CN105960458B

CN105960458B - 转化的植物细胞的取得方法

Info

Publication number: CN105960458B
Application number: CN201580007421.XA
Authority: CN
Inventors: 樋江井佑弘; 小鞠敏彦
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2014-02-06
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2035-02-04
Also published as: WO2015118640A1; US11136587B2; EP3103870B1; AU2015215536B2; AU2015215536A1; BR112016016772A2; CN105960458A; US20160340682A1; WO2015119166A1; EP3103870A4; JPWO2015118640A1; EP3103870A1

Abstract

本发明涉及一种转化的植物细胞的取得方法。本发明包含以下的步骤：(a)将所期望的DNA和第一标记基因在植物细胞中进行共转化的步骤；及(b)从步骤(a)中得到的转化的植物细胞中选择在其染色体中导入所期望的DNA、且没有导入第一标记基因的转化细胞的步骤，但是，所述方法不包含通过使用所述第一标记基因的阳性选择而除去仅将所期望的DNA导入染色体的转化细胞的步骤。

Description

转化的植物细胞的取得方法

技术领域

本发明涉及一种转化的植物细胞的取得方法及转化植物的制备方法。

背景技术

植物的转化

在将植物进行转化时，可利用向植物细胞导入DNA的技术，所述技术能够在稔实种子的后代或营养繁殖体中使外来基因维持并表达。可以使用该技术实际地转化许多单子叶植物、双子叶植物。

在植物生理学、植物分子生物学的领域中，拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻、短柄草属(Brachypodium)等的转化体经常用于基础研究。在作物中，玉米、稻、小麦、大麦、高梁、大豆、油菜籽、向日葵、棉、马铃薯、番茄等不用说，即使水果类或其它蔬菜类，也可制备转化体。另外，可以通过转化赋予高附加价值的特性，因此，对商业用途存在强烈的兴趣，目前，转化的玉米、大豆、油菜籽、棉正在广泛地进行商业生产。

但是，制备转化植物时，在研究方面及商业利用方面这两者中存在重要的问题。其为制备的转化体大多保持多拷贝的目标DNA的情况。在多拷贝数导入有目标DNA的转化植物中，导入基因的表达量在植物间较大变化，导入基因的表达受到强烈抑制(一种被称为同源性依赖性基因沉默的现象)的植物的情况不少。另一方面，仅以单拷贝保持目标DNA的转化体与基因组上的插入位置没有关系，显示稳定的基因表达(Nagaya et al.，2005)。在同源性依赖性基因沉默中存在转录后型(PTGS)和转录型(TGS)这2种，两者均介由双链RNA而产生，但PTGS在多拷贝的目标DNA相互沿正向或反向连接而导入的情况、或在部分缺失的目标DNA一起被导入的情况下容易产生。TGS因表遗传学而被发动，一般而言伴随通过与基因上游的启动子区域同源的小RNA的DNA甲基化。该甲基化即使经过体细胞分裂或减数分裂也被维持，结果，沉默遗传给后代(Eamens et al.，2008)。

另外，由于拷贝数较高，目标DNA对基因组的整合方面变得复杂且更难以分析。因此，对于大多数转化目的，如在1)在转化体中以表达水平评价导入基因的效果、2)在转化体中评价启动子或转录因子的特性、3)制备T-DNA标签库、4)以商业化为目标制备转化植物的目的，优选以1-2拷贝导入目标DNA，最优选以单拷贝导入。

在植物的转化方法中，已知有粒子枪法、电穿孔法、电注射法、聚乙二醇法、须晶法等物理化学的方法(DNA的直接导入法)和利用土壤杆菌属细菌具有的功能的生物学方法(DNA的间接导入法)。在直接导入法中，目标DNA被片段化而被导入、以高拷贝数(多的时候达到100拷贝)被导入的现象以高频率产生(Butaye et al.，2005)。另外，多拷贝导入目标DNA时，各拷贝经常彼此连接而被整合到相同的基因座(Kohli et al.，1998；Klein，2010)。因此，显示目的基因未得到表达的基因沉默现象的转化体以高频率出现(Register etal.，1994)。

在土壤杆菌法中，通过Ti或Ri质粒的毒力区域(vir区域)中的基因簇的表达控制而导入目标DNA。目标DNA通过vir基因所编码的蛋白质簇的作用，经过植物细胞和细菌的相互作用的识别和信号传递、vir基因的表达诱导、类型IV分泌路径的形成、T-DNA边界重复序列的认识、T-DNA链的形成、将T-DNA链转移到植物细胞和然后到核、和T-DNA对植物核基因组的整合等的许多过程而被导入。因此，与直接导入法相比时，更低保持目标DNA的导入拷贝数(低于10拷贝)，被片段化而被导入的情况也少(Shou et al.，2004；Butaye et al.，2005)。土壤杆菌法与DNA的直接导入法相比，为优异的转化方法，尽管如此，不能充分地控制向基因组导入的DNA的拷贝数。另外，多拷贝的DNA向相同基因座导入也并不罕见(Wangand Waterhouse，2000)。因此，在目的基因的表达量上产生某种程度的植物间差异，有时产生伴有同源性依赖性基因沉默的植物(Butaye et al.，2005；Nagaya et al.，2005)。

控制导入DNA的拷贝数的尝试

由于此类背景技术，以低拷贝导入目标DNA的方法也报道有数件。这些方法之一为使用位点特异性重组系统的方法。首先，将在具有选择标记的所期望的DNA的两侧沿反向方向有位点特异性重组酶的识别序列(lox)的DNA片段导入植物。另外，预先将Cre表达盒导入另一个植物。接着，将导入有多个连接的目标DNA拷贝的T0植物和表达Cre的T0植物进行杂交。在得到的F1植物中表达Cre时，从导入多个连接拷贝的DNA区域仅将由DNA区内的正向lox序列之间夹持的DNA区域全部切出。其结果，保留在DNA中的两个末端彼此连接，可得到仅具有单拷贝的目标DNA的细胞。通过该细胞分化为生殖细胞，可以得到以单拷贝或单拷贝纯合含有目标DNA的F2植物(Srivastava et al.，1999；DeBuck et al.，2007)。但是，杂交的方法存在着得到目的植物之前花费长时间的缺点。另外，在引起表遗传性的TGS的情况下，即使通过Cre-lox反应而降低拷贝数，所期望的DNA的表达仍受到抑制。

另外，作为类似使用位点特异性重组系统的方法，也报道有将上述的目标DNA片段和具有Cre基因的DNA片段进行共转化的方法(Srivastava and Ow，2001)。共转化的Cre表达时，从导入多个连接的目标DNA拷贝的区域切出由lox序列间所夹持的区域，并且可以在T0世代得到目标DNA单拷贝的植物。但是，在共转化法中，如果Cre基因自身进行多拷贝导入，则有时由于表达抑制而不起作用。根据Butaye等(2005)的评论，使用位点特异性重组系统的拷贝数减少方法理论上可行，但成功例的报道少，并且转化效率也较低。顺便说一下，在该方法中，也指出夹持于2个导入DNA拷贝之间的野生型的基因组区域被切出并且缺失的问题(Butaye et al.，2005)。

这些方法中的第二个为在土壤杆菌法中使用毛根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的oriRi作为具有目标DNA的T-DNA的载体的复制起点的方法。Ye等(2011)通过使用oriRi起作用的二元载体和作为IncP RK2型复制起点的oriV起作用的二元载体比较植物频率，在所述植物中以单拷贝导入有目标DNA，而不包含对应于得到的转化体中的T-DNA外侧的载体的骨架序列。通过使用oriRi载体获得的单拷贝导入植物的频率在转化的大豆植物中是38％-40％，这与通过使用oriV载体获得的频率相比是加倍的，在转化的油菜籽植物中是51％，这高1.5倍，并且在转化的玉米植物中是58％，这高1.4倍。另一方面，转化效率减少，将oriV载体的情况设为100％时，在大豆中显示45％-68％，在油菜籽中显示80％，在玉米中显示58％(Ye et al.，2011)。考虑通过使用oriRi载体得到的无骨架单拷贝转化体的制备频率以及转化效率获得的每个测试材料的制备效率与通过使用oriV载体获得的效率相比时，在大豆中高0.96-1.36倍，在油菜籽中高1.2倍，在玉米中高0.82倍。可以说，即使每测试材料的制备效率较低，只要整体上操作效率或成本效率较高，oriRi二元载体可以认为是有用的。就转化体的分析而言，在DNA的提取和拷贝数的分析中需要大量的成本和劳动力，因此，认为oriRi二元载体有益于改善整体效率。

这些方法中的第三个为使T-DNA保持在土壤杆菌的染色体上、进行植物的转化的方法。Oltmanns等(2010)向土壤杆菌的GV3101菌株及EHA101菌株的染色体上的picA区域以同源重组整合含有T-DNA的DNA区域，将所得物用于玉米的转化。而且，研究了得到的转化体中的单拷贝导入植物的频率。其结果，玉米转化体中的单拷贝导入植物的频率在使用有EHA101的情况下为64％，在使用有GV3101的情况下为58％，显示非常高的值(Oltmanns etal.，2010)。但是，使T-DNA保持在该土壤杆菌的染色体上的方法存在转化效率低的根本的问题，就玉米的转化效率而言，EHA101菌株、GV3101菌株均为1％左右(Oltmanns et al.，2010)。因此，使用作为现有法的二元载体的土壤杆菌菌株引起的转化效率在EHA101菌株中显示9-12％，在GV3101菌株中显示5-8％。使T-DNA保持在土壤杆菌的染色体上的该方法似乎仅在使用GV3101菌株的拟南芥的花序浸渍法时是相当有效的。转化效率相对于现有法的1.6-2.1％为0.9％，没有大幅度降低，就单拷贝导入植物的频率而言，现有法为16-35％，与此相对，其为80％，非常高(Oltmanns et al.，2010)。但是，当该方法应用于染色体背景相同的EHA101菌株时，转化效率会是0.1％左右，是常规方法获得的转化频率的1/10左右(Oltmanns et al.，2010)。如上所述，进行了使导入DNA的拷贝数减少的尝试，但这些方法分别存在问题，不能作为有效方法广泛利用。

