TWI804117B - 生產五胺基酮戊酸的大腸桿菌及生產五胺基酮戊酸的方法 - Google Patents

生產五胺基酮戊酸的大腸桿菌及生產五胺基酮戊酸的方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種生產五胺基酮戊酸的大腸桿菌，其具有雙倍的 pdxY基因。本發明並提供一種生產五胺基酮戊酸的方法，其包含提供上述大腸桿菌；以及將該大腸桿菌接種於含有碳源、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、甘胺酸、琥珀酸與吡哆醛的培養基中進行培養，以產生五胺基酮戊酸。藉由如上所述之生產五胺基酮戊酸的大腸桿菌及使用其生產五胺基酮戊酸的方法，進而提供一種生長速度快同時具有高ALA產量的菌株以及一種能夠快速且高產量地生產ALA之方法。

Description

生產五胺基酮戊酸的大腸桿菌及生產五胺基酮戊酸的方法
本發明係關於一種生產五胺基酮戊酸的大腸桿菌及使用其生產五胺基酮戊酸的方法，尤其是一種以基因轉殖方法製成的大腸桿菌。
5-胺基酮戊酸(5-Aminolevulinic Acid)(以下簡稱ALA)是生物體中必需的代謝中間體，ALA在農業領域有廣泛的用途，例如，ALA可以作為除草劑、殺蟲劑、農作物生長的促進因子，此外，ALA也被運用於醫療診斷用途，例如ALA可以用於作為癌細胞的標記物。目前ALA的生產方式主要是透過麩胺酸棒狀桿菌來生產ALA。
然而，麩胺酸棒狀桿菌的生長速度較慢，麩胺酸棒狀桿菌需要較長的培養時間才能達到較高的菌量，藉此提升其ALA產量，亦即，麩胺酸棒 狀桿菌的緩慢生長速度影響到ALA的生產效率。因此，如何開發出一種生長速度快同時又能具有高ALA產量的菌株，仍為有待解決的問題。
本發明之目的即針對上述問題，提供一種大腸桿菌，其具有雙倍的pdxY基因，該大腸桿菌可生產五胺基酮戊酸。
如上所述之大腸桿菌，該大腸桿菌更包含RchemA基因。
如上所述之大腸桿菌，該大腸桿菌更包含pRARE質體。
為達上述目的及其他目的，本發明提供一種大腸桿菌，其具有SEQ ID NO.1之序列，該大腸桿菌可生產五胺基酮戊酸。
如上所述之大腸桿菌，該大腸桿菌更具有SEQ ID NO.2之序列
如上所述之大腸桿菌，該大腸桿菌更包含pRARE質體。
為達上述目的及其他目的，本發明提供一種生產五胺基酮戊酸的方法，包含以下步驟：(a)提供如上所述之大腸桿菌；及(b)將該大腸桿菌接種於含有碳源、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、甘胺酸、琥珀酸與吡哆醛的培養基中進行培養，以產生五胺基酮戊酸。
如上所述之方法，該碳源為由葡萄糖及甘油組成的混合碳源。
如上所述之方法，該培養基中含有鐵離子。
藉由如上所述之生產五胺基酮戊酸的大腸桿菌及使用其生產五胺基酮戊酸的方法，提供一種生長速度快同時具有高ALA產量的菌株以及一種能夠快速且高產量地生產ALA之方法。
圖1示出本發明實施例1所使用的CRIM質體圖譜。
圖2示出本發明實施例1所使用的SITAG質體圖譜。
圖3示出本發明實施例1之大腸桿菌PIECE的ALA生產效率測試中質體拷貝數。
圖4示出本發明實施例1之大腸桿菌PIECE的ALA生產效率測試中生物量。
圖5示出本發明實施例1之大腸桿菌PIECE的ALA生產效率測試中大腸桿菌PIEC的ALA產量。
圖6示出本發明實施例2所使用的pSIT質體圖譜。
圖7示出本發明實施例2之大腸桿菌RcGI與其他轉殖大腸桿菌的生長速率的比較結果。
圖8示出本發明實施例2之大腸桿菌RcGI與其他轉殖大腸桿菌的ALA產量的比較結果。
圖9示出本發明實施例2之大腸桿菌RcGI在不同時間點添加鐵離子的生長速率比較結果。
圖10示出本發明實施例2之大腸桿菌RcGI在不同時間點添加鐵離子的ALA產量比較結果。
圖11示出本發明實施例2之大腸桿菌RcGI的發酵槽量產效率測試結果。
圖12示出本發明實施例3所使用的pCT-PY質體圖譜。
圖13示出本發明實施例3之大腸桿菌A-RcYI的發酵槽量產效率測試結果。
為充分瞭解本發明之目的、特徵及功效，茲藉由下述具體之實施例，並配合所附之圖式，對本發明做一詳細說明，說明如後：
實施例1之大腸桿菌PIECE
