CN105219766B - 一种三轮扩增的多重pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三轮扩增的多重PCR方法、引物及其试剂盒，以及在建立二代测序平台文库的用途。在前两轮PCR反应时，将低浓度的特异引物尽可能地消耗，以减少不同扩增子的差异、提高多重PCR产物的均一性。第三轮PCR反应时添加携带不同条形码序列的接头引物以标示不同模板，而不同的接头引物携带相同的通用扩增引物，保证不同模板扩增效率一致，以减少不同模板扩增产物的差异。不仅改善了普通多重PCR扩增均一性差的问题，而且可以快速方便的完成测序文库的构建。

Description

一种三轮扩增的多重PCR方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，特别是涉及一种通过三轮多重PCR对多个样本目标区段DNA序列进行富集，并将均一的富集片段构建成适合二代测序平台文库的技术。

背景技术

核酸是一切遗传物质的基础，自从遗传密码被破解后，研究基因型和表型的关系就是遗传学者孜孜不倦的追求。研究者希望弄清楚在基因组层面，遗传突变和生物学功能的关系，以期望于对遗传疾病、进化起源和疾病定位有新的突破。

在过去三十年，核酸测序仍要依赖以sanger测序为基础的毛细管电泳；而近十年来，二代测序技术的高速发展，使得测序越来越容易，使其花费相较于sanger测序要低至少2个数量级。伴随二代测序的大规模应用，复杂生物的全基因组测序逐渐变为常态，研究者对遗传变异进行了更深入了解，并重新定义其复杂的发病机制。然而同时检测大量样本全部序列所花费的金钱和时间，仍然让研究者难以接受。因此，研究者通常会在测序前先富集自己感兴趣的区段。

因此，结合二代测序技术，对富集目标序列进行测序的方法越来越受到关注。已报道的技术有长片段PCR、多重PCR、芯片杂交、分子内探针等。在这些技术里，多重PCR是最适合进行大规模样本目的片段测序的，因为其操作简单，设计灵活，价格低廉，对DNA模板需求量小。根据文献“Microdroplet-based PCR enrichment for large-scale targetedsequencing”(Nature biotechnology,2009,27(11):1025-1031)和“Nested Patch PCRenables highly multiplexed mutation discovery in candidate genes”(Genomeresearch,2008,18(11):1844-1850)提供的数据，三轮多重PCR的均一性与一些已公布的多重PCR方法相比毫不逊色，同时不需要昂贵硬件设施或者多步酶反应。例如，需要多步酶反应的补丁PCR，其均一性为75％扩增子差异在50倍以内；需要昂贵硬件的液体杂交和分子内探针则分别是80％扩增子差异在25倍以内和88％扩增子差异在100倍以内。

但是利用多重PCR进行大规模样本目标区段富集仍然有两个挑战，第一个挑战是对于一个给定反应，反应内不同扩增子的均一性差。多重PCR中，由于引物二聚体或者错配的形成，不但引入了大量非特异扩增产物，而且不同目标片段的拷贝数均一性有很大差异，所以多重PCR一般被限制为10-20对引物扩增，超过该限制则无法得到均一的产物。第二个挑战是不同样本的PCR产物总量之间的均一性差异，不同样本的产物总量在测序前需要进行定量均一化，否则不同样本所占测序通量会发生偏差，导致测序资源的浪费。提高多重PCR均一化能力，是提高测序效率和突变检测能力的关键，但是有效的多重PCR策略仍没有见到文献报道。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是提供一种三轮多重PCR建立均一的适合二代测序平台文库的方法，以克服现有多重PCR技术中不同样本和位点不均一的难题，以及检测方案操作过程复杂、特异性差的缺陷。