共转化

植物中的外来DNA的共转化通常用于得到仅导入有目标DNA的转化体。选择标记基因和选择药剂是用于从主要由非转化细胞构成的植物组织中得到转化细胞的非常有用的工具，但得到转化体之后基本上不需要。在土壤杆菌法中，共转化主要以在下一世代除去选择标记基因的目的而进行。即，将目标外来DNA和选择标记基因分别插入于各自的T-DNA上，经由土壤杆菌而同时导入植物细胞。使选择药剂中所选择的细胞块再生时，可得到与选择标记基因同时导入有目标DNA的转化体。如果目标DNA和选择标记基因被导入各自的染色体，则通过遗传性分离，在下一世代可以得到具有目标DNA、但排除了选择标记基因的植物(Yau and Stewart，2013)。另外，通过土壤杆菌的共转化法有如下4种类型：两个T-DNA分别位于一个菌株中的两个二元载体上的类型；两个T-DNA位于一个菌株中的一个二元载体上的类型；两个T-DNA分别位于两个菌株的二元载体上并且混合接种菌株的类型，和两个右侧边界序列位于一个菌株的一个二元载体上的类型(Yau and Stewart，2013)。

另外，共转化法在DNA的直接导入法中，不是排除选择标记基因的目的，而是为了在基因导入之前省略连接目标DNA和选择标记基因的预先操作而使用。这是因为，如上所述，DNA的直接导入法的多个外来DNA容易整合于相同的基因座。实际上在DNA的直接导入法中，即使以排除选择标记基因的目的使用共转化法，在下一世代能够除去选择标记基因的效率也非常低(Yau and Stewart，2013)。

利用共转化的情况下，通过例如潮霉素抗性基因等阳性选择标记基因的表达选择T0植物之后，在T1世代用阳性选择标记进行选择时，通过遗传性分离而仅导入有出现的目标DNA的T1植物因潮霉素而枯死，因此不能选择。因此，不在整个植物中，而是在叶区段中测定药剂抗性的方法和/或通过PCR检测导入的DNA的方法是必需的。但是，在这些检测中花费劳动力。为了减少该劳动力，使用阳性-阴性选择的方法是有效的。作为选择标记，与阳性选择标记基因同时将阴性选择标记基因定位于相同的T-DNA上，在T0世代通过阳性选择获得转化体之后，在T1世代进行阴性选择，由此可以使导入有选择标记基因的T1植物枯死。在残存的T1植物中不再含有选择标记基因，可以仅通过PCR或基因表达辨别目标DNA的有无而完成(Yau and Stewart，2013)。

也使用通过土壤杆菌的共转化法、进行了对营养繁殖性的作物而言价值高、且在T0世代排除选择标记基因的尝试。用于导入的T-DNA为“所期望的DNA”和“阳性选择标记基因-阴性选择标记基因”这2种。报道例有2次报道，但效率低，二者都为通过同样的步骤的方法(Dutt et al.，2008；RamanaRao and Veluthambi，2010)。即，共培养后，所期望的DNA和选择标记还没有被整合于染色体，阳性选择标记瞬时表达的阶段进行利用药剂的阳性选择，谋求细胞的选择。在该过程中，含有所期望的DNA、不含有选择标记基因的细胞被除去，但在所选择的细胞中，包含所期望的DNA也一起被导入的物质的细胞。其后，将得到的组织重新移至没有选择药剂的培养基时，可得到所期望的DNA被整合于染色体、但选择标记没有被整合于染色体的细胞块。另一方面，在染色体中整合有选择标记基因的细胞其后通过阴性选择标记的表达而致死。通过使得到的仅具有所期望的DNA的细胞块进行再分化，可得到目标植物体。

通过上述的方法，Dutt等(2008)将许多(没有显示具体的数字)葡萄的体细胞胚用于材料，得到仅导入有作为所期望的DNA的egfp(增强型绿色荧光蛋白)的5植物的植物。Dutt等(2008)通过实时PCR的分析的结果，发现了导入五个植物之每个中的egfp基因的拷贝数是三个植物中的单拷贝，一个植物中的两拷贝，和一个植物中的六拷贝。报道有：由于以单拷贝导入的植物的比例为60％，因此，以效率高的方式可看到，但相同的研究组用通常的转化方法得到的葡萄转化体中的单拷贝转化体的比率也为60％(Li et al.，2006)。就RamanaRao and Veluthambi(2010)进行的烟草中的结果而言，得到的114植物中的仅5植物具有所期望的DNA的nptII(新霉素磷酸转移酶II)。这些方法的最重要的步骤为瞬时表达的阶段中的阳性选择。如果在不经过该步骤的情况下，则不能浓缩两种基因都被导入并且瞬时表达的细胞，所得的组织处于主要由无一被导入的细胞占据的嵌合状态，因此得到目标植物变得非常困难。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:WO2007/148819A1

非专利文献

非专利文献1:Burgess，D.G.，Ralston，E.J.，Hanson，W.G.，Heckert，M.，Ho，M.，Jenq，T.，Palys，J.M.，Tang，K.，and Gutterson，N.(2002).A novel，two-componentsystem for cell ethality and its use in engineering nuclear male-sterility inplants.PlantJ31，113-125.

非专利文献2:Butaye，K.M.J.，Cammue，B.P.A.，Delaure，S.L.，and De Bolle，M.F.C.(2005).Approaches to Minimize Variation of Transgene Expression inPlants.Molecular Breeding16，79-91.

非专利文献3:Chilton，M.-D.，Currier，T.C.，Farrand，S.K.，Bendich，A.J.，Gordon，M.P.，and Nester，E.W.(1974).Agrobacterium tumefaciens DNA andPS8bacteriophage DNA not detected in crown gall tumors.Proc Natl Acad SciUSA71，3672-3676.

非专利文献4:De Buck，S.，Peck，I.，De Wilde，C.，Marjanac，G.，Nolf，J.，DePaepe，A.，and Depicker，A.(2007).Generation of single-copy T-DNA transformantsin Arabidopsis by the CRE/loxP recombination-mediated resolution system.PlantPhysiol145,1171-1182.

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非专利文献8:Klein，T.M.(2010).Particle Bombardment：An EstablishedWeapon in the Arsenal of Plant Biotechnologists.In Plant TransformationTechnologies(Wiley-Blackwell)，pp.51-71.

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非专利文献11:Li，Z.T.，Dhekney，S.，Dutt，M.，Aman，M.，Tattersall，J.，Kelley，K.T.，and Gray，D.J.(2006).Optimizing Agrobacterium-mediated transformation ofgrapevine.In Vitro Cell Dev Biol-Plant42，220-227.

非专利文献12:Nagaya，S.，Kato，K.，Ninomiya，Y.，Horie，R.，Sekine，M.，Yoshida，K.，andShinmyo，A.(2005).Expression of randomly integrated singlecomplete copy transgenes does not vary in Arabidopsis thaliana.Plant CellPhysiol 46，438-444.

非专利文献13:Oltmanns，H.，Frame，B.，Lee，L.-Y.，Johnson，S.，Li，B.，Wang，K.，andGelvin，S.B.(2010).Generation of Backbone-Free，Low Transgene Copy Plants byLaunching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome.Plant Physiol 152，1158-1166.

非专利文献14:RamanaRao，M.，and Veluthambi，K.(2010).Selectable markerelimination in the T0 generation by Agrobacterium-mediated co-transformationinvolving Mungbean yellow mosaic virus TrAP as a non-conditional negativeselectable marker and bar for transient positive selection.Plan tCell Rep 29，473-483.

非专利文献15:Register，J.C.3rd，Peterson，D.J.，Bell，P.J.，Bullock，W.P.，Evans，I.J.，Frame，B.，Greenland，A.J.，Higgs，N.S.，Jepson，I.，Jiao，S.etal.(1994).Structure and function of selectable and non-selectable transgenes in maizeafter introduction by particle bombardment.Plant Mol Biol 25,951-961.

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非专利文献18:Srivastava，V.，Anderson，O.D.，and Ow，D.W.(1999).Single-copy transgenic wheat generated through the resolution of complex integrationpatterns.Proceedings of the National Academy of Sciences 96，11117-11121.

非专利文献19:Terada，R.，Urawa，H.，Inagaki，Y.，Tsugane，K.，and Iida，S.(2002).Efficient gene targeting by homologous recombination in rice.NatBiotechnol 20，1030-1034.

非专利文献20:Upadhyaya，C.P.，Nookaraju，A.，Gururani，M.A.，Upadhyaya，D.C.，Kim，D.-H.，Chun，S.-C.and Park，S.-W.(2010).An update on the progresstowards the development of marker-free transgenicplants.Botanical Studiesp.277-292

非专利文献21:Wang，M.B.，and Waterhouse，P.M.(2000).High-efficiencysilencing of a beta-glucuronidase gene in rice is correlated with repetitivetransgene structure but is independent of DNA methylation.Plant Mol Biol 43，67-82.

非专利文献22:Yau，Y.Y.，andStewart，C.N.，Jr.(2013).Less is more：strategies to remove marker genes from transgenic plants.BMC Biotechnol 13，36.

非专利文献23:Ye，X.，Williams，E.，Shen，J.，Johnson，S.，Lowe，B.，Radke，S.，Strickland，S.，Esser，J.，Petersen，M.，and Gilbertson，L.(2011).Enhancedproduction of single copy backbone-free transgenic plants in multiple cropspecies using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacteriumtumefaciens.Transgenic Res 20，773-786

非专利文献24:Ishida，Y.，Hiei，Y.，and Komari，T.(2007).Agrobacterium-mediated transformation of maize Nat Protocols 2，1614-1621

非专利文献25:Ishida，Y.，Saito，H.，Ohta，S.，Hiei，Y.，Komari，T.，andKumashiro，T.(1996).High efficiency transformation of maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens.Nat Bio technol 14，745-750

非专利文献26:Yang L.，DingJ.，ZhangC.，JiaJ.，WengH.，LiuW.，and ZhangD.(2005)Estimating the copy number of transgenes in transformed rice by real-time quantitative PCR.Plant Cell Rep 23，759-763

发明内容

发明所要解决的技术问题

在多拷贝导入有目标外来基因的转化植物中，经常产生较强地抑制导入的基因的表达的被称为基因沉默的现象。另外，就目标DNA整合于基因组的方面而言，如果为多拷贝，则某种程度上变得复杂，其分析变得困难。转化以如下目的而进行：1)在转化体中以表达水平评价导入基因的效果、2)在转化体中评价启动子或转录因子的特性、3)制备T-DNA标签库、4)以商业化为目标制备基因重组植物，但任一种情况均优选以1-2拷贝导入目标DNA。最优选的是以单拷贝被导入。

