CN102485894A

CN102485894A - 两个棉花纤维伸长期优势表达的启动子及应用

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Publication number: CN102485894A
Application number: CN2010105823878A
Authority: CN
Inventors: 涂礼莉; 李阳; 张献龙; 朱龙付; 邓锋林
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2010-12-06
Filing date: 2010-12-06
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2030-12-06
Also published as: CN102485894B

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域。特征是：克隆鉴定了海岛棉GbEXPA1和GbEXPATR基因的启动子。其启动子的核苷酸序列如序列表1和序列表2所示。这两个启动子在棉花中是纤维特异/优势表达启动子。将启动子PGbEXPA1和PGbEXPATR DNA序列分别与GUS基因融合构建的植物表达载体经农杆菌介导的遗传转化方法转化棉花，获得转基因植株经染色鉴定，GUS基因在棉花纤维中优势表达。这两个启动子表达模式基本一致，但有微弱差异。通过一系列截短启动子序列与GUS融合，转基因棉花验证结果表明-461bp～-1bp的序列是该启动子PGbEXPA1的核心序列。本发明还公开了含有启动子PGbEXPA1的重组表达载体，该重组表达载体可应用于培育在植物根中特异表达目的基因的转基因植株。

Description

两个棉花纤维伸长期优势表达的启动子及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及两个棉花纤维发育时期特异启动子的克隆及其应用。通过克隆、鉴定两个棉花纤维伸长期特异性启动子，将其应用于棉花纤维品质改良的遗传转化。

背景技术

棉花纤维是一种重要的纺织业原料，对棉花纤维的遗传改良有利于棉纺工业的发展。而纤维细胞又是一种独特的植物细胞，它由棉花种皮的单细胞发育而来，从开花当天开始，经历起始，延长，次生壁沉积及成熟四个阶段，最后发育成一个长达3厘米左右、次生壁中纤维素含量达百分之九十多的纤维细胞。为此，棉花纤维细胞是研究植物细胞发育及纤维素沉积的良好研究材料。

基因启动子是重要的基因表达调控元件，决定了基因的转录方向、转录效率以及转录的时空特性。运用基因工程手段对农作物进行遗传改良，赋予农作物一些新的性状，需要外源基因在受体内以高度受控的方式表达，这就对启动子的表达特性提出了很多新的要求。比如启动子能接受外部信号刺激，引导基因在特定器官、组织和细胞类型的特定发育阶段表达。外源基因的特异表达类型有很多优点，如表达高效、节约能量等等。目前一批棉花组织特异启动子已经得到表达特性分析(John和Crow，Gene expression incotton(Gossypium hirsutum L.)fiber：Cloning of the mRNAs，Proc Natl Acad Sci USA，89：5769-731992；Rinehart等，Tissue-specific and developmental regulation of cotton gene Fbl2a，PlantPhysiol，89：5769-5773，1996；Liu等，Cloning and promoter analysis of the cotton lipid transfer proteingene Ltp3，BiochimBiophysActa，1487：106-112000；Wang等，Control of plant trichome developmentby a cotton fiber Myb gene，Plant Cell，16：2323-2334，2004；Zhang等，Members of a new groupof chitinase-like genes are expressed preferentially in cotton cells with secondary walls，PlantMol Biol，54：353-72，2004；Li等，The cotton actinl gene is functionally expressed in fibersand participates in fiber elongation，Plant Cell，17：859-875，2005；Wu等，Isolation of a cottonreversibly glycosylated polypeptide(Ghrgp1)promoter and its expression activity in transgenictobacco，J Plant Physiol，163：426-35，2006)。这些启动子中E6达高峰在纤维发育10天左右；FbL2A启动子在20天纤维中特异表达，表达高峰在纤维发育的第35天。GhCTL的启动子不仅启动GUS在次生壁增厚期纤维中表达，而GUS在其他组织的次生壁部位也表达。虽然到目前为止克隆的棉花纤维启动子已经为数不少，但像克隆种子特异启动子a-globulin promoter真正以克隆启动子为最初目标而克隆的很少(Sunilkumar等，Cotton alpha-globulin promoter：isolation and functional characterization intransgenic cotton，Arabidopsis，and tobacco，Transgenic Res，11：347-359，2002)。目前克隆的纤维特异启动子都是克隆或分析某些纤维发育相关基因功能时的副产品，这就造成了启动子资源的相对缺乏，不能满足棉花纤维发育相关基因功能验证和纤维品质转基因育种的需要，本专利能丰富棉花纤维特异/优势启动子资源。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供两个棉花纤维伸长期优势表达启动子，利用所述的启动子转化棉花以及作为在棉花遗传改良中的应用。

