ES2650721T3 - Análisis de alto rendimiento de los bordes transgénicos - Google Patents
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Abstract
Un método para encontrar una secuencia de polinucleótidos desconocida adyacente a una secuencia de polinucleótidos conocida en un DNA aislado, que comprende: a) digerir el DNA aislado que contiene una parte o toda la secuencia de polinucleótidos conocida y una secuencia de polinucleótidos desconocida adyacente con uno o más enzimas de restricción adecuados para producir una pluralidad de fragmentos de restricción de polinucleótidos digeridos; b) sintetizar una cadena complementaria de los fragmentos de restricción de polinucleótidos digeridos utilizando un cebador de oligonucleótidos, diseñado para unirse específicamente a la secuencia de polinucleótidos conocida, teniendo dicha secuencia del cebador de oligonucleótidos una fijación química unida al extremo 5' de la secuencia del cebador de oligonucleótidos; c) aislar la cadena complementaria por unión de la fijación química a una matriz de aislamiento adecuada, desnaturalizando después la cadena complementaria de los fragmentos de restricción del polinucleótido digerido; d) ligar un adaptador monocatenario a la cadena complementaria aislada unida a la matriz de aislamiento para producir una cadena complementaria aislada ligada; e) realizar una primera amplificación de PCR de la cadena complementaria aislada ligada utilizando un primer cebador de PCR diseñado para unir la secuencia de polinucleótidos conocida y un segundo cebador de PCR diseñado para unir el adaptador monocatenario para producir un primer amplicón de PCR; f) realizar una segunda amplificación de PCR de dicho primer amplicón de PCR, en donde la segunda amplificación de PCR amplifica una secuencia interna de dicho primer amplicón de PCR para producir un segundo amplicón de PCR; y, g) secuenciar el segundo amplicón de PCR para determinar la secuencia de la secuencia de polinucleótidos desconocida.
Description
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Tradicionalmente, las ligasas disponibles comercialmente solo estaban disponibles para unir fragmentos de DNA bicatenario. Recientemente, se ha demostrado que se puede utilizar una ligasa de RNA para unir fragmentos de DNA monocatenarios (Zhang y Chiang (1995) Nucleic Acids Research, 24(5); 990-991). Las ligasas monocatenarias preferidas están comercialmente disponibles y se comercializan como CIRCLIGASETM (Epicentre Biotechnologies, Madinson, WI), T4 RNA Ligase 1 y T4 RNA Ligase 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA), y Single Strand DNA Ligase (Wako Chemicals, Richmond, VA). Una ligasa de DNA monocatenario preferida es Thermostable RNA Ligase (TRL) de Epicentre Biotechnologies (Madinson, WI).
Como describen Brautigma y colaboradores, 2010, el análisis de la secuencia de DNA se puede utilizar para determinar la secuencia de nucleótidos del fragmento aislado y amplificado. Los fragmentos amplificados se pueden aislar y sub-clonar en un vector y secuenciarse utilizando el método de terminación de cadena (también denominado como secuenciación de Sanger) o secuenciación de terminación de colorante. Además, el amplicón se puede secuenciar con la secuenciación de nueva generación. Las tecnologías NGS no requieren la etapa de sub-clonación, y se pueden completar múltiples lecturas de secuenciación en una uníca reacción. Están comercialmente disponibles tres plataformas NGS, Genome Sequencer FLX de 454 Life Sciences/Roche, Illumina Genome Analyser de Solexa y Applied Biosystems’ SOLiD (acrónimo de “Secuenciación por unión y detección de Oligo”). Además, hay dos métodos de secuenciación de moléculas individuales que se están desarrollando en la actualidad. Estos incluyen la verdadera secuenciación de moleculas individuales (tSMS) de Helicos Bioscience y la secuenciación en tiempo real de moléculas individuales (SMRT) de Pacific Biosciences.
El Genome Sequencher FLX que está comercializado por 454 Life Sciences/Roche es un NGS de lectura larga, que utiliza una PCR de emulsión y pirosecuenciación para generar lecturas de secuenciación. Se pueden utilizar fragmentos de DNA de 300 – 800 pares de bases o librerías que contienen fragmentos de 3 – 20 kbp. Las reacciones pueden producir alrededor de un millón de lecturas de aproximadamente 250 a 400 bases por carrera para un rendimiento total de 250 a 400 megabases. Esta tecnología produce las lecturas más largas pero la salida de la secuencia total por carrera es baja comparado con otras tecnologías NGS.
