CN114269946A - 核苷酸序列的扩增方法和序列确定方法 - Google Patents

核苷酸序列的扩增方法和序列确定方法 Download PDF

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Abstract

扩增与特定序列相邻的序列的方法，包括：在特定序列使第1正向引物退火而合成互补链的工序；在该互补链的3’末端依次以聚合的形式添加第1脱氧核苷酸和第2脱氧核苷酸的工序；在所述互补链的3’末端与由第1脱氧核苷酸组成的多聚脱氧核苷酸链的结合部位，使第1反向引物退火，合成双链DNA的工序；以该双链DNA作为模板，使用与所述特定序列互补的第2正向引物和第1反向引物进行PCR的工序；以及使用与所述特定序列互补的第3正向引物和第2反向引物进行PCR的工序。

Description

核苷酸序列的扩增方法和序列确定方法
技术领域
本发明涉及核苷酸序列的扩增方法和序列确定方法。更详细地，涉及扩增与特定的序列相邻的序列的方法、和确定该相邻的序列的方法，例如，涉及扩增插入到宿主基因组中的外来DNA(特定序列)的插入部位的序列(相邻序列)，确定该相邻的序列的方法。另外例如，涉及在编码T细胞受体(TCR)等的RNA中扩增与恒定区的序列(特定序列)相邻的可变区的序列(相邻序列)，确定该相邻的序列的方法。进而，本发明涉及用于实施这些方法的试剂盒。
背景技术
利用逆转录病毒载体、慢病毒载体的基因治疗已经取得了很多成绩，大量进一步的研究开发、临床试验也正在进行。然而，在该治疗方法中，有时在治疗对象的染色体(宿主基因组)上的不期望的位置插入病毒载体。如果该插入物进入癌基因附近或抑癌基因内，则可能发生癌化。以利用逆转录病毒载体针对先天性免疫缺陷病进行的以造血干细胞为目标的基因治疗为例，虽然确认了有效性，但有92人中11人得白血病，其中1人死亡这样的事例。因此，在该基因治疗中，作为安全性保证策论，要求15年的受检者跟踪。
另外，近年来基因改造技术随着基因组编辑的兴起而加速发展。然而，在导入在与靶标部位同源的序列之间夹入了外来DNA等的核酸，通过同源重组定点地插入该DNA等的基因组编辑技术(所谓SDN-3)中，存在产生所述DNA等向不期望的部位的导入(脱靶突变)等问题，对于医疗领域中的利用特别要求慎重。
并且，在HTLV-1等与病毒相关的疾病中也提示了向宿主基因组的插入部位与病况的相关性。例如，已知在运载体中在本来转录失活的基因组区域插入病毒来源的DNA的频率高，另一方面在病毒相关疾病(ATL等)的患者中该DNA被插入到转录起始位点附近。因此，在有效且适当地判定病毒相关疾病的发病风险时，适当鉴定向宿主基因组的插入位置是极为重要的。
这样，在利用病毒载体和/或基因组编辑技术的基因治疗、利用基因组编辑等的基因改造技术、以及病毒相关疾病中，要求鉴定外来DNA向宿主基因组上的插入位置。
然而，外来DNA向宿主基因组上的插入部位、特别是随机整合的位置不明，其鉴定困难。作为原始的方法，可列举以全基因组作为对象的Mate-Pair Sequencing，但该方法由于无选择性而灵敏度低，在费用方面存在问题。另外，关于外来DNA插入部位附近的DNA序列的鉴定，开发了各种方法，可列举例如，将基因组DNA片段化并通过连接而环状化，通过对外来DNA为特异性的寡核苷酸进行反向PCR的方法；以及Tail-PCR、LAM-PCR、nrLAM-PCR(专利文献1、非专利文献1)等。然而，在所需时间、操作性、效率、灵敏度、费用的方面不充分。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2012/138549号
非专利文献
非专利文献1：Paruzynski A.等，Nat Protoc.，2010年8月、5卷，8号，1379～1395页
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于上述一直以来技术所具有的课题而做出的，目的是提供能够实现扩增与特定的序列相邻的序列的方法的方法。例如，本发明的目的是提供能够实现插入到宿主基因组中的外来DNA(特定的序列)的插入部位的序列(与特定序列相邻的序列)的扩增的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们为了实现上述目的而反复进行了深入研究，结果发现，通过如图1所示的包含工序1～6的方法，能够扩增DNA链中的与特定的序列相邻的序列。
在一直以来的方法之中所需时间最短的nrLAM-PCR中，例如非专利文献1所记载的那样，为了获得与特定的序列相邻的序列的扩增产物也要30小时以上(非专利文献1，第1392页，“TIMING”中，Steps 1-3，Linear PCR～Steps 32和33，到Second exponential PCR为止的累计时间为32.5小时)。然而，根据上述方法，如图2所示，能够以约3小时获得与特定的序列相邻的序列的扩增产物，所需时间短，具有高效性。
另外，在nrLAM-PCR中，例如专利文献1和非专利文献1所记载的那样，在纯化工序中需要生物素和链霉抗生物素蛋白等核苷酸以外的物质，花费成本。另一方面，在上述方法中只要有仅由核苷酸组成的引物即可，因此在成本上优异。
进而，如非专利文献1所记载的那样，在nrLAM-PCR中接头连接反应并不是100％进行，因而灵敏度低(参照非专利文献1，第1379页，右栏，第24～27行)。另一方面，根据上述方法，如后述的实施例所示，将插入了1拷贝HTLV-1的感染细胞的基因组DNA与非感染细胞的基因组DNA调整为规定的前病毒量而混合，然后对混合物进行分析的情况下，即使是前病毒量为0.032％这样的极微量，也能够获得特异性的扩增产物，能够高灵敏度地检测相邻序列。
另外，根据上述方法，不限于HTLV-1，对于分别插入了HIV-1、SIV、HBV和腺病毒的基因组DNA、在基因组编辑中发生了脱靶的细胞的基因组DNA、基因重组植物细胞的基因组DNA的任一者，都能够特异性地扩增各外来DNA的插入部位，通用性高。
进而，在使用HTLV-1运载体3样本的基因组DNA，使其独立地反应2次而分析的情况下，也能够获得同样的扩增产物，再现性高。
另外，根据如图1所示那样的包含工序1～6的方法，能够在编码T细胞受体(TCR)等的RNA链中扩增与恒定区的序列(特定序列)相邻的可变区的序列(相邻序列)，确定该相邻的序列。即，无论DNA链、RNA链，都能够扩增该核苷酸链中的与特定的序列相邻的序列。
本发明是基于上述结果的发明，涉及扩增与特定的序列相邻的序列的方法、和确定该相邻的序列的方法。另外，本发明涉及用于实施这些方法的试剂盒，更具体地涉及以下发明。
＜1＞扩增核苷酸链中的与特定序列相邻的序列的方法，该方法包括下述工序(1)～(6)，
工序(1)：使第1正向引物在所述特定序列退火，以该引物作为起点进行延伸反应，合成在3’末端包含与所述相邻序列互补的序列的互补链，
工序(2)：在工序(1)中所得的互补链的3’末端以聚合的形式添加第1脱氧核苷酸，
工序(3)：在工序(2)中所添加的由第1脱氧核苷酸组成的多聚脱氧核苷酸链的3’末端进一步以聚合的形式添加第2脱氧核苷酸，
工序(4)：在工序(3)中所形成的单链DNA中的所述互补链的3’末端与所述多聚脱氧核苷酸链的结合部位，使第1反向引物退火，以该引物作为起点进行延伸反应，合成双链DNA，
工序(5)：以工序(4)中所合成的双链DNA作为模板，使用与所述特定序列互补的第2正向引物、和第1反向引物进行聚合酶链反应，
工序(6)：以工序(5)中所得的扩增产物作为模板，进一步使用与所述特定序列互补的第3正向引物、和第2反向引物进行聚合酶链反应，
第2正向引物位于特定序列中比第1正向引物更靠近相邻序列的位置，
第3正向引物位于特定序列中比第2正向引物更靠近相邻序列的位置，
第1反向引物是从5’末端起依次包含衔接子引物序列和由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸的引物，
第2反向引物是在3’末端包含衔接子引物序列的引物，