技术方案

本发明的第一个方面是提供一种三轮扩增的多重PCR方法，包括利用3’端与目标区段DNA序列互补的特异序列及5’端通用序列所构成的上下游特异引物完成第一轮扩增，利用第一轮扩增产物作为模板的第二轮扩增，将第二轮扩增产物作为模板、利用从5’-3’端依次为二代测序接头序列、条形码(即barcode)序列、和通用序列所构成的上下游接头引物，完成第三轮扩增；其中，第二轮扩增不额外添加引物。

上述的三轮多重PCR方法的优选方式为，在同一轮PCR反应中所述的上下游特异引物大于或等于20对，或者，大于或等于30对，再或者大于或等于37对。

本发明的第二个方面是提供上述的方法在构建二代测序平台文库中的应用。

本发明的第三个方面是提供一种三轮扩增的多重PCR引物，包括一套针对多个目标区段DNA序列设计的3’端特异序列及其5’端分别添加不同的通用序列所构成的上下游特异引物，和一套3’端与通用序列互补且5’端为测序接头序列的上下游接头引物。

本发明的第四个方面是提供一种用于建立二代测序平台文库的三轮多重PCR试剂盒，包括上述第三方面的三轮多重PCR引物。所述试剂盒还可以包括DNA样本提取试剂、Taq酶、dNTPs、二价镁离子、和PCR体系缓冲液中的一种或几种。

本发明的第五个方面是提供上述第三方面的三轮扩增的多重PCR引物在建立二代测序平台文库中的用途。

本发明的第六个方面是提供一种二代测序平台文库的构建方法，包括如下步骤：

(1)在针对目标区段设计的特异引物序列的上下游5’端分别添加上游通用序列和下游通用序列，获得多对上下游特异引物；

(2)第一轮PCR反应，利用多对特异引物对目标区段进行有限循环数的扩增；

(3)利用第一轮PCR扩增产物的原液或者稀释液作为第二轮反应的模板和引物，进行第二轮PCR反应；

(4)第二轮反应结束后，利用第二轮反应液为模板，添加上下游接头引物进行第三轮PCR，将不同样本所获得的第三轮扩增产物混合，即可构成二代测序平台文库。

上述的二代测序平台文库的构建方法的优选方式为，所述的第一轮PCR中上下游特异引物数大于或等于37对。如上文所述，多重PCR的引物对数目，可以根据实际需要选择。

进一步地，本发明采用的具体方式，举例而言，可以包括以下步骤：

特异引物的设计：针对需要测序的目标区段序列设计引物，根据NCBI数据库中的序列，使用Primer3在线软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)进行设计，并人工在设计的引物上下游5’端分别添加上游通用序列和下游通用序列，然后进行引物合成。

接头引物的设计：接头引物包含三部分序列，从5’端开始依次是二代测序接头引物、条形码(即barcode)序列、通用序列。为了区分不同模板身份，每一对接头引物的条形码序列不同。

三轮多重PCR第一轮反应，利用多对特异引物进行反应，进行有限的循环数对目标区段进行富集。例如，PCR扩增体系具体为：25ng DNA加入到10μL Taq酶体系中，其中Taq酶体系包含0.005μM每对特异引物，200μM dNTPs，10μM MgSO₄，1X PCR Buffer，1U Taq酶，并使用矿物油覆盖；同时设阴性对照，反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸30s，20个循环。上述体系和反应程序可以依照通常的多重PCR反应的常规进行适当调整，例如变性、复性、延伸的温度和时间，以及循环数，使之能够达到对数线性扩增、或者均一性等考量的要求。

发明人通过多次试验，测试第一轮多重PCR所能够允许的引物对数，亦即多重PCR反应的“重”数，发现，在20重(即20对引物同时在一个反应体系中扩增)以下、20-30重，以及最多测试了37重的情形下，都能够获得本发明均一的适合二代测序的平台文库，获得所预期的技术效果。尽管未进行更多重PCR的试验，但是，发明人相信利用本发明的方法，40重、50重、甚至80重或者100重，都是可能成功实现本发明构思的。更多重的反应或许需要对多重PCR的反应体系或者反应条件做出优选，但是，应当仍然是在本发明的技术方案之内的优选方式。同时，对于多重PCR的重数，并非影响最终平台文库的构建及其均一性的决定或唯一因素，所以，不应当构成对本发明构思的限制，实施本发明过程中，可以根据实际需要选择重数。

