CN117586975B - 多巴双加氧酶HhDODA1及其编码基因在甜菜色素合成中的应用 - Google Patents
多巴双加氧酶HhDODA1及其编码基因在甜菜色素合成中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物领域，公开了多巴双加氧酶HhDODA1及其编码基因在甜菜色素合成中的应用，具体为河南高生熊虫（Hypsibius henanensis）多巴双加氧酶HhDODA1及其编码基因在甜菜色素合成中的应用。本发明公开了HhDODA1蛋白可催化合成甜菜色素；证明了HhDODA1蛋白的关键酶活性位点，突变关键酶活性位点后多巴双加氧酶活性缺失；证明了在人HeLa细胞中表达HhDODA1可以建立甜菜色素合成通路。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种多巴双加氧酶HhDODA1及其编码基因在甜菜色素合成中的应用。
背景技术
甜菜色素是一种L-酪氨酸（Tyr）衍生的水溶性含氮生物碱类色素，因最早在甜菜根中被发现而得名。甜菜色素包括甜菜红素和甜菜黄素两类，它们分别是由甜菜醛氨酸与环多巴和氨基酸或胺形成的不定共轭物。所有甜菜色素都含有基本生色团——甜菜醛氨酸。甜菜色素是重要的天然色素之一，通常用作食品添加剂、化妆品着色剂等。同时，甜菜色素也具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保肝和预防阿尔茨海默病、糖尿病等生物活性和潜在的保健医用价值。
甜菜色素是一种次级代谢产物，由芳香族氨基酸酪氨酸通过多步酶反应合成。其中甜菜黄素合成途径比较简单，首先Tyr在酪氨酸羟化酶羟化作用下形成L-DOPA，然后再在4,5-多巴双加氧酶（DODA,4,5-L-DOPA dioxygenase）作用生成4,5-开环多巴（4,5-Seco-DOPA），4,5-开环多巴不稳定，自发反应生成甜菜醛氨酸；甜菜醛氨酸和不同的胺或氨基酸分子缩合自发生成不同的甜菜黄素。L-DOPA还可以在在酪氨酸酶或L-DOPA氧化酶的作用下生成多巴醌（o-DOPA-quinone），接着自发形成环多巴（Cyclo-DOPA），这是合成甜菜红素的重要前体。环多巴与甜菜醛氨酸结合自发反应生成甜菜红苷配基。不同种类的甜菜红素是由甜菜红苷配基在UDP-葡糖基转移酶的作用下连接糖基而形成。
甜菜色素的合成依赖于关键酶的作用。因此，新型、高效的酶的研发对于甜菜色素合成、医疗保健品开发具有重要的研究及应用意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种河南高生熊虫（Hypsibius henanensis）多巴双加氧酶HhDODA1在甜菜色素合成中的应用。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种多巴双加氧酶HhDODA1在甜菜色素合成中的应用，所述多巴双加氧酶HhDODA1来源于水熊虫，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或与其具有至少85%同一性的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供了编码所述多巴双加氧酶HhDODA1的基因在甜菜色素合成中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，或与其具有至少85%同一性的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供了多巴双加氧酶HhDODA1的酶活性位点。
第四方面，本发明提供含有编码上述多巴双加氧酶HhDODA1的基因的重组载体在甜菜色素合成中的应用。
第五方面，本发明提供含有编码上述多巴双加氧酶HhDODA1的基因的表达盒在甜菜色素合成中的应用。
第六方面，本发明提供含有编码上述多巴双加氧酶HhDODA1的基因的转基因细胞系在甜菜色素合成中的应用。
第七方面，本发明提供含有编码上述多巴双加氧酶HhDODA1的基因的重组菌在甜菜色素合成中的应用。
第八方面，本发明提供含有上述多巴双加氧酶HhDODA1作为活性成分的组合物在甜菜色素合成中的应用。
第九方面，本发明提供上述多巴双加氧酶HhDODA1或多巴双加氧酶HhDODA1的基因的试剂盒在甜菜色素合成中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种新的动物来源的多巴双加氧酶HhDODA1及其编码基因在甜菜色素合成中的应用；
2、本发明在体外证明了HhDODA1蛋白能够催化甜菜色素合成；
3、本发明利用结构预测了HhDODA1的酶活性位点，并通过突变体的体外酶活性实验证明了HhDODA1蛋白的多巴双加氧酶活性的关键位点；
4、本发明在细胞水平证明了人HeLa细胞中表达HhDODA1可建立甜菜色素合成通路。
附图说明
图1为多巴双加氧酶催化甜菜色素合成通路图。
图2a为HhDODA1蛋白催化甜菜色素合成的质谱鉴定保留时间峰图。
图2b为甜菜醛氨酸质谱谱图。
图2c为多巴黄质质谱谱图。
