CN104004075B - 一种钝鳞紫背苔bHLH转录因子及其表达基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种钝鳞紫背苔bHLH转录因子及其表达基因与应用，所述的钝鳞紫背苔bHLH转录因子，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述钝鳞紫背苔bHLH转录因子的表达基因PabHLH，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。经试验证明，本发明所述的钝鳞紫背苔bHLH转录因子的表达基因PabHLH具有在制备生产联苄类化合物中的应用前景。

Description

一种钝鳞紫背苔bHLH转录因子及其表达基因与应用
技术领域
本发明涉及一种钝鳞紫背苔bHLH转录因子及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
苔类植物是活性天然产物的宝库，其中含有的联苄类化合物是苔类植物所特有的，具有多种多样的生物活性，为人们开发新药物提供了前体化合物。然而由于苔类植物自然资源有限，原材料的来源受到限制。通过对联苄类化合物生物合成途径及其调控机制研究，运用代谢工程的手段，在同源或异源的植物中进行过表达，达到提高目标化合物产量的目的，是解决该类化合物来源的一条途径。苔类植物特有的联苄类化合物和黄酮类化合物来源于一共同的苯丙烷途径，该途径受R2R3-MYB、MYC(bHLH)和WD40蛋白等各种类型转录因子的调控。
因此通过筛选调控该途径转录因子的调控基因，从而实现苔类植物过量表达联苄类化合物的目的，是提高联苄类化合物产量的有效途径。
钝鳞紫背苔(Plagiochasma)，是一种小型的绿色植物，结构简单，没有茎叶分化，只有扁平的叶状体，没有真正的根和维管束。
目前，尚无通过过量表达bHLH转录因子提高联苄类化合物含量的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种钝鳞紫背苔bHLH转录因子及其表达基因PabHLH与应用。
本发明的技术方案如下：
一种钝鳞紫背苔bHLH转录因子，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述钝鳞紫背苔bHLH转录因子的表达基因PabHLH，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
一种重组表达载体，表达载体中插入了上述表达基因PabHLH。
优选的，所述表达载体为植物表达载体pCAMBIA1301。
一种重组细胞，含有上述重组表达载体。
优选的，所述的重组细胞通过将上述表达载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)后获得。
上述钝鳞紫背苔bHLH转录因子、上述表达基因PabHLH、上述重组细胞在制备生产联苄类化合物中的应用。
有益效果
本发明首次利用RT-PCR方法从钝鳞紫背苔cDNA文库中筛选出1个基因表达量和联苄类化合物含量呈正相关的bHLH转录因子,5’RACE获得了其全长cDNA序列。通过构建GFP融合蛋白转化洋葱表皮细胞，证明该基因定位在细胞核，酵母单杂交实验证明该基因具有转录激活活性。在钝鳞紫背苔中过量表达bHLH基因提高了转基因植物中联苄类化合物含量。构建该基因RNAi载体，转化钝鳞紫背苔，相应联苄类化合物含量降低。从而为通过代谢工程手段提高联苄类化合物含量提供了一个候选基因。并且，通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入钝鳞紫背苔，经过比较分析证明，转基因植株联苄化合物含量增加，从而证明钝鳞紫背苔bHLH转录因子的表达基因PabHLH具有在制备生产联苄类化合物中的应用前景。
附图说明
图1：PabHLH基因5'-RACE扩增产物的电泳图；
其中：图A：第一轮PCR扩增产物的电泳图；
图B：第二轮PCR扩增产物的电泳图；
图2：表达基因PabHLH扩增产物电泳图；
其中：图A：PabHLH全长cDNA扩增结果；
图B：PabHLH基因组DNA扩增结果；
图C：PabHLH内含子和外显子分析。
图3：PabHLH的转录激活活性。
其中：图A:PabHLH及PabHLH各截短片段PCR扩增；
图B：对照质粒pGBKT7与PabHLH及PabHLH各截短片段重组质粒分别转化酵
母AH109后于单缺培养基SD-Trp与三缺培养基SD-Trp-His-Ade上的生长情况。
图4：PabHLH的亚细胞定位。
其中：图A:软件预测定位；
图B：融合载体pCAMBIA1301GFP-PabHLH与空载体pCAMBIA1301GFP通过农
杆菌介导瞬时转化洋葱表皮细胞，两者在洋葱表皮细胞中的表达情况；