反应结束后，取出第一轮部分PCR的原液或者原液稀释液作为第二轮反应的模板进行反应。例如，PCR扩增体系具体为：1μL第一轮PCR产物原液或者2μL第一轮PCR产物稀释液加入到第二轮10μL Taq酶体系中，其中Taq酶体系包含200μM dNTPs，10μM MgSO₄，1X PCRBuffer，1U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸30s，40个循环。同样，上述体系和反应程序可以依照通常的多重PCR反应的常规进行适当调整，例如变性、复性、延伸的温度和时间，以及循环数，使之能够达到对数线性扩增、或者均一性等考量的要求。

第二轮反应目的是尽量消耗特异引物，以减少不同扩增子间产物差异，保证不同片段的有效扩增，打破了常规多重PCR对引物数目的限制。在上述的体系中，引物对数目可以达到XX对。

第二轮反应结束后，添加包含接头引物的第三轮体系到第二轮反应液中，使接头引物添加到目的片段的两端。例如，第三轮PCR扩增体系具体为：10μL Taq酶体系添加到第二轮PCR产物中，其中第三轮Taq酶体系包含0.5μM上下游接头引物，200μM dNTPs，10μMMgSO₄，1X PCR Buffer，1U Taq酶。反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸1min，15个循环。同样地，上述体系和反应程序可以依照通常的多重PCR反应的常规进行适当调整，例如变性、复性、延伸的温度和时间，以及循环数，使之能够达到对数线性扩增、或者均一性等考量的要求。

各个样本的第三轮的扩增产物合并后，测序文库构建即可完成，直接用于后续的二代测序反应。由于本发明的整体方案设计，多个样本在完成三轮多重PCR之后，仍然保持了各个样本目标序列之间的均一性、以及各个样本第三轮扩增产物之间的均一性，所以，可以将多达数百个乃至上千个以上样本的扩增产物等量，比如，等体积地，直接混合，构成测序文库，直接用于后续二代平台测序。

在试验中，发明人发现，若是省略本发明的第二轮PCR，而在第一轮PCR之后直接加入接头引物进行下一轮PCR，那么，由于反应体系中有超过20对引物，不可避免产生大量引物二聚体或者错配，且不同片段的均一性有很大差异，无法作为二代测序文库。所以在本领域，多重PCR一般被限制为10-20对引物扩增，超过该限制则无法得到均一的产物。

发明人惊奇地发现，若在第一轮和最后一轮PCR之间，加一轮PCR，该第二轮PCR不额外添加引物，以便尽可能消耗掉第一轮留下的低浓度的特异性引物，则可以减少不同扩增子间产物拷贝数的差异。随后在第三轮PCR添加含二代测序接头的接头引物，扩增前两轮的PCR产物，即可以完全达到二代测序建库对片段均一性的要求。

有益效果

本发明提供了现有技术文献中所缺乏的利用三轮多重PCR对多个目标区段进行富集的方案。通过三轮多重PCR的前两轮极大的消耗了特异引物，保证了不同位点间扩增子的均一性；同时扩增的引物对数目远超普通多重PCR，提高了测序的效率和分辨率。在第三轮扩增时，不同样本的接头引物只有条形码序列不同，以标示不同模板，而通用序列一致，保证了不同模板在第三轮中扩增效率的一致，有效地减轻了模板序列之间的差异所导致均一性问题。经过三轮扩增后，不仅不同位点和模板的差异被有效地控制，而且扩增的产物无需进一步处理，即可通过简单混合，构建为适合二代测序平台的文库，直接用于后续测序，有效的节省了研究者的时间。