本发明通过下列技术方案实现：

申请人通过基因克隆方法，从海岛棉中克隆得到两个棉花纤维伸长期优势表达启动子PGbEXA1和PGbEXATR，它们是由序列表SEQ ID NO：1及序列表SEQ ID N0：2所示的DNA分子。

上述启动子PGbEXA1和PGbEXPATR的核苷酸序列包括所述启动子序列的全部或部分序列，所述的部分序列是指大于或等于所述启动子PGbEXA1起始密码子上游461bp的序列，其中启动子PGbEXA1的461bp序列位于序列表SEQ ID NO：1所示序列的379-839bp处。

与此同时，申请人获得了一种棉花纤维伸长优势表达的启动子PGbEXA1的表达载体pGWB407-PGbEXA1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明所述的PGbEXA1和PGbEXATR启动子和所述重组表达载体可用于改良棉花纤维品质或特种棉花创制的棉花转基因育种。

实验证明，这两个启动子在棉花纤维伸长期优势表达，并且在拟南芥叶片表皮毛中特异表达。本研究是在研究海岛棉纤维发育相关基因表达谱的基础上发掘的两个在海岛棉纤维伸长期高丰度表达的基因GbEXA1和GbEXATR，进而克隆的启动子(图1)。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的启动子GbEXA1的核苷酸序列。其中该序列表SEQ ID NO：1所示序列的379-839bp区段是该启动子的核心区。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的启动子GbEXATR的核苷酸序列。

图1：是GbEXA1和GbEXATR启动子克隆和验证的技术路线。

图2：是GbEXA1和GbEXATR表达分析。

图中：GbEX2(上面一排)和GbEX3(下面一排)的3’-UTR设计引物RT-PCR(28的循环)的电泳图。泳道1-2分别为：DNA、水；3-8为TM-1的23、15、10、5、3DPA的纤维和开花前1-4天的胚珠；9-15为Pima 3-79的27、23、17、15、10、5DPA的纤维和开花前1-4天的胚珠；16-25为花粉、花、蕾、叶、乙烯处理的铃柄离层、赤霉素处理的铃柄离层、未处理铃柄离层、茎、黄萎病菌处理的茎、DNA分子量标记。

图3：是PGbEXA1启动子驱动GUS基因在棉花和拟南芥中的表达情况，PGbEXA1启动子驱动GUS在棉花纤维中优势表达，其中在纤维发育早期有微弱表达，在纤维伸长期表达丰度很高。A-D：0、3、9、18DPA棉花胚珠及纤维；E-H：18DPA纤维、剥掉纤维的胚珠、胚珠切面及胚，表明除纤维外胚珠其他部分GUS是不表达的。I-O：萌发的胚、内种皮、胚根、根、叶片、茎尖、茎尖(O)的放大，表明该启动子驱动GUS在刚萌发的子叶及内种皮上微弱表达，在下胚轴子叶端微弱表达，还在茎尖幼嫩叶片表皮毛上表达。P：PGbEXA1启动子驱动GUS在拟南芥叶片的表皮毛特异表达。

图4：是PGbEXATR启动子驱动GUS基因在棉花和拟南芥中的表达情况，表达模式与PGbEXA1基本一致，但有微弱差别。图中：A-H：棉花萌发的胚、内种皮、胚根、下胚轴、根、24DPA胚珠、叶片、茎尖，表明该启动子驱动GUS在胚根根尖有微弱表达，在下胚轴子叶端微弱表达，但在茎尖幼嫩叶片表皮毛没有表达，和PGbEXA1启动子有差异。I：PGbEXA1启动子驱动GUS在拟南芥幼嫩叶片的表皮毛特异表达，与PGbEXA1区别在于在成熟叶片表皮毛中没有表达。

图5：为启动子PGbEXA1的截短策略。

图6：为启动子PGbEXA1起始密码子上游118bp驱动GUS表达的模式，118bp的启动子不具备驱动GUS在伸长纤维中表达的能力。各种组织如图中标示，其中DPA表示开花后的天数。

图7：为PGbEXATR、PGbEXA1及PGbEXA1不同截短区段转基因棉花GUS定量分析。分析表明起始密码子上游461bp为该启动子的核心序列。

图8：为表达载体pGWB407-PGbEXA1的物理图谱。

A：pGWB407物理图谱；B：含有PGbEXA1启动子的植物表达载体的物理图谱；C：利用pGWB407-PGbEXA1进行转基因功能验证，Southern杂交结果表明该载体的T-DNA已经整合到基因组上(NPTII为探针)。