第1～3脱氧核苷酸是从由脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷组成的4种脱氧核苷酸中分别选择的1种脱氧核苷酸，
第2脱氧核苷酸是与第1脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸，并且
第3脱氧核苷酸是与第1脱氧核苷酸互补的脱氧核苷酸。
＜2＞确定核苷酸链中的与特定序列相邻的序列的方法，该方法包括：
通过＜1＞所述的方法扩增所述相邻序列的工序，和
进行所扩增的相邻序列的测序分析的工序。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的方法，第1反向引物是从5’末端起依次包含衔接子引物序列、由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸、第4脱氧核苷酸和第5脱氧核苷酸的引物，
第4脱氧核苷酸是从除了第3脱氧核苷酸以外的3种脱氧核苷酸中随机选择的脱氧核苷酸，并且
第5脱氧核苷酸是从所述4种脱氧核苷酸中随机选择的脱氧核苷酸。
＜4＞根据＜1＞～＜3＞中的任一项所述的方法，所述特定序列是来源于插入到DNA链中的外来基因的序列，所述相邻序列是与所述插入到DNA链中的外来基因插入物相邻的来源于宿主基因组的序列。
＜5＞用于＜1＞～＜4＞中的任一项所述的方法的试剂盒，
该试剂盒包含第1正向引物、第2正向引物、第3正向引物、第1反向引物和第2反向引物。
发明的效果
根据本发明，能够短时间、高效率、高灵敏度、低成本、且通用性高、另外再现性良好地扩增与特定的序列相邻的序列，进而确定该相邻的序列。
附图说明
图1是显示本发明的扩增与特定序列相邻的序列的方法、和确定该相邻的序列的方法的一实施方式的概略图。
图2是显示本发明的扩增与特定序列相邻的序列的方法的实施中的各工序的所需时间的一例的图。
图3是显示将插入了1拷贝HTLV-1的感染细胞(TL-Om1)的基因组DNA、与非感染细胞(Jurkat)的基因组DNA调整成图中所示的各前病毒量(PVL)而混合，将所得的混合物通过本发明的方法进而分析而得的结果的凝胶电泳的照片。
图4是显示将分别插入了HTLV-1、HIV-1、SIV、HBV和腺病毒的生物体试样和感染细胞的基因组DNA、通过基因组编辑而插入了Loxp序列的小鼠(idlr-mLO-4、idlr-mLO-5)的基因组DNA、以及基因重组植物(Bt176)的基因组DNA通过本发明的方法进行分析而得的结果的凝胶电泳的照片。
图5是显示对于HTLV-1运载体3样本的基因组DNA(图中、AC1～3)，通过本发明的方法将HTLV-1插入部位的扩增独立地进行2次而得的结果的凝胶电泳的照片。
图6是显示添加或不添加脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)而进行本发明所涉及的工序2和3(互补链3’末端的脱氧核苷酸的聚合添加)，将工序5(第1次PCR)中所得的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进而分析而得的结果的凝胶电泳的照片。
图7是显示在本发明中，作为第1反向引物分别使用包含第4、第5核苷酸的引物(Oligo-dT-AD2)、不包含第5核苷酸的引物(Oligo-dT-AD3)、不包含第4、第5核苷酸的引物(Oligo-dT-AD4)，实施工序4(双链DNA的合成)，将工序6(第2次PCR)中所得的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析而得的结果的凝胶电泳的照片。图中，标记于各泳道的虚线(辅助线)显示扩增产物的平均长度的位置。
具体实施方式
＜本发明的方法＞
本发明是扩增核苷酸链中的与特定序列相邻的序列的方法，该方法包括下述工序(1)～(6)。
工序(1)：使第1正向引物在所述特定序列退火，以该引物作为起点进行延伸反应，合成在3’末端包含与所述相邻序列互补的序列的互补链，
工序(2)：在工序(1)中所得的互补链的3’末端以聚合的形式添加第1脱氧核苷酸，
工序(3)：在工序(2)中所添加的由第1脱氧核苷酸组成的多聚脱氧核苷酸链的3’末端进一步以聚合的形式添加第2脱氧核苷酸，
工序(4)：在工序(3)中所形成的单链DNA中的所述互补链的3’末端与所述多聚脱氧核苷酸链的结合部位，使第1反向引物退火，以该引物作为起点进行延伸反应，合成双链DNA，
工序(5)：以工序(4)中所合成的双链DNA作为模板，使用与所述特定序列互补的第2正向引物、和第1反向引物进行聚合酶链反应，
工序(6)：以工序(5)中所得的扩增产物作为模板，进一步使用与所述特定序列互补的第3正向引物、和第2反向引物进行聚合酶链反应。
此外，第2正向引物位于特定序列中比第1正向引物更靠近相邻序列的位置，第3正向引物位于特定序列中比第2正向引物更靠近相邻序列的位置。
第1反向引物是从5’末端起依次包含衔接子引物序列和由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸的引物，第2反向引物是在3’末端包含衔接子引物序列的引物。
第1～3脱氧核苷酸是从由脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷组成的4种脱氧核苷酸中分别选择的1种脱氧核苷酸，第2脱氧核苷酸是与第1脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸，第3脱氧核苷酸是与第1脱氧核苷酸互补的脱氧核苷酸。
供于本发明的方法的“核苷酸链”只要包含后述的特定序列和与其相邻的序列(相邻序列)，就不特别限制，可以是例如，从动物、植物这样的生物体(组织、细胞等)、培养细胞、食品、环境(土壤、排水等)等分离的核苷酸的聚合物。另外，供于本发明的方法的核苷酸链既可以是脱氧核苷酸的聚合物(DNA链)，也可以是核糖核苷酸的聚合物(RNA链)。
供于本发明的方法的核苷酸链从所述生物体等的分离可以通过任意的方法进行。可列举例如，利用表面活性剂(CTAB等)的溶解处理、声波处理、利用玻璃珠的振荡搅拌和使用法压壶等的方法。核苷酸链的纯化可以通过例如，苯酚提取、层析、离子交换、凝胶电泳、依赖于密度的离心分离等来实施。更具体地，作为供于本发明的方法的核苷酸链，可列举通过上述方法分离的基因组DNA、PCR片段这样的双链核酸、总RNA或mRNA、或由这些RNA通过逆转录反应制备的cDNA这样的单链核酸。
“特定序列”只要是其序列已经特定的，就不特别限制，可列举例如，插入到宿主细胞的基因组DNA(宿主基因组)中的外来DNA(外来基因)。作为外来基因，更具体地，可列举转入基因(例如，用于基因重组等的敲入基因和载体、基因组编辑(SDN-3)的敲入基因)、病毒DNA(例如，HTLV-1、HIV、SIV、HBV、HBV、MCV、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒)、和它们的一部分。另外，作为本发明所涉及的“特定序列”，可列举例如，在编码T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)或抗体等抗原结合性多肽的核苷酸中编码恒定区的序列、及其一部分。
“相邻序列”是指与所述特定序列的5’侧和3’侧的至少一方相邻的序列。可列举例如，与所述外来基因相邻的宿主基因组来源的序列、与编码所述恒定区的序列相邻的编码TCR等的可变区的序列。
以下，参照图1对于本发明的合适的实施方式按照其工序依次详细地说明，但本发明不限于图1所示的方式。
(工序(1)互补链的合成)
在该工序中，使第1正向引物在所述特定序列(图中的“F1”)退火，以该引物作为起点进行从所述特定序列向所述相邻序列的延伸反应，合成在3’末端包含与所述相邻序列互补的序列的单链DNA。
“引物”是指可以特异性地与模板多核苷酸退火，为了产生与模板多核苷酸互补的延伸产物，而提供成为模板依赖的聚合酶的底物(起点)的3’末端的多核苷酸分子。“延伸反应”是指至少1个互补的核苷酸向退火后的引物的3’末端的模板依赖的整合。