图3为HhDODA1蛋白的多巴双加氧酶活性关键位点预测。
图4为HhDODA1蛋白野生型及突变体的多巴双加氧酶活性检测结果图（a. 酶标板照片；b.甜菜醛氨酸特征吸收峰处的吸光度；c. 多巴黄质特征吸收峰处的吸光度）。
图5a为人HeLa细胞中表达HhDODA1的Western Blot结果图。
图5b为人HeLa细胞可建立甜菜色素合成通路的代谢产物质谱结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.HhDODA1蛋白催化甜菜色素合成
如图1所示，理论上，4,5-多巴双加氧酶可以将L-多巴（L-DOPA）催化，生成4,5-开环多巴（4,5-seco-DOPA），4,5-开环多巴不稳定，会自发形成甜菜醛氨酸（Betalamicacid），甜菜醛氨酸可以与另一分子的L-多巴自发反应，生成具有黄色的一种甜菜色素（Betalains），即多巴黄质（Dopaxanthin）。甜菜色素是一大类色素分子的统称，主要分布于石竹目植物中，根据具体结构的不同，可将甜菜色素分为2大类，分别是具有黄色的甜菜黄素（Betaxanthins）和具有红色或紫红色的甜菜红素（Betacyanins），多巴黄质就是其中一种甜菜黄素。
为验证HhDODA1蛋白是否能够催化甜菜色素的合成，将HhDODA1和GdDODA蛋白在大肠杆菌中诱导表达并纯化分离，进行体外酶活性实验，并对反应产物进行质谱检测。其中，GdDODA是来自葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）的多巴双加氧酶，具有DOPA_dioxygen结构域，是已知的具有4,5-多巴双加氧酶活性的多巴双加氧酶。具体实施步骤如下：
一、HhDODA1和GdDODA蛋白的诱导表达及纯化
1. 向1.5 mL EP管中加入30 µL BL21感受态细胞，将带有His标签的HhDODA1和GdDODA原核表达质粒1 µL分别加入到感受态细胞中，混匀；
2. 冰浴30 min，42°C水浴热休克45 s，再快速置于冰浴2 min；
3. 向EP管中加600 µL不含抗生素的LB培养液，混匀；
4. 37°C振荡45 min，使细菌复苏，从而表达抗性基因；
5. 取该菌液100 µL接种于含50 µg/mL卡那青霉素的平皿中，37°C培养过夜；
6. 挑取单个菌落，接种于50 µg/mL卡那青霉素的5 mL LB培养液中，37°C，220rpm培养约6 h，将此菌液按1:100稀释后接种于50 µg/mL卡那青霉素的300 mL LB培养液中，37°C，220 rpm培养约2 h，使OD600达到0.8~1.0，加入IPTG（终浓度1 mM），在20°C诱导12h；
7. 收集细菌，4°C 4000 rpm离心15 min，使用20 mL裂解液（磷酸盐缓冲液PBS，含有：2 mM咪唑，1% Triton X-100（v/v），1% β-巯基乙醇（v/v），1 mM PMSF）重悬；
8. 超声破碎菌体（50%，时间20 min，开5 s、关15 s），15000 g，10 min离心取上清，在上清中加入500 µL His-beads，4°C混悬仪上孵育2 h；
9. 500 g，5 min离心，弃上清；
10. 加入10 mL清洗缓冲液（PBS，含1% Triton X-100，150 mM NaCl，5 mM咪唑，pH8.0），4°C混悬仪上孵育5 min，500 g，5min离心，弃上清；
11. 重复步骤10共四次。最后一次清洗，将His-beads转移至1.5 mLEP管中，加入1mL清洗缓冲液进行；
12. 用注射器吸干液体，His-beads中加入200 µL洗脱缓冲液（PBS溶液，含500 mM咪唑，pH 8.0），4°C混悬仪上孵育轻摇10 min，500 g，5 min离心，收集上清；
13. 重复步骤12共两次；
14. 超滤。将收集的上清分次加入超滤管（截留量3K），4°C离心机进行超滤，除去咪唑。用PBS溶液置换洗脱液，获得干净的蛋白，最终收集超滤好的蛋白溶液300 µL至新的1.5 mL EP管中；
15. SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度；
16. 将纯化好的GdDODA和HhDODA1蛋白置于冰上备用。
二、HhDODA1蛋白体外酶活性实验及代谢物质谱分析
1. 在反应缓冲液（50 mM 磷酸氢二钠，2.5 mM L-DOPA，10 mM抗坏血酸，pH 7.0）中分别加入BSA、GdDODA或者HhDODA1，总反应体系为200 μL。25℃反应1h，观察，拍照；
2. 反应后的样品用UPLC-IMS QTOF质谱仪进行代谢物检测分析；
3. 分析实验数据。
如图2a、图2b和图2c所示，UPLC-IMS QTOF质谱检测分析表明，HhDODA1和GdDODA均能够催化L-多巴（L-DOPA），产生代谢产物甜菜醛氨酸（Betalamic acid）和一种黄色的甜菜色素多巴黄质（Dopaxanthin），证明HhDODA1是一种多巴双加氧酶且可以催化合成甜菜色素。
实施例2.HhDODA1蛋白多巴双加氧酶酶活性位点预测及验证
