CN108374203B

CN108374203B - 一种用于双向测序的扩增子文库的构建方法

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Publication number: CN108374203B
Application number: CN201810172791.4A
Authority: CN
Inventors: 易健明; 蔡万世; 屈武斌; 杭兴宜; 王瑞超
Original assignee: Igenetech Biotech Beijing Co ltd
Current assignee: Igenetech Biotech Beijing Co ltd
Priority date: 2018-03-01
Filing date: 2018-03-01
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2038-03-01
Also published as: CN108374203A

Abstract

本发明属于高通量测序领域，本发明涉及一种用于双向测序的扩增子文库的构建方法、由该构建方法获得的扩增子文库、以及利用该扩增子文库进行双向测定的方法。本发明提供的文库构建方法使用的试剂更少，成本更低，速度更快。此外，使用本发明所述方法构建的文库中也存在着4种类型的文库，可以实现双向测序，得到高质量的测序数据。

Description

一种用于双向测序的扩增子文库的构建方法

技术领域

本发明属于高通量测序领域。具体而言，本发明涉及一种用于双向测序的扩增子文库的构建方法、由该构建方法获得的扩增子文库、以及利用该扩增子文库进行双向测定的方法。

背景技术

Ion torrent测序仪是赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)的一款商业测序仪，它的核心技术是使用半导体技术将测序过程中产生的化学信号直接转换为数字信号，从而实现碱基序列的准确测序。与其他测序仪相比，Ion torrent测序仪采用天然底物和聚合酶，无需荧光修饰的试剂、光学系统和照相系统，具有测序信号读取快、测序周期短、快速、灵活、可扩展等优势，已经成为主流的测序仪之一，广泛应用于农学、法医、医学和科研等众多领域。

目前，应用于Ion torrent测序仪的主流文库构建方法是Life Technology公司开发的扩增子文库构建技术，其文库构建流程如图1所示：第1步：采用多重PCR技术对多个目标区域进行扩增，得到扩增子产物；第2步：对扩增子产物进行酶消化，特异性去除扩增子产物两侧的部分引物序列；第3步：采用DNA连接酶，将测序接头序列A和P1连接到扩增子产物的两侧，得到扩增子文库；第4步：采用磁珠试剂对扩增子文库进行纯化。在第3步，由于测序接头A和P1随机连接到扩增子产物的两侧，因此从理论上讲，构建好的文库存在4种类型：第1种，两侧均为A接头；第2种，两侧均为P1接头；第3种，左侧为A接头，右侧为P1接头；第4种，左侧为P1接头，右侧为A接头。其中，第1种文库和第2种文库在后续乳液PCR扩增及测序过程中，会被过滤，因此为无效的文库。与Illumina测序仪不同，Ion torrent测序仪只能从A接头测序。因此，如果文库中同时存在第3种文库和第4种文库，便可以实现双向测序，得到该文库的正反链序列信息，然后通过内置的程序对正反链碱基序列进行校正，提高测序数据的准确性。如果文库中只存在第3种文库或者第4种文库，便只能进行单向测序，得到正链或者反链的序列信息，由于无法进行正反链序列的校正，因此测序数据往往偏好性较强，测序数据准确度较低，往往无法满足后续数据的深度分析。因此，在Ion torrent测序平台上构建得到的文库，需要同时具有第3种和第4种结构，才能实现双向测序，得到高质量的测序数据，满足后续的数据分析要求。

尽管Life Technology公司已经开发出针对Ion torrent测序平台的扩增子文库构建方法，但是该方法在酶消化和测序接头连接过程中还存在诸多缺陷，例如使用较多的反应试剂，需要对扩增子产物进行消化切割以及采用酶连接处理，成本较高，且速度较慢。另外，除了Life Technology公司已经开发出的扩增子文库构建方法而外，本领域也亟需一种可替代的扩增子文库构建方法，由此可以为本领域技术人员提供更多的选择。