图9：为启动子PGbEXA1的核心序列如下划线部分所示。

具体实施方式

实施例1：GbEXA1和GbEXATR的表达分析

以GbEXA1和GbEXATR基因(基因登录号分别为DQ912952和DQ912951)的3’-UTR设计引物对进行RT-PCR，验证其表达模式。所述的引物对的DNA序列如下：

GbEXA1Sense：5’CGATGGCAGGACTATCACAAAC3’；

GbEXA1Anti：5’TATAATATTGTCTTAAAACTGGCC TCCTT 3’

GbEXATRSense：5’GTGAAGAAAGGAGGCATCAG3’；

GbEXATRAnti：5’TCGAAAATACTTGCAAAAAT3’

RT-PCR步骤如下：提取不同组织的总RNA：陆地棉TM-13、5、10、15、23DPA(days post anthesis开花后天数)的纤维和开花前1-4天的胚珠；海岛棉3-79的5、10、15、17、23、27DPA的纤维和开花前1-4天的胚珠；花粉、花、蕾、叶、乙烯处理的铃柄离层、赤霉素处理的铃柄离层、未处理铃柄离层、茎、黄萎病菌处理的茎。RNA提取完成后后用DNaseI(购自Promega公司，美国)处理，RNA完整性通过1.4％(w/v)琼脂糖胶(EtBr)电泳检测(5V/cm)。核酸浓度的测定在Beckman DU800 spectrophotometer上进行。RNA260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是以3μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT₍₁₅₎引物(购自Promega公司，美国)，1μl 10mM dNTP，DEPC-water混合，总体积为12μl；然后65℃变性5min冰上骤冷；再加入8μl含有4μl RT buffer，2μl 0.1M dithiothreitol，40units of

Ribonuclease Inhibitor(购自Promega公司，美国)，和200unitsof Superscript II RT(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；42℃温浴1h合成第一链(以随机引物来合成第一链的反应先在25℃放置10min)；反应结束后75℃处理15min使Superscript IIRT失活。每份cDNA稀释到300μl后-20℃保存待用。PCR反应体系(20μl)包括：1μl稀释后的cDNA(等于10ng起始总RNA)，10μl 2×PCR Master Mix，200nM的引物。PCR程序为：50℃，2min；95℃变性10min；然后28个循环(95℃变性15s，60℃复性延伸1min)。

结果表明GbEXA1是棉花纤维特伸长期异/优势表达基因，只在海岛棉和陆地棉纤维快速伸长期表达(5-15DPA)，在非纤维组织没有检测到相应的表达。GbEXATR是海岛棉伸长期纤维特异表达基因(见图1)。

实施例2：启动子PGbEXA1和PGbEXATR的序列的获得

以全长cDNA3’端序列设计引物GSP1(gene special primer基因特异性引物)和引物GSP2分别与GenomeWalker^TM Universal Kit(Protocol No.PT3042-2，购自Clontech公司，美国)的引物AP1、引物AP2组合进行启动子的克隆(具体步骤见试剂盒操作手册)，得到如下所示的引物对，其序列如下所示：

GbEXA1GSP1：CCACCGTAGAAGGTGGCATGGGCAGTTT

GbEXA1GSP2：ATTAGCACCAAGGAAAATGGAGTTGCAT

GbEXATRGSP1：CCACCGTAGAAGGTGGCATGGGCAGTTC

GbEXATRGSP2：ATTAGCACCAAGGAAAATGGAGTTGCAG

在凝胶电泳后用凝胶回收试剂盒回收目的片段(试剂盒购自Qiagene公司，德国，Cat.No.28704)后进行TA克隆，测序。确认这两个启动子PGbEXA1和PGbEXATR分别长839bp、1405bp，其序列见序列SEQ IDNO：1和序列表SEQ ID NO：2所示。利用预测植物启动子软件TSSP进行启动子顺式元件进行预测(http://www.softberry.com/berry.phtml？topic＝tssp&group＝programs&subgroup＝promoter&advanced ＝on；Solovyev and Salamov，1997；Solovyev，2001；Solovyev and Shahmuradov，2003)，发现该序列具有核心启动子序列(上述两个启动子的核心区见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)及相应的激素和环境响应的各个元件。