左：激发光下绿色荧光信号；中：自然光下洋葱表皮细胞；右：左图与中图叠加。
图5：钝鳞紫背苔愈伤组织遗传转化过程。
其中：图A：愈伤组织与含有目的基因的农杆菌共培养；
图B：筛选培养基上筛选阳性克隆；
图C：经PCR鉴定的阳性克隆；
图D：阳性克隆分化出小叶片。
图6：农杆菌介导的PabHLH转化愈伤组织及阳性鉴定。
其中：图A：过表达转基因愈伤组织阳性克隆鉴定；
图B：转RNAi载体愈伤组织阳性克隆鉴定。
图7：PabHLH转基因愈伤组织实时定量PCR分析。
其中：图A：过表达转基因愈伤组织中PabHLH基因表达分析；
图B：转RNAi载体愈伤组织PabHLH基因表达分析。
图8:转基因愈伤组织化学成分分析。
其中：图A：过表达转基因愈伤组织和野生型愈伤组织中联苄类化合物含量；
图B：转RNAi载体愈伤组织和野生型愈伤组织中联苄类化合物含量变化；
图C：野生型、过表达和转RNAi载体愈伤组织联苄类化合物HPLC分析结果；
P1:半月苔酸；P2:片叶苔素C；P3:核子木素E；P4:异地钱素C；P5:新地钱素A。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1.表达基因PabHLH的克隆
1.1CTAB-PVP法提取钝鳞紫背苔总RNA
(1)取新鲜钝鳞紫背苔植物材料，洗净后用滤纸吸干多余水分。加液氮研磨材料，反复2-3次至材料成粉末状，取少量至提前预冷的离心管中。
(2)加1ml65℃预热的CTAB-PVP提取液，振荡缓和均匀。
上述CTAB-PVP提取缓冲液按如下方法配制：
100mM Tris·HCl(pH8.0)，2％CTAB(w/v)，2％PVP(w/v)，25mM EDTA，2M NaCl，高压蒸汽灭菌之后巯基乙醇加至0.2％；以上溶液用DEPC处理过的ddH2O配制，高压灭菌后备用。
(3)65℃温浴30min，期间每隔6-10min振荡一下。
(4)冷却后加入600μl氯仿，振荡混合均匀。
(5)4℃13,000rpm离心10min。
(6)取上清转移至新离心管，加入600μl氯仿，振荡混合均匀后4℃13,000rpm离心10min。
(7)重复上步(即用氯仿抽提三次)。
(8)小心吸取上清转移至新的1.5ml离心管中，加入1/3体积的8M LiCl，-20℃静置3h以上(或4℃静置过夜)。
(9)4℃13,000rpm离心10min，弃上清。
(10)加入800μl75％乙醇洗涤沉淀。离心弃上清后挥干剩余乙醇。
(11)加入40μl Proteinase K处理后的灭菌水溶解RNA，制得总RNA。使用BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪测定提取的RNA浓度及质量，经检测，RNA浓度为773.7μg/ml,260/280为1.93，260/230为1.89。
1.25’RACE的一链cDNA合成
采用试剂盒SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(购自Clontech公司)来进行5'-RACE，cDNA第一链合成步骤如下：
(1)在0.5ml离心管中加入以下成分：
3μl总RNA；1μl5’-CDS primer；1μlSMARTⅡA Oligo，混匀，70℃变性10min，置于冰浴中2min，13000rpm短暂离心3-5s使成分聚集管底。
(2)在上述管中加入以下成分：2.0μl5×first-strand buffer；1.0μl DTT(二硫苏糖醇，浓度20mmol/L)；1.0μldNTP mix(each10mmol/L)；1.0μl PowerScript ReverseTranscriptase。
(3)轻轻混匀各成分，短暂离心，42℃空气浴中反应1-1.5hr。
(4)加入100μl Tricine-EDTA buffer稀释第一链反应产物。
(5)72℃加热7min，样品5’-RACE-Ready cDNA贮存于-20℃冰箱中保存。
1.3目的片段的5'-RACE
对cDNA文库中EST测序，对PabHLH部分序列信息进行分析后，设计两个3'端巢式引物PabHLHGSP与PabHLHNGSP，其可以与SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(购自Clontech公司)所带引物UPM与NUP形成嵌套。
Universal Primer A Mix(UPM)
Long:5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'
Short:5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'
