CN103627808A - 一种t-发卡结构介导的测定dna侧翼未知序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种利用限制性内切酶、T-发卡结构(HSO-T)和巢式PCR扩增等技术，基于已知DNA序列扩增其5′或3′端侧翼未知序列的方法。该方法设计一条HSO-T的寡聚核苷酸序列；用单一限制性内切酶酶切基因组DNA并经rTaq或Ex Taq修饰；HSO-T接头与修饰后基因组连接；根据HSO-T序列合成引物THSO-F，根据已知DNA序列合成2条下游引物或2条上游引物；以连接物为模板，引物THSO-F和2条下游引物进行巢式PCR扩增获得5′端未知序列；同理，引物HSO-F和2条上游引物进行巢式PCR获得3′端未知序列。该技术操作简便、应用范围广、成本低廉、高效准确等优点，具有广阔应的用前景。

Description

一种T-发卡结构介导的测定DNA侧翼未知序列的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，是一种涉及限制性内切酶(Restriction Endonuclease)酶切、T-发卡结构(T-Hairpin Structure)连接和巢式PCR(Nest Polymerase Chain Reaction)扩增等技术，基于已知DNA序列测定其侧翼未知DNA序列的方法。
背景技术
在当今的“基因大战”中，新基因的发现与克隆已成为研究的热点，侧翼未知序列的扩增在分子生物学研究中占有举足轻重的地位，是结构基因组研究以及功能基因组研究的基础，可应用于启动子克隆、获得基因的排布信息、确定T-DNA插入位点、染色体定位、图位克隆、基因表达调控研究、人工染色体PAC、YAC和BAC片段搭接等。目前已有的测定侧翼未知序列的方法如随机测序法、3′-和5′-RACE法以及基因组文库进行杂交筛选等，往往工程浩大，费时费力，应用局限或特异性不高。近几年，基于PCR技术克隆侧翼未知序列的方法格外引人注目，该方法包括一类是依赖连接介导的PCR法，如T-inker PCR法等，操作过程相对复杂，且扩增长度较短，非特异扩增的风险较大；另一类是不需要酶切连接的PCR法，如Tail-PCR法等，也存在一定缺陷，比如新Alu-PCR扩增区域包含较短的Alu重复序列时，往往得不到目的产物。由本研究发明两种基于PCR的测定DNA侧翼未知序列技术，操作简便、高效准确等优点，但仍存在一些不足。一种T载体介导PCR测定侧翼未知序列方法，其连接不受限制性内切酶的限制，通用性强，但以pUCm-T为接头连接效率低，且购买pUCm-T价格较贵；另一种以发卡结构介导PCR测定侧翼未知序列，小分子核苷酸链构建的接头结构稳定，大幅度提高了PCR扩增的特异性和效率，但该方法受限制性内切酶的限制，连接位点单一，限制其应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、应用范围广、成本低廉、高效准确的T-发卡结构介导的PCR扩增方法，能够基于已知DNA序列确定其5′或3′端侧翼未知DNA序列。
本发明的技术方案：合成一条极易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列(HSO-T)，经变性、退火可形成稳定的HSO-T接头；基于发卡结构序列，合成特异性引物THSO-F，再根据已知的DNA序列，合成两条特异性下游引物和两条上游引物；选择单一限制性内切酶酶切基因组DNA，根据酶切产物末端的类型，选择rTaq或Ex Taq进行修饰，修饰后其3′端均被添加上碱基“A”；将HSO-T接头与经Taq处理的酶切产物进行连接；以连接物为模板，采用THSO-F和两条下游引物进行巢式PCR扩增，获得已知DNA序列5′端侧翼未知序列；同理，采用THSO-F和两条上游引物进行巢式PCR扩增，获得3′端侧翼未知序列：
(1)T-发卡结构及PCR引物的合成：根据原核生物回文结构的原理，合成一条极易形成发卡结构的、3′端含有“T”的寡聚核苷酸序列，命名为HSO-T(42bp)；基于HSO-T序列，合成一条特异性PCR引物，命名为THSO-F(20bp)；
HSO-T：5′-GACTACTGGCATGGGCGGATTACTCGCCCATGCCAGTAGTCT-3′
THSO-F：5′-ACTCGCCCATGCCAGTAGTC-3′
(2)上下游引物的合成：基于已知的DNA序列，合成两条扩增已知DNA序列5′端侧翼未知序列的特异性下游引物，命名为Pri-R1和Pri-R2，Pri-R2距离已知DNA序列5′端30bp以上；同理，基于已知的DNA序列，合成两条扩增3′端侧翼未知序列的上游引物，命名为Pri-F1和Pri-F2，Pri-F2距离3′端30bp以上；
(3)限制性内切酶的选择：分析已知DNA序列中限制性内切酶的酶切位点，选择在已知DNA序列中没有酶切位点的限制性内切酶；本发明可供选择的、产生5′端粘性末端的内切酶有EcoR I、HindIII、Bgl II、Sal I、BamH I、Nco I、Xba I、Xho I、Cla I、Msp I和NdeI等，产生平末端的酶有EcoR V、Sna B和Sca I等，产生3′端粘性末端的酶有Aat II、BmtI、Pst I、Sac I和Sph I等；