本发明的多重PCR方案通过与二代测序结合，实现了针对上百个样本进行的平行测序分型，与一般测序方案只针对2-10个样本测序相比，极大地节约了测序通量，有效地提高了测序效率。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明的引物示意图。图中，101.上游接头引物，102.下游接头引物，103.上游特异引物，104.上游特异引物。

图2是本发明前两轮的引物示意图。图中，201.上游特异引物，202.下游特异引物，203.上游特异引物序列，204.下游特异引物序列，205.通用引物上游序列，206.通用引物下游序列。

图3是本发明第三轮的引物示意图。图中，301.上游接头引物，302.下游接头引物，303.二代测序上游接头引物，304.二代测序下游接头引物，305.上游接头引物条形码序列，306.下游接头引物条形码序列，307.通用引物上游序列，308.通用引物下游序列，309.前两轮特异引物扩增产物。

图4是本发明利用Ion torrent PGM平台检测单核苷酸多态性的结果图。图中，401.扩增子测定序列数(reads)取10的对数值，402.扩增子数目。

图5是本发明利用Ion torrent PGM平台检测单核苷酸多态性的样本比例图。图中，501.样本所占百比例，502.均一化的测定序列数，即将每个样本的总测定序列数和所有样本的平均测定序列数之比，以计算每个样本针对平均测定序列数的倍数(平均测定序列数为4593reads)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆操作手册,或按照试剂制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂有限公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs均购自美国Promega公司，引物由上海翰宇生物科技有限公司合成，人血细胞DNA抽提采用爱思进生物技术(杭州)有限公司(Axygen公司)血基因组小量制备试剂盒，琼脂糖凝胶回收测序文库使用天根生化科技有限公司的回收试剂盒，测序试剂盒Ion PGMTM Sequencing 200Kit v2购自Thermo Fisher Scientific公司。实施例1:

利用Ion torrent PGM平台检测单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)。

序列查找和引物设计：根据NCBI的SNP数据库，查找出人类基因组中共计37段携带SNP位点的目标区段序列，使用Primer3在线软件按照一般规则进行引物设计，并人工在设计的引物上下游5’端分别添加上游通用序列和下游通用序列，然后用化学方法合成上下游特异引物(表1)。

表1.SNP检测特异引物

DNA抽提：757组人血细胞采用血基因组小量制备试剂盒，按照说明书进行抽提得到DNA，以0.8％琼脂糖凝胶电泳确定DNA质量和浓度。757组DNA与接头引物对应如表2和表3所示。

表2.样本编号和接头引物对应表

对757组样本DNA分别进行三轮PCR扩增。

第一轮PCR选取表1中所有37对上下游特异引物，混合在同一反应体系中作为扩增引物，对单个样本进行37重PCR反应。PCR扩增体系具体为：每个样本的25ng DNA分别加入到各自的10μL Taq酶体系中，其中Taq酶体系包含0.005μM每对特异引物，200μM dNTPs，10μMMgSO₄，1X PCR Buffer，1U Taq酶，并使用矿物油覆盖；同时设阴性对照，反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸30s，20个循环。

第二轮PCR选取第一轮PCR产物作为模板和引物，PCR扩增体系具体为：1μL第一轮PCR产物分别加入到各自的第二轮10μL Taq酶体系中，其中Taq酶体系包含200μM dNTPs，10μM MgSO₄，1X PCR Buffer，1U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸30s，40个循环，

第三轮PCR配制10μL Taq酶体系添加到各自的第二轮PCR产物中，其中第三轮Taq酶体系包含0.5μM上下游接头引物，200μM dNTPs，10μM MgSO₄，1X PCR Buffer，1U Taq酶。反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸1min，15个循环。

