CN107236800A - 一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记及其应用 - Google Patents

一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记及其应用，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明所述分子标记具有良好的敏感性、特异性和重复性，具有敏感、特异、快速的优点，为我国动物源细菌磺胺类药物耐药基因的检测及流行病学调查提供新的技术手段；(2)本发明所述分子标记的应用方式，无需质粒DNA的提取，且经过三轮PCR可准确检测动物源性葡萄球菌磺胺类药物的耐药基因。

Description

一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记及其 应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，具体为一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记及其应用。
背景技术
随着动物养殖业向规模化、集约化方向发展，饲养密度提高，应激因素增多，为疾病的流行提供了有利条件，导致动物细菌性疾病的危害加重。国内外大量资料表明，多年来由于临床抗生素广泛及不合理的使用，给细菌带来了选择压力，其最终结果是选择性保留了耐药能力强的致病菌，给感染性疾病的治疗带来了严重的危机。细菌耐药性已成为全球关注的热点。
我国已成为世界上细菌耐药性最严重的国家之一。1997年解放军总医院报道大肠埃希菌对环丙沙星的耐药率从1994年的41.9％上升至1997年的60.4％。王红宁、朱力军、高松等的研究表明，鸡源、猪源大肠杆菌对常用抗菌药如氨基糖苷类、氯霉素类、磺胺类等产生的耐药率在38～95％，并且有70.2％以上的菌株是多重耐药；郝秀红、马聪等对临床病原菌的研究发现，大肠杆菌、沙门氏菌以及金葡萄球菌对庆大霉素、头孢唑啉、青霉素的平均耐药率超过50.0％。
分子生物学方法在细菌耐药性方面的应用非常广泛，与传统的表型检测相比，它更能准确反映耐药性的传播和流行趋势。综合比较几种基因检测方法，PCR方法因其操作简单、结果准确可靠、成本较低等优点，在现有技术条件下，该方法在临床上的应用前景将会非常广阔。但是单基因pcr方法的最大不足之处在于检测的指标过于单一，而多重PCR具有高效性，即在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个目标基因进行分型，特别是用一滴血就能检测多种病原体。同时，多重PCR方法经济简便，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。
PCR检测试剂盒能快速、准确地对细菌耐药性进行检测，但目前国内还未见动物源细菌耐药性检测试剂盒的研究和报道。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种快速、稳定的动物源细菌耐药性的检测方法，本发明提供了一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记及其应用。
技术方案：一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
表1分子标记序列
名称 序列(5，-3，) SEQ ID NO.
P1-F NH2-T(10)CATCATTTTCGGCATCGTC 1
P1-R TCTTGCGGTTTCTTTCAGC 2
P2-F NH2-T(10)AGATGTGATTGATTTGGGAGC 3
P2-R TAGTTGTTTCTGGATTAGAGCCT 4
P3-F NH2-T(10)CATTGCCTGGTTGCTTCAT 5
P3-R ATCCGACTCGCAGCATTT 6
所述分子标记在制备检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LA Taq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
优选的，所述试剂盒检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的葡萄球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入10～60μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
有益效果：(1)本发明所述分子标记具有良好的敏感性、特异性和重复性，具有敏感、特异、快速的优点，为我国动物源细菌磺胺类药物耐药基因的检测及流行病学调查提供新的技术手段；(2)本发明所述分子标记的应用方式，无需质粒DNA的提取，且经过三轮PCR可准确检测动物源性葡萄球菌磺胺类药物的耐药基因。
附图说明
图1是实施例1～3检测结果图；
其中，1为分子量为1500bp的Maker；3为实施例1PCR产物电泳结果；4为实施例2PCR产物电泳结果；5为实施例3PCR产物电泳结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
所述分子标记在制备检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LA Taq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
所述试剂盒检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的葡萄球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入10μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
实施例2
一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
所述分子标记在制备检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LA Taq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
所述试剂盒检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的葡萄球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入30μL60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释350倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
实施例3
一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
所述分子标记在制备检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LA Taq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
所述试剂盒检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的葡萄球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入60μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州乔纳森新材料
科技有限公司
<120> 一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catcattttc ggcatcgtc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcttgcggtt tctttcagc 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agatgtgatt gatttgggag c 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tagttgtttc tggattagag cct 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cattgcctgg ttgcttcat 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atccgactcg cagcattt 18

Claims (9)

1.一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
3.权利要求1或2所述分子标记在制备检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LA Taq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测葡萄球菌磺胺类药物耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的葡萄球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入10～60μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
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