(4)基因组DNA的酶切：采用步骤(3)选择的单一限制性内切酶对基因组DNA进行完全酶切，纯化酶切产物；
(5)酶切产物的修饰：基因组DNA经限制性内切酶酶切后，其酶切产物两端有3种形式，分别为5′端粘性末端、3′端粘性末端和平末端；针对5′端粘性末端，利用rTaq或Ex Taq DNA聚合酶具有不依赖于模板的5′→3′核苷酸聚合活性，将粘性末端补齐，并在3′端添加上碱基“A”；针对平末端，直接利用该两种酶在3′端添加上碱基“A”；针对3′端粘性末端，利用Ex TaqDNA聚合酶具有3′→5′核苷酸外切活性，将粘性末端切齐，再利用该酶均具有不依赖于模板的5′→3′核苷酸聚合活性，在3′端添加上碱基“A”；
(6)HSO-T接头与酶切修饰产物的连接：HSO-T经变性、退火形成HSO-T接头，将其与经Taq处理的基因组酶切片段进行连接，即可作为PCR扩增的模板；
(7)目的DNA片段的PCR扩增：以步骤(6)的连接物为模板，THSO-F和Pri-R1作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，THSO-F和Pri-R2为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；根据巢式PCR原理验证扩增产物是否为目的DNA片段，从而获得已知DNA序列5′端侧翼未知序列；
同理，以步骤(6)的连接物为模板，Pri-F1和THSO-F作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，Pri-F2和THSO-F为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，从而获得已知DNA序列3′端侧翼未知序列。
THSO-PCR扩增侧翼未知DNA序列操作流程如图1所示(以Xba I酶切为例)。
本发明的有益效果：
(1)操作简便。与随机测序法相比，避免了对基因组进行大规模的测序，也无需进行繁琐的计算和排序工作，从而节省了大量的人力、时间和财力。
(2)引物特异性强。本发明通过利用寡聚核苷酸的T-发卡结构介导的PCR方法，把随机引物的扩增转变成特异性引物的扩增，大幅度提高了PCR扩增的特异性和效率。HSO-T接头是一个反向重复序列，故只需一条引物THSO-F即可用于5′端或3′端侧翼未知DNA序列。
(3)应用范围广。在已知部分DNA序列的基础上，T-发卡结构介导的PCR扩增可应用于各种不同基因的5′端或3′端侧翼未知DNA序列的测定。
(4)操作限制少。只要有90bp左右的已知DNA序列就足够操作，且在3′端碱基“T”的设计，基因组DNA酶切不受限制性内切酶的限制。
(5)结果验证简捷。巢式PCR扩增可快速验证其扩增的产物是否为目标DNA片段，具有简捷、准确和实用性强等特点。
(6)未知序列长度不限。由于基因组DNA的酶切位点是随机分布的，本发明可获取未知序列长达几Kb的片段，而且序列的准确性和真实性不会因长度的增加而受到影响，并可应用于染色体步移获得更长的DNA序列。
(7)成本低廉。本发明的核心还是简单的PCR扩增，HSO-T接头和THSO-F具有通用性，无需昂贵的仪器和试剂盒。
附图说明
图1：THSO-PCR扩增侧翼未知DNA序列示意图
图2：宇佐美曲霉E001环氧化物水解酶基因(Auseh2)5′端侧翼的测序结果
图3：宇佐美曲霉E001环氧化物水解酶基因(Auseh2)3′端侧翼的测序结果
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1
宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001Auseh2基因的5′端侧翼未知DNA序列的测定：
(1)HSO-T接头的构建：HSO-T(100μmol／L)2μL，ddH2O8μL，充分混匀；用PCR基因扩增仪94℃变性3min，缓慢降温(1℃／s)至25℃后恒温退火30min。
(2)基因组DNA酶切产物的制备：选用Xba I对宇佐美曲霉基因组DNA进行酶切。构建如下酶切体系：10×M Buffer1μL，Xba I0.5μL，0.1M BSA1μL，基因组DNA5μL，ddH2O2.5μL；37℃反应4h。
(3)酶切基因组修饰：酶切产物20μL，10×PCR Buffer2.5μL，dNTP0.5μL，rTaq或Ex Taq0.25μL，ddH2O1.75μL；使用PCR基因扩增仪在72℃反应10min；修饰后酶切产物命名为Auseh2-DM。
(4)Auseh2-DM与HSO-T接头的连接：10×T4DNA Ligase Buffer1μL，HSO-T3μL，Auseh2-DM5μL，T4DNA Ligase1μL；16℃反应4h或过夜，即可作为PCR扩增的模板。