综上，本领域亟需一种可替代的扩增子文库的构建方法，该方法不仅简便、快捷，而且成本低廉。

发明内容

为解决背景技术部分所述及的技术问题，本发明人经过反复的研究，开发出了另外的可替代Life Technology公司开发出的扩增子文库构建方法的方法，由此完成本发明。具体地，本发明提供了一种用于双向测序的扩增子文库的构建方法，其主要流程如下：采用多重PCR技术对多个目标区域进行扩增，得到扩增子产物；采用磁珠纯化扩增子产物；采用接头PCR反应，将上下游测序接头序列引入到扩增子的两侧，得到扩增子文库；采用磁珠纯化扩增子文库。

因此，在第一方面，本发明涉及一种扩增子文库的构建方法，所述扩增子文库用于双向测序，且所述构建方法包括以下步骤：

S1：采用多重PCR反应对多个目标序列进行扩增，得到扩增子产物，其中所使用的多重上游引物和多重下游引物的5’端序列为相同的通用序列，所述通用序列具有14-35bp的长度，且不能与目标基因组的序列互补配对，并且所使用的多重上游引物和多重下游引物的3’端序列为与目标序列互补配对的特异性序列；

S2：采用磁珠试剂对扩增子产物进行纯化，以除去扩增后剩余的原料；

S3：采用接头PCR反应，将上游测序接头序列和下游测序接头序列引入到扩增子产物的两侧，得到扩增子文库，其中所述上游测序接头序列和所述下游测序接头序列各自的3’端序列均为S1步骤中述及的通用序列或者是该通用序列的3’端截短序列；

S4：采用磁珠试剂对扩增子文库进行纯化，以除去扩增后剩余的原料。

在第二方面，本发明涉及一种用于双向测序的扩增子文库，所述扩增子文库使用本发明第一方面的扩增子文库的构建方法构建而成。

在第三方面，本发明涉及一种双向测序方法，所述方法包括以下步骤：

S4：采用磁珠试剂对扩增子文库进行纯化，以除去扩增后剩余的原料；

S5：对在S4步骤中经纯化的扩增子文库进行双向测序

本发明提供的扩增子文库的构建方法与Life Technology开发的扩增子文库的构建方法相比，主要存在以下差异：在得到第1轮的扩增子产物之后，采用第2轮PCR反应快速高效将测序接头引入到扩增子产物的两侧得到文库，无需对扩增子产物进行酶消化切割以及采用酶连接处理。因此，本发明提供的文库构建方法使用的试剂更少，成本更低，速度更快。此外，使用本发明所述方法构建的文库中也存在着4种类型的文库，可以实现双向测序，得到高质量的测序数据。

附图说明

图1是Life Technology公司的扩增子文库构建流程。

图2是本发明的扩增子文库构建流程。

图3本发明使用的接头序列的结构。

具体实施方式

下面对本发明的用于双向测序的扩增子文库的构建方法、由该构建方法获得的扩增子文库、以及利用该扩增子文库进行双向测定的方法进行更为详细的描述。应注意，上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。

如上所述，本发明的目的是找到另外的可替代Life Technology公司开发出的扩增子文库的构建方法。通过反复研究，本发明人开发出了一种用于双向测序的扩增子文库的构建方法，其主要流程如下：采用多重PCR技术对多个目标区域进行扩增，得到扩增子产物；采用磁珠纯化扩增子产物；采用接头PCR反应，将Ion torrent平台的测序接头序列A和P1引入到扩增子的两侧，得到扩增子文库；采用磁珠纯化扩增子文库。

S1：采用多重PCR反应对多个目标序列进行扩增，得到扩增子产物，其中所使用的多重上游引物和多重下游引物的5’端序列为相同的通用序列(GSP序列)，所述通用序列具有14-35bp的长度，且不能与目标基因组的序列互补配对，并且所使用的多重上游引物和多重下游引物的3’端序列为与目标序列互补配对的特异性序列；

