10A-R20.5μl，无菌水19.25μl，Taq酶0.25μl；94℃ 5min，30个循环(94℃30s，55℃ 30s，72℃ 1min)，72℃ 10min。目的产物命名为xyn10AP-In。
(6)xyn10AP-In的克隆和测序：将xyn10AP-In按照割胶回收试剂盒说明书上的操作步骤进行割胶回收，将纯化的产物克隆到pUCm-T载体上进行测序，结果如图2所示。
实施例2
宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 xyn11A启动子序列的测定。
(1)DNA酶切产物的制备：选用MspⅠ对宇佐美曲霉基因组DNA进行酶切。构建如下酶切体系：10×T Buffer 2μl，MspⅠ 2μl，0.1％BSA 2μl，基因组DNA 10μl，无菌水4μl；将该体系在37℃水浴中反应4h。酶切纯化产物(20μl)命名为xyn11AP。
(2)发卡接头的制备：HSO(100μmol/L)2μl，无菌水8μl，充分混匀；94℃变性3min，缓慢降温(1℃/s)至25℃后恒温退火30min。
(3)xyn11AP与发卡结构的连接：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μl，HSO 3μl，xyn11AP 5μl，T4 DNA Ligase 1μl；16℃连接过夜。
(4)xyn11A启动子第一轮PCR扩增：10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 1.5μl，HSO连接物2μl，HSO-F 0.5μl，Xyn11A-R1 0.5μl，无菌水17.75μl，Taq酶0.25μl；94℃ 5min，30个循环(94℃30s，56℃ 30s，72℃ 1min)，72℃ 10min。目的产物命名为xyn11AP-Out。
(5)xyn11A启动子第二轮PCR扩增：10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 1.5μl，xyn11AP-Out 0.5μl，HSO-F 0.5μl，Xyn11A-R20.5μl，无菌水19.25μl，Taq酶0.25μl；94℃ 5min，30个循环(94℃30s，55℃ 30s，72℃ 1min)，72℃ 10min。目的产物命名为xyn11AP-In。
(6)xyn11AP-In的克隆和测序：将xyn11AP-In按照割胶回收试剂盒说明书上的操作步骤进行割胶回收，将纯化的产物克隆到pUCm-T载体上进行测序，结果如图4所示。
Claims (2)
1.一种发卡结构介导的PCR扩增已知DNA序列5′端侧翼未知序列的方法，其特征在于：选用限制性内切酶单酶切基因组DNA；将纯化的酶切产物与发卡结构进行连接；利用引物设计软件选定发卡结构上的一段特异性序列作为5′端引物以及两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的互补序列作为3′端引物；以发卡结构连接物为模板，采用设计的引物进行巢式PCR扩增以获取已知DNA序列5′端侧翼的未知序列；
(1)引物及发卡结构的设计：依据已知DNA序列设计两条3′端特异性引物，命名为Primer-R1和Primer-R2(18-22bp)；Primer-R2的3′端距待测序列要保留30bp以上长度，它比Primer-R1接近待测定的未知序列；设计一条易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列，命名为HSO(41bp)；基于HSO设计一条5′端特异性引物，命名为HSO-F(18bp)；
HSO：5′-NNNNCTACTGGCATGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAG-3′或
5′-CTACTGGCATGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAGNNNN-3′，
HSO-F：5′-ATCCGCCCATGCCAGTAG-3’，
其中：NNNN为随机寡聚核苷酸，其位置、序列和长度需要根据步骤(2)选用的限制性内切酶的特性而定；
(2)限制性内切酶的选择：分析已知DNA序列上的限制性内切酶位点，选用从Primer-R1到待测的未知序列之间没有酶切位点的内切酶；本发明可供选择常用的产生5′末端突出四个碱基的限制性内切酶有EcoRⅠ、HindⅢ、BglⅡ、SalⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等；产生3′末端突出四个碱基的有AatⅡ、PstⅠ、SacⅠ和SphⅠ等；产生5′末端突出两个碱基的有ClaⅠ、MspⅠ和NdeⅠ等；
(3)发卡结构的形成：对合成的寡聚核苷酸序列HSO进行94℃热变性3min，随后缓慢降温至25℃并保持30min，即可形成发卡结构；
(4)PCR模板的构建：采用步骤(2)选择的内切酶对基因组DNA进行单酶切，纯化的酶切产物与步骤(3)形成的发卡结构进行连接，即可作为PCR模板；
(5)巢式PCR扩增：以步骤(4)的发卡结构连接物为模板，用HSO-F和Primer-R1为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，用HSO-F和Primer-R2为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据巢式PCR原理可快速验证其扩增的产物是否为目的片段。
2.根据权利要求1所述的方法，操作过程中所使用的反应体系和条件如下：
(1)按如下的体系和条件单酶切宇佐美曲霉E001基因组DNA(以PstⅠ为例)：10×HBuffer 2μl，PstⅠ 2μl，基因组DNA 10μl，无菌水6μl；将该体系在37℃水浴中反应4h；纯化回收酶切产物并溶于20μl无菌水中；酶切纯化产物命名为xyn10AP；
(2)按如下体系和条件形成发卡结构：HSO(100μmol/L)2μl，去离子水8μl，混匀；94℃热变性3min，随后缓慢降温(1℃/s)至25℃后恒温退火30min；
(3)按如下的体系和条件连接xyn10AP与发卡结构HSO：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μl，HSO 3μl，xyn10AP 5μl，T4 DNA Ligase 1μl；16℃连接过夜；
(4)按如下的体系和条件进行第一轮PCR扩增：10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 1.5μl，步骤(3)连接产物2μl，HSO-F 0.5μl，Xyn10A-R10.5μl，无菌水17.75μl，Taq酶0.25μl；94℃5min，30个循环(94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min)，72℃ 10min；首轮PCR扩增产物命名为xyn10AP-Out；按如下的体系和条件进行第二轮PCR扩增：10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 1.5μl，xyn10AP-Out 0.5μl，HSO-F 0.5μl，Xyn10A-R2 0.5μl，无菌水19.25μl，Taq酶0.25μl；94℃ 5min，30个循环(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)，72℃ 10min；第二轮PCR扩增产物命名为xyn10AP-In。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105509058A CN102140503A (zh) | 2010-11-19 | 2010-11-19 | 一种发卡结构介导的测定5′端侧翼未知序列的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105509058A CN102140503A (zh) | 2010-11-19 | 2010-11-19 | 一种发卡结构介导的测定5′端侧翼未知序列的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102140503A true CN102140503A (zh) | 2011-08-03 |