因此，本发明的目的在于，提供一种转化的植物细胞的取得方法，其中，每植物细胞所导入的所期望的DNA的拷贝数较小。

用于解决技术问题的方案

本发明包括但不限于以下的实施方案。

[实施方案1]

一种转化的植物细胞的取得方法，其包含以下的步骤：

(a)将所期望的DNA和第一标记基因在植物细胞中进行共转化的步骤；及

(b)从步骤(a)中得到的转化植物细胞中选择在染色体中导入了所期望的DNA、且没有导入第一标记基因的转化细胞的步骤，

但是，所述方法不包含通过使用所述第一标记基因的阳性选择而除去仅将所期望的DNA导入了染色体的转化细胞的步骤。

[实施方案2]

如实施方案1所述的方法，其中，第一标记基因为阴性选择标记基因。

[实施方案3]

如实施方案1或2中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中用于共转化的所期望的DNA和第一标记基因的混合比率为3:1-1:5。

[实施方案4]

如实施方案1-3中任一项所述的方法，其中，在用于步骤(a)的所期望的DNA上连接有作为第二标记基因的阳性选择标记基因，

通过使用第二标记基因的阳性选择而进行在步骤(b)的染色体中导入有所期望的DNA的转化细胞的选择。

[实施方案5]

如实施方案1-4中任一项所述的方法，其中，步骤(a)通过选自由土壤杆菌法、粒子枪法、电穿孔法、电注射法、聚乙二醇法及须晶法构成的组中的转化方法而进行。

[实施方案6]

一种转化植物的制备方法，其包含：用实施方案1-5中任一项所述的方法取得转化的植物细胞；

将所述植物细胞进行培养而得到植物体。

[实施方案7]

一种植物的转化方法，其包含以下的步骤：

发明效果

本发明的方法为可以在转化系统的初期排除多拷贝导入有目标DNA的细胞的技术。使用本发明时，优选可以以现有技术的1.3倍以上的频率获得仅单拷贝导入有目标DNA的转化植物。另外，优选可以将3拷贝以上导入的转化体的频率减少至现有技术的1/2以下。通过将本发明的技术适用于公知的植物转化技术，可以减少得到的转化植物中的目标DNA的拷贝数。进而，与减少拷贝数的现有的方法同时使用本发明的方法时，可以进一步以高频率获得仅单拷贝导入的转化植物。

附图说明

图1是用于多拷贝转基因细胞排除技术的、利用土壤杆菌法的共转化法的示意图。a.：1菌株1载体法、LBA4404(pLC41 GUS-HPT共转化(cotra.Barnase).芽孢杆菌RNA酶)、b.：2菌株混合法、LBA4404(pLC41 GUS-HPT)+LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶)、c.：1菌株2载体法(三元载体系统)、LBA4404(pLC41 GUS-HPT::pGW芽孢杆菌RNA酶)、GUS-HPT：具有内含子介导的GUS基因和HPT基因的T-DNA、芽孢杆菌RNA酶：具有内含子介导的芽孢杆菌RNA酶基因的T-DNA、Vir：毒力区域、pAL4404：卸甲型Ti质粒

图2是表达载体pLC41 GUS-HPT的示意图。

图3是表达载体pLC41的示意图。

图4是表达载体pLC41芽孢杆菌RNA酶的示意图。

图5是表达载体pLC41 GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶的示意图。

图6是pGW的示意图。

图7是pGW芽孢杆菌RNA酶的示意图。

图8是导入的2种T-DNA的示意图。a.：pLC41 GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶及pLC41 GUS-HPT中共同的T-DNA区域、b.：pLC41GUS-HPT::pGW芽孢杆菌RNA酶、pLC41芽孢杆菌RNA酶及pGW芽孢杆菌RNA酶中共同的T-DNA区域

图9是表示Southern分析的结果所推定的GUS-HPT片段的导入拷贝数的图。对照：LBA4404(pLC41 GUS-HPT)1菌株1载体：LBA4404(pLC41GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶)，2菌株混合：LBA4404(pLC41 GUS-HPT)+LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶)，1菌株2载体：LBA4404(pLC41GUS-HPT::pGW芽孢杆菌RNA酶)

图10是表示利用定量实时PCR法所推定的烟草转化体中的GUS-HPT片段的导入拷贝数的图。对照：LBA4404(pLC41 GUS-HPT)和试验(2菌株混合)：LBA4404(pLC41 GUS-HPT)+LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶)

图11是表示利用定量实时PCR法所推定的玉米转化体中的GUS-bar片段的导入拷贝数的图。对照：LBA4404(pSB131)和试验(2菌株混合)：LBA4404(pSB131)+LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶::pVGW9)

具体实施方式

以下，对用于实施本发明的优选实施方案进行说明。

本发明涉及一种转化的植物细胞的取得方法。本发明的方法包含以下的步骤：

植物

成为本发明的方法的对象的植物没有特别限定，包含藻类、被子植物、裸子植物等任意的植物，可以为单子叶植物或双子叶植物。供试于转化的组织可以根据植物的种类或使用的转化方法而适当选择。

标记基因

本发明包含将所期望的DNA和第一标记基因在植物细胞中进行共转化的步骤(a)。本说明书中的“标记基因”是指：具有起指标作用的特性的基因，所述指标用于选择导入了该基因的细胞或没有导入该基因的细胞。

不希望限于理论，在将所期望的DNA和第一标记基因进行共转化时，认为将所期望的DNA和第一标记基因随机导入基因组中，期间混合存在于细胞核中。这种转化的结果，产生“低拷贝数导入有基因的细胞”和“多拷贝数导入有基因的细胞”，但在后者中，产生“多拷贝数导入有仅所期望的DNA的细胞”的可能性较低，但是后者细胞中的许多成为“包含所期望的DNA和标记基因两者的多拷贝导入细胞”。因此，通过从得到的转化细胞群中选择“导入所期望的DNA、且没有导入标记基因的细胞”，可以大幅度减少“多拷贝导入有所期望的DNA的细胞”。

因此，本发明的“第一标记基因”指与所期望的DNA不同的基因、且具有在细胞中进行表达时可以除去标记基因表达细胞的性质即可。即，它可以为根据已经作为选择指标导入的可容易地检测的基因表达有无而除去表达标记基因的细胞(“标记基因表达细胞”)的基因。本发明中阴性选择是指选择性地除去标记基因表达的细胞。因此，换句话说，第一标记基因只要具有可进行阴性选择的性质即可。

标记基因表达细胞和没有导入标记基因的细胞视觉上可以识别的情况下，可以从细胞群中人为地、例如在显微镜下使用镊子或手术刀等器具等除去该细胞。作为这种标记基因的实例，可列举：绿色荧光蛋白质(GFP)、红色荧光蛋白质(DsRed)、萤光素酶基因等荧光蛋白质基因、lacZ基因等催化呈色反应的酶的基因等。

另外，潮霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因、壮观霉素抗性基因、四环素抗性基因、双丙氨磷抗性基因、草甘膦抗性基因等药剂抗性基因也可以作为这种标记基因使用。在药剂选择步骤中将添加于选择培养基的药剂浓度控制为未导入药剂抗性基因的细胞不死亡的程度时，未导入药剂抗性基因的细胞虽然没有完全灭绝，但几乎不增殖，与正常的细胞在外观上产生不同，因此，可以与药剂抗性基因导入细胞进行识别。

以上，可以进行细胞的视觉识别的基因、例如催化呈色反应的酶的基因、药剂抗性基因也具有可进行阴性选择的性质，可以作为本发明的第一标记基因利用。

另外，作为本发明的“第一标记基因”，可以优选使用阴性选择标记基因。在本说明书中，将具有表达时选择性除去含有基因的细胞自身的性质的标记基因称为阴性选择标记基因。予以说明，还包括下述基因，在对植物细胞或培养基添加特定物质的情况下，其选择性消除含有基因的细胞自身的特性发挥功能。另外，阴性选择标记基因不一定限定于结构基因，可以使用编码蛋白质的结构基因以外的非结构基因、例如非编码RNA的表达序列等。阴性选择标记基因在该基因被整合于植物基因组中并且从基因导入处理后至植物体的再生期间进行表达，由此诱导细胞死亡、细胞的生长停止、或异常的组织形成。使用细胞死亡诱导型的阴性选择标记基因作为标记基因的情况下，标记基因表达细胞灭绝，因此，不需要除去标记基因表达细胞的操作，操作效率大幅度提高。

在再生的植物体中，优选不残存阴性选择标记基因。本领域技术人员可以适当选择这种阴性选择标记基因。另外，阴性选择标记基因的表达优选为在瞬时表达的阶段不诱导细胞死亡的水平。在本发明的共转化步骤中，可以产生仅目标DNA被整合于基因组且阴性选择标记基因进行瞬时表达的细胞，但这种细胞的一部分得到培养而成为仅含有目标DNA的细胞。因此，从防止转化效率的降低的观点出发，优选通过阴性选择标记基因的瞬时表达而不使这种细胞灭绝。例如阴性选择标记的毒性强的情况下，优选适用减少该标记基因的表达的启动子等而抑制毒性。本领域技术人员可以基于公知的技术适当进行这种表达调节。予以说明，并不受限定，在本申请实施例中，记载有在使用芽孢杆菌RNA酶基因作为阴性选择标记基因的情况下，使用nos启动子是适当的。

植物中最广泛使用的阴性选择标记基因为源自大肠杆菌的codA基因(Yau andStewart，2013)。codA基因编码胞嘧啶脱氨酶，将没有毒性的5-氟胞嘧啶(5-FC)变换为有毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU)。大肠杆菌的鸟氨酸脱乙酰基酶基因的argE将植物中没有毒性的N-乙酰基草铵膦(N-乙酰基-PPT)变换为具有除草剂活性的草铵膦(PPT)。细菌的细胞色素P450sui将非毒性的除草剂R4702前体变换为细胞有毒性的除草剂R4702。白喉毒素片段A(DT-A)在植物细胞中显示毒性，但在大肠杆菌或土壤杆菌中没有毒性(Terada et al.，2002)。另外，由于在DT-A基因中没有附加poly-A信号，因此，瞬时表达的mRNA立即被分解，在整合于基因组的情况下，利用附近的poly-A信号而持续地表达。芽孢杆菌RNA酶为源自解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的核糖核酸酶。它对原核生物及真核生物均具有强的毒性，但通过使内含子插入基因中，可以抑制对原核生物的毒性(Burgess etal.，2002)。并不受限定，在本发明的方法中，可以将这些基因作为阴性选择标记基因优选使用。