El Illumina Genome Analyser que está comercializado por Solexa es un NGS de lectura corta que utiliza el método de síntesis por secuenciación con nucleótidos terminadores reversibles marcados con colorante y se basa en la PCR de puente en fase sólida. Se puede utilizar la construcción de bibliotecas de secuencias de terminación emparejadas que contienen fragmentos de DNA de hasta 10 kb. Las reacciones producen alrededor de 100 millones de lecturas cortas que son de 35 – 76 bases de longitud. Este dato puede producir de 3 – 6 gigabases por carrera.
El sistema de secuenciación por unión y detección de oligo (SOLiD) comoercializado por Applied Biosystem es una tecnología de lectura corta. Esta tecnología NGS utiliza DNA bicatenario fragmentado que tiene hasta 10 kbp de longitud. El sistema utiliza la secuenciación por unión de cebadores de oligonucleótidos marcados con colorante y la PCR de emulsión para generar un billón de lecturas cortas que dan como resultado una salida de secuencia total de hasta 30 gigabases por carrera.
tSMS de Helicos Bioscience y SMRT de Pacific Biosciences aplican un método diferente que utiliza moléculas de DNA individuales para las reacciones de secuencias. El sistema de Helicos tSMS produce hasta 800 millones de lecturas cortas que dan como resultado 21 gigabases por carrera. Estas reacciones se completan utilizando nucleótidos terminadores virtuales marcados con colorante que se describen como un método de “secuenciación por síntesis”.
El sistema de secuenciación de nueva generación SMRT comercializado por Pacific Biosciences utiliza una secuenciación por síntesis en tiempo real. Esta tecnología puede producir lecturas de hasta 1.000 pares de bases de longitud como resultado de no estar limitado por terminadores reversibles. El rendimiento de lectura sin procesar que es equivalente a la cobertura de un pliegue de un genoma humano diploide se puede producir por día utilizando esta tecnología.
Los siguientes ejemplos describen un método desarrollado para aislar e identificar las secuencias flanqueantes genómicas de una inserción transgénica. Además, el método se puede utilizar para determinar el número de copias del transgén y la localización genómica de un transgén para un suceso transgénico.
Realizaciones de la presente invención se definen además en los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 1
Un plásmido que contiene un gen de un casete de expresión de interés y un casete de expresión de un gen marcador de selección se utilizó para transformar el tejido vegetal Hi-II de Zea mays mediante la pistola génica de Biorad. La producción de maíz transgénico a partir de un callo de Tipo II bombardeado: efecto del tamaño de partícula de oro y la morfología del callo en la eficacia de la transformación. In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant. 36:21-29). Se modificó el protocolo: componentes de medios, agentes de selección y temporización se optimizaron para mejorar la eficacia del proceso de transformación. Un fragmento linearizado Fsp I del plásmido se utilizó para la transformación. Las transformaciones resultantes produjeron plantas de maíz transgénicas que contenían un gen de un casete de expresión de interés que estaba unido al casete de expresión del gen marcador de selección de la planta.
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Ejemplo 2
El DNA genómico se aisló de tres acontecimientos de maíz diferentes (3)-001, (3)-008, y (3)-009 y controles de maíz intransformados. Se emplearon varios métodos para aislar el gDNA, tal como el kit DNeasy (Qiagen, Valencia, CA) o el protocolo tradicional de aislamiento de DNA CTAB. Las concentraciones de DNA se determinaron utilizando Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Un total de 250 ng de gDNA se digirieron con la enzima de restricción TaqI. La reacción de digestión se purificó después utilizando el kit MinElute Reaction Cleanup (Qiagen, Valencia, CA).