Nested Universal Primer A(NUP)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'
PabHLHGSP:CTGCTGGGGTCTGAACGCTGGGGTG；
PabHLHNGSP:CCTGGGGTAATGCTCTGCCTTTG；
嵌套PCR的第一轮反应体系为：
将上述成分充分混匀后，按以下程序进行PCR：94℃预变性3min；94℃变性15s，55℃退火5s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
第一轮PCR结束后，琼脂糖凝胶电泳并观测结果。将第一轮PCR产物稀释50倍作为第二轮PCR的模板，反应体系如下：
按以下程序进行PCR：94℃预变性3min；94℃变性15s，55℃退火5s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。
PCR结果同样进行琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图1)，将目的条带切胶回收，方法如下。
将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％，W/V，g/100ml)，并用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段。步骤如下：
(1)电泳结束后溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)染色5min，于紫外灯下快速切下含有目的条带的胶块，将胶块放入1.5mL离心管。
(2)加入500μL Binding Buffer(XP2)，55℃温浴5min至胶块完全溶解。期间每隔2-3min颠倒震荡离心管一次。
(3)将HiBind DNA column置于2mL的收集管中，然后将上述溶胶液转移至HiBindDNA column，室温12,000rpm离心1min。
(4)弃掉收集管中的滤液，HiBind DNA column中加入300μL Binding Buffer(XP2)。室温12,000rpm离心1min，弃掉收集管中的滤液。
(5)加入700μL SPW Wash Buffer，室温12,000rpm离心1min。
(6)重复上步一次。
(7)弃掉滤液，空HiBind DNA column室温12,000rpm离心2min挥干剩余乙醇。
(8)将HiBind DNA column置于新的1.5mL离心管中。在柱子膜中央加入30μLddH2O，室温静置2min，12,000rpm离心1min。
(9)测定回收率：使用Biophotometer plus核酸蛋白测定仪测定样品浓度及质量，回收片段立即使用或-20℃保存。
1.4目的片段的T-A克隆
将嵌套PCR第二轮反应后的胶回收产物片段进行加A反应，体系及条件如下：
轻弹离心管以混合内容物，短暂离心，16℃连接2.5h。将该10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。待长出单克隆后，随机挑选进行菌落PCR，以M13F/R为引物，将能扩增出大小合适条带的克隆送博尚生物技术有限公司测序。测序结果与已知的PabHLH转录因子的部分序列进行拼接、分析。阳性克隆存菌：菌液930μL加DMSO70μL，混和均匀后于-80℃保存。
1.5PabHLH基因全长扩增
PabHLH基因中间片段及5’序列经DNAMAN软件的sequence assembly程序拼接后，将拼接后的全长序列利用软件Bioxm2.0的sequence analysis程序进行分析，预测基因ORF全长，并根据预测结果在ORF两侧的非编码区(Untranslated Region,UTR)用软件primerpremier5.0设计全长引物PabHLH-qF/R，对基因进行扩增；
全长引物：
PabHLH-qF:CTCTCGCTGTCCCCTCTGTGT；
PabHLH-qR:GGGTCTGTACAAGAGGCTAGGCT；
扩增体系及扩增程序如下：
扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性15s，53℃退火5s，72℃延伸30s，31个循环；最后72℃延伸10min；
扩增产物经回收、T-A克隆、转化鉴定后送博尚生物技术有限公司测序。
1.6PabHLH基因组序列扩增
1.6.1钝鳞紫背苔DNA的提取
取来自温室的钝鳞紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)叶状体200mg，采用CTAB法提取其DNA，方法如下：
(1)水浴锅调至65℃，将已加入巯基乙醇的CTAB提取液置于其中预热。
取约0.1g材料至研钵中，加液氮研磨成粉状。