在一个实施方案中，所述通用序列为SEQ ID NO.1，如下：5’CTACACGACGCTCTTCCGATCT3’。

在一个实施方案中，所述双向测序将在Ion torrent测序仪进行，此时所述上游测序接头序列和所述下游测序接头序列各自的5’端序列均为Ion torrent平台提供的序列。

如上所述，所述上游测序接头序列和所述下游测序接头序列各自的3’端序列可以为S1步骤中述及的通用序列或者是该通用序列的3’端截短序列。在此所谓“该通用序列的3’端截短序列”，是指可以自该通用序列3’端截去部分碱基，例如1-10个碱基，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碱基。

在一个具体实施方案中，所述上游测序接头序列为SEQ ID NO.2，如下：5’CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGATCTACACGACGCTC TTCCGATCT3’，所述下游测序接头序列为SEQ ID NO.3，如下：CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATCTACACGACGCTCTTCCGATCT。

在一个实施方案中，在S2和S4步骤中，采用目前商业化的磁珠试剂对PCR产物进行纯化，从而去除扩增后剩余的原料，例如DNA聚合酶、引物、盐离子、底物等。

在第二方面，本发明涉及一种用于双向测序的扩增子文库，所述扩增子文库使用本发明第一方面所述的扩增子文库的构建方法构建而成。该扩增子文库可以采用例如IonTorrent测序仪进行双向测序，由此获得高质量的测序数据。

在本发明中，最终构建的扩增子文库包含4种类型：第1种，两侧均为上游测序接头序列；第2种，两侧均为下游测序接头序列；第3种，左侧为下游测序接头序列，右侧为上游测序接头序列；第4种，左侧为上游测序接头序列，右侧为下游测序接头序列。其中第1种文库和第2种文库为无效文库，在后续上机测序的过程中会自动被过滤；第3种文库和第4种为有效文库，分别实现正负链的测序，从而实现双向测序。

在第三方面，本发明涉及一种双向测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1：采用多重PCR反应对多个目标序列进行扩增，得到扩增子产物，其中所使用的多重上游引物和多重下游引物的5’端测序为相同的通用序列，所述通用序列具有14-35bp的长度，且不能与目标基因组的序列互补配对，且所使用的多重上游引物和多重下游引物的3’端序列为与目标序列互补配对的特异性序列；

S5：对在S4步骤中纯化的扩增子文库进行双向测序。

在一个具体实施方案中，所述上游测序接头序列为SEQ ID NO.2，如下：5’CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGATCTACACGACGCTCTTCCGATCT3’，所述下游测序接头序列为SEQ ID NO.3，如下：CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATCTACACGACGCTCTTCCGATCT。

本发明提供的扩增子文库构建方法与Life Technology开发的扩增子文库构建方法相比，主要存在以下差异：在得到第1轮的扩增子产物之后，采用第2轮PCR反应快速高效将测序接头引入到扩增子产物的两侧得到文库，无需对扩增子产物进行酶消化切割以及采用酶连接处理。因此，本发明提供的文库构建方法使用的试剂更少，成本更低，速度更快。此外，使用本发明所述方法构建的文库中也存在着4种类型的文库，可以实现双向测序，得到高质量的测序数据。本发明方法简化了文库构建的流程，减少了文库构建所需要的试剂，提高了文库构建的效率。

下面结合附图以及实施例对本发明进行更为具体和详细的描述。

实施例

本实施例具体描述的扩增子文库的构建方法参见图2。在该实施例中，构建了单个反应管100重扩增子文库，以及采用Ion torrent测序仪进行双向测序。

第1步：100重PCR反应得到扩增子产物

1.1本步操作的反应体系如下表1所示：DNA聚合酶、缓冲液和dNTP均为NEB的产品(货号M0493L)；模板是从唾液样本提取得到的gDNA；多重引物的浓度为20mM，引物序列分为5’端的通用序列和3’端的特异性序列。所有上游引物和下游引物其5’端的通用序列均为5’CTACACGACGCTCTTCCGATCT3’(SEQ ID NO.1)。100对多重引物3’端的特异性序列如表2所示。