(5)已知序列下游引物的合成：基于已知的Auseh2基因序列，合成两条扩增已知DNA序列5′端侧翼未知序列的特异性下游引物，命名为EH-R1和EH-R2，其中EH-R2距离已知DNA序列5′端30bp以上：
EH-R1：5′-TGAGGGAAGCTGTTGATG-3′
EH-R2：5′-CTCCTCGATTTGCTCGTCTGA-3′
(6)Auseh2的5′端DNA序列扩增：10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，THSO-PCR模板2μL，THSO-F0.5μL，EH-R10.5μL，ddH2O17.75μL，rTaq酶0.25μL；94℃5min，30个循环(94℃，30s；51℃，30s；72℃，1min20s)，72℃10min，经第一轮PCR扩增产物命名为5′-Auseh2-Out；10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，5′-Auseh2-Out2μL，THSO-F0.5μL，EH-R20.5μL，ddH2O17.75μL，rTaq酶0.25μL；94℃5min，30个循环(94℃，30s；51℃，30s；72℃，1min20s)，72℃10min，经第二轮PCR扩增产物命名为5′-Auseh2-In。
(7)5′-Auseh2-In的克隆和测序：将5′-Auseh2-In按照割胶回收试剂盒说明书上的操作步骤分别进行割胶回收，将纯化的产物克隆到pUCm-T载体上进行测序，Auseh2基因5′端DNA未知序列的测结果如图2所示。
实施例2
宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001Auseh2基因的3′端侧翼未知DNA序列的测定：
(1)HSO-T接头与基因组DNA酶切产物的制备及连接方法同实施例1。
(2)已知序列上游引物的合成：基于已知的Auseh2基因序列，合成两条扩增已知DNA序列3′端侧翼未知序列的特异性下游引物，命名为EH-F1和EH-F2，其中EH-F2距离已知DNA序列3′端30bp以上：
EH-F1：5′-TCATGATGCTTGCAAAGCC-3′
EH-F2：5′-GGAGAGAAGTTCCTCGAT-3′
(3)Auseh2的3′端DNA序列扩增：10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，THSO-PCR模板2μL，THSO-F0.5μL，EH-F10.5μL，ddH2O17.75μL，rTaq酶0.25μL；94℃5min，30个循环(94℃，30s；51℃，30s；72℃，1min20s)，72℃10min，经第一轮PCR扩增产物命名为3′-Auseh2-Out；10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，3′-Auseh2-Out2μL，THSO-F0.5μL，EH-F20.5μL，ddH2O17.75μL，rTaq酶0.25μL；94℃5min，30个循环(94℃，30s；51℃，30s；72℃，1min20s)，72℃10min，经第二轮PCR扩增产物命名为3′-Auseh2-In。
(4)3′-Auseh2-In的克隆和测序：将3′-Auseh2-In按照割胶回收试剂盒说明书上的操作步骤分别进行割胶回收，将纯化的产物克隆到pUCm-T载体上进行测序，Auseh2基因3′端DNA未知序列的测结果如图3所示。

Claims (2)

1.一种T-发卡结构介导的测定DNA侧翼未知序列的方法，其特征在于：合成一条极易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列(HSO-T)，经变性、退火可形成稳定的HSO-T接头；基于发卡结构序列，合成特异性引物THSO-F，再根据已知的DNA序列，合成两条特异性下游引物和两条上游引物；选择单一限制性内切酶酶切基因组DNA，根据酶切产物末端的类型，选择rTaq或Ex Taq进行修饰，修饰后其3′端均被添加上碱基“A”；将HSO-T接头与经Taq处理的酶切产物进行连接；以连接物为模板，采用THSO-F和两条下游引物进行巢式PCR扩增，获得已知DNA序列5′端侧翼未知序列；同理，采用THSO-F和两条上游引物进行巢式PCR扩增，获得3′端侧翼未知序列：
(1)T-发卡结构及PCR引物的合成：根据原核生物回文结构的原理，合成一条极易形成发卡结构的、3′端含有“T”的寡聚核苷酸序列，命名为HSO-T(42bp)；基于HSO-T序列，合成一条特异性PCR引物，命名为THSO-F(20bp)；
HSO-T：5′-GACTACTGGCATGGGCGGATTACTCGCCCATGCCAGTAGTCT-3′
THSO-F：5′-ACTCGCCCATGCCAGTAGTC-3′
(2)上下游引物的合成：基于已知的DNA序列，合成两条扩增已知DNA序列5′端侧翼未知序列的特异性下游引物，命名为Pri-R1和Pri-R2，Pri-R2距离已知DNA序列5′端30bp以上；同理，基于已知的DNA序列，合成两条扩增3′端侧翼未知序列的上游引物，命名为Pri-F1和Pri-F2，Pri-F2距离3′端30bp以上；