(2)取研磨好的材料装入已预冷的离心管中，加入600μL CTAB提取液，上下颠倒混合均匀。
(3)65℃水浴30min，期间每隔10min取出混匀一次。
(4)取出离心管待温度降至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，室温放置20min，12,000rpm离心15min。
(5)吸取上清至新的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒混匀几次，12,000rpm离心15min。
(6)再吸取上清至新的1.5mL离心管中，加入2/3体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置3h以使DNA析出。
(7)于4℃12,000rpm离心10min，倒掉上清，沉淀用800μL70％乙醇洗涤两次。
(8)弃掉乙醇，将剩余的液体尽量吸干净，真空干燥DNA沉淀。
(9)乙醇挥干后，加入30μL灭菌水溶解DNA。用Biophotometer plus核酸蛋白测定仪检测DNA浓度及质量。
(10)以提取的DNA为模板，选择合适的引物进行PCR扩增。
1.6.2PabHLH基因的基因组DNA扩增
以提取的上述钝鳞紫背苔基因组DNA为模板，PabHLH-qF/R为引物进行扩增，全长引物：
PabHLH-qF:CTCTCGCTGTCCCCTCTGTGT；
PabHLH-qR:GGGTCTGTACAAGAGGCTAGGCT；(引物与1.5一样)
扩增体系同1.5。
扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性15s，53℃退火5s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸5min；
目的条带经回收并T-A克隆后送测序。测序结果与cDNA序列ORF进行对比，寻找内含子和外显子，结果见图2。
实施例2、基因体外转录活性分析
2.1cDNA序列扩增
为了鉴定PabHLH是否具有转录活性及阐明转录激活区的位置，根据PabHLH的ORF设计特异性引物，以pMD19T-PabHLH为模板扩增，分别将不同区段的片段及全长ORF构建到pGBKT7表达载体上进行体外转录活性实验。
PabHLH-1F:CGGAATTCATGGGCCAGGGTGGGCATTT；
PabHLH-481F:CGGAATTCAGTAGGTTCAGTTCTCTGTC；
PabHLH-820F:CGGAATTCGATTGGAGGCTGGATTTCGG；
PabHLH-480R:CGGGATCCGCTGTAACAAGTATCGTCAC；
PabHLH-819R:CGGGATCCTACTCCTATCACTTCGTTGC；
PabHLH-1563R:CGGGATCCTACAGACGAGTTCGGCTTCG；
将载体质粒pGBKT7和上述各PCR产物用EcoR I+BamH I酶切，片段回收后连接，转化大肠杆菌感受态DH5α(购自TransGen Biotech)。转化子用菌落PCR及EcoR I+BamH I酶切进行验证。
2.2酵母转录激活实验
2.2.1酵母感受态细胞的制备
(1)划线酵母菌AH109(购自Clontech公司)于YPD固体培养基中，30℃静置培养3天左右；
YPD固体培养基组分(1L)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，琼脂加至20g，加水定容至900mL，高压灭菌后加入100mL质量浓度为20wt％的葡萄糖溶液。
(2)挑取直径3mm左右的呈粉红色的单克隆，用5mL YPD液体培养基充分悬浮菌体，转接于20mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm条件下培养17～18h左右，培养至OD600>1.5；
YPD液体培养基组分(1L)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，加水定容至900mL，高压灭菌后加入100mL质量浓度20％的葡萄糖溶液。
(3)转接适量的上述酵母菌于50mL YPD液体培养基中，使得在OD600值在0.2～0.3之间，于30℃条件下继续培养3～4hr，直到OD600达到0.5～0.6；
(4)室温，4,000rpm，离心10min收集菌体；
(5)弃上清，用25mL ddH2O重新悬浮菌并洗涤菌体；
(6)重复步骤(4)；
(7)弃上清，用500μL1×TE/LiAc(1×TE/LiAc：10×TE buffer1mL，10×LiAc1mL，超纯水补齐至10mL)重新悬浮菌；
(8)以4,000rpm离心2min，去上清，后加入用500μL1×TE/LiAc重新悬浮菌后即为酵母感受态细胞。