实施例3：启动子PGbEXA1和PGbEXATR驱动GUS在棉花及拟南芥中表达

设计带有Hind III和BamH I的酶切位点的引物扩增了该启动子，替换载体pBI121(购自Clontech公司，美国))上的驱动GUS表达的35S启动子，转化棉花品系YZ-1检测是否为纤维特异启动子。引物序列如下(两个启动子反向引物一样)：

PGbEXA1F：5’agag aagctt AGTGCGAATAAAGAAGACCGCA’3

PGbEXATRF：5’agag aagctt CACTTAAATTCTCAATAAAATTAGAAAAC’3

PEXR：5’aga ggatcc TTGAGTAAGAGCTAGCTAGCTCAAACAA’3

上述引物中的酶切位点以小写英文字母表示。

本发明中所涉及的棉花转基因采用的方法为农杆菌介导的遗传转化法，所采用的农杆菌菌株为LBA4404(Octopine Ti-plasmid deletion mutants of Agrobacterium tumefaciens with emphasis on theright side of the T-region，Plasmid，1982，7：15-29)，转化受体材料为YZ-1(参照Jin(金双侠)等的文献：Identification of a novel elite genotype for in vitro culture and genetic transformationof cotton.Biologia Plantarum，2006，50：519-524)。转化方法和程序参照Jin等建立的高效转化体系(Identification of a novel elite genotype for in vitro culture and genetic transformation ofcotton.Biologia Plantarum，200650：519-524；An efficient grafting system for transgenic plantrecovery in cotton(Gossypium hirsutum L.).Plant Cell，Tissue and Organ Culture，85：181-185，2006；Factors affecting stable transformation and plant regeneration during transforming embryogeniccallus of Upland cotton(Gossypium hirsutum L.)via Agrobacterium tumefaciens，Plant Cell，Tissueand Organ Culture，81：229-237，2005)，并作了相应的调整和修改，具体方法和流程如下：

1、无菌苗的培养

将棉籽壳去掉，用0.1/100的升汞灭菌十分钟，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中配方如下：1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L+phytagel(购自Sigma-Aldrich公司，美国)2.5g/L，3-6天暗培养，培养温度为28℃。

2.农杆菌的活化和保存

2.1材料准备：

农杆菌LBA4404，含卡那霉素50mg/L的MGL液体培养基(胰化蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，MgSO₄.7H₂O0.1g/L，KH₂PO₄0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L，pH7.0)，无菌三角瓶，LB(固、液)培养基(含卡那霉素50mg/L)，灭菌甘油，无菌枪头，无菌1.5mL离心管。

2.2操作：

2.2.1活化，悬浮：

超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上划线，26.5℃暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，26.5℃暗培养36-48h，待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，27℃、200rpm摇2h，OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。

2.2.2菌株的保存：

从培养皿内挑取单菌落接于LB液体培养基中150rpm、26℃摇48h，按菌液和甘油按体积比1∶1加入1.5mL离心管混匀，-70℃保存。

3.浸染，共培养：

3.1准备：

取暗培养5天左右幼嫩健壮的YZ-1幼苗，经活化农杆菌，无菌培养皿，无菌滤纸

3.2操作：

无菌条件下将YZ-1幼苗下胚轴用锋利的刀片切成0.5-1cm长的切段，转入到经活化的农杆菌菌液中，搅匀，静置5-10分钟，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21℃暗培养38-42小时。

4.愈伤组织的诱导

将侵染共培养后的下胚轴切段接种于诱导培养基上配方如下：MS无机盐+B5有机物+2，4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L，pH5.8。

5、非胚性愈伤组织的增殖

MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+2，4-D 0.05mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，pH5.8。。

6、愈伤组织的分化

愈伤组织经继代(一个月继代一次)几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基(MS+B5有机物+KT0.15mg/L+IBA0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L，pH5.8)中，进一步分化成胚状体。

7、胚性愈伤组织的继代

MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B₅有机物+KT0.15mg/L+IBA0.5mg/L+Gln(谷胺酰胺)1.0mg/L+Asn(天冬酰胺)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L，pH5.8。

8、成苗生根培养

将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长(1/2MS无机盐+B₅有机物+葡萄糖15g/L+phytagel2.5g/L，pH5.8)。

9、炼苗移栽

将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽大田。

附：MS培养基母液配制：

1.配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解，逐一加到容量瓶中，一定要最后加入CaCl₂否则容易产生沉淀，定容到一升。

2.配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温下10小时以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。