“互补的”是指在2个多核苷酸彼此退火的情况下，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)成对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)成对的、这些碱基间的利用氢键的碱基对形成选择性。进而，本发明中“互补的”是指相对于对象的多核苷酸的序列，在其全长或一部分具有至少80％的互补性(例如85％以上的互补性，优选为90％以上的互补性(91％、92％、93％、94％)，更优选为95％以上的互补性(96％、97％、98％、99％)，特别优选为100％的互补性)。
作为在工序(1)中合成的互补链的链长，只要是在3’末端包含与所述相邻序列互补的序列的长度就不特别限制，例如，也可以为能够在后述的测序分析的各方法中分析的长度。更具体地，为了适应Illumina公司的新一代测序分析用文库，可以使与相邻序列互补的序列为包含优选200～2000个核苷酸、更优选400～1000个核苷酸的程度的链长。
工序(1)中的互补链的合成，例如，可以通过重复以下循环来进行，所述循环是由：使与特定序列互补的第1正向引物与核苷酸链退火、以该引物作为起点利用DNA聚合酶进行延伸反应的工序，使包含通过该工序合成的序列的双链通过热变性而解离成为单链的工序这2个工序组成的。此外，在本发明所涉及的核苷酸链是RNA链的情况下，可以通过使用RNA依赖性DNA聚合酶作为所述DNA聚合酶，来进行延伸反应(逆转录反应)。
作为进行延伸反应的工序中的温度，只要是能够合成互补链的温度就不特别限制，只要是本领域技术人员就能够适当调整，优选为50～80℃，更优选为50～70℃。其保持时间不特别限定，根据所期望的互补链的链长、使用的DNA聚合酶的种类等只要是本领域技术人员就能够适当设定，例如为10秒～20分钟。另外，延伸工序中的温度可以在全部循环为相同温度，也可以不同。
作为热变性工序中的温度，只要是能够解离双链的温度就不特别限制，只要是本领域技术人员就能够适当调整，优选为80～100℃，更优选为90～99℃，进一步优选为94～98℃。另外，其保持时间不特别限定，优选为1秒～5分钟，更优选为5秒～3分钟，进一步优选为10秒～2分钟。
在工序(1)中的互补链形成中，循环数只要能够扩增到可以在后述的工序中成为模板的程度，就不特别限制，只要是本领域技术人员就能够根据所使用的DNA聚合酶的种类等适当调整，优选为10～50个循环，更优选为15～40个循环，进一步优选为20～30个循环。
这样的互补链合成中的反应液中，只要包含进行该合成所需的成分，就对其组成不特别限定。作为反应液中所包含的成分，可列举例如，后述的第1正向引物和后述的DNA聚合酶、以及脱氧核苷酸(dNTP)等底物、2价离子(例如，镁离子、钙离子)和1价离子(例如，钠离子、钾离子)、或用于提供它们的盐(例如，硫酸镁、乙酸镁、氯化镁)、以及缓冲液(例如，Tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液)。另外，反应液中除了这些之外，还可以包含溶剂(例如，乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亚砜)、有机酸(例如，甲酸、乙酸、苯甲酸)、表面活性剂(例如，SDS、TritonX-100)、氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸)、蛋白质(例如，BSA、DNA结合蛋白质)、糖(例如，葡萄糖、木糖、半乳糖)、还原剂(例如，DTT)、甜菜碱等作为添加剂。另外，在本发明所涉及的核苷酸链是RNA链的情况下，为了抑制RNA的分解，可以包含核糖核酸酶(RNase)抑制剂，进而另外，为了抑制逆转录反应的效率降低，可以包含逆转录反应辅助试剂(例如，ニッポンジーン社制、产品名：RTmate(由用T7 RNA聚合酶合成的976个核苷酸组成的RNA))。
另外，这样合成的互补链在供于下述工序(2)之前可以供于纯化处理。作为纯化处理，只要能够除去所述第1引物等就不特别限制，只要是本领域技术人员就可以适当使用公知的方法进行。作为公知的方法，可列举苯酚/氯仿处理、利用异丙醇或乙醇的沉淀处理、利用柱的纯化。作为该柱，可列举例如，DNA吸附柱(作为柱的担载体，为硅胶、玻璃等)、凝胶过滤柱、阴离子交换体、超滤柱。另外，该柱也优选使用市售品。作为互补链(单链DNA)纯化用的市售柱，可列举例如，Monarch PCR&DNA Cleanup Kit(New England Biolabs公司制)、ssDNA/RNA Clean&Concentrator(ZYMO RESEARCH公司制)、Elutip-d DNA纯化用微型柱(GEヘルスケア株式会社制)。
(工序(2)第1脱氧核苷酸向互补链3’末端的聚合添加)
该工序中，在工序(1)中所分离的互补链的3’末端以聚合的形式添加第1脱氧核苷酸。
在工序(2)中被聚合的第1脱氧核苷酸只要是由脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷组成的4种脱氧核苷酸中的任一者，就不特别限制，从聚合添加反应更容易进行、每单位时间形成的多聚脱氧核苷酸链的链长容易变长这样的观点考虑，另外从能够将该多聚脱氧核苷酸链与后述的第1反向引物(图1中的“R1”)的退火温度抑制得比较低这样的观点考虑，优选为脱氧腺苷、脱氧胞苷或脱氧胸苷，更优选为脱氧腺苷。
另外作为以聚合的形式添加于所述互补链的3’末端的由第1脱氧核苷酸组成的多聚脱氧核苷酸链(以下也称为“第1多聚脱氧核苷酸链”)的链长不特别限制，但从在该多聚脱氧核苷酸链与所述互补链的3’末端的结合部位，后述的第1反向引物(图1中的“R1”)更容易特异性地退火这样的观点考虑，优选为20～300个核苷酸。
第1脱氧核苷酸向互补链的3’末端的聚合添加可以通过例如，使用末端脱氧核苷酸转移酶，利用催化向该DNA的3’OH末端的脱氧核苷酸聚合反应的活性，从而进行。
作为该酶反应的温度不特别限制，通常为30～40℃，优选为37℃。另外，作为其反应时间，根据所期望的互补链的链长，只要是本领域技术人员就能够适当设定，优选为5～40分钟，更优选为10～30分钟。
这样的聚合添加中的反应液中，只要包含为了进行该添加所必需的组成，就对其组成不特别限定。作为反应液所包含的组成，可列举例如，第1脱氧核苷酸和末端脱氧核苷酸转移酶、以及2价离子(例如，锰离子、钴离子、镁离子)、或用于提供它们的盐(例如，氯化锰、氯化钴、氯化镁)和缓冲液(例如，HEPES缓冲液、Tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲液)。另外，反应液除了这些以外，还可以包含还原剂(例如，DTT)、蛋白质(例如，BSA、DNA结合蛋白质)、溶剂(例如，乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亚砜)、有机酸(例如，甲酸、乙酸、苯甲酸)、表面活性剂(例如，SDS、TritonX-100)、氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸)、糖(例如，葡萄糖、木糖、半乳糖)、甜菜碱等作为添加剂。
(工序(3)第2脱氧核苷酸向第1多聚脱氧核苷酸链3’末端的聚合添加)
该工序中，在工序(2)中所添加的第1多聚脱氧核苷酸链的3’末端进一步以聚合的形式添加第2脱氧核苷酸。
工序(3)中被聚合的第2脱氧核苷酸是由脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷组成的4种脱氧核苷酸中的任一者，并且是与第1脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸，但从聚合添加反应不易进行、容易调整每单位时间形成的多聚脱氧核苷酸链的链长这样的观点考虑，优选为脱氧鸟苷。