2.2.2酵母转化
(1)鲑精DNA融解，预先煮沸5min后，立即冰浴备用；
(2)在1.5mL离心管中加入100uL新鲜制备的酵母感受态细胞，2μL待转化质粒(包括PabHLH各不同区段片段及全长ORF以及载体pGBKT7(购自Clontech公司))，10μL变性鲑精DNA(10mg/mL)，600μL PEG/LiAc溶液，涡旋混匀；
(3)30℃，静置，培养30min；期间颠倒混匀2次；
(4)向上述体系加入DMSO(购自Sigma公司)70μL，42℃水浴中热激15min，冰浴5min；
(5)室温，5,000rpm，离心2min，去上清，加入600μL YPD液体培养基；
(6)30℃振荡培养2h，12000rpm离心15s，弃上清，500μL灭菌水洗两次，500μL灭菌水重悬，取0.1mL涂布在SD/-Trp固体培养基上，30℃，倒置培养3天。
(7)挑取单菌落，保存阳性克隆菌液备用。
2.2.3激活功能分析
(1)将上述各酵母阳性转化子在营养缺陷型平板SD/-Trp上划线活化，30℃倒置培养2～3d。
(2)待单菌落长出时，各菌挑单克隆分别溶于20μL无菌水，轻柔吹打溶解。
(3)将SD/-Trp与SD/-Trp-His-Ade平板划分区域，分别吸取上述溶有各单克隆的无菌水5μL滴于相应区域。
(4)30℃静置培养2～3天，观察生长情况，结果见图3。
实施例3基因亚细胞定位
3.1目的基因GFP定位载体的构建
根据目的基因PabHLH设计引物PabHLH-F与PabHLH-GFPR：
PabHLH-F:CGGGATCCATGGGCCAGGGTGGGCATTT；
PabHLH-GFPR:GGGGTACCTACAGACGAGTTCGGCTTCG；
扩增其ORF(去除终止子)，PCR产物电泳并回收，载体p35S-1301-GFP及回收片段用BamH I与Kpn I进行酶切，酶切产物的回收、连接、转化及鉴定，方法如下：
3.1.1连接
酶切后的目的片段与酶切后的载体pET32a(购自Novagen公司)用T4DNA Ligase(购自Takara公司)连接，体系如下：
将上述组分充分混匀后，16℃过夜连接。连接产物于4℃保存，待做转化。
3.1.2转化
-80℃取出大肠杆菌DH5α感受态细胞(50μL)置于冰上解冻，加入10μL连接产物，轻柔吹打混匀，冰上静置30min；42℃水浴中热击90s后迅速置于冰上，待2min后加入600μL LB培养基，37℃振荡培养1h，待其复苏后取200μL转化液涂于LB固体培养基(含100μg/mL Amp)上，37℃静置培养12-16h。
LB培养基组分(1L)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、NaCl10g，加水溶解后，调pH至7.0，定容。固体培养基加入琼脂(12g/L)后，高压蒸汽灭菌。
3.1.3重组子阳性克隆鉴定
随机挑选10个单克隆于200uL培养基，37℃振荡培养4h，以菌液为模板进行菌落PCR。体系如下：
扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min30s，32个循环；最后72℃延伸10min；
菌落PCR后进行琼脂糖凝胶电泳，能扩增出目的片段大小条带的为阳性克隆，然后将其扩大培养，菌液抽提质粒，并进行酶切验证。若能切下与目的片段大小相符的条带则证明该克隆为阳性。至此载体构建完成。
构建完成后摇菌提其质粒p35S-1301-GFP-PabHLH，转化农杆菌备用。
3.2农杆菌感受态制备
(1)取冻存于-80℃的农杆菌EHA105(购自Invitrogen公司)划含利福平100μg/mL的YEP固体培养基，30℃静置培养36h；
YEP固体培养基组分如下：
酵母提取物10g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂加至20g，加水定容至1L。高压蒸汽灭菌。
(2)挑单克隆于Rif抗性的液体YEP培养基中，30℃，摇过夜，制得培养液；
Rif抗性的液体YEP培养基，组分如下：
酵母提取物10g，蛋白胨10g，NaCl5g，加水定容至1L。高压蒸汽灭菌。使用前加Rif，使其终浓度为100μg/mL。
(3)将步骤(2)制得的培养液按体积比1:50的比例接种至50mLRif抗性的液体YEP培养基中，继续培养至OD600为0.4～0.6；
(4)菌液冰浴30min后，4℃5,000rpm离心5min，弃掉上清；
(5)收集的菌体重悬于6mL预冷的0.15M氯化钠溶液中，4℃5,000rpm离心5min，弃上清；
(6)收集的菌体再次用600μL20mM预冷的氯化钙溶液重悬，分装成100μL/管，制得农杆菌感受态细胞，液氮速冻后-80℃保存备用。
3.3冻融法转化农杆菌