3.配制铁盐时，两种盐用热水分别溶解，然后混合，放置于室温下10小时以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。

4.各种生长激素一般可以用1mol/L的NaOH或HCl溶解后，再定容。

5.配制B5有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染

6.各种母液配制好后应存放在4℃冰箱中，发现有沉淀后，不得使用。

大量元素(20倍)母液(g/L)

KNO3 38

NH3NO3 33

MgSO4·7H2O(无水MgSO4) 7.4(3.8)

KH2PO4 3.4

CaCl2·2H2O(无水CaCl2) 8.8(6.6)

微量元素(100倍)母液(g/L)

CoCl2·6H2O 0.0025

CuSO4·5H2O 0.0025

H3BO3 0.62

KI 0.083

MnSO4·4H2O 2.23

NaMO4·2H2O 0.025

ZnSO4·7H2O 0.86

铁盐(100倍)母液(g/L)

FeSO₄·7H₂O 2.78

Na2EDTA 3.73

B₅有机物

VB1(硫胺素) 10mg/L

VB5(盐酸吡哆醇) 1mg/L

VB6(烟酸) 1mg/L

肌醇 100mg/L

甘氨酸 2mg/L

T0植株收获的种子(T1)在50mg/L卡那霉素的MS培养基上进行阳性筛选，然后阳性植株的不同器官进行GUS组织化学定位。

拟南芥的转化采用Floral dip法(参考文献)转化哥伦比亚野生型拟南芥，将收获的当代转基因拟南芥种子在添加30mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选阳性苗。收获阳性植株种子，然后对阳性T₂代植株进行GUS染色。

GUS组织化学定位法参照Jefferson等(Gus fusions：β-glucuronidase as a sensitive and versatilegene fusion marker in higher plants.EMBO J，1987，6：3901-3907)方法，将转化转基因植株的不同器官，组织放到GUS染色液溶液中，37℃保温2h至过夜，经70％酒精脱色后FAA固定保存在中，肉眼或在体式显微镜观察GUS基因表达情况，然后在体式显微镜(Leika MZFLIII)下照相。GUS染色液成分如下(100mL)：x-gluc 90mg、氯霉素10.0mg、0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)50mL、甲醇20％(v/v)，补足无菌水至100mL；组织固定液(FAA)：70％乙醇90mL、5％醋酸5mL、38％甲醛5mL。

将上述两个启动子PGbEXA1和PGbEXATR与GUS融合转化棉花和拟南芥，组织化学染色表明：启动子PGbEXA1主要在棉花纤维伸长期表达，其中在纤维发育早期有微弱表达，在纤维伸长期表达丰度很高。在刚萌发的子叶和内种皮，下胚轴，茎尖幼嫩叶片表皮毛有微弱表达。另外启动子PGbEXA1在拟南芥叶片的表皮毛中也有特异表达(见图2)。对于棉花胚珠，PGbEXA1只诱导GUS在纤维细胞中表达，而在剥掉纤维的种皮、胚乳及胚中检测不到GUS表达(图2E-H)。PGbEXATR的表达模式和PGbEXA1基本一样，但有微弱差别：PGbEXATR启动子驱动GUS在胚根根尖处有微弱表达，而茎尖幼嫩叶片表皮毛没有表达，与PGbEXA1启动子正好相反。PGbEXA1启动子除了驱动GUS在拟南芥叶片的表皮毛表达外，在幼嫩叶柄表皮毛也有表达。

实施例4：PGbEXATR的表达模式和PGbEXA1核心序列的确定

为了确定PGbEXATR的表达模式和PGbEXA1的核心序列，根据软件预测结果从5’端进行一系列截短，图5所示为PGbEXA1的截短序列示意图。不同的截短片段GUS融合转化棉花。转基因棉花后代先进行GUS表达模式的定性分析，然后进行GUS定量。GUS定量的具体步骤如下：

1、试剂准备

①GUS提取缓冲液

50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)

10mM β-巯基乙醇

10mM Na₂-EDTA

0.1％Sarkosyl十二烷基肌氨酸钠

0.1％Triton-X-100

②反应终止液

0.2M NaCO₃

③1mM 4-MU

称取19.8mg 4-MU粉末溶于100mL 0.2M NaCO₃溶液中，4℃避光可保存一个月。测定GUS活性前再稀释1000倍，取100μL加入1.9mL反应终止液中，终浓度为50nM。