添加于第1多聚脱氧核苷酸链的3’末端的由第2脱氧核苷酸组成的多聚脱氧核苷酸链(以下，也称为“第2多聚脱氧核苷酸链”)的链长，只要是能够抑制由后述的第1反向引物(图1中的“R1”)造成的非特异性的合成的链长就不不特别限制，优选为1～300个核苷酸。另外，在第2多聚脱氧核苷酸链中，可以包含除了第2脱氧核苷酸以外的其他脱氧核苷酸。作为其他脱氧核苷酸不特别限制，可列举例如，与第1脱氧核苷酸同种的脱氧核苷酸。
第2脱氧核苷酸向第1多聚脱氧核苷酸链的3’末端的聚合添加与所述第1脱氧核苷酸同样地，例如，可以通过利用末端脱氧核苷酸转移酶的酶反应来进行。
作为该酶反应的温度不特别限制，通常为30～40℃，优选为37℃。另外，作为其反应时间，根据所期望的互补链的链长，只要是本领域技术人员就能够适当设定，优选为2～40分钟，更优选为5～30分钟，进一步优选为10～20分钟。
另外，这样的聚合添加中的反应液可以通过对所述工序(2)中的反应液添加第2脱氧核苷酸来制备。
并且，这样在所述互补链的3’末端介由第1多聚脱氧核苷酸链而添加了第2多聚脱氧核苷酸链的单链DNA，可以为了使末端脱氧核苷酸转移酶的酶活性失活而供于热处理。作为该热处理的条件，只要是所述酶失活的条件就不特别限制，通常在60～90℃(优选为70～80℃)孵育1分钟～1小时(优选为5～20分钟)，从而能够使所述酶失活。
(工序(4)双链DNA的合成)
在该工序中，在工序(3)中所形成的单链DNA中的所述互补链的3’末端与第1多聚脱氧核苷酸链的结合部位，使第1反向引物(图1中的“R1”)退火，以该引物作为起点进行延伸反应，从而合成双链DNA。
在工序(4)中，双链的合成可以通过例如，在热变性处理之后使第1反向引物与所述单链DNA退火，以该引物作为起点利用DNA聚合酶进行延伸反应，从而进行。
作为该工序中使用的酶，只要能够进行该延伸反应就不特别限制，优选为即使在氯化钴存在下也能够发挥其活性的DNA聚合酶。氯化钴如上所述，是通常添加于利用末端脱氧核苷酸转移酶的聚合添加反应体系中的盐，因此通过使用在该盐存在下能够进行延伸反应的DNA聚合酶，可以不需要纯化处理等地，一锅进行上述工序(2)至工序(5)。作为该DNA聚合酶，可列举例如，Q5 DNA聚合酶(Q5-高保真DNA聚合酶、Q5-热启动高保真DNA聚合酶等，均为New England Biolabs公司制)。
作为热变性工序中的温度，只要是能够使所述单链DNA的高级结构变性的温度就不特别限制，优选为30～100℃，更优选为50～99℃。其保持时间不特别限定，例如为1秒～10分钟。
作为退火工序中的温度，只要是产生第1反向引物与所述单链DNA的退火、并能够维持的温度就不特别限制，从抑制非特异性的扩增产物的观点考虑，优选为40～80℃，更优选为45～70℃，进一步优选为50～65℃。其保持时间不特别限定，优选为30秒～5分钟，更优选为1～2分钟。另外，退火温度既可以是相同温度，也可以不同。例如，通过设定每10秒各下降数℃(2～3℃)的温度梯度，从而第1反向引物容易以在第1多聚脱氧核苷酸链上滑动的方式，与其3’末端特异性地退火。
作为延伸工序中的温度，只要是双链能够合成的温度就不特别限制，只要是本领域技术人员就能够适当调整，优选为50～80℃，更优选为65～75℃，特别优选为72℃。另外，其保持时间不特别限定，优选为10秒～5分钟，更优选为30秒～2分钟，特别优选为1分钟。此外，退火温度可以是与延伸工序中的温度相同的温度，但不要高于延伸工序中的温度地设定。
此外，该反应可以通过使用与工序(1)中的反应液同样的反应液来进行。另外，延伸反应后为了抑制DNA聚合酶的酶活性、维持双链DNA结构，通常在4℃维持。
(工序(5)第1次聚合酶链反应)
该工序中，以工序(4)中所合成的双链DNA作为模板，使用与所述特定序列互补的第2正向引物(图1中的“F2”)、和第1反向引物(图1中的“R1”)进行聚合酶链反应。
“聚合酶链反应(PCR)”是指通过使温度变化反复而使靶标核苷酸序列扩增。更具体地，通过由用于使正向引物和反向引物与靶标核苷酸序列退火的工序、接着以所述引物作为起点通过DNA聚合酶进行延伸反应的工序、使该工序所合成的包含靶标核苷酸序列的双链通过热变性而解离形成单链的工序这三个工序组成的循环，从而构成PCR。
作为工序(5)中的退火的温度，只要是产生所述退火、并能够维持的温度就不特别限制，只要是本领域技术人员就能够适当调整，但从抑制非特异性的扩增产物的观点考虑，优选为50～80℃，更优选为60～70℃。另外，其保持时间不特别限定，优选为1～60秒。此外，退火温度可以所有循环为相同温度，也可以不同。
作为进行延伸反应的工序中的温度，只要是能够合成互补链的温度就不特别限制，优选为50～80℃，更优选为65～75℃，特别优选为72℃。其保持时间不特别限定，优选为1～60秒，更优选为10～50秒，进一步优选为20～40秒，特别优选为30秒。另外，进行延伸反应的工序中的温度可以所有循环为相同温度，也可以不同。退火温度可以与进行延伸反应的工序中的温度为相同温度，但不要高于延伸工序中的温度地设定。
作为热变性工序中的温度，只要是能够使双链解离的温度就不特别限制，优选为80～100℃，更优选为95～99℃，特别优选为98℃。其保持时间不特别限定，优选为1～60秒，更优选为10～50秒，进一步优选为20～40秒，特别优选为30秒。
工序(5)中的PCR中，循环数只要能够以在后述的工序可以成为模板的程度进行扩增就不特别限制，优选为10～40个循环，更优选为15～30个循环，进一步优选为20～25循环。
此外，该PCR可以通过使用与工序(1)(工序(4))中的反应液同样的反应液来进行。即，可以在工序(4)中的反应之后，添加F2引物，重复上述温度变化，从而进行工序(5)中的PCR。
这样得到的扩增产物在供于下述工序(6)之前，可以供于纯化处理。作为纯化处理，与工序(1)所记载的纯化处理是同样的。另外，作为纯化用柱也适合使用市售品，作为该PCR扩增产物纯化用柱的市售品，可列举例如，AmpureXP(ベックマンコールター社制)、GenElute PCR Cleanup Kit(メルク社制)。
另外，下述工序(6)中，即使不实施纯化处理，也可以将扩增产物稀释而作为模板使用。作为该稀释倍率不特别限制，只要是本领域技术人员就能够适当调整，通常为10～1000倍，优选为100～500倍，更优选为200～300倍。
(工序(6)第2次聚合酶链反应)
该工序中，以工序(5)中所合成的扩增产物作为模板，使用与所述特定序列互补的第3正向引物(图1中的“F3”)、和第2反向引物(图1中的“R2”)进行PCR。
关于PCR如上所述，但关于其条件，例如，工序(6)中的退火和延伸反应中的温度可以相同。作为该温度，只要是产生工序(5)中所合成的扩增产物、与第3正向引物或第2反向引物的退火，进而能够合成互补链的温度就不特别限制，只要是本领域技术人员就能够适当调整，从抑制非特异性的扩增产物这样的观点考虑，优选为50～80℃，更优选为60～70℃。其保持时间不特别限定，优选为5秒～2分钟，更优选为10秒～1分钟，进一步优选为20～40秒，特别优选为30秒。此外，退火和延伸反应中的温度可以不同，但不要高于延伸工序中的温度地设定。另外，退火温度和/或延伸反应中的温度可以所有循环为相同温度，也可以不同。
作为热变性工序中的温度，只要是能够解离双链的温度就不特别限制，只要是本领域技术人员就能够适当调整，优选为80～100℃，更优选为90～99℃，进一步优选为94～98℃。其保持时间不特别限定，优选为1秒～5分钟，更优选为5秒～3分钟，进一步优选为10秒～2分钟。
工序(6)中的PCR中，只要能够以后述的方法中可以检测的程度或可以测序分析的程度扩增，循环数就不特别限制，优选为10～50个循环，更优选为25～40个循环，进一步优选为30～35循环。
此外，该PCR也可以与工序(4)和工序(5)同样地，通过使用与工序(1)中的反应液同样的反应液来进行。
并且，通过经过以上的工序，从而根据本发明，如图1所示，能够扩增相邻序列。此外，如该图中所示，不仅相邻序列，特定序列的一部分和第1多聚脱氧核苷酸链的一部分也一起被扩增。另外，PCR中，模板多核苷酸和具有与其互补的序列的互补链两者的关系终究不过是相对的。即，作为互补链所合成的链能够再次作为模板发挥功能。因此，本发明中成为扩增或后述的序列确定的对象的相邻序列等不仅包含该序列，也包含该序列的互补链。