本實施例1提供一種大腸桿菌PIECE，PIECE菌株中包含一段額外插入的大腸桿菌pdxy基因，亦即，PIECE菌株包含雙倍的pdxy基因(本身的pdxy基因與外加的pdxy基因)，pdxy基因會表現PdxY蛋白(即吡哆醛激酶)，PdxY蛋白能協助磷酸吡哆醛(以下稱PLP)的合成，而PLP為ALA合成酶(以下稱ALAS)的輔因子。亦即，pdxy基因的表現量增加有助於大腸桿菌的ALA產量的提升，同時，大腸桿菌的生長速度快，相較於麩胺酸棒狀桿菌，大腸桿菌能夠以較短的時間生長到足夠的菌量來生產更多的ALA。本實施例1的PIECE菌株的製備方法如下所述。
首先，準備條件式複製整合模組化(conditional-replication,integration,and modular,CRIM)質體以及大腸桿菌菌株BL21(DE3)。如圖1所示，本實施例1所使用的CRIM質體為pHK-Km，CRIM質體中攜帶有啟動子LacI和pdxY基因而形成pHK-PlacI-pdxY-Km質體，本實施例1的pHK-PlacI-pdxY-Km質體中攜帶有卡那黴素(kanamycin)基因。利用轉型作用將該CRIM質體中送入大腸桿菌BL21(DE3)中。
上述pdxY基因的製備係透過PCR反應進行擴增。pdxy基因擴增所使用的引子序列如下：正向引子序列為5’-GCGCTTATGAGTAGTTTGTTGTTGT TTAACG-3’；反向引子序列為5’-ACTAGTTTATGCTTCCGCCAGCGGCGGCA A-3’。
上述轉型作用過程為先將大腸桿菌BL21(DE3)與CRIM質體混合，接著大腸桿菌BL21(DE3)與CRIM質體的混合物以42℃熱休克90秒，接著加 入LB溶液到前述混合物中回復1小時，最後將含有轉型後大腸桿菌BL21(DE3)之LB菌液塗佈於LB瓊脂培養基上。
轉入大腸桿菌BL21(DE3)體內的CRIM質體可以將pdxY基因與卡那黴素基因整合至大腸桿菌BL21(DE3)之HK022位點。如此一來便可製成本實施例1的PIECE菌株。本實施例1的PIECE菌株是透過將PIECE菌株培養於含有卡那黴素基因的LB瓊脂培養基上進一步挑選而得。
為了避免含有卡那黴素基因的PIECE菌株進入到環境中因具有抗藥性而不易被消滅。因此需要進一步剔除PIECE菌株中的卡那黴素基因。剔除方式為依據前述轉型作用條件，將pAH69質體送入PIECE菌株體內，依據先前文獻(ANDREAS HALDIMANN and BARRY L.WANNER.Conditional-Replication,Integration,Excision,And Retrieval Plasmid-Host Systems For Gene Structure-Function Studies Of Bacteria.J Bacteriol.2001 Nov；183(21)：6384-93.)提供的方法，以pAH69質體剔除PIECE菌株中的卡那黴素基因。
最後，依據先前文獻(François St-Pierre et al.One-Step Cloning and Chromosomal Integration of DNA.ACS Synth Biol.2013 Sep 20；2(9)：537-41.)提供的加熱方法，去除留在PIECE菌株體內的所有質體，即可獲得能夠穩定表現PdxY蛋白的PIECE菌株，PIECE菌株的DNA中具有如序列表中所示之SEQ ID NO.1之序列。本實施例1之PIECE菌株由於是透過將pdxy基因直接嵌入PIECE菌株的本體DNA中，而非透過進入PIECE菌株體內的質體來表現pdxy基因。因此，本實施例1之PIECE菌株能夠穩定地表現出pdxy基因。
上述實施例1係揭示透過含有啟動子LacI、RBS的CRIM質體將pdxY基因送入PIECE菌株體內使其表現pdxY基因，但在其他實施例中，亦可透 過現有已知的其他載體、其他啟動子或是其他方式，來使大腸桿菌菌株表現pdxY基因，不以本實施例1為限。此外，本實施例1所選用的大腸桿菌菌株品種為BL21(DE3)，但在其他實施例中，亦可選用其他大腸桿菌菌株品種來表現pdxY基因。
PIECE菌株之ALA生產效率測試
首先，依據上述PIECE菌株的製備方法，準備PIECE菌株；同時準備未插入pdxY基因的原始大腸桿菌菌株BL21(DE3)。接著，依據上述CRIM質體的轉型方法，分別將SITAG質體送入PIECE菌株和大腸桿菌菌株BL21(DE3)體內，其中SITAG質體為攜帶有基因簇(T7-RchemA-T7-GroES-GroEL)的質體，RchemA為莢膜紅桿菌中表現ALA合成酶的基因，GroES、GroEL為伴侶蛋白，其可改善菌株生長的穩定性。SITAG質體的製備方式如下所述。首先，透過延長的重疊延伸PCR，以引子IF、IR、VF和VR將RchemA基因插入到pSIT質體中，以製成pSIT-Rc質體。然後，再以前述方式以引子NdeI-GF、XhoI-GR將從大腸桿菌中獲得的GroES基因、GroEL基因插入到pSIT質體中，以製成SITAG質體。上述引子的序列如下列表1所示。SITAG質體為使菌株生產ALA的質體，亦即，在本測試中，將比較插入pdxY基因的PIECE菌株與一般大腸桿菌在ALA生產效率上的差異。