Family
ID=44408297
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010105509058A Pending CN102140503A (zh) | 2010-11-19 | 2010-11-19 | 一种发卡结构介导的测定5′端侧翼未知序列的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102140503A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103627808A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-12 | 江南大学 | 一种t-发卡结构介导的测定dna侧翼未知序列的方法 |
| CN106591293A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-04-26 | 贵州省草业研究所 | 基于酶切连接从未知基因组中分离已知序列侧翼序列的方法 |
| CN108103170A (zh) * | 2017-12-11 | 2018-06-01 | 西北大学 | 识别简并序列或四碱基序列的限制性内切酶在接头介导的pcr方法中的应用 |
| CN114269946A (zh) * | 2019-08-20 | 2022-04-01 | 国立感染症研究所长 | 核苷酸序列的扩增方法和序列确定方法 |
-
2010
- 2010-11-19 CN CN2010105509058A patent/CN102140503A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103627808A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-12 | 江南大学 | 一种t-发卡结构介导的测定dna侧翼未知序列的方法 |
| CN106591293A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-04-26 | 贵州省草业研究所 | 基于酶切连接从未知基因组中分离已知序列侧翼序列的方法 |
| CN108103170A (zh) * | 2017-12-11 | 2018-06-01 | 西北大学 | 识别简并序列或四碱基序列的限制性内切酶在接头介导的pcr方法中的应用 |
| CN114269946A (zh) * | 2019-08-20 | 2022-04-01 | 国立感染症研究所长 | 核苷酸序列的扩增方法和序列确定方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102634506B (zh) | 一种黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法 | |
| Weng et al. | Estimating number of transgene copies in transgenic rapeseed by real-time PCR assay with HMG I/Y as an endogenous reference gene | |
| JP5166276B2 (ja) | トランスポゾンタギング集団のハイスループットスクリーニングおよび挿入部位の大規模並行配列特定のための方法 | |
| CN104894271B (zh) | 一种检测基因融合的方法及装置 | |
| CN106282353A (zh) | 一种利用发夹引物进行多重pcr的方法 | |
| CN109797436A (zh) | 一种测序文库构建试剂盒及其使用方法和应用 | |
| CN102080128B (zh) | 甲基化敏感扩增多态性技术在转基因植物毒性分析的应用 | |
| EP3674413A1 (en) | Probe and method for high-throughput sequencing targeted capture target region used for detecting gene mutations as well as known and unknown gene fusion types | |
| CN102140503A (zh) | 一种发卡结构介导的测定5′端侧翼未知序列的方法 | |
| CN106471134A (zh) | 用于定量rna转录物变体的方法和产物 | |
| CN104673824B (zh) | 一种适合基因叠加的载体及其应用 | |
| CN103627808A (zh) | 一种t-发卡结构介导的测定dna侧翼未知序列的方法 | |
| CN103725674A (zh) | 一种在大肠杆菌中一步法合成dna片段并组装合成基因的方法 | |
| CN105368930A (zh) | 测序基因分型技术中测序酶切组合的确定方法 | |
| CN110607356A (zh) | 一种基因组编辑检测方法、试剂盒及应用 | |
| Wang et al. | Fast-tracking determination of homozygous transgenic lines and transgene stacking using a reliable quantitative real-time PCR assay | |
| CN109825552B (zh) | 一种用于对目标区域进行富集的引物及方法 | |
| Trinh et al. | Loop‐linker PCR: an advanced PCR technique for genome walking | |
| CN103757014A (zh) | 富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法 | |
| CN102140502A (zh) | 一种发卡结构介导的测定3′端侧翼未知序列的方法 | |
| CN103334159A (zh) | 一种构建降解组测序文库的方法 | |
| CN102140500A (zh) | 一种t载体介导的测定5′端侧翼未知序列的方法 | |
| CN107937407B (zh) | 特异性人源基因片段及检测其的引物、探针和应用 | |
| CN102140501A (zh) | 一种t载体介导的测定3′端侧翼未知序列的方法 | |
| CN101235417B (zh) | 一种基于功能基因多态性的分子标记方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110803 |