本发明中所扩增的相邻序列等的检测或确认，只要是本领域技术人员就能够通过适当使用公知的方法来进行，作为公知的方法，可列举电泳法(例如，在琼脂糖凝胶或丙烯酰胺凝胶中将扩增产物展开的电泳法)、核酸层析法、嵌入法、利用猝灭剂的荧光检测法、DNA印迹。
(测序分析)
通过确定经过上述工序而得的扩增产物的序列，能够明确相邻序列。该序列确定可以通过公知的测序分析进行。例如，对于扩增产物，可以分离、亚克隆到载体内，然后使用桑格尔序列确定法或色素终止剂(dye terminator)序列确定法进行序列确定。另外，通过供于新一代测序(NGS；Next Generation Sequencing)或单分子测序法，不需要亚克隆步骤就能够进行序列确定。
作为新一代测序法不特别限制，可列举合成测序法(sequencing-by-synthesis、例如，利用Illumina公司制Solexa Genome Analyzer、Hiseq(注册商标)、Nextseq、Miseq或Miniseq的测序)、焦磷酸测序法(例如，利用ロッシュ/ダイアグノステックス(454)社制的测序仪GSLX或FLX的测序(所谓454测序))、连接酶反应测序法(例如，利用ライフテクノロジー社制的SoliD(注册商标)或5500xl的测序)。作为单分子测序法，可列举例如，パシフィック/バイオサイエンシズ/オブ/カリフォルニア社制的PacBio RS II或PacBioSequel系统、オックスフォード/ナノポアテクノロジーズ社制的PromethION、GridION或MinION等。
另外，通过确定这样相邻序列，例如，通过进一步将该序列进行BLAST检索，从而可以确定插入了作为特定序列的外来DNA的宿主基因组的位置。
＜本发明的试剂盒＞
如上所述，根据本发明，通过使用上述的引物进行各反应，从而能够扩增与特定的序列相邻的序列，进而确定该相邻的序列。因此，本发明提供用于上述的方法的包含第1正向引物、第2正向引物、第3正向引物、第1反向引物和第2反向引物的试剂盒。
第1正向引物、第2正向引物和第3正向引物如上所述，是具有与所述特定序列分别互补的序列的引物，但如图1所示，第2正向引物位于比第1正向引物更靠近相邻序列的位置，第3正向引物位于比第2正向引物更靠近相邻序列的位置。此外，所谓“更靠近相邻序列”只要引物5’末端的退火位置更靠近相邻序列即可，正向引物的退火区域之间可以一部分重复。作为退火的位置不特别限制，只要是本领域技术人员就能够基于特定序列信息适当调整，第1～3正向引物的退火位置(各引物5’末端的退火位置)优选距离特定序列与相邻序列的边界分别为1000～200个核苷酸、500～80个核苷酸和300～30个核苷酸。
另外，在特定的序列是具有LTR的外来DNA来源的序列的情况下，从如果在LTR区域内使第1正向引物退火，则可能LTR区域(5’LTR和3’LTR)之间所夹的病毒来源的DNA也被扩增这样的观点考虑，第1正向引物期望在LTR区域外退火。
作为第1～3正向引物的链长不特别限制，与特定的序列互补的序列部分的长度优选为18～27个核苷酸，更优选为18～25个核苷酸。
第1～3正向引物的解链温度(Tm)值优选为57～72℃，更优选为62～70℃，特别优选为68℃。
此外，具备这样的所期望的链长和Tm值的引物，只要是本领域技术人员，就能够通过使用PCR引物设计工具来设计。作为该设计工具，可列举例如Primer3。
第1反向引物是从5’末端起至少依次包含衔接子引物序列和由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸的引物。如上所述，该引物在上述互补链的3’末端与第1多聚脱氧核苷酸链的结合部位退火，因此需要具有作为与第1脱氧核苷酸互补的脱氧核苷酸的由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸。另外，如后述的实施例中所示，从容易在与相邻序列互补的序列、与第1多聚脱氧核苷酸链的结合部位特异性更高地退火这样的观点考虑，第1反向引物优选为在3’末端进一步包含第4脱氧核苷酸的引物(即，从5’末端起依次包含衔接子引物序列、由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸和第4脱氧核苷酸的引物)，更优选为在3’侧进一步包含第4脱氧核苷酸和第5脱氧核苷酸的引物(即，从5’末端起依次包含衔接子引物序列、由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸、第4脱氧核苷酸和第5脱氧核苷酸的引物)。
此外，第4脱氧核苷酸是从除了第3脱氧核苷酸以外的3种脱氧核苷酸中随机选择的脱氧核苷酸，第5脱氧核苷酸是从4种脱氧核苷酸中随机选择的脱氧核苷酸。具体地，第1～第5脱氧核苷酸形成下述表1所示的关系。
表1
Figure BDA0003510193430000191
作为由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸的链长，只要是能够与第1多聚脱氧核苷酸链充分退火的长度，就不特别限制，只要是本领域技术人员，就能够根据所包含的脱氧核苷酸的种类而适当调整，优选为5～30个核苷酸，更优选为10～25个核苷酸。此外，第4脱氧核苷酸和第5核苷酸在第1反向引物分别包含各1个核苷酸。
第1反向引物进一步在5’侧包含衔接子引物序列。另外，第2反向引物也在3’末端包含衔接子引物序列。本发明中“衔接子引物序列”，至少不是与本发明所涉及的特定的序列、第1多聚脱氧核苷酸链和第2多聚脱氧核苷酸链互补的序列，进而优选不是与本发明所涉及的DNA链(例如，插入了外来DNA的宿主基因组)互补的序列。另外，衔接子引物序列更优选是天然不存在的序列。
作为衔接子引物序列的链长，只要是上述的第2次聚合酶链反应(工序(6))能够充分进行的长度，就不特别限制，只要是本领域技术人员就能够适当调整，优选为18～27个核苷酸，更优选为20～25个核苷酸，特别优选为22个核苷酸。衔接子引物序列的解链温度(Tm)值优选为50～72℃，更优选为55～68℃。
衔接子引物序列的合适的例子示于下述表2。
表2
序列名 序列(5’→3’) 序列号：
ADP1 ACAGCAGGTCAGTCAAGCAGTA 2
ADP2 AGCAGTAGCAGCAGTTCGATAA 3
M13-20 GTAAAACGACGGCCAGT 4
M13-21 TGTAAAACGACGGCCAGT 5
M13-47 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 6
M13-P5 CAGGAAACAGCTATGAC 7
M13rev GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 8
T3 ATTAACCCTCACTAAAGGGAA 9
T3pro ATTAACCCTCACTAAAGGGA 10
T7 TAATACGACTCACTATAGGG 11
T7term GCTAGTTATTGCTCAGCGG 12
BGHrev TAGAAGGCACAGTCGAGG 13
SP6 CATACGATTTAGGTGACACTATAG 14
SP6-II ATTTAGGTGACACTATAGAATA 15
SP6pro GATTTAGGTGACACTATAG 16
构成本发明中引物的“核苷酸”通常为DNA，但只要能够形成碱基对结合，也可以是其他天然核苷酸(RNA)，也可以包含非天然核苷酸(人工核苷酸、核苷酸类似物)。作为非天然核苷酸，可列举例如，己糖醇核酸(HNA)、环己烯核酸(CeNA)、肽核酸(PNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、吗啉核酸、三环-DNA(tcDNA)、2’-O-甲基化核酸、2’-MOE(2’-O-甲氧基乙基)化核酸、2’-AP(2’-O-氨基丙基)化核酸、2’-氟化核酸、2’F-阿糖核酸(2′-F-ANA)、BNA(LNA等的交联化核酸(Bridged Nucleic Acid))。