(1)取出农杆菌感受态细胞，冰上融化，分别加入2μL质粒p35S-1301-GFP-PabHLH和2μL质粒p35S-1301-GFP用移液枪轻柔地吹打混匀，冰上放置25min；
(2)液氮速冻60s，然后于37℃水浴保温3min；
(3)加入400μL无抗性YEP液体培养基，30℃振荡培养4h；
(4)待其复苏后，取200μL菌液涂于含利福平100μg/mL，含卡那霉素50μg/mL的YEP固体培养基上。30℃静置培养36h；
(5)挑取长出的单克隆进行小量振荡培养，菌落PCR鉴定其阳性，制得携带质粒p35S-1301-GFP及p35S-1301-GFP-PabHLH质粒的农杆菌EHA105。
3.4农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞
(1)将携带质粒p35S-1301-GFP及p35S-1301-GFP-PabHLH质粒的农杆菌EHA105的单克隆接种至50mL YEP液体培养液中(含有50mg/mL卡那霉素和100mg/mL Rif)，28℃振荡培养过夜；
(2)培养物于4,500rpm离心10min收集菌体，并重悬于MS液体培养基(MS培养基粉末购自sigma公司4.4g/L，蔗糖20g/L，pH为5.6～5.8，琼脂1％)(含100mmoL/L乙酰丁香酮)中，使OD600在0.6左右；
(3)选取生长状况良好、新鲜的洋葱球茎，除去外层2～3层鳞茎，将剩余部分在75％乙醇中浸泡5min，并用无菌水洗涤3次；
(4)用解剖刀将鳞茎切成四半，选取球茎内部较新鲜肥厚的鳞片，在内表皮划出约为1cm2的小方块，用镊子将小方块撕下，使贴近叶肉的一面朝下，平铺于MS固体培养基中暗培养24h；
(5)预培养后的洋葱表皮于上述重悬的农杆菌液中侵染20min，无菌滤纸稍滤干菌液，平铺于MS固体培养基(含100mmoL/L乙酰丁香酮)上，以光周期16h光照/8h黑暗，25℃共培养；
(6)16h～48h后，取出洋葱表皮小块，用灭菌水洗涤以除去附着的农杆菌，压片法制片，于激光共聚焦显微镜下观察、拍照，结果见图4。
实施例4、植物过表达载体及RNAi载体的构建
4.1植物过表达载体构建
根据PabHLH的序列信息及p35S-1301GFP载体信息选择酶切位点，PabHLH5'端选择BamH I，3'端选择Kpn I为酶切位点，设计引物PabHLH-F/R
PabHLH-F:CGGGATCCATGGGCCAGGGTGGGCATTT，
PabHLH-R:GGGGTACCTTATACAGACGAGTTCGGCT；
以pMD19T-PabHLH为模板进行扩增。回收片段及载体分别用BamH I和Kpn I双酶切，继而是连接、转化以及阳性克隆的鉴定。阳性克隆的质粒转化农杆菌EHA105，同时转化空载体质粒做对照，方法同3.3。
4.2植物RNAi载体构建
将带有PabHLH基因的pMD19-T重组质粒模板，用引物FbHLH-RNAiSF/R与FbHLH-RNAiASF/R分别扩增，扩增产物回收后分别用Xba I+Sma I与Not I+Sac I进行酶切。将酶切片段先后构建到载体pBSK(购自Stratagene公司)上，继而再将重组载体Sma I+Sac I双酶切，最后整合到载体pCAMBIA1301上并转化农杆菌EHA105(农杆菌转化同3.3)。
FbHLH-RNAiSF:TCCCCCGGGCGGGATCTGGGTACGTTGGC；
FbHLH-RNAiSR:GCTCTAGACAGGCTGGTTGAGGGTTGTG；
FbHLH-RNAiASF:CGAGCTCCGGGATCTGGGTACGTTGGC；
FbHLH-RNAiASR:ATAAGAATGCGGCCGCCAGGCTGGTTGAGGGTTGTG；
实施例5、转基因功能验证－钝鳞紫背苔愈伤组织转化及鉴定
5.1转基因愈伤克隆的获得
将含有植物过表达载体、RNAi载体以及空载体的农杆菌转化钝鳞紫背苔的愈伤组织，得到转基因愈伤克隆，具体步骤如下：
(1)挑阳性克隆于YEP液体培养基中(含利福平100μg/mL、卡那霉素50μg/mL)，30℃200rpm振荡培养过夜；
(2)取该菌液按1:100的比例扩大培养至200mL，30℃200rpm振荡培养至OD600为1.5-2.0；
(3)5,000rpm离心5min收集菌体，用50mL含有100μM乙酰丁香酮MS液体培养基重悬菌体，菌体活化半个小时；
(4)取继代一周左右的新鲜愈伤组织，用灭菌后的镊子将材料夹成小块，置于已活化的转化液中，由农杆菌于25℃，110rpm侵染4h；
(5)侵染结束后，将菌液倒掉，然后将被侵染的愈伤材料铺于共培养培养基(该培养基为不含激素的MS固体培养基，pH为5.6～5.8，含有100μM乙酰丁香酮)上，于培养箱中23±1℃黑暗培养2-3天；