为进一步验证上述结论，利用PyMOL软件对HhDODA1的酶活性关键位点进行了预测。结果如图3所示，经预测，HhDODA1的潜在酶活性位点为H16、H18、H67、H100、D106和H110。随后，分别构建这些潜在酶活性位的点突变变体，并将这些突变体以及野生型HhDODA1蛋白（WT）分别表达纯化，进行体外酶活性实验。其中，蛋白诱导表达及纯化的具体实施步骤和实施例1中相同，体外酶活性实验的实施步骤为：
1.在反应缓冲液（50 mM 磷酸氢二钠，1 mM L-DOPA，10 mM抗坏血酸，pH 7.0）中分别加入野生型（WT）及HhDODA1突变体蛋白（蛋白终浓度均为0.05 μg/μL），总反应体系为200μL。25℃反应1h，观察，拍照；
2.用酶标仪（Multiskan Sky plate reader，Thermo Fisher Scientific）检测OD414（甜菜醛氨酸特征吸收峰）和OD480（多巴黄质特征吸收峰）；
3.作图分析。
将体外酶活性实验反应产物进行酶标仪检测，检测结果显示野生型（WT）及D106A突变体蛋白的反应产物中检测到了甜菜醛氨酸（Betalamic acid）和多巴黄质（Dopaxanthin），但D106A突变体反应体系中甜菜醛氨酸和多巴黄质的量比野生型组少，其他突变体组别未检测到上述产物（图4），证明H16、H18、H67、H100和H110为HhDODA1的多巴双加氧酶酶活性关键位点，这些位点突变导致酶活性完全丧失，而D106A突变导致多巴双加氧酶酶活性部分丧失。
实施例3.HhDODA1在人HeLa细胞中表达及甜菜色素合成通路建立
人体中不存在多巴双加氧酶基因和甜菜色素合成通路。为了进一步验证水熊虫HhDODA1蛋白的多巴双加氧酶酶活性，将HhDODA1的真核表达质粒（野生型及H16A、D106A突变体）稳定表达在人HeLa细胞中。人细胞中存在可以将L-酪氨酸转变为L-DOPA的酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）。因此，理论上，人的细胞中表达DODA1可以建立甜菜色素合成通路。
Western Blot实验实施步骤：
1.细胞裂解液样品制备：
a. 吸干培养板中的细胞培养液，PBS轻轻摇晃洗2次；
b. 吸干PBS洗液，加入细胞裂解液，加入等体积的2×loading buffer，混匀将细胞完全裂解后转移到EP管，沸水中煮15 min后备用；
2.SDS-PAGE电泳（12%浓度SDS-PAGE胶）分离蛋白，先80V电压跑30 min后140 V电压跑至溴酚蓝至底部1cm停止电泳；
3.尼龙膜（也称NC膜，9 cm/6 cm）和滤纸浸泡入电转缓冲液几分钟；
4.按照滤纸-膜-胶-滤纸的顺序将夹板放入电转槽中，150 mA冰上电转2 h；
5.断开电源，取出夹板，将NC膜切出目的条带，TBST洗1次后封闭；
6.TBST-5%脱脂奶粉封闭液封闭，室温封闭1 h；
7.封闭完成后，一抗4℃过夜孵育，回收一抗，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；
8.显色反应：将ECL发光试剂A/B液等体积混合后加至NC膜上，反应3 min后吸去发光液，于暗室中曝光，观察Western Blot结果。
如图5a所示，HhDODA1野生型（WT）及突变体蛋白在HeLa细胞中成功表达。为进一步检测表达HhDODA1的HeLa细胞中是否产生了甜菜色素，收集HeLa细胞，提取代谢物并利用UPLC-IMS QTOF质谱仪进行代谢物检测分析，发现HhDODA1野生型（WT）及D106A突变体表达细胞系中，明显富集到一种甜菜色素Arginine-betaxanthin，其为HhDODA1催化产生的甜菜醛氨酸与细胞内氨基酸反应后的产物，以上结果证明通过在人细胞中的表达HhDODA1成功建立了甜菜色素合成通路（图5b）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种多巴双加氧酶HhDODA1在甜菜色素合成中的应用，其特征在于，所述多巴双加氧酶HhDODA1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多巴双加氧酶HhDODA1来源于河南高生熊虫。
3.编码权利要求1中所述的多巴双加氧酶HhDODA1的基因在甜菜色素合成中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.含有权利要求3或4中所述基因的重组载体在甜菜色素合成中的应用。
6.含有权利要求3或4中所述基因的表达盒在甜菜色素合成中的应用。
7.含有权利要求3或4中所述基因的转基因细胞系在甜菜色素合成中的应用。
8.含有权利要求3或4中所述基因的重组菌在甜菜色素合成中的应用。
9.含有权利要求1或2中所述的酶作为活性成分的组合物在甜菜色素合成中的应用。
10.含有权利要求1或2中所述的酶或权利要求3或4中所述基因的试剂盒在甜菜色素合成中的应用。
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