予以说明，在本申请发明的步骤中，不包含通过使用第一标记基因的阳性选择而除去仅将所期望的DNA导入染色体的转化细胞的步骤。阳性选择的定义在“第二标记基因”的项中进行详述，如果使用第一标记基因进行阳性选择情况下，会除去仅将所期望的DNA导入染色体的转化细胞，因此无法得到本申请发明的效果。

在本发明的方法中，对使用的第一标记基因的数量没有限定。可以优选使用1～2种标记基因。

所期望的DNA

“所期望的DNA”为进行向细胞的导入的任意的DNA，没有特别限定。所期望的DNA为导入植物细胞的染色体(基因组)的DNA，不一定限定于结构基因，可以使用编码蛋白质的结构基因以外的非结构基因。可以在“所期望的DNA”上连接所期望的启动子及终止子。“所期望的DNA”可以使用与所使用的转化方法相应的任意长度的DNA。例如，使用土壤杆菌法的情况下，优选0.1kb-50kb的长度的DNA，这不限制本发明。

对供于共转化的所期望的DNA和第一标记基因的混合比率没有特别限定，但优选3:1～1:5之间，更优选2:1～1:3之间。

转化方法

本发明中转化方法只要是可以转化植物的方法，就没有特别限定，可以根据植物的种类而适当选择。例如可以优选使用粒子枪法、电穿孔法、电注射法、聚乙二醇法、须晶法等物理化学的方法(DNA的直接导入法)或土壤杆菌法等生物学的方法(DNA的间接导入法)。

共转化

在本说明书中，将源自外源性遗传物质(外源性DNA)的导入、整合(及表达)的细胞的遗传修饰称为转化。另外，该术语也用于指为了修饰而进行的步骤(工艺)。而且，将独立的两个以上的外源性遗传物质同时进行转化称为共转化。同样地，该术语也用于指进行它的步骤。予以说明，“独立的”意指两个以上的外源遗传材料不是作为整体的DNA，而是作为分别能够独立运行的DNA导入细胞中。

在通过土壤杆菌的共转化法中，有如下4种类型：多个T-DNA分别位于一个菌株中的多个二元载体上的类型(1菌株多载体法)、两个T-DNA位于一个菌株中的一个二元载体上的类型(1菌株1载体法)、两个T-DNA分别位于两个菌株的二元载体上并且混合接种菌株的类型(2菌株法)、和含有通过使用两个右侧边界序列获得的两个基因的一个T-DNA位于一个菌株的一个二元载体上(Yau and Stewart，2013)。在本发明中，任一种类型的方法均可以优选实施。关于2菌株法，菌株的数目没有特别限定于2个菌株，而是多个T-DNA可以分别位于要混合接种的多个菌株的二元载体上。

予以说明，第四类是利用双右侧边界方法的方法。其为用土壤杆菌法进行转化时的选择标记除去方法之一(Yau and Stewart，2013)。即，在此方法中，以成为“RB(右边界序列)-阳性选择标记-RB-所期望的DNA-LB(左边界序列)”的顺序的方式构成T-DNA，将“RB-阳性选择标记-RB-所期望的DNA-LB”和“RB-所期望的DNA-LB”导入植物的各自的染色体，从而使它们在下一代分离。通过应用该方法，以成为“RB-阴性选择标记-RB-阳性选择标记-所期望的DNA-LB”(或“RB-阴性选择标记-RB-所期望的DNA-阳性选择标记-LB”)的方式构成T-DNA并用于转化，产生“RB-阴性选择标记-RB-所期望的DNA-阳性选择标记-LB”和“RB-所期望的DNA-阳性选择标记-LB”，成为与进行2种T-DNA的共转化的情况相同的状况。因此，即使在该情况下通过将此方法应用于本发明的方法，由此可以排除多拷贝数转化细胞。在本说明书中，使用此类T-DNA的转化也包含在共转化中。

粒子枪法为将在金或钨等金属的微粒上涂敷有DNA的物质作为子弹、以高速射出而在细胞内导入DNA的方法。也被称为生物射弹法、颗粒轰击法、或微粒法。就子弹而言，从为高比重且向细胞内的贯通力高、并且化学上为惰性、对生物体不易带来伤害的理由出发，优选金微粒。在金属微粒的射出中主要使用氦等高压气体。可以根据气体的压力或金属粒子和试样间的距离等调节金属微粒的射出强度，可以通过此方法向各种各样的细胞导入DNA。在粒子枪法中，可以通过将2种以上的DNA涂敷于金属的微粒、作为子弹在细胞内导入DNA而进行共转化。

电穿孔法为通过对细胞悬浮液施加电脉冲而在细胞膜中打开微小的孔、将细胞悬浮液中的DNA送入至细胞内部而进行转化的方法。在将植物细胞设为材料的情况下，一般使用分解除去了细胞壁的原生质体。但是，也可以使用具有细胞壁的细胞进行转化，其被称为电注射法。在电穿孔法或电注射法中，可以通过将2种以上的DNA溶解于悬浮液中、在植物细胞存在下施加电脉冲而进行共转化。

聚乙二醇法为使聚乙二醇(PEG)与原生质体作用、使DNA掺入植物细胞内部。该DNA掺入的机制还不清楚。

须晶法为使用被称为须晶的针状的物质刺穿植物细胞，从而使DNA掺入细胞内的方法。在须晶中可使用碳化硅或硼酸铝等。

另外，关于所期望的DNA和标记基因的转化，双方既可以使用相同的转化方法，也可以使用不同的转化方法，但使用相同的转化方法进行共转化是有效的，更优选。

第二标记基因

另外，可以在所期望的DNA上连接作为第二标记基因的阳性选择标记基因。特别是所期望的DNA不能用作确定转化成功与否的指标的情况，即所期望的DNA不具有作为标记基因的性质的情况下，优选在该DNA上连接阳性选择标记基因。

本说明书中“阳性选择”是指选择性地选择标记标记基因表达的细胞，将可在阳性选择中使用的标记基因称为阳性选择标记基因。

视觉上可以识别标记基因表达细胞和没有导入标记基因的细胞的情况下，可以从细胞群中人为地、例如在显微镜下使用镊子或手术刀等器具除去选择标记基因表达细胞。因此，可以将具有对细胞赋予荧光等视觉上可识别的性质的特征的基因作为阳性选择标记基因使用。作为这样的标记基因的实例，可列举：绿色荧光蛋白质(GFP)、红色荧光蛋白质(DsRed)、萤光素酶基因等荧光蛋白质基因、lacZ基因等催化呈色反应的酶的基因等。

另外，作为阳性选择标记基因，可以优选使用下述基因，所述基因在从基因转移过程直至植物再生的期间在植物染色体基因组中整合和表达时防止细胞死亡、细胞生长停滞或异常组织形成等细胞现象。通过设定为表达这种阳性选择标记基因的细胞能够存活、但是不表达该阳性选择标记基因的细胞不能存活的条件，可以有效地进行阳性选择。并不受限定，作为阳性选择标记基因的实例，可列举：潮霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因、壮观霉素抗性基因、四环素抗性基因等抗生素抗性基因、双丙氨磷抗性基因、草甘膦抗性基因等除草剂抗性基因、磷酸甘露糖异构酶(phosphormannose isomerase：PMI)基因、2-脱氧葡萄糖-6-磷酸酶基因或木糖异构酶基因等对植物赋予新的糖代谢能力的基因。

予以说明，抗生素或除草剂对植物的非转化细胞而言具有有害的作用，但甘露糖或木糖之类的糖虽然对植物而言为不能进行代谢的碳源，但是没有有害性。在此，将植物本来不能代谢的碳源作为选择药剂，并与能将这些碳源变换为植物可以代谢的碳源的酶基因作为选择标记组合，构建对非转化细胞不产生有害的影响的选择系统。将该系统称为(狭义的)阳性选择系统，有时将该选择标记称为(狭义的)阳性选择标记基因(Upadhyaya etal.，2010)。但是，如上所述，本发明中阳性选择是指选择性地选择标记基因表达的细胞，将可在阳性选择中使用的标记基因称为阳性选择标记基因，并且这些术语不限定于狭义的内容。

因此，本申请发明也包含如下实施方案：

在用于步骤(a)的所期望的DNA上连接作为第二标记基因的阳性选择标记基因，

通过使用第二标记基因的阳性选择而进行在步骤(b)中对染色体中导入有所期望的DNA的转化细胞的选择。

“在所期望的DNA上连接作为第二标记基因的阳性选择标记基因”是指：所期望的DNA和第二标记基因彼此连接，在转化中两者同时运行。因此，在通过转化将所期望的DNA整合于植物细胞的染色体的情况下，第二标记基因也被整合。另一方面，在转化失败、所期望的DNA没有被整合于植物细胞的染色体的情况下，第二标记基因也没有被整合。该点，第二标记基因与第一标记基因在转化的位置上不同，所述第一标记基因作为与所期望的DNA分开并且独立于所期望的DNA的DNA共转化并且不同运行。

例如，通过两个T-DNA位于一个菌株中的一个二元载体上的土壤杆菌法类型(1菌株1载体法)进行共转化时，所期望的DNA和第二标记基因彼此进行连接，以被夹持于“RB”和“LB”之间。例如，“RB-第二标记基因-所期望的DNA-LB”。另一方面，第一标记基因夹持于与夹持所期望的DNA的“RB”和“LB”不同的“RB”和“LB”之间。例如，序列参照本申请的图5。或者，采用双右边界法的情况下，例如，可以以成为“RB-阴性选择标记-RB-阳性选择标记-所期望的DNA-LB”(或“RB-阴性选择标记-RB-所期望的DNA-阳性选择标记-LB”)的方式构成T-DNA。

转化细胞的选择

在本说明书中，转化细胞是指外来基因经过转化过程而被整合于染色体基因组的细胞或其后代。

在本发明的步骤(b)中，从步骤(a)中得到的转化植物细胞中选择在染色体中导入所期望的DNA、且没有导入第一标记基因的转化细胞。

对这些选择的顺序没有特别限定。具体而言，可以为如下任一种方案：

1)除去含有第一标记基因的转化细胞，并且对剩余的细胞选择含有所期望的DNA的转化细胞；

2)选择含有所期望的DNA的转化细胞，并且对剩余的细胞除去含有第一标记基因的转化细胞；或者

3)同时进行含有第一标记基因的转化细胞的除去和含有所期望的DNA的转化细胞的选择。

“除去含有标记基因的转化细胞”例如在第一标记基因为阴性选择标记基因的实施方案中，在该基因被导入染色体的细胞中阴性选择标记基因表达的情况下，通过引起细胞死亡、细胞的增殖停止、或异常的组织形成等的阴性选择，可以除去含有标记基因的转化细胞。