本发明的“引物”是与靶标核苷酸序列退火、成为DNA复制的起点的寡核苷酸，可以是仅由1种核苷酸(例如，仅DNA)构成的寡核苷酸，也可以是由多种核苷酸(例如，DNA和RNA)构成的嵌合寡核苷酸，优选为仅由DNA构成的寡核苷酸。
本发明的引物只要是本领域技术人员就能够通过适当选择公知的方法而制备。例如，可以通过使用市售的核酸自动合成仪(アプライドバイオシステムズ社制、べックマン社制等)合成，接着使用使用反相柱等纯化所得的寡核苷酸，从而制备引物。
另外，本发明的引物中，为了使利用PCR检测扩增产物等容易，也可以结合标记物质。作为“标记物质”，可以结合于核苷酸，只要能够通过化学的或光学的方法检测，就不特别限制，可列举例如，绿色荧光蛋白质(GFP)、别藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白(R-PE)等荧光蛋白质、碱性磷酸酶(ALP)、辣根过氧化物酶(HRP)、β半乳糖苷酶(β-gal)等酶、125I等放射性同位素、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明(RITC)等荧光色素、胶体状金属、着色胶乳等显色标记物质、亲和素、生物素、DIG、抗DIG抗体。此外，在作为标记物质使用酶的情况下，通过添加生色底物、荧光底物、或者化学发光底物等作为底物，从而可以根据底物而进行各种检测。另外，标记物质的结合可以直接结合于构成引物的核苷酸，也可以介由其他物质间接地结合。
进而，第3正向引物和第2反向引物上如后述的实施例所示，可以添加用于确定相邻的序列的序列(例如，FLOW-CELL结合区域等新一代测序仪用衔接子序列)。
另外，本发明的试剂盒中除了上述引物之外，可以包含用于反应的各种酶。作为该酶，可列举上述DNA聚合酶、末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyltransferase，TdT)。
作为“DNA聚合酶”，只要是对靶标核苷酸序列具有合成由DNA组成的互补链的活性的酶(DNA依赖性DNA聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶)即可，可以使用常温性、中温性、耐热性的酶。另外，可列举具有5’→3’外切核酸酶活性、3’→5’外切核酸酶活性(校正活性)和TdT活性中的至少1种活性的DNA聚合酶。
作为本发明所涉及的“DNA依赖性DNA聚合酶”，不特别限制，优选为耐热性DNA聚合酶。作为耐热性DNA聚合酶，不特别限制，可列举例如，KOD聚合酶(KOD-Plus-Neo等、东洋纺株式会社制)、Q5 DNA聚合酶(Q5-高保真DNA聚合酶、Q5-热启动高保真DNA聚合酶等，均为New England Biolabs公司制)、ExTaq聚合酶(タカラバイオ株式会社制)。
另外，作为本发明所涉及的“RNA依赖性DNA聚合酶”，不特别限制，可列举例如，逆转录病毒来源的逆转录酶。更具体地，可列举突变型莫洛尼(Moloney)小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶、鸟成髓细胞症病毒(AMV)逆转录酶、劳斯相关病毒(RAV)逆转录酶、人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶、或它们的突变体(例如，作为MMLV逆转录酶的突变体的SuperScript(注册商标)逆转录酶(Thermo Fisher Scientific公司制))。
本发明的试剂盒中可以进一步包含上述反应所需的物质。作为该物质，可列举上述反应液的组成(底物(dNTP)、上述离子或用于提供它们的盐、缓冲液、添加剂)。另外，在使本发明的引物结合了标记物质的情况下，用于检测该标记物质的底物也包含在所述试剂盒中。进而，根据检测方法，用于展开利用PCR的扩增产物的担载体(例如，电泳方法中的凝胶、核酸层析法中的层析用试验纸)和溶剂、荧光物质(例如，嵌入法中的嵌入剂)、利用猝灭剂的荧光检测法中的结合了荧光物质和消光物质的探针也可以适当包含在所述试剂盒中。进而，用于确认所扩增的序列的DNA分子量标志物和阳性对照也可以包含在所述试剂盒中。另外，还可以包含序列确定所需的物质、例如测序用引物等。进而另外，本发明的试剂盒中可包含其使用说明书。
实施例
以下，基于实施例更具体地说明本发明，本发明不限于以下实施例。
(基因组DNA的制备)
关于包含特定的序列(HTLV-1来源的DNA等的转入基因)和与其相邻的序列(宿主基因组来源的序列)的基因组DNA，在试样是外周血白细胞或细胞株的情况下，使用キアゲン社制QIAamp DNA Blood Mini kit，按照附带的说明书所记载的方法分离、制备；在试样是腺病毒、大鼠的组织或玉米Bt176种(http：//bch.cbd.int/database/attachment/？id＝10723)的情况下，使用碱性溶解液按照常规方法分离、制备。
然后，对所得的基因组DNA，如下述表3所示，添加RNaseA(タカラバイオ株式会社或株式会社ニッポンジーン社制)，在37℃孵育10分钟，将RNA失活、除去。
表3
Figure BDA0003510193430000231
然后，通过图1所示的工序，尝试与特定的序列相邻的序列的扩增。
(工序1)互补链的合成
包含转入基因和宿主基因组的单链DNA的合成，以所述基因组DNA作为模板，将转入基因特异性F1引物与KOD-Plus Neo反应液(东洋纺社制)以下述表4所示的组成混合，使用Thermo Fisher SCIENTIFIC公司制Veriti热循环仪，在下述表5所示的条件下使其反应(所需时间：约40分钟)。
表4
Figure BDA0003510193430000232
表5
Figure BDA0003510193430000241
*在外来DNA具有LTRs的情况下，将延伸时间设为45秒。
此外，各F1引物、后述的各F2引物和各F3引物的序列如下。另外，下述表6中“Common”表示是无论转入基因的种类如何都共同使用的引物。“NGS-F2”序列中的“NNNNNNNN”表示在后述的Illumina公司新一代测序仪中使用的索引标签(双重索引序列)。
Figure BDA0003510193430000251
所合成的单链DNA的纯化和F1引物的除去，使用Monarch PCR&DNA Cleanup Kit(New England Biolabs公司制、产品编号：T1030)进行。暂时结合于该试剂盒所附的柱的单链DNA的溶出添加9.2μL的水来进行，结果回收了8.2μL的样品(所需时间：约15分钟)。
(工序2和3)互补链3’末端的加多聚AG尾
将所纯化的单链DNA、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应液(New England Biolabs公司制)和dATP以下述表7所示的组成混合，在37℃使其反应20分钟，从而进行所述单链DNA的3’末端的加多聚A尾。
表7
Figure BDA0003510193430000261
然后，以下述表8所示的组成加入dGTP，进一步在37℃使其反应15分钟，从而在所述单链DNA的3’末端添加多聚AG。
表8
Figure BDA0003510193430000262
然后，在75℃进行10分钟的加热处理，从而进行末端脱氧核苷酸转移酶的失活(所需时间：约45分钟)。
(工序4)双链DNA的合成
双链DNA的合成，在所述工序3的反应液中，以下述表9所示的组成直接加入寡聚dT衔接子引物(序列号：2和41)和Q5热启动高保真DNA聚合酶反应液(New England Biolabs公司制)，使用Thermo Fisher SCIENTIFIC公司制Veriti热循环仪，在下述表10所示的降落条件下使其反应(所需时间：约5分钟)。此外，在移入下一工序之前，所得的样品在4℃维持。
表9