Figure 110147693-A0305-02-0008-1
Figure 110147693-A0305-02-0009-2
然後，攜帶有SITAG質體的PIECE菌株(以下簡稱SITAG/PIECE菌株)和攜帶有SITAG質體的BL21(DE3)菌株(以下簡稱SITAG/BL21(DE3)菌株)分別接種於2mL的LB培養液中在37℃環境下培養12小時作為前培養液，取SITAG/PIECE菌株和SITAG/BL21(DE3)菌株的前培養液，將上述兩種菌株的前培養液以2%的接種比例接種於30mL的MM9培養液(其中含有20g/L的葡萄糖)中進行培養，上述MM9培養液裝於250mL的搖瓶中。其中，含有SITAG/PIECE菌株的MM9培養液作為實驗組，含有SITAG/BL21(DE3)菌株的MM9培養液作為對照組，實驗組與對照組皆在37℃環境中以175rpm的轉速搖瓶培養，直到實驗組與對照組中的菌液濃度達到OD600約為0.6時，各組菌液中再加入0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作為基因表現的誘導劑，並且加入4g/L的甘胺酸、1g/L的琥珀酸與40μM的吡哆醛(pyridoxal)，甘胺酸與琥珀酸係作為合成ALA所需的基質，吡哆醛為PLP的前驅物，在此透過使用吡哆醛來取代PLP，由菌株自身來將吡哆醛合成為PLP，可以降低製程成本。實驗組與對照組中添加IPTG、甘胺酸、琥珀酸與吡哆醛之後，將實驗組與對照組置於在30℃環境中以200rpm的轉速搖瓶培養24小時，在培養24小時的期間，分別在不同時間點測定實驗組與對照組中的質體拷貝數、生物量、ALA產量。上述過程係重複三次。
上述實驗組與對照組的質體拷貝數測定方法如下所述。首先，在實驗組與對照組培養24小時之後，將實驗組與對照組以12,000rpm的轉速離心3分鐘以取得菌體沉澱物，實驗組與對照組的菌體沉澱物以去離子水清洗兩 次，然後再將實驗組與對照組的菌體沉澱物均勻打散於去離子水中並放置於95℃環境中10分鐘進行高溫處理，實驗組與對照組的菌體沉澱物經高溫處理後以12,000rpm的轉速再次離心3分鐘並取出離心後的上清液，最後使用即時PCR系統所用的EvaGreen試劑(Applied Biosystems,USA)進行定量PCR(qPCR)分析，評估質體拷貝數所使用的目標基因可以選自先前文獻(Yi YC,Ng IS.Establishment of toolkit and T7RNA polymerase/promoter system in Shewanella oneidensis MR-1.J Taiwan Inst Chem Eng 2020；109：8-14.)中所使用的基因。
上述實驗組與對照組的生物量測定方法如下所述。在實驗組與對照組如前述添加IPTG、甘胺酸、琥珀酸與吡哆醛培養至第2小時、第4小時、第8小時、第12小時及第24小時之後，從實驗組與對照組中取出200μL的菌液樣本，在各個取樣時間點，先測定實驗組與對照組的菌液之OD600值，再將實驗組與對照組的菌液樣本以6000 xg的轉速進行離心10分鐘，離心完畢後取實驗組與對照組的菌體沉澱物，實驗組與對照組的菌體沉澱物以去離子水清洗兩次，然後以紅外線濕度分析儀(FD-660,Kett Electric Laboratory,Japan)在110℃環境中對實驗組與對照組的菌體沉澱物進行加熱乾燥20分鐘，直到實驗組與對照組的菌體沉澱物中的水分被完全去除以取得菌體沉澱物的確切乾重，藉此得到實驗組與對照組中的單位生物量(g/L)。。
上述實驗組與對照組的ALA產量測定方法係參考先前文獻(Ying-Chen Yi,Chengfeng Xue,and I-Son Ng.Low-Carbon-Footprint Production of High-End 5-Aminolevulinic Acid via Integrative Strain Engineering and RuBisCo-Equipped Escherichia coli.ACS Sustainable Chemistry & Engineering 2021 9(46), 15623-15633)中之實驗流程及實驗條件以及Bio-Rad Protein Assay Kit的產品操作手冊進行，ALA產量的測定流程概述如下。