④40mM 4-MUG

称取1.408mg 4-MUG粉末溶于100μL双蒸水中，现用现配。

⑤考马斯亮蓝G-250溶液

称取50mg考马斯亮蓝G-250粉末，溶于90％乙醇中，加入50mL磷酸，定容至500mL，过滤后4℃避光保存。

⑥100μg/mL BSA标准溶液

称取10mg BSA粉末，加水溶解定容至100mL。

2、GUS蛋白提取

①取适量材料用液氮研磨成粉末，取约0.6克粉末装入1.5mL离心管中。

②加入1mL蛋白提取液，摇匀，在冰上放至沉淀。

③4℃13000rpm离心15分钟。

④吸取上清，冰箱中保存。

3、蛋白浓度测定

①将100μg/mL BSA标准溶液按下表制成BSA梯度液

表1牛血清白蛋白(BSA)梯度液配置

分别取上述浓度的BSA溶液1mL至装有3mL考马斯亮蓝G-250溶液的10mL离心管中，摇匀，室温放置5分钟。

②用分光光度计Du640测定各样品在595nm下的吸光度。

③以BSA浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

④取GUS蛋白20μL稀释至1mL，加入至3mL考马斯亮蓝G-250溶液中，摇匀，室温放置5分钟，测定595nm下的吸光度，根据标准曲线计算蛋白质样品的浓度。

4、GUS活性测定

①在10mL离心管中加入400μL GUS蛋白提取缓冲液、100μg GUS蛋白、10μL 40mM 4-MUG，37℃反应1小时。

②加入1.6mL反应终止液。

③预热Tecan Infinite M200型多功能酶标仪(购自Tecan公司，奥地利)，以50nM的4-MU为标准，在激发光365nm、发射光455nm条件下测定其读数，再测各样品。

④GUS活性以pmol 4-MU/μg蛋白/min表示。

结果表明将启动子PGbEXATR的表达模式和PGbEXA1基本一致，且驱动GUS的表达能力一致(图7)。截短的启动子片断461bp起始密码ATG上游461bp)就具备了和PGbEXATR和PGbEXA1相差无几的驱动能力。但258bp和118bp基本不具备启动子的驱动能力(图6、7)。所以起始密码ATG上游461bp是PGbEXA1驱动基因表达的核心序列，如图9下划线所示。同样PGbEXATR的核心序列也是起始密码ATG上游460bp左右。所以-461～-258bp之间可能有重要的顺式作用元件。

实施例5：含有启动子PGbEXA1植物表达载体的构建

设计含有Hind III和Xba I酶切位点的引物对扩增了该启动子序列，该引物对的序列如下：

PGbEXA1F：CGAAGCTTAGTGCGAATAAAGAAGACCGCA；

PGbEXA1R：GGTCTAGATTGAGTAAGAGCTAGCTAGCTCAAACAA。

将PCR产物和载体pGWB407(Improved gateway binary vectors：high-performance vectors forcreation of fusion constructs in transgenic analysis of plants，2007，Biosci biotechmol biochem)分别用Hind III和Xba I酶双酶切。带有启动子的PCR产物酶切后用PCR产物回收试剂盒(购自Qiagen公司，德国)回收。pGWB407酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收载体骨架。用T4DNA连接酶连接。用连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(购自Invitrogen公司，美国)，挑取具有壮观霉素抗性单克隆，PCR鉴定阳性克隆提取质粒进行酶切和测序鉴定。将获得重组表达载体命名为pGWB407-PGbEXA1，其物理图谱如图8A、B所示。将该载体运用于棉花功能基因的验证，得到棉花转基因后代，并完成Southern杂交验证。结果表明该载体pGWB407-PGbEXA1的T-DNA区段能很好的整合到植物基因组中(见图8C)。

Claims

1.两个棉花纤维伸长期优势表达启动子PGbEXA1和PGbEXPATR，其核苷酸序列分别如SEQID NO：1和SEQID NO：2所示。

2.权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子PGbEXA1和PGbEXPATR的核苷酸序列包括所述启动子序列的全部或部分序列，所述的部分序列是指大于或等于所述启动子PGbEXA1起始密码子上游461bp的序列，其中启动子PGbEXA1的461bp序列位于序列表SEQ ID NO：1所示序列的379-839bp处。

3.一种棉花纤维发育伸长期优势表达的启动子PGbEXA1的表达载体pGWB407-PGbEXA1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

4.权利要求1或2所述的启动子在棉花遗传改良中的应用。

5.权利要求3所述的表达载体在棉花遗传改良中的应用。