Ejemplo 3
Se completaron las reacciones de extensión del cebador que utilizan el gDNA aislado y purificado. Un cebador marcado con doble biotina se sintetizó por Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA) y se utilizó para la reacción (SEQ ID NO:1 (4468-3PA01-2Btn) 5’-\Dual Biotin\-GGACAGAGCCACAAACACCACAAGA-3’). El kit Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad,CA) se utilizó para sintetizar una cadena de DNA mediante la extensión del cebador. Los siguientes reactivos: 2µL, tampón TAQ 10X platino; 1,25 µL, MgCl2 50mM; 0,8 µL, dNTP 10mM; 0,1 µL, 4468-3PA01-2Btn 10 µM; 0,1µL TAQ de platino; 14,75µL H2O; 1 µL gDNA se mezclaron en un tubo. La amplificación se completó utilizando las siguientes condiciones de reacción: 1) 94ºC 3 minutos; 2) 98ºC 10 segundos; 3) 63ºC 1 minuto; 4) 72ºC 5 minutos; 5) repetir las etapas 2 – 4 15 veces; 6) 72ºC 3 minutos; 7) mantener a 4ºC.
Ejemplo 4
Una reacción de captura se completó con 2,5 µL de perlas magnéticas de estreptavidina Dynabeads M-280 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las perlas se lavaron en un imán con tampón PBST (solución salina tamponada con fosfato y tween 20) una vez y con tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) dos veces. Después de que el sobrenadante se eliminase del imán, se añadieron 20 µL de PBS a las perlas y las perlas se mezclaron y se resuspendieron. Esta solución se añadió a una reacción de extensión de un cebador individual a una concentración 1:1, 20 µL de perlas se mezclaron con 20 µL de reacción de extensión del cebador. La solución resultante se incubó durante 1 hora con pipeteo suave a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron después sobre un imán con PBST dos veces, PBS dos veces, y H2O una vez. Todas las soluciones de lavado se separaron de las perlas.
Ejemplo 5
Un adaptador monocatenario se unió al gDNA objetivo capturado monocatenario de los sucesos (3)-001, (3)-008, y (3)-009. El adaptador monocatenario (SEQ ID NO:2 (ZC-Adp-01) 5’\5Phos\ATTGGATTCTCTGACGGTCGGACGC\36-FAM\-3’), que se sintetizó en Integrated DNA Technologies (Coralville, IA), se unió con Thermostable RNA Ligase (TRL) de Epicentre Technologies (Madison, WI). La siguiente reacción se utilizó para unir el adaptador al DNA monocatenario: 0,125µL de ZC-Adp-01 100uM; 5,0µL de PEG 8000 al 50% (peso/volumen en H2O); 1,0µL de DMSO; y 1,875µL de H2O. El coctel se mezcló y se desnaturalizó en un termociclo a 94ºC durante 5 minutos enfriándose después a temperatura ambiente. Después, 1µL de tampón 10X TRL, 0,5µL de ATP 1 mM, y 0,5µL de TRL se añadieron y se mezclaron en la solución. La solución resultante se añadió a las perlas lavadas de la reacción de captura y se incubó en un termociclo a 60ºC durante 1 hora y después a 4ºC. Las perlas se lavaron en un imán con tampón 0,1X TE varias veces, y todos los líquidos se separaron de las perlas.
Ejemplo 6
Las reacciones de PCR se completaron utilizando el kit Takara LA TAG HS PCR (Milipore, Billerica, Ma). Los siguientes cebadores se utilizaron para amplificar el suceso y la secuencia flanqueante: el cebador específico transgénico, SEQ ID NO:3 (PAT-InvPriF) 5’-CGCTTACGATTGGACAGTTGAGAGTACTG-3’) y el cebador del adaptador, SEQ ID NO:4 (Zn_Adt_PCR_01) 5’-GTCCGACCGTCAGAGAATCCAAT-3’). Los siguientes reactivos se utilizaron en la reacción de PCR: 5µL, tampón 10X LA TAQ HS; 8 µL, dNTP 2,5mM, 1µL, de cebador específico transgénico 10µM; 1µL, del cebador específico del adaptador 10µM; 0,5µL de polimerasa LA Taq HS; y 34,5µL, H2O. El coctel se añadió a las perlas lavadas de la reacción de unión y se amplificó utilizando las siguientes condiciones de la Tabla 1.
Tabla 1
Condiciones de amplificación de PCR
- 1 ciclo
- 94ºC, 2 min
- 2 ciclos
- 98ºC, 10s
- 66ºC, 1 min
- 68ºC, 5 min
9
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