“含有所期望的DNA的转化细胞的选择”也在所期望的基因为标记基因的情况下，仅选择具有基于标记基因的表达的性质的细胞。所期望的DNA不能用作确定转化成功与否的指标的情况、即所期望的DNA不是标记基因的情况下，优选在该DNA上连接阳性选择标记基因。仅选择具有基于该阳性选择标记基因的表达的性质的细胞。

所期望的DNA、第一标记基因、第二标记基因的各基因的表达可以为组成性的，也可以为诱导性。在表达为诱导性的情况下，例如可以利用后述的从外部给予的特定化合物诱导基因表达。诱导性表达除从外部给予的特定化合物以外，可以通过高温处理、低温处理等应力处理而进行。

予以说明，在转化细胞的选择中，不包含使转化植物杂交而得到的转化植物后代中利用选择标记的选择。

利用特定化合物的基因表达诱导系统

有利用从外部给予的化合物诱导基因表达的方法。在本发明的方法中，可以使用利用这种特定化合物的基因表达诱导系统控制选择标记基因的表达时间。特别是使用在瞬时表达水平上诱导细胞死亡或细胞生长停滞的强阴性选择标记基因作为第一标记基因的情况下，从转化效率的观点出发，优选将标记基因的表达时期推迟到标记基因被整合于染色体基因组。这种情况下，可以使用利用下述的特定化合物的基因表达诱导系统控制表达时间。

作为这种基因表达诱导系统的条件，可列举：(1)特定化合物作为诱导剂或活化剂对于控制反式转录因子的活性是必需的，并且此类化合物在植物的生命周期中自身不能合成，并且具有接触植物的低可能性的条件；(2)植物不含控制转录的启动子的顺式元件的条件。例如，利用进化上远缘的细菌等的顺式元件时，植物自身本来具有的反式转录因子与其顺式元件相互作用的可能性较低。为了满足上述的条件，合成嵌合/反式转录因子，其中将与源自细菌的顺式序列连接的域的氨基酸序列、与用于控制转录因子的活性的特定化合物连接的区的氨基酸序列、及与转录活化域的氨基酸序列的三个区域进行了融合。目前，正在开发利用四环素或雌二醇等的基因表达诱导系统。

(i)四环素诱导系统：存在于大肠杆菌的转座子Tn10的四环素抗性操纵子(tet操纵子)的表达由作为阻遏物的TetR(氨基酸序列)和作为操纵基因的tetO(5’-TCCCTATCAGTGATAGAGAA-3’)负控制。在缺乏四环素的情况下，TetR与tetO连接而抑制转录，但在四环素存在下从tetO中解离。即，四环素为tet操纵子的诱导剂。因此，与植物中组成性表达的基因的启动子下游连接的TetR的tetR基因与多个与另一个启动子下游连接的tetO组合，期望表达的基因与所述另一个启动子的下游连接。通过将四环素作为诱导剂进行给药而诱导tetO下游的基因。予以说明，作为诱导剂，与四环素相比，多西环素的诱导性高。

(ii)雌二醇诱导系统：这是一种转录诱导系统，其含有合成的转录活化物XVE(氨基酸序列)并且将作为最初与LexA连接的操纵基因的SOS盒(5’-TACTGTATATATATACAGTA-3’)作为与XVE连接的顺式序列在CaMV35S最小启动子的TATA盒的上游定位，所述合成的转录活化物XVE通过融合LexA(即，大肠杆菌的SOS调节子(regulon)的阻遏物)的位置1-87的氨基酸残基、源自单纯疱疹病毒(HSV)的VP16(氨基酸序列)的转录活性位点(第403-479位氨基酸残基)、人雌激素受体的调节域(282-595位氨基酸残基)获得。在缺乏雌二醇时，CaMV35S最小启动子几乎没有转录活性。但是，XVE与雌二醇彼此结合时，XVE与SOSbox结合而强力地诱导下游的CaMV35S最小启动子的转录活性。即，这为正调节系统。

转化植物的制备方法

本发明进而涉及一种转化植物的制备方法。本发明的转化植物的制备方法包含：通过取得本发明的转化的植物细胞的方法，取得转化的植物细胞；将所述植物细胞进行培养而得到植物体。

在本发明的方法中，将转化细胞进行培养。将转化细胞进行培养而得到植物体的步骤可以使用与植物的种类相应的任意的方法。

作为培养基，可列举例如以LS无机盐类或N6无机盐类为基本的培养基、例如具体而言为LSZ培养基等。培养基可以含有选择药剂。本步骤中的“培养”是指：在固化的培养基上或液体培养基中放置植物细胞或植物组织，以在适当的温度、明暗条件下培养适当的时间段。在本发明中，就培养基的方案而言，只要是将培养基成分充分供给至植物组织，就没有特别限定。培养基的固化可以通过例如琼脂糖等来进行。本步骤中的培养温度可以适当选择，并且在优选20℃-35℃、进一步优选25℃下进行。另外，本步骤的培养在优选16-24小时/天的光照条件下进行，但并不限定于此。本步骤的培养期间也可以适当选择，优选为7天-21天，更优选为14天。

植物的转化方法

本发明还涉及植物的转化方法。本发明的方法包含以下的步骤：

实施例

以下，基于实施例，详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。本领域技术人员可以基于本说明书的记载容易地对本发明加以修饰、变更，这些也包含在本发明的技术的范围。

实施例1共转化载体的构建

1)目标DNA及阳性选择标记基因

使用蓖麻过氧化氢酶基因的第一个内含子介导的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因作为目标DNA，使用潮霉素抗性(HPT)基因作为阳性选择标记基因。GUS基因由35S启动子控制，终止子使用nos。HPT基因由玉米泛素(Ubi)基因的启动子控制，终止子使用nos。予以说明，在HPT翻译区域的上游定位有玉米的泛素基因的第一个内含子。

2)阴性选择标记基因

阴性选择标记基因使用解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶基因。表达由nos启动子控制，终止子使用35S。另外，由于芽孢杆菌RNA酶的表达会使大肠杆菌或土壤杆菌死亡，因此，使稻Rf-1基因的第5ge内含子介入芽孢杆菌RNA酶基因(Pnos-芽孢杆菌RNA酶-T35S)。由此，此标志物可以被改变为仅在植物细胞内表达的阴性选择标记。将稻Rf-1基因的第5个内含子介入了使用的解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶基因中的序列示于序列号1，将解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶基因的序列示于序列号2，将稻Rf-1基因的第5个内含子的序列示于序列号3。序列号1的碱基180-288的碱基序列相当于序列号3的稻Rf-1基因的第5个内含子的碱基序列。

3)二元载体pLC41 GUS-HPT(图2)的构建

国际申请公开WO2007/148819A1中所记载的国际载体pLCleo(别名pLC41GWH)为具有复制起点oriV的IncP质粒。oriV在大肠杆菌及土壤杆菌这两者中起作用。通过将pLC41GWH的EcoRI-PmeI片段及具有多克隆位点的pSB11(Komari et al.，1996)的EcoRI-PmeI片段连接，得到在T-DNA上仅具有多克隆位点的二元载体pLC41(图3)。

pLC41 GUS-HPT载体的构建按照以下的步骤进行。首先，进行将GUS-HPT片段扩增的PCR。将pSB34(Hiei and Komari，2006)作为模板，使用引物GUS-HPT in pSB34 F(其含有位于GUS下游的Tnos的3’部分和位于下游的编码SpeI的序列)、和引物GUS-HPT in pSB34 R(其位于HPT下游的Tons的3’部分和位于下游的编码KpnI的序列)进行PCR。将得到的GUS-HPT片段用SpeI和KpnI进行双重消化，在预先用XbaI和KpnI进行了双重消化的pLC41载体上进行连接，由此得到载体pLC41 GUS-HPT。将该载体用电穿孔法导入土壤杆菌LBA4404，得到LBA4404(pLC41 GUS-HPT)(图1-b左)。

[表1]

表1：pLC41 GUS+HPT相关引物

4)二元载体pLC41芽孢杆菌RNA酶(图4)的构建

载体pLC41芽孢杆菌RNA酶的构建按照以下的步骤进行。首先，对Pnos-芽孢杆菌RNA酶-T35S片段(以下，芽孢杆菌RNA酶片段)进行合成，在pUC57载体的EcoRV位点进行克隆(芽孢杆菌RNA酶/pUC57)。接着，进行扩增芽孢杆菌RNA酶片段的PCR。使用芽孢杆菌RNA酶/pUC57作为模板，并且使用编码M13测序引物区域的M13/pUC24mer、和在pUC57的多克隆位点的3’部分加入编码AvrII的序列的pUC57476(ArII)longR作为引物。其结果，得到1120bp的PCR产物。将该芽孢杆菌RNA酶片段在载体pCR4TOPO(Invitrogen公司制备)上进行TA克隆，得到pCR4TOPO/芽孢杆菌RNA酶。

接着，在pLC41的RB-LB间的多克隆位点插入芽孢杆菌RNA酶片段。具体而言，将pLC41用XbaI消化后，进行脱磷酸化，与预先进行了SpeI消化的pCR4TOPO/芽孢杆菌RNA酶的芽孢杆菌RNA酶片段进行连接，得到pLC41芽孢杆菌RNA酶(图4)。将该载体用电穿孔法导入土壤杆菌LBA4404，得到LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶)(图1-b右)。

[表2]

表2：pLC41芽孢杆菌RNA酶相关引物

5)双重T-DNA二元载体pLC41 GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶(图5)的制备

接着，将pLC41芽孢杆菌RNA酶作为模板，进行扩增从RB上游的约330bp至LB下游的约520bp的RB-芽孢杆菌RNA酶-LB的PCR，另外，将pLC41 GUS-HPT作为模板，进行扩增从KorB至ori的pLC41 GUS-HPTKorBtooriT的PCR。在用于RB-芽孢杆菌RNA酶-LB的PCR反应中，使用由编码RB的约330bp上游部分的序列构成的5’末端磷酸化引物(pLC41330bp-RBF+P)和由编码LB的约520bp下游部分的序列构成的5’末端磷酸化引物(pLC41LB-520bpR+P)。在用于pLC41 GUS-HPTKorBtooriT的PCR反应中，使用由在下游方向编码oriT-IncC间的部分的序列构成的引物pLC41oriT-IncCF及由在上游方向编码oriT-IncC间的部分的序列构成的引物pLC41oriT-IncCR。其结果，在RB-芽孢杆菌RNA酶-LB片段中得到约2280bp的PCR产物，在pLC41 GUS-HPT KorBto oriT片段中得到约17000bp的PCR产物。

