JP2020005549A - Htlv−1挿入部位同定方法 - Google Patents
Htlv−1挿入部位同定方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
通院患者からInformed consentを得た後、末梢血あるいは手術で摘出された固形腫瘍部(臨床献体)からゲノムDNAを抽出した。サンプルDNAの抽出は、Ficoll-paque Plus(Amaersham Bioscience)を用いた密度勾配遠心により、PBMC を分離し、分離したPBMCからQIAamp DNABlood Mini Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出する手法によった。
2-1.第1工程
下記表1及び表2に記載される条件にて、宿主ゲノムにHTLV-1プロウイルスが組み込まれている一本鎖核酸を合成した。モナーク PCR & DNA クリーンアップ キット(NEB:T1030)を使用し、ゲノムDNAと余剰配列番号1記載の配列(CAAGGCCTACCACCCCTCAT)である第1プライマーを除去した。7.4μLの一本鎖核酸が抽出された。
Terminal Transferase(NEB:M0315)を使用し、下記表3に記載される条件にて、合成された一本鎖核酸の末端にPoly-Aテールを付加した。
下記表4の反応混合物で複数回混和した後、PCR反応チューブへ移し、表5に記載される条件にて2本鎖DNA合成の後、100μlの1×緩衝液を添加し、1.5mlチューブへ移し、D DynaMagTM-2(Invitrogen:123.21D)又は8連PCRチューブ用マグネットスタンド MABI-Mag200(Cosmobio:MABI0812)で1分間静置させた。上清除去後、100μlの1×緩衝液を添加し、ボルテックスで攪拌後、再び1分間DynaMagTM-2を作用させ、上清を除去した。
下記表6の反応混合物で複数回混和した後、PCR反応チューブへ移し、表7に記載される条件にて第1PCRを行った。
第1PCRの結果物を蒸留水で1:100の割合で希釈し、下記表8及び表9に記載される条件にて第2PCRを行った。
3-1.既存サザンブロット法のHTLV-1検出感度
非感染細胞株であるJurkatとHTLV-1感染細胞株であるTL-Om1からQIAamp DNABlood Mini Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出した上で、サザンブロット法によるHTLV-1プロウイルスの挿入解析を行った。図2Aは、既存のHTLV-1モノクローナリティ解析に用いられるサザンブロット法のHTLV-1検出感度を示す図である。
「2-5.第5工程」における反応産物が目的のものであるかどうかをアガロースゲル電気泳動により確認した。PCRの反応液の一部を泳動の目安となる色素を含み、比重を高めるためのローディングバッファーと混合し、アガロースゲルのウェルにアプライした。電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド(EtBr)で染色を行い、UVトランスイルミネーター上で確認した。図2Bは、本発明にかかるHTLV-1挿入部位同定方法にて同定したHTLV-1挿入部位につき、第5工程後のPCRの反応液についての電気泳動写真図である。図2A及び図2Bの結果から、従来のサザンブロット法のHTLV-1検出感度と比較して、本発明にかかる方法のHTLV-1検出感度がすぐれていることが判明した。
4-1.本発明同定方法の第5工程後のPCRの反応液の電気泳動写真図
3例の無症候性キャリア(AC)の末梢血検体からFicoll-paque Plus(Amaersham Bioscience)を用いた密度勾配遠心により、PBMCを分離し、分離したPBMCからQIAamp DNABlood Mini Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出した。本発明にかかるHTLV-1挿入部位同定方法にて同定したHTLV-1挿入部位をアガロースゲルのウェルにアプライして電気泳動を行った後、EtBrで染色を行い、UVトランスイルミネーター上で確認した(AC16,AC17,AC20)。
本発明同定方法とリアルタイムPCRを用いたHTLV-1プロウイルス量の測定結果の相関性を調べた。1μgのDNAあたりのウイルスコピー数を算出して比較を行なった。図3Bは、本発明同定方法とリアルタイムPCRを用いたHTLV-1プロウイルス量の測定結果の相関性を示す図である。図3Bに示されているように、本発明同定方法と既存方法との高い相関性が確認された。
3例の無症候性キャリア(AC)及び4例のATL患者の末梢血あるいは手術で摘出された固形腫瘍部(臨床献体)からFicoll-paque Plus(Amaersham Bioscience)を用いた密度勾配遠心により、PBMCを分離し、分離したPBMCからQIAamp DNABlood Mini Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出し、本発明にかかる同定方法を適用し、第5工程後のPCR産物のシーケンス解析をサンガー法にて行った。図3Cは、無症候性キャリアと成人T細胞白血病患者とにおけるPCR産物のシーケンス解析を示す図である。図3Cに示されているように、ACの細胞ではHTLV-1プロウイルスの挿入部位はポリクローナルなパターンを示すが、ATL患者の細胞ではHTLV-1プロウイルスの挿入部位はモノクローナルなパターンを示すことが明確に示された。
配列番号5,6:アダプター
Claims (3)
- 配列番号1記載の配列である第1プライマーを使用して、宿主ゲノムにHTLV-1プロウイルスが組み込まれている一本鎖核酸を合成する第1工程と、
合成された一本鎖核酸の末端にPoly-Aテールを付加する第2工程と、
5’側に一本鎖核酸とは反応しない第1アダプタ及び第2アダプタが付加されている配列番号2記載の配列であるdTアダプタープライマーを使用して、Poly-Aテールから二本鎖核酸を合成する第3工程と、
配列番号3記載の配列である第2プライマーと配列番号5記載の配列である第1アダプタを使用してPCR法により第1の核酸増幅を行う第4工程と、
配列番号4記載の配列である第3プライマーと配列番号6記載の配列である第2アダプタを使用してPCR法により第2の核酸増幅を行う第5工程と、
を有することを特徴とするHTLV-1挿入部位同定方法。 - 前記dTアダプタープライマーは、dTプライマーに、5’側から順に前記第1アダプタ及び前記第2アダプタが付加されていることを特徴とする請求項1に記載のHTLV-1挿入部位同定方法。
- 配列番号2に示される塩基配列であることを特徴とするdTアダプタープライマー。
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JP2018128683A JP2020005549A (ja) | 2018-07-06 | 2018-07-06 | Htlv−1挿入部位同定方法 |
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JP2018128683A JP2020005549A (ja) | 2018-07-06 | 2018-07-06 | Htlv−1挿入部位同定方法 |
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JP2020005549A true JP2020005549A (ja) | 2020-01-16 |
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ID=69149654
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Country Status (1)
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JP (1) | JP2020005549A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021033648A1 (ja) * | 2019-08-20 | 2021-02-25 | 国立感染症研究所長 | ヌクレオチド配列の増幅方法及び配列決定方法 |
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2018
- 2018-07-06 JP JP2018128683A patent/JP2020005549A/ja active Pending
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WO2021033648A1 (ja) * | 2019-08-20 | 2021-02-25 | 国立感染症研究所長 | ヌクレオチド配列の増幅方法及び配列決定方法 |
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