(3)限制性内切酶的选择：分析已知DNA序列中限制性内切酶的酶切位点，选择在已知DNA序列中没有酶切位点的限制性内切酶；本发明可供选择的、产生5′粘性末端的内切酶有EcoR I、HindIII、Bgl II、Sal I、BamH I、Nco I、Xba I、Xho I、Cla I、Msp I和Nde I等，产生平末端的酶有EcoR V、Sna B和Sca I等，产生3′粘性末端的酶有Aat II、Bmt I、Pst I、Sac I和Sph I等；
(4)基因组DNA的酶切：采用步骤(3)选择的单一限制性内切酶对基因组DNA进行完全酶切，纯化酶切产物；
(5)酶切产物的修饰：基因组DNA经限制性内切酶酶切后，其酶切产物两端有3种形式，分别为5′粘性末端、3′粘性末端和平末端；针对5′粘性末端，利用rTaq或Ex Taq DNA聚合酶具有不依赖于模板的5′→3′核苷酸聚合活性，将粘性末端补齐，并在3′端添加上碱基“A”；针对平末端，直接利用该两种酶在3′端添加上碱基“A”；针对3′粘性末端，利用Ex Taq DNA聚合酶具有3′→5′核苷酸外切活性，将粘性末端切齐，再利用该酶均具有不依赖于模板的5′→3′核苷酸聚合活性，在3′端添加上碱基“A”；
(6)HSO-T接头与酶切修饰产物的连接：HSO-T经变性、退火形成HSO-T接头，将其与经Taq处理的基因组酶切片段进行连接，即可作为PCR扩增的模板；
(7)目的DNA片段的PCR扩增：以步骤(6)的连接物为模板，THSO-F和Pri-R1作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，THSO-F和Pri-R2为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；根据巢式PCR原理验证扩增产物是否为目的DNA片段，从而获得已知DNA序列5′端侧翼未知序列；
同理，以步骤(6)的连接物为模板，Pri-F1和THSO-F作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，Pri-F2和THSO-F为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，从而获得已知DNA序列3′端侧翼未知序列。
2.根据权利要求1所述的方法，操作过程中所使用的反应体系和条件如下：
(1)HSO-T接头的构建：HSO-T(100μmol／L)2μL，ddH2O8μL，混匀；使用PCR基因扩增仪94℃变性3min，缓慢降温(1℃／s)至25℃后，恒温退火30min；
(2)基因组DNA的酶切：酶切反应体系和条件为：10×Buffer1μL，限制性内切酶0.5μL，基因组DNA5μL，ddH2O2.5μL；30或37℃反应4h；其中10×Buffer的类型和酶切温度需与所选内切酶相匹配；
(3)酶切产物的修饰：酶切产物20μL，10×PCR Buffer2.5μL，dNTP0.5μL，rTaq或Ex Taq0.25μL，ddH2O1.75μL；使用PCR基因扩增仪72℃反应10min；
(4)酶切修饰产物与HSO-T接头的连接：酶切修饰产物5μL，HSO-T接头3μL，10×Ligasebuffer1μL，T4DNA Ligase1μL；16℃反应4h或过夜，即可作为PCR扩增的模板；
(5)已知DNA序列5′端侧翼未知序列的PCR扩增：10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，连接物2μL，THSO-F0.5μL，Pri-R10.5μL，ddH2O17.75μL，rTaq酶0.25μL；第一轮PCR扩增产物命名为5′-1st-Out；10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，5′-1st-Out2μL，THSO-F0.5μL，Pri-R2 0.5μL，ddH2O17.75μL，rTaq酶0.25μL，第二轮PCR扩增产物命名为5′-2nd-In；
(6)已知DNA序列3′端侧翼未知序列的PCR扩增：10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，连接物2μL，THSO-F0.5μL，Pri-F10.5μL，ddH2O17.75μL，rTaq酶0.25μL；第一轮PCR扩增产物命名为3′-1st-Out；10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，3′-1st-Out2μL，THSO-F0.5μL，Pri-F20.5μL，ddH2O17.75μL，rTaq酶0.25μL，第二轮PCR扩增产物命名为3′-2nd-In。
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