将RB-芽孢杆菌RNA酶-LB片段和pLC41 GUS-HPT KorBto oriT片段进行连接，得到载体pLC41 GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶(图5)。

将该载体用电穿孔法导入土壤杆菌LBA4404，得到LBA4404(pLC41 GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶)(图1-a)。

[表3]

表3：pLC41 GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶相关引物

6)三元载体pGW芽孢杆菌RNA酶(图7)的制备

在专利文献WO2007/148819A1中公开一种在土壤杆菌中能够与二元载体pLC41(IncP型)共存、且具有源自pTiBo542的virGN54D的pVGW2(IncW型)载体。在本实施例中，将载体pVGW2通过从中除去virGN54D而修饰为更简单的载体pGW(图6)。具体而言，以pVGW2为模板，通过pSa5‘EcT22I和M13(-20)Fw的引物集进行PCR，使得到的片段自身连接，以获得用作三元载体的新克隆载体pGW(图6)。载体pGW可以与第二载体(二元载体)pLC41同时作为第三载体(三元载体)在相同土壤杆菌中保持，并且在各自的载体上可以分别地定位T-DNA。因此，可以仅使用1种土壤杆菌将连接有阳性选择标记基因的目标DNA和阴性选择标记基因进行共转化(图1-c)。以pLC41芽孢杆菌RNA酶为模板，进行用于在RB-芽孢杆菌RNA酶-LB盒的两端之每个添加SpeI位点的PCR。在PCR反应中，使用由在RB上游的330bp添加有SpeI位点的序列构成的引物pLC41330bp-RB+SpeIF(10pmol/ul)及由在LB下游的520bp添加有SpeI位点的序列构成的引物pLC41520bp-LB+SpeIR。其结果，得到作为2300bp的PCR产物的RB-芽孢杆菌RNA酶-LB的SpeI片段。将该片段在预先用XbaI进行了消化的pGW上进行连接，得到在正向方向插入有RB-芽孢杆菌RNA酶-LB片段的pGW芽孢杆菌RNA酶。

将完成的pGW芽孢杆菌RNA酶与pLC41 GUS-HPT同时利用电穿孔法导入土壤杆菌LBA4404，得到LBA4404(pLC41 GUS-HPT::pGW芽孢杆菌RNA酶)(图1-c)。

[表4]

表4：pGW芽孢杆菌RNA酶相关引物

实施例2使用共转化载体系统的稻转化

材料及方法

1)供试土壤杆菌菌株及载体

在下述的3种用于消除多拷贝细胞的共转化载体系统中进行连接有阳性选择标记基因的目标DNA和阴性选择标记基因的共转化。

a.1菌株1载体型：LBA4404(pLC41 GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶)(图1-a)

b.2菌株混合型：LBA4404(pLC41 GUS-HPT)+LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶)(图1-b)

c.1菌株2载体型：LBA4404(pLC41 GUS-HPT::pGW芽孢杆菌RNA酶)(三元载体系统)(图1-c)

2)稻的转化方法

在水稻品种中使用雪光(Yukihikari)。在开花后第10天左右采集在温室内栽培的稻的穗。将用镊子除去了颖片的未熟种子进行杀菌之后，在实体显微镜下采集1.3-1.8mm长的未熟胚。对这些未熟胚以20,000xg的离心加速度进行10分钟的离心处理。土壤杆菌在含有与菌株的药剂抗性相应的选择药剂的AB培养基(Chilton et al.，1974)上、在28℃黑暗下培养3天后，悬浮于1.0ml的AA-inf培养基(AA主要为无机盐类、B5微量无机盐类、B5维生素、AA氨基酸、0.1mM乙酰丁香酮、20g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、0.5g/l维生素检测酪蛋白氨基酸、pH5.2)中。悬浮浓度以660nm的OD值计调整为约1.0。予以说明，将2菌株混合接种的情况下，2菌株均以OD值计调整为约1.0之后，进行混合并接种。接着，将未熟胚在共培养用的N6-As培养基(N6无机盐类及维生素、1mg/l的2,4-D、0.5mg/l的6BA、20g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、0.5g/l脯氨酸、0.5g/l维生素检测酪蛋白氨基酸、8g/l琼脂糖I型、0.1mM乙酰丁香酮、pH5.2)上使盾片面朝上放置未熟胚，滴加土壤杆菌的悬浮液。共培养在25℃黑暗下进行7天。

共培养后，将每个未熟胚切成4-6个切片，使盾片朝上，置于nN6C培养基(N6无机盐类及维生素、1mg/l的2,4-D、0.5mg/l的6BA、20g/l蔗糖、55g/l山梨醇、0.5g/l脯氨酸、0.5g/l维生素检测酪蛋白氨基酸、5g/l结冷胶(gellan gum)、250mg/l头孢噻肟、100mg/l羧苄西林、pH5.8)，在30℃、5,000lx光照条件下进行10天非选择(静息)培养。将未熟胚的每个切片进一步切成4-5个切片，置于nN6CH50(N6无机盐类及维生素、1mg/l的2,4-D、0.5mg/l的6BA、20g/l蔗糖、55g/l山梨醇、0.5g/l脯氨酸、0.5g/l维生素检测酪蛋白氨基酸、5g/l结冷胶、250mg/l头孢噻肟、100mg/l羧苄西林、50mg/l潮霉素B、pH5.8)选择培养基，在30℃、5,000lx光照条件下进行10-14天利用潮霉素的选择培养。

将增殖的愈合组织置于N6RH50再生培养基(N6微量无机盐类及维生素、1/2浓度N6主要无机盐类、AA氨基酸、0.5mg/l激动素、20g/l蔗糖、30g/l山梨醇、0.5g/l维生素检测酪蛋白氨基酸、4g/l结冷胶、50mg/l潮霉素B、pH5.8)，在30℃、5,000lx光照条件下培养14天。置于再生培养基的愈合组织的数目是每未熟胚切片的单个部分为1个。由此，可以将在再生培养基上放置的各自的愈合组织作为独立的转化事件处理。将再生的幼苗移植于N6FH50生根培养基(N6微量无机盐类及维生素、1/2浓度N6主要无机盐类、AA氨基酸、20g/l蔗糖、0.5g/l维生素检测酪蛋白氨基酸、4g/l结冷胶、50mg/l潮霉素B、pH5.8)，在30℃、5,000lx光照条件下培养10-14天。每个生根的植物体移植到盆，在温室内进行栽培。

3)稻转化体的Southern分析

从在温室内进行了栽培的潮霉素耐性转化体的叶中利用酚-氯仿提取法提取基因组DNA。将基因组DNA用KpnI消化后，使用TypeII琼脂糖(SIGMA公司)在TAE缓冲液中进行琼脂糖电泳。通过碱性印迹法进行对尼龙膜转移后，将hpt作为探针进行Southern杂交(图8-a)。另外，通过使用1菌株1载体型的LBA4404(pLC41 GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶)(图1-a)得到的51稻转化植物用SalI消化，然后进行以芽孢杆菌RNA酶为探针的Southern分析(图8-b)。

结果及讨论

1)稻的转化结果

在任何实验区中均可得到转化体，但与仅导入有GUS-HPT的对照区相比，在将芽孢杆菌RNA酶进行了共转化的实验区中，转化效率更低(表5)。这是由于作为阴性选择标记的芽孢杆菌RNA酶与GUS-HPT同时被整合于同一稻细胞的染色体，并且该细胞通过芽孢杆菌RNA酶的表达而致死。芽孢杆菌RNA酶引起的稻的细胞死亡以盾片表面上的细胞中部分引起的明显褐变的形式出现。从接种土壤杆菌后10天-20天开始观察到褐变。这先于选择培养的开始，因此，褐变不是潮霉素导致的影响。另外，7天的共培养之后即刻，未熟胚的盾片细胞中的瞬时GUS活性没有得到阻止，将作为底物的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸(X-Gluc)溶液进行处理时，对照以及3种实验区中均显示同等GUS活性。其显示：芽孢杆菌RNA酶以瞬时表达的水平没有使细胞致死。

在使用1菌株1载体法的LBA4404(pLC41 GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶)时，可看到30％的效率降低(表5)。通过LBA4404(pLC41 GUS-HPT)和LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶)的2菌株混合接种法、以及LBA4404(pLC41 GUS-HPT::pGW芽孢杆菌RNA酶)的1菌株2载体法获得的转化效率为同程度，二者都为90％以上(表5)。在1菌株1载体法中，显示两种T-DNA对同一细胞的导入效率高。这推测是因为，在1菌株1载体法中，与其它实验区相比，2种T-DNA在基本上相同的时机被大量切除以转移至植物细胞。另外，在芽孢杆菌RNA酶以瞬时表达水平诱导细胞死亡的情况下，预料转化的效率非常低。由于没有获得这种结果，因此，认为通过nos启动子适当控制芽孢杆菌RNA酶的表达。

[表5]

雪光稻品种中的转化效率

＊对照：LBA4404(pLC41 GUS-HPT)

1菌株1载体：LBA4404(pLC41 GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶)

2菌株混合：LBA4404(pLC41 GUS-HPT)+LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶)

1菌株2载体：LBA4404(pLC41 GUS-HPT::pGW芽孢杆菌RNA酶)

2)利用Southern法的导入拷贝数的分析

将使用hpt探针进行Southern杂交的结果示于图9。由每种经分析的转化体检测的至少一条带具有6.7kb以上的大小。6.7kb以上的带的检测暗示GUS-HPT的整个T-DNA被导入。在对照的载体中，分析植物中的47％为单拷贝导入，与此相对，在1菌株1载体系统中，在2倍以上的89％的植物中为单拷贝导入。另外，残余的11％的植物全部显示2拷贝导入(图9)。在2菌株混合系统和1菌株2载体系统中，在单拷贝植物的比例上几乎没有差异，分别为67％及65％，增加至对照的1.43倍及1.38倍(图9)。这样，在实验区中，低拷贝导入植物的比例显著地增加，其显示：在共转化中，在向同一细胞的染色体多拷贝导入GUS-HPT的情况下，用作阴性选择标记的芽孢杆菌RNA酶基因趋于一起。Wang and Waterhouse(2000)报道了：在用土壤杆菌法得到的许多稻转化体植物中，彼此以正向或互相反向方向重复连接的T-DNA被整合于相同基因座中。推测生成此类转化植物的细胞在与阴性选择标记基因的共转化中被杀死。