757个样本的接头引物不同，以区分不同模板的文库(表3)。

表3.接头引物序列表

三轮扩增结束后，将757个样本的扩增产物等体积均匀混合在一起，作为构建完成的测序文库，对757个样本同时进行Ion torrent PGM平台测序分型。测序文库按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行纯化。纯化后的文库按照PGM商业化操作流程进行后续乳液PCR和富集。富集后的产物利用318芯片和Ion PGMTM Sequencing 200Kit v2进行二代测序，步骤严格按照供应商要求使用。

测序结果如图4所示。通过检测不同扩增子的测定序列数(reads)来判断三轮多重PCR的均一性。

757个样本的所有扩增子在PGM上进行测序的结果表明，98.6％的扩增子至少有1个测定序列数(reads)，而91.8％的扩增子有大于等于15个测定序列数。并且，所有本实施例检测到的扩增子中，大部分测定序列数差异在1-2个数量级。92.3％的扩增子差异在50倍以内。证实该三轮多重PCR的均一性与背景技术中一些已公布的多重PCR方法相比毫不逊色(表4)。

图5的结果显示，不仅针对每一个扩增子的均一性差异被缩小，针对每一个样本的均一性差异也同样减小。757个样本中，98.4％的样本差异在30倍以内，保证了每一个样本都有很好的分辨率。

表4.不同扩增方案均一性比较

扩增方法	均一性
		实施例1的三轮多重PCR	92.3％的扩增子差异在50倍以内
High-plex PCR	98.33％在100倍以内
		分子内探针	58％在10倍以内，88％在100倍以内
补丁PCR	75％在50倍以内
		液体杂交	80％在25倍以内

Claims (10)

1.一种三轮扩增的多重PCR方法，包括利用3’端与目标区段DNA序列互补的特异序列及5’端通用序列所构成的上下游特异引物完成第一轮扩增，利用第一轮扩增产物作为模板的第二轮扩增，将第二轮扩增产物作为模板、利用从5’-3’端依次为二代测序接头序列、条形码序列、和通用序列所构成的上下游接头引物，完成第三轮扩增；其中，第二轮扩增不额外添加引物。

2.根据权利要求1所述的三轮多重PCR方法，其特征在于，在同一轮PCR反应中所述的上下游特异引物大于或等于20对。

3.根据权利要求2所述的三轮多重PCR方法，其特征在于，在同一轮PCR反应中所述的上下游特异引物大于或等于37对。

4.根据权利要求3所述的三轮多重PCR方法，其特征在于，在同一轮PCR反应中所述的上下游特异引物大于或等于37对。

5.权利要求1所述的方法在构建二代测序平台文库中的应用。

6.根据权利要求1所述的三轮多重PCR方法，其特征在于，设计的引物，包括一套针对多个目标区段DNA序列设计的3’端特异序列及其5’端分别添加不同的通用序列所构成的上下游特异引物，和一套3’端与通用序列互补且5’端为测序接头序列的上下游接头引物。

7.根据权利要求6所述的三轮多重PCR方法，其特征在于，三轮扩增的多重PCR引物用于建立二代测序平台文库的三轮多重PCR试剂盒。

8.根据权利要求6所述的三轮多重PCR方法，其特征在于，三轮扩增的多重PCR引物在建立二代测序平台文库中的用途。

9.一种二代测序平台文库的构建方法，包括如下步骤：

(1)在针对目标区段设计的特异引物序列的上下游5’端分别添加上游通用序列和下游通用序列，获得多对上下游特异引物；

(2)第一轮PCR反应，利用多对特异引物对目标区段进行有限循环数的扩增；

(3)利用第一轮PCR扩增产物的原液或者稀释液作为第二轮反应的模板和引物，进行第二轮PCR反应；

(4)第二轮反应结束后，利用第二轮反应液为模板，添加上下游接头引物进行第三轮PCR，将不同样本所获得的第三轮扩增产物混合，即可构成二代测序平台文库。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的第一轮PCR中上下游特异引物数大于或等于37对。