Figure BDA0003510193430000271
表10
Figure BDA0003510193430000281
此外，寡聚dT衔接子引物等的序列如下。另外，下述表11中“Common”表示是无论转入基因的种类如何都共同使用的引物。另外“NGS-R2”序列中的“NNNNNNNN”表示在后述的Illumina公司新一代测序仪中使用的索引标签(双重索引序列)。
Figure BDA0003510193430000291
(工序5)第1次聚合酶链反应(PCR)
双链DNA的扩增，在工序4的反应液中以下述表12所示的组成直接加入转入基因特异性F2引物，使用Thermo Fisher SCIENTIFIC公司制Veriti热循环仪，在下述表13所示的条件下使其反应(所需时间：约35分钟)。
表12
Figure BDA0003510193430000301
表13
Figure BDA0003510193430000302
(工序6)第2次PCR
将工序5中所扩增的DNA稀释1/200，将转入基因特异性F3引物、衔接子引物1(ADP1-NGS-R1)和KOD-Plus Neo反应液(东洋纺社制)以下述表14所示的组成混合，使用Thermo Fisher SCIENTIFIC、Veriti热循环仪，在下述表15所示的条件下使其反应(所需时间：约40分钟)。
表14
Figure BDA0003510193430000311
表15
Figure BDA0003510193430000312
然后，使用AmpureXP(Beckman coulter公司制)进行DNA的纯化和引物的除去。
此外，以上的工序如图2所示，可以进行不到3小时。
(利用桑格尔测序的HTLV-1的克隆性分析)
以上述的(工序6)中所得的扩增产物作为模板，使用衔接子特异性的引物(Sangerseq primer)和BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(サーモフィッシャー社制)进行测序反应，供于3730Xl DNA Analyzer(サーモフィッシャー社制)，进行桑格尔测序。
(NGS衔接子文库的制备)
上述的(工序6)中所得的扩增产物的序列确定、即转入基因插入部位的序列确定通过供于新一代测序分析(NGS)来进行。
如下述表16所示，以工序6中制备的DNA 2μL作为模板，在下述表17所示的条件下使其反应，从而通过Tail-PCR法制备添加了Illumina公司的新一代测序仪用衔接子(索引标签和FLOW-CELL结合区域)的扩增产物(NGS衔接子文库)。另外，然后，使用AmpureXP(Beckman coulter公司制)进行DNA的纯化和引物的除去。
表16
Figure BDA0003510193430000321
表17
Figure BDA0003510193430000322
所制备的文库供于llumina公司的Miseq进行测序。通过测序而得的序列(READ)经过与利用FASTX-Tool试剂盒的引物序列完全一致的序列的提取、利用sickle的引物序列的裁剪(trim)和低准确度序列的除去、利用Usearch的OTU聚类(一致性97％)的工序，用BLAST+进行同源性检索。
(实施例1)
将插入了1拷贝HTLV-1的感染细胞(TL-Om1)的基因组DNA、和非感染细胞(Jurkat)的基因组DNA以成为各前病毒量(PVL)的方式调整而混合，将所得的混合物通过上述的方法进行分析。
其结果如图3所示，即使前病毒量为0.032％这样的极微量，也能够检测到特异性的条带。即，表明根据本发明，能够特异性地扩增与特定的序列(HTLV-1)相邻的序列(宿主基因组DNA)，另外能够灵敏度高地检测。
(实施例2)
除了设计各转入基因用引物、代替引物以外，在与实施例1相同的条件下使其反应，进行分析。其结果如图4所示，明确了在HIV-1、SIV、HBV、腺病毒、基因组编辑的脱靶基因重组植物的任一者中，都能够特异性地扩增外来DNA的插入部位。因此表明，根据本发明，不仅能够特异性地扩增实施例1所示的HTLV-1，而且能够通用性高地特异性地扩增与特定的序列(HTLV-1)相邻的序列(宿主基因组DNA)。
(实施例3)
使用HTLV-1运载体3样本的基因组DNA，在与实施例1相同的条件下独立地使其反应2次，进行分析。其结果如图5所示，对于运载体3样本，即使将HTLV-1插入部位的扩增独立地进行2次，也能够获得同样的条带图谱。另外，虽未图示，但对于利用桑格尔测序的克隆性分析、新一代测序中的同源性检索的结果也获得了再现性良好的数据。因此表明，根据本发明，能够特异性地、再现性良好地扩增与特定的序列(HTLV-1)相邻的序列(宿主基因组DNA)。
(实施例4)
为了明确添加第2多聚脱氧核苷酸链的技术意义，以插入了1拷贝HTLV-1的感染细胞(TL-Om1)的基因组DNA作为对象，在不添加脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)的条件下进行工序2和3(互补链3’末端的脱氧核苷酸的聚合添加)，将工序5(第1次PCR)中所得的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析。另外，添加dGTP而进行工序2和3，与工序5中所得的扩增产物进行比较。
其结果如图6所示，在不添加dGTP的情况下，检测到了非特异性扩增产物来源的条带。与此相对，在添加了dGTP的情况下，未检测到该条带。因此表明，为了特异性地扩增与特定的序列相邻的序列，需要添加第2多聚脱氧核苷酸链。
(实施例5)
为了明确第1反向引物包含第4、第5核苷酸的技术意义，以插入了多拷贝HTLV-1的感染细胞(SLB1)的基因组DNA作为对象，对于第1反向引物，分别使用包含第4、第5核苷酸的(Oligo-dT-AD2)、不包含第5核苷酸的(Oligo-dT-AD3)、不包含第4、第5核苷酸的(Oligo-dT-AD4)，实施工序4(双链DNA的合成)，将工序6(第2次PCR)中所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。
其结果如图7所示，表明按照Oligo-dT-AD2、Oligo-dT-AD3、Oligo-dT-AD4的顺序，反应产物的扩增长度依次向短链长侧收敛。即表明，第1反向引物通过含有第4和/或第5核苷酸，从而在扩增长度增大的同时，向第1多聚脱氧核苷酸链等的非特异性的退火被抑制，另一方面，该引物特异性更高地在与相邻序列互补的序列与第1多聚脱氧核苷酸链的结合部位退火。由此提示，第1反向引物包含第4和/或第5核苷酸，虽然在扩增与特定的序列相邻的序列方面并非必要，但从提高特异性的观点是期望的。
(实施例6)
通过以下所示的方法确认了，根据本发明的方法，即使以RNA链作为对象，也能够扩增链中的与特定序列相邻的序列，进而能够确定该相邻的序列。即，尝试了在编码人TCRα(TCRA)和TCRβ(TCRB)的RNA中，扩增与编码恒定区的序列相邻的编码各可变区的序列，并确定它们的序列。
此外，实施例6中使用的各引物的序列如表18所示。另外各反应中的温度控制使用Thermo Fisher SCIENTIFIC公司制Veriti热循环仪。
Figure BDA0003510193430000351
(RNA的制备)
从成人T细胞白血病淋巴瘤(ATLL)细胞株(插入了1拷贝HTLV-1的感染细胞(TL-Om1))，使用RNA提取/纯化试剂盒(Zymo research公司制、Quick-RNA miniprep)，按照其附带的方案，制备总RNA。
然后，通过图1所示的工序，尝试编码TCR可变区的序列的扩增。
(工序1)互补链的合成
为了合成编码恒定区和可变区的单链DNA，首先，以所述RNA作为模板，以下述表19所示的组成进行混合。此外，根据作为模板的RNA的添加量，以总量为3.25μL的方式，适当调整DEPC处理水的添加量。
表19
Figure BDA0003510193430000361
然后，将所述RNA与F1引物等的混合液在65℃孵育5分钟后，在冰上静置至少1分钟，使RNA与F1引物退火。