表1.第1步PCR反应的体系

试剂	体积(μl)
		去核酸酶水	9
5×Q5反应缓冲液	5
		10mM dNTP	1
引物混合物(20mM)	4
		模板DNA(10ng/μl)	5
Q5Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase(2U/μl)	1

表2. 100重多重引物3’端的特异性序列(SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.203)

1.2第1步多重PCR反应条件如下表3所示进行操作。

表3. 100重扩增子文库扩增的反应条件

第2步：磁珠纯化第1步的100重扩增子产物

向25μl 100重扩增子产物中加入40μl室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次。室温孵育10min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min。移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s。之后移除上清，再加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。之后室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发。然后将PCR管从磁力架取下，加入22μl去核酸酶水，移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min，之后将PCR管重新置于磁力架上，静置3min，再用移液器吸取17μl上清液，转移到新的200μl PCR管内，管内上清液为100重扩增子产物。

第3步：第2轮接头PCR反应

3.1第2轮接头PCR的反应体系如下表4所示，DNA聚合酶为KAPA Biosystems公司的产品(货号KK2600)；上游接头A的序列为5’CCATCTCATCCCTGCGTGT CTCCGACTCAGCTAAGGTAACGATCTACACGACGCTCTTCCGATCT3’(SEQ ID NO.2)，下游接头P1的序列为CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTC GGTGATCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.3)。DNA模板为第2步磁珠纯化后的扩增子产物。

表4.第2轮接头PCR的反应体系

3.2接头PCR反应按照下表的条件运行。

表5.接头PCR的反应条件

第4步：磁珠纯化第2轮PCR产物

向25μl PCR产物中加入30μl室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次。室温孵育10min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min。移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s。之后移除上清，再加入180μl80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。之后室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发。然后将PCR管从磁力架取下，加入22μl去核酸酶水，移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min，之后将PCR管重新置于磁力架上，静置4min，再用移液器吸取20μl上清液，转移到新的200μl PCR管内，管内上清液为扩增子文库。

第5步：对文库进行二代测序并进行数据分析

采用赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)公司的Ion torrent测序平台对上述扩增子文库进行二代测序，对得到的测序数据进行统计分析，结果如下表6所示：文库的碱基质量评分(％)为85.72％，比对率为93.42％，覆盖率为100％，20％平均测序深度为96.75％，均一性高。文库的各项数据指标表现优异。

表6. 100重扩增子文库的测序数据统计结果

上文已经通过一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种扩增子文库的构建方法，其特征在于，所述扩增子文库用于双向测序，且所述构建方法包括以下步骤：

其中所述双向测序将在Ion torrent测序仪上进行，此时所述上游测序接头序列和所述下游测序接头序列各自的5’端序列均为Ion torrent平台提供的序列。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其中所述通用序列为SEQ ID NO.1。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其中所述上游测序接头序列为SEQ ID NO:2，并且所述下游测序接头序列为SEQ ID NO:3。

4.一种用于双向测序的扩增子文库，其特征在于，所述扩增子文库使用权利要求1至3任一项所述的扩增子文库的构建方法构建而成。

5.一种双向测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S5：对在S4步骤中纯化的扩增子文库进行双向测序；

其中所述双向测序在Ion torrent测序仪上进行，此时所述上游测序接头序列和所述下游测序接头序列各自的5’端序列均为Ion torrent平台提供的序列。

6.根据权利要求5所述的双向测序方法，其中所述通用序列为SEQ ID NO.1。

7.根据权利要求5或6所述的双向测序方法，其中所述上游测序接头序列为SEQ ID NO:2，并且所述下游测序接头序列为SEQ ID NO:3。