对使用1菌株1载体法的LBA4404(pLC41 GUS-HPT共转化芽孢杆菌RNA酶)得到的51个稻转化体植物实施使用芽孢杆菌RNA酶探针的Southern杂交。在全部的植物中，未检测出与芽孢杆菌RNA酶基因杂交的信号。可知：为了诱导植物的细胞死亡，导入的Pnos-Int芽孢杆菌RNA酶-T35S是必需且充分表达的。推测为：芽孢杆菌RNA酶即使极少的表达量也诱导细胞死亡。

3)结论

可知：通过阴性选择标记基因和含有阳性选择标记基因的目标DNA的共转化，可以在培养的初期排除多拷贝导入细胞。在实施例中，使用3种土壤杆菌的载体系统，但不限于该系统，容易地推测为可以使用一大批转化系统。考虑到机制，明显的是：关于粒子枪等DNA的直接导入法也可以适用于共转化。在直接导入法中，最初经常发生多拷贝导入，因此，此方法非常有效用于减少拷贝数。

实施例3：通过使用芽孢杆菌RNA酶的共转化消除烟草的多拷贝转化体

材料及方法

1)烟草的转化

利用安替佛民(antiformin)将烟草品种SR1的种子进行杀菌处理，无菌地播种于生根培养基(1/2浓度LS无机盐、1/2浓度LS维生素、15g/l蔗糖、3g/l结冷胶、250mg/l头孢噻肟、pH5.8)。播种后，在25℃光照条件下进行培养，培育至子叶完全展开。将通过用剪子切除完全展开的子叶的前端和基部而得到的长方形的子叶区段用于土壤杆菌的感染。土壤杆菌的接种通过将子叶区段收集到皿中的LSR液体培养基(LS无机盐、LS维生素、30g/l蔗糖、0.5g/l的2-吗啉代乙磺酸(MES)一水合物、pH5.8)上、将该液体培养基更换为土壤杆菌的悬浮液并浸渍其中的区段10分钟来进行。土壤杆菌悬浮液通过在补充有50mg/l卡那霉素的AB培养基上在28℃黑暗下将土壤杆菌培养3天、悬浮于LSR液体培养基而制备。悬浮浓度以660nm的OD值计调整为1.0。在两个实验区中进行测试，即，在将LBA4404(pLC41 GUS-HPT)进行单独接种的对照区以及将LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶)和LBA4404(pLC41 GUS-HPT)的2菌株进行混合接种的实验区。

接种土壤杆菌之后，将叶区段在使该区段的背侧朝上的情况下置于补充有3g/L结冷胶的LSR固体培养基上，在25℃黑暗下进行2天共培养。共培养后，将叶区段移植到LS-S培养基(LS无机盐、LS维生素、10mg/l6-(γ,γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2ip)、0.3mg/l吲哚-3-醋酸(IAA)、30g/l蔗糖、250mg/l头孢噻肟、pH5.8)，在28℃光照条件下培养2～4天。接着，移植到补充有50mg/l潮霉素的LS-S培养基，进行潮霉素抗性细胞的选择。从叶区段中切下由每个叶区段的切口端得到的潮霉素抗性芽，移植到含有50mg/l潮霉素和250mg/l头孢噻肟的生根培养基。这样得到的生根植物体移植到含有具有相同培养基组成的培养基的具有大容积的培养容器(77mm长度，77mm宽度：97mm高度)，培养至进行取样。将这样得到的潮霉素抗性植物体作为转化体用于以下的分析。

2)利用定量实时PCR法测量烟草转化体植物中的导入DNA的拷贝数

对于测量转化的烟草植物中整合的T-DNA的拷贝数，使用定量实时PCR。采用多重PCR，其中将标靶DNA区域和内部标准DNA区域在同一孔内进行扩增。标靶DNA区域设为HPT基因内。从各转化体植物的叶中，使用E.Z.N.A.(注册商标)SP Plant DNA Kit(OmegaBio-tek公司)提取基因组DNA，制备成12.5ng/μl的浓度。使用Applied Biosystems(注册商标)7500实时PCR系统(Life Technologies公司)，在96孔PCR板中反复进行实时PCR的三个循环，并且将此PCR实施2次。在PCR反应液中含有25μl Premix Ex.Taq(TaKaRa公司)和5μl模板DNA和0.3-0.4μM的引物、及0.2-0.24μM的TaqMan MGB探针(LifeTechnologies公司)，总量设为50μl。PCR引物和TaqMan MGB探针根据Primer Express(Life Technologies公司)而设计。所设计的引物和探针名称如下所述，其序列示于表6。使用NtBWC1-5F及NtBWC1-5R作为内部标准用引物，使用NtBWC1-5P作为内部标准TaqMan MGB探针。使用Hpt-2F及Hpt-2R作为标靶DNA用引物，使用Hpt-2P作为标靶DNA用TaqMan MGB探针。全部的实时PCR实验按照以下的程序实施。即，在95℃下30秒1次，接着是95℃5秒和60℃34秒的40次。荧光按照各循环中的60℃的伸长步骤进行监视。

为了评估定量PCR分析的效率及相对定量，使用基于基因组DNA的5种浓度(36、18、9、4.5及2.25ng/μl)的连续稀释系列制备校准曲线。阈值线测定为0.06，基线测定为3-16个循环。利用Yang等(2005)的方法计算出拷贝数。

[表6]

表6：用于定量实时PCR的引物和Taq Man MGB探针

结果及讨论

1)烟草的转化结果

与仅导入有GUS-HPT的对照区相比，在用2菌株混合法将芽孢杆菌RNA酶基因进行了共转化的实验区中，转化效率降低至1/3左右(表7)。转化效率的降低认为是作为阴性选择标记的芽孢杆菌RNA酶基因与GUS-HPT基因同时被整合于烟草的同一细胞的基因组，并且因此该细胞通过芽孢杆菌RNA酶的稳定表达而致死。在实验区中，在含有潮霉素的LS-S培养基中选择的阶段，从叶片形成潮霉素抗性芽的效率降低至1/3左右。因此，大大减少了将芽移植到生根培养基和制备生根培养基的劳动力。

通过实施例2中的两菌株混合法进行稻的共转化，但转化效率的降低极少，为10％左右。转化效率在烟草中显著地变低认为是因为，与稻相比，2种T-DNA被整合于相同的细胞的基因组的效率(即共转化效率)更高。

[表7]

表7：烟草SR1的转化结果

*:对照：LBA4404(pLC41 GUS-HPT)

**:测试(两菌株混合):LBA4404(pLC41 GUS-HPT)+LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶)

2)利用定量实时PCR法分析烟草转化体植物中的导入DNA的拷贝数

通过定量实时PCR法分析对烟草导入的DNA的拷贝数。结果示于图10。在单独接种LBA4404(pLC41 GUS-HPT)的对照区中，在分析植物中的10％中以单拷贝导入GUS-HPT，残余的90％以多拷贝导入。与此相对，在用2菌株混合接种法将芽孢杆菌RNA酶基因进行了共转化的实验区中，在对照区的3倍以上的34％的植物中以单拷贝导入GUS-HPT(图10)。另一方面，3拷贝以上导入有GUS-HPT的植物的比例大大减少(图10)。这是因为，在向相同基因组以多拷贝导入作为目的基因的GUS-HPT的情况下，作为阴性选择标记的芽孢杆菌RNA酶基因也容易一起被导入，因此这种细胞通过芽孢杆菌RNA酶的表达而在培养的早期阶段被排除。

如上所述，在实验区中，以单拷贝具有目的基因的烟草转化体植物的比例增加至3倍以上。另一方面，转化效率降低至大约1/3。但是，由于多拷贝导入细胞可以在培养的早期阶段排除，因此，可以大大减少培养操作的劳动力以及培养基制备的成本和劳动力。作为结论，确认：将阴性选择标记进行共转化的方法为总体上可以有效地获得以单拷贝具有目的基因的转化体的有用的技术。

实施例4：通过使用芽孢杆菌RNA酶的共转化消除玉米的多拷贝转化体

材料及方法

1)玉米的转化

从进行了温室栽培的植物中无菌地取出大小约1.2mm的玉米未熟胚(品种：A188)，浸渍于液体培养基LS-inf(Ishida et al.，2007)。在46℃、3分钟的热处理后，在液体培养基中将所得的未熟胚清洗1次之后，以20,000G进行10分钟(4℃)的离心处理。土壤杆菌的接种通过将未熟胚浸渍于土壤杆菌悬浮液来进行。将附着有土壤杆菌的未熟胚置于LS-AS共培养培养基(Ishida et al.，2007)上，在25℃黑暗下进行3天的培养。土壤杆菌悬浮液通过将土壤杆菌在YP培养基上、在28℃黑暗下培养2天之后，悬浮于含有0.1mM乙酰丁香酮的LS-inf-As液体培养基而制备。悬浮浓度以660nm的OD值计调整为1.0。在将LBA4404(pSB131)(Ishida et al.，1996)进行单独接种的对照区以及在混合接种通过将超三元载体pVGW9(专利文献WO2014157541A1)导入LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶)获得的LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶::pVGW9)和LBA4404(pSB131)的两个菌株的实验区中实施测试。pSB131为超二元载体，在T-DNA中具有35S启动子控制的内含子GUS基因和35S启动子控制的bar基因。bar基因为膦丝菌素(PPT)抗性基因。

共培养后，将未熟胚置于含5mg/lPPT的LSD1.5B选择培养基(Ishida et al.，2007)上，在25℃黑暗条件下进行初次选择10天。将增殖的愈合组织直接移植到含10mg/lPPT的LSD1.5B选择培养基，进行约3周的二次选择。将通过二次选择增殖的愈合组织制成小块并切下，在相同组成的培养基进行约3周的三次选择。将通过三次选择增殖的愈合组织制成小块并切下，置于含有5mg/lPPT的LSZ再生培养基(Ishida et al.，2007)，在25℃光照条件下进行培养。2周后，将PPT抗性自生植物移植到含有5mg/lPPT的LSF生根培养基(Ishida et al.，2007)，在相同条件下培养至进行取样。将这样得到的PPT抗性植物体作为转化体用于以下的分析。