接着，添加下述表20所示的组成的混合液，在54℃孵育10分钟，通过逆转录反应合成所述单链DNA。
表20
Figure BDA0003510193430000362
所合成的单链DNA的纯化和F1引物的除去使用Monarch PCR&DNA Cleanup Kit，按照其附带的说明书进行。并且，暂时与该试剂盒所附的柱结合了的单链DNA的溶出添加9.2μL的水进行，结果回收了约8.0μL的样品。
(工序2和3)互补链3’末端的加多聚AG尾
将所纯化的单链DNA(cDNA)、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)及其反应缓冲液(NewEngland Biolabs公司制)和dATP以下述表21所示的组成混合，在37℃使其反应30分钟，从而进行所述单链DNA的3’末端的加多聚A尾。
表21
Figure BDA0003510193430000371
然后，以下述表22所示的组成加入dGTP，进一步在37℃反应15分钟，从而在所述单链DNA的3’末端添加多聚AG。
表22
Figure BDA0003510193430000372
然后，进行75℃、10分钟的加热处理，从而进行末端脱氧核苷酸转移酶的失活。
(工序4)双链DNA的合成
双链DNA的合成以所述工序3的反应液中以下述表23所示的组成，直接加入寡聚dT衔接子引物(Oligo-dT-AD2)和Q5热启动高保真DNA聚合酶反应液(New England Biolabs公司制)，在下述表24所示的降落条件下使其反应。此外，在移入下一工序之前，所得的样品在4℃维持。
表23
Figure BDA0003510193430000381
表24
Figure BDA0003510193430000382
(工序5)第1次聚合酶链反应(PCR)
双链DNA的扩增，在工序4的反应液中，以下述表25所示的组成直接加入对TCRA和TCRB的各个恒定区为特异性的F2引物混合物，在下述表26所示的条件下使其反应。
表25
Figure BDA0003510193430000391
表26
Figure BDA0003510193430000392
(工序6)第2次PCR
将工序5中所扩增的DNA稀释1/200，将对TCRA和TCRB的各个恒定区为特异性的F3引物、衔接子引物1(ADP1-NGS-R1)和KOD-Plus Neo反应液(东洋纺社制)以下述表27所示的组成混合，在下述表28所示的条件下使其反应。
表27
Figure BDA0003510193430000401
表28
Figure BDA0003510193430000402
然后，使用AmpureXP进行DNA的纯化和引物的除去。
(利用桑格尔测序的TCR库分析)
以上述的(工序6)中所得的扩增产物作为模板，使用衔接子特异性的引物(Sangerseq primer)和BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(サーモフィッシャー社制)进行测序反应，供与3730Xl DNA Analyzer(サーモフィッシャー社制)进行桑格尔测序。然后，将所得的各序列与V-QUEST的数据库进行比对。其结果如表29和30所示，能够鉴定出α基因、β基因的再构成结果(此外，表29显示人TCRA基因的再构成分析结果，表30显示人TCRB基因的再构成分析结果)。
Figure BDA0003510193430000411
Figure BDA0003510193430000421
产业可利用性
如以上说明的那样，根据本发明，能够短时间、高效率、高灵敏度、低成本、高通用性、另外再现性良好地扩增与特定的序列相邻的序列，进而能够确定该相邻的序列。
因此，本发明在基因治疗、基因组编辑等基因改造技术、以及病毒相关疾病中鉴定外来DNA(特定序列)向宿主基因组上的插入部位(相邻序列)的方面优异，因此在基因改造技术的安全性评价、病毒相关疾病的诊断法和治疗法的开发等中极为有用。另外，如上所述，在TCR库分析中也极为有用。
Figure IDA0003510193500000011
Figure IDA0003510193500000021
Figure IDA0003510193500000031
Figure IDA0003510193500000041
Figure IDA0003510193500000051
Figure IDA0003510193500000061
Figure IDA0003510193500000071
Figure IDA0003510193500000081
Figure IDA0003510193500000091
Figure IDA0003510193500000101
Figure IDA0003510193500000111
Figure IDA0003510193500000121
Figure IDA0003510193500000131
Figure IDA0003510193500000141
Figure IDA0003510193500000151

Claims (5)

1.扩增核苷酸链中的与特定序列相邻的序列的方法，该方法包括下述工序(1)～(6)，
工序(1)：使第1正向引物在所述特定序列退火，以该引物作为起点进行延伸反应，合成在3’末端包含与所述相邻序列互补的序列的互补链，
工序(2)：在工序(1)中所得的互补链的3’末端以聚合的形式添加第1脱氧核苷酸，
工序(3)：在工序(2)中所添加的由第1脱氧核苷酸组成的多聚脱氧核苷酸链的3’末端进一步以聚合的形式添加第2脱氧核苷酸，
工序(4)：在工序(3)中所形成的单链DNA中的所述互补链的3’末端与所述多聚脱氧核苷酸链的结合部位，使第1反向引物退火，以该引物作为起点进行延伸反应，合成双链DNA，
工序(5)：以工序(4)中所合成的双链DNA作为模板，使用与所述特定序列互补的第2正向引物、和第1反向引物进行聚合酶链反应，
工序(6)：以工序(5)中所得的扩增产物作为模板，进一步使用与所述特定序列互补的第3正向引物、和第2反向引物进行聚合酶链反应，
第2正向引物位于特定序列中比第1正向引物更靠近相邻序列的位置，第3正向引物位于特定序列中比第2正向引物更靠近相邻序列的位置，
第1反向引物是从5’末端起依次包含衔接子引物序列和由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸的引物，
第2反向引物是在3’末端包含衔接子引物序列的引物，
第1～3脱氧核苷酸是从由脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷组成的4种脱氧核苷酸中分别选择的1种脱氧核苷酸，
第2脱氧核苷酸是与第1脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸，并且
第3脱氧核苷酸是与第1脱氧核苷酸互补的脱氧核苷酸。
2.确定核苷酸链中的与特定序列相邻的序列的方法，该方法包括：
通过权利要求1所述的方法扩增所述相邻序列的工序，和
进行所扩增的相邻序列的测序分析的工序。
3.根据权利要求1或2所述的方法，第1反向引物是从5’末端起依次包含衔接子引物序列、由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸、第4脱氧核苷酸和第5脱氧核苷酸的引物，
第4脱氧核苷酸是从除了第3脱氧核苷酸以外的3种脱氧核苷酸中随机选择的脱氧核苷酸，并且
第5脱氧核苷酸是从所述4种脱氧核苷酸中随机选择的脱氧核苷酸。
4.根据权利要求1～3中的任一项所述的方法，所述特定序列是来源于插入到DNA链中的外来基因的序列，所述相邻序列是与所述插入到DNA链中的外来基因插入物相邻的来源于宿主基因组的序列。
5.用于权利要求1～4中的任一项所述的方法的试剂盒，
该试剂盒包含第1正向引物、第2正向引物、第3正向引物、第1反向引物和第2反向引物。
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