(6)暗培养期间观察愈伤组织的侵染情况，若发现愈伤组织表面已完全侵染上农杆菌，即材料表面呈现出粘液状，则可用无菌水洗涤材料，洗涤次数视情况而定，直至洗涤后的溶液不再浑浊；
(7)洗涤后的愈伤材料置于置于筛选培养基(含有250μg/mL头孢霉素和25μg/mL潮霉素的pH为5.8的MS固体培养基)上，培养条件为：23±1℃，12h光照/12h黑暗培养；
(8)将逐渐生长出的绿色愈伤组织转移到新的含250μg/mL头孢霉素和25μg/mL潮霉素的MS固体培养基上继续筛选；两周后再次传代至含250μg/mL头孢霉素与50μg/mL潮霉素的MS固体培养基上筛选，结果见图5。
5.2转基因愈伤的鉴定
在抗性培养基上筛选出的阳性愈伤克隆扩繁一段时间后，取传代培养一周的各转基因愈伤组织的不同克隆用CTAB法提取其DNA，提取同1.6.1。
根据载体上的潮霉素基因序列，设计一对PCR引物：
Hpt1:AGGGCGAAGAATCTCGTGCT；
Hpt6a:GGGCGTCGGTTTCCACTATC；
以此引物为载体特异引物，提取的DNA为模板，PCR扩增能够得到大小合适清晰条带的克隆为转基因克隆，结果见图6。
实施例6、转基因愈伤组织基因表达及化合物含量变化分析
6.1转基因愈伤基因表达水平分析
采用CTAB-PVP法提取PabHLH基因过表达、RNAi阳性愈伤克隆以及未转基因愈伤克隆RNA，以提取的各克隆RNA为模板，使用PrimeScriptTMRT Master Mix Kit(购自Takara公司)合成cDNA链。冰浴条件下于离心管中加入下列组分，轻轻混匀，离心3～5s。
在PCR仪中按如下程序进行逆转录反应：37℃反应15min，85℃反应5s，4℃保温。逆转录产物立即使用或-20℃保存。
采用Real-time PCR对PabHLH基因过表达、RNAi阳性愈伤克隆以及未转基因愈伤克隆体内目的基因表达强度情况进行检测。
以合成的cDNA稀释10倍后作模板，PabHLH-RT-F/R为引物：
PabHLH-RT-F:TCATCAACACCAGCAACACC；
PabHLH-RT-R:AGCAACGAAATCTGGTGAAC；
钝鳞紫背苔elongation factor作为内标：
elongation-F:TATTGCTCTGTGGAAGTTTG；
elongation-R:TCATCTGCTTCACTCCCAAC；
进行Real-time PCR，实验在MasterCyclerTM ep realplex实时定量PCR仪上进行，每个样品平行重复三次。反应体系参照Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(Thermoscientific)说明书进行，具体如下：
扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环；最后72℃延伸10min；结果如图7所示。
6.2转基因愈伤的化学成分分析
为了检测钝鳞紫背苔中PabHLH基因过表达以及RNAi后其体内联苄、双联苄类化合物的变化情况，故将转基因愈伤及未转基因愈伤组织进行化学成分分析。
(1)材料处理：取继代两周的愈伤，取0.1g愈伤材料(每个克隆做三个平行)，加入200μL甲醇溶液，机械破碎后置于摇床内轻摇1h。12,000rpm离心10min，取上清液进行液相分析。
(2)HPLC分析：采用Luna5u C18，5μm，4.6×250mm(phenomenex)色谱柱，检测波长280nm，流速0.8mL/min。液相分析条件如下：
转基因愈伤液相分析条件
结果见图8。

Claims (7)

1.一种钝鳞紫背苔bHLH转录因子，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述钝鳞紫背苔bHLH转录因子的表达基因PabHLH，核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
3.一种重组表达载体，表达载体中插入了权利要求2所述的表达基因PabHLH。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为植物表达载体pCAMBIA1301。
5.一种重组细胞，含有权利要求3所述的重组表达载体。
6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞通过将权利要求3所述的重组表达载体转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）后获得。
7.权利要求1所述钝鳞紫背苔bHLH转录因子、权利要求2所述表达基因PabHLH、权利要求5所述重组细胞在制备生产联苄类化合物异地钱素C和新地钱素A中的应用。
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