2)通过定量实时PCR法测量玉米转化体植物中的导入DNA的拷贝数

为了测量转化玉米植物中整合的T-DNA的拷贝数，使用定量实时PCR。采用多重PCR，其中将标靶DNA区域和内部标准DNA区域在同一孔内进行扩增。标靶DNA区域设为bar基因内。从各转化体的叶中，使用E.Z.N.A.(注册商标)SP Plant DNA Kit提取基因组DNA，制备成15.625ng/μl的浓度。使用Applied Biosystems(注册商标)7500实时PCR系统，在96孔PCR板中反复进行实时PCR的三个循环，并且将此PCR实施2次。在PCR反应液中含有25μlPremix Ex.Taq和5μl模板DNA和0.3μM的引物、及0.2μM的TaqMan MGB探针，总量设为50μl。PCR引物和TaqMan MGB探针由PrimerExpress而设计。所设计的引物和探针名称如下所述，其序列示于表8。

[表8]

表8：用于定量实时PCR的引物和Taq Man MGB探针

使用Hmg-2F及Hmg-2R作为内部标准引物，使用Hmg-2P作为内部标准TaqMan MGB探针。使用Bar-1F及Bar-1R作为标靶DNA用引物，使用Bar-1P作为标靶DNA用TaqMan MGB探针。全部的实时PCR实验按照以下的程序实施。即，在95℃下30秒为1次，95℃5秒和60℃34秒为40次。荧光按照各循环中的60℃的伸长步骤进行监视。为了评估定量PCR分析的效率及相对定量，使用基于基因组DNA的5种浓度(48、24、12、6及3ng/μl)的连续稀释系列制备校准曲线。利用Yang等(2005)的方法计算出拷贝数。

结果及讨论

1)玉米的转化结果

与仅导入有GUS-bar的对照区相比，在用2菌株混合法将芽孢杆菌RNA酶基因进行共转化的实验区中，转化效率降低至2/3左右(表9)。转化效率的降低认为是作为阴性选择标记的芽孢杆菌RNA酶基因与GUS-bar基因同时被整合于玉米的同一细胞的基因组，并且因此该细胞通过芽孢杆菌RNA酶的稳定表达而致死。在实验区中，在二次选择的结束时，产生PPT抗性愈合组织的未熟胚的比例降低至2/3左右。因此，切下愈合组织的小块并移植到三次选择培养基、或将三次选择后的愈合组织的小块移植到再生培养基、或将再生植物移植到生根培养基的劳动力减少了1/3。在玉米的转化中，这个期间的劳动力占整体的劳动力的85％，因此，减少了28％的劳动力。

[表9]

表9：玉米A188的转化结果

*:对照：LBA4404(pSB131)

**:测试(两菌株混合):LBA4404(pSB131)+LBA4404(pLC41芽孢杆菌RNA酶::pVGW9)

2)通过定量实时PCR分析玉米转化体植物中导入的DNA的拷贝数

利用定量实时PCR法分析向玉米导入的DNA的拷贝数。结果示于图11。在单独接种LBA4404(pSB131)的对照区中，在分析植物的46％中以单拷贝导入GUS-bar，残余的54％以多拷贝导入。与此相对，在用2菌株混合接种法将芽孢杆菌RNA酶基因进行了共转化的实验区中，在比对照区多17％的63％的植物中以单拷贝导入GUS-bar(图11)。另一方面，2拷贝以上导入有GUS-HPT的植物的比例是37％，减少了17％(图11)。这是因为，在向相同基因组以多拷贝导入作为目的基因的GUS-bar的情况下，阴性选择标记的芽孢杆菌RNA酶基因也容易一起被导入，因此这种细胞通过芽孢杆菌RNA酶的表达而在培养的早期阶段被排除。

如上所述，在实验区中，以单拷贝具有目的基因的玉米转化体植物的比例增加至对照区的1.3倍以上。另一方面，转化效率降低至大约2/3。但是，由于多拷贝导入细胞可以在培养的早期阶段排除，因此，与实施例3的烟草的情况同样地，在玉米中也可以大幅度减少培养操作的劳动力以及培养基制备的成本和劳动力。将阴性选择标记进行共转化的方法在玉米中也为总体上有效地获得以单拷贝具有目的基因的转化体的有用的技术。

序列表

<110> 日本烟草产业株式会社

<120> 转化的植物细胞的取得方法

<130> FA0392-15006

<140> CN 201580007421.X

<141> 2015-02-04

<150> PCT/JP2014/052765

<151> 2014-02-06

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 541

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 解淀粉芽胞杆菌的芽孢杆菌RNA酶基因加稻的Rf-1基因的第5内含子

<400> 1

atggcacagg ttatcaacac gtttgacggg gttgcggatt atcttcagac atatcataag 60

ctacctgata attacattac aaaatcagaa gcacaagccc tcggctgggt ggcatcaaaa 120

gggaaccttg cagacgtcgc tccggggaaa agcatcggcg gagacatctt ctcaaacagg 180

taatttattt ggccatacct acaccagaga tccatatatt acttttataa ctgcagtttt 240

tacttgttaa catttcattg tgcttttaca tttgttccaa gctttcaggg aaggcaaact 300

cccgggcaaa agcggacgaa catggcgtga agcggatatt aactatacat caggcttcag 360

aaattcagac cggattcttt actcaagcga ctggctgatt tacaaaacaa cggaccatta 420

tcagaccttt acaaaaatca gataacgaaa aaaacggctt cctgcggagg ccgttttttt 480

cagctttaca taaagtgtgt aataaatttt tcttcaaact ctgatcggtc aatttcactt 540

t 541

<210> 2

<211> 432

<212> DNA

<213> 解淀粉芽胞杆菌

<400> 2

atggcacagg ttatcaacac gtttgacggg gttgcggatt atcttcagac atatcataag 60

ctacctgata attacattac aaaatcagaa gcacaagccc tcggctgggt ggcatcaaaa 120

gggaaccttg cagacgtcgc tccggggaaa agcatcggcg gagacatctt ctcaaacagg 180

gaaggcaaac tcccgggcaa aagcggacga acatggcgtg aagcggatat taactataca 240

tcaggcttca gaaattcaga ccggattctt tactcaagcg actggctgat ttacaaaaca 300

acggaccatt atcagacctt tacaaaaatc agataacgaa aaaaacggct tcctgcggag 360

gccgtttttt tcagctttac ataaagtgtg taataaattt ttcttcaaac tctgatcggt 420

caatttcact tt 432

<210> 3

<211> 109

<212> DNA

<213> 稻

<400> 3

gtaatttatt tggccatacc tacaccagag atccatatat tacttttata actgcagttt 60

ttacttgtta acatttcatt gtgcttttac atttgttcca agctttcag 109

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GUS-HPT in pSB34 F引物

<400> 4

ggactagtcc gatctagtaa catagatg 28

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GUS-HPT in pSB34 R引物

<400> 5

tcatgtttga cagggtacca tcggatgag 29

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> M13/pUC 24mer引物

<400> 6

gacgttgtaa aacgacggcc agtg 24

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pUC57 476(AvrII) R

<400> 7

gctatgacca tgattacgcc taggttgcat 30

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLC41 330bp-RB F引物

<400> 8

cgacaagcag atcacgcttt tcgac 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLC41 LB-520bp R

<400> 9

ctccaagaga cggttacaca aacgg 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLC41 oriT-IncC F引物

<400> 10

tgaatccgat gctgttctac atcgc 25

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLC41 oriT-IncC R引物

<400> 11

ttcttcggtc ctccttgtag cgg 23

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSa5'EcT22I引物

<400> 12

aaaatgcatg gcatgtttaa cagaatctg 29

<210> 13

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> M13(-20)Fw引物

<400> 13

gtaaaacgac ggcca 15

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NtBWC1-5F引物

<400> 14

gtgtctccgg cggtgaac 18

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NtBWC1-5R引物

<400> 15

atcgggtcat ggattatgtc aat 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hpt-2F引物

<400> 16

ggatttcggc tccaacaatg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hpt-2R引物

<400> 17

gcctcgctcc agtcaatgac 20

<210> 18

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NtBWC1-5P引物

<400> 18

cgcgtttcaa tcgg 14

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hpt-2P引物

<400> 19

cctgacggac aatggccgca taac 24

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hmg-2F引物

<400> 20

cctctcctgg tcgaactttt ca 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hmg-2R引物

<400> 21

gactcgctca gggatttcca 20

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bar-1F引物

<400> 22

acagcgacca cgctcttga 19

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bar-1R引物

<400> 23

gctctacacc cacctgctga a 21

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hmg-2P引物

<400> 24

aaagctgctg gcgacag 17

<210> 25

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bar-1P引物

<400> 25

ccctgtgcct ccagg 15

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> terO (操纵子)

tccctatcag tgatagagaa 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SOS盒

tactgtatat atatacagta 20

Claims

1.转化的植物细胞的取得方法，其包含以下的步骤：

(a)将所期望的DNA、阳性选择标记和第一标记基因在植物细胞中进行共转化的步骤，所述阳性选择标记是与所期望的DNA连接的第二标记基因，

其中所期望的DNA和第二标记基因被夹持于T-DNA的RB(右侧边界序列)和T-DNA的LB(左侧边界序列)对之间，并且第一标记基因夹持于与夹持所期望的DNA和第二标记基因的RB和LB不同的另一对RB和LB之间；

(b)从步骤(a)中得到的转化的植物细胞中选择在其染色体中导入了所期望的DNA、且没有导入第一标记基因的转化的植物细胞的步骤，及

(c)通过使用第二标记基因的阳性选择而进行在步骤(b)的染色体中导入有所期望的DNA的转化细胞的选择，

2.如权利要求1所述的方法，其中，第一标记基因为阴性选择标记基因。

3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中用于共转化的所期望的DNA和第一标记基因的混合比率为3:1-1:5。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，步骤(a)通过选自土壤杆菌法、粒子枪法、电穿孔法、电注射法、聚乙二醇法及须晶法中的转化方法而进行。

5.转化植物的制备方法，其包含：

用权利要求1-4中任一项所述的方法取得转化的植物细胞；

将所述植物细胞进行培养而得到植物体。

6.植物的转化方法，其包含以下的步骤：

其中所期望的DNA和第二标记基因被夹持于T-DNA的RB(右侧边界序列)和T-DNA的LB(左侧边界序列)对之间，并且第一标记基因夹持于与夹持所期望的DNA和第二标记基因的RB和LB不同的另一对RB和LB之间，

(b)从步骤(a)中得到的转化的植物细胞中选择在其染色体中导入了所期望的DNA、且没有导入第一标记基因的转化的植物细胞的步骤，以及