首先，製備200μL的反應溶液，反應溶液由50mM的Tris HCl(pH 7.5)、50mM的NaCl、0.1mM的PLP、1mg/mL的游離酶(其為將菌體以高壓破菌方式破壞細胞膜後獲得的粗蛋白)、0.29mM的琥珀醯輔酶A和2mM的甘胺酸組成。
接著，在實驗組與對照組如前述添加IPTG、甘胺酸、琥珀酸與吡哆醛培養至第8小時、第12小時及第24小時之後，在各個取樣時間點從實驗組與對照組取出2mL的菌液樣本，在各組反應混合物中加入200μL的1M乙酸鈉(pH 4.6)和40μL的乙醯丙酮終止ALAS所進行的合成ALA反應。然後，將已終止合成反應的各組反應混合物於100℃加熱10分鐘，再進一步以使由前述合成反應所生成之ALA與乙醯丙酮充分反應，加熱完畢後，降溫至室溫，然後在各組反應混合物中加入等量的Ehrlich試劑均勻混合並反應10分鐘以對各組中在各個時間點合成出的ALA進行定量，Ehrlich試劑的製備係參考先前文獻(Shemin D,Russell CS.d-aminolevulinic acid its role in the biosynthesis of porphyrins and purines.J Am Chem Soc 1953；75(19)：4873-4.)。各組反應混合物與Ehrlich試劑反應完成後，使用微量盤式分析儀以553nm的波長來確定各組中的ALA產量。
上述PIECE菌株之質體拷貝數、生物量及ALA生產效率測試結果如圖3-5所示，SITAG/PIECE菌株其相較於僅含有單套pdxY基因的SITAG/BL21(DE3)菌株有更高的生物量及ALA產量。
實施例2之大腸桿菌RcGI
本實施例2提供一種大腸桿菌RcGI，RcGI菌株中包含額外插入的hemA基因及伴侶蛋白GroES基因、GroEL基因。如前所述，RchemA基因為表現ALA合成酶的基因，伴侶蛋白GroES、GroEL其可改善菌株生長的穩定性，本實施例2係進一步測試，將RchemA基因和GroES基因、GroEL基因轉入大腸桿菌中對於大腸桿菌生產ALA的效率提升效果。本實施例2的RcGI菌株的製備方法如下所述。
首先，準備如圖1所示之CRIM質體以及大腸桿菌菌株BL21(DE3)，本實施例2的CRIM質體進一步插入由RchemA基因和GroES基因、GroEL基因所整合成的基因簇(T7-RchemA-T7-GroES-GroEL)。
接著根據實施例1中的轉型方式，將前述攜帶有T7-RchemA-T7-GroES-GroEL基因簇的CRIM質體中送入大腸桿菌BL21(DE3)中製成RcGI菌株，此時T7-RchemA-T7-GroES-GroEL基因簇是直接整合在大腸桿菌的DNA中，上述基因簇並非透過共存在大腸桿菌體內但未整合到在大腸桿菌DNA的質體來表現。並且，根據實施例1的方法將pAH69質體送入RcGI菌株體內，以剔除RcGI菌株中的卡那黴素基因。
上述RchemA基因的製備係透過PCR反應進行擴增。RchemA基因擴增所使用的引子序列如下：正向引子序列為5’-TCGACGAAGTCCATGCTGT CGG-3’；反向引子序列為5’-CGACGTAGAGAAGATGAATCCAG-3’。
最後，透過前述實施例1所述的加熱去除留在RcGI菌株體內的所有質體，即可獲得能夠穩定表現ALA合成酶和伴侶蛋白GroES、GroEL的RcGI菌株。此時RcGI菌株的DNA中具有如序列表中所示之SEQ ID NO.3之序列。
上述實施例2係揭示透過如圖1所示之CRIM質體將RchemA基因及GroES、GroEL基因送入RcGI菌株體內使其表現RchemA基因及GroES基因、GroEL基因，但在其他實施例中，亦可透過現有已知的其他載體、其他啟動子或是其他方式，來使大腸桿菌菌株表現RchemA基因及GroES基因、GroEL基因，不以本實施例2為限。此外，本實施例2所選用的大腸桿菌菌株品種為BL21(DE3)，但在其他實施例中，亦可選用其他大腸桿菌菌株品種來表現RchemA基因及GroES基因、GroEL基因。
RcGI菌株之ALA生產效率測試
首先，依照前述RcGI菌株的製備方法準備RcGI菌株。同時，根據前述製備RcGI菌株的轉型作用方式，以如圖6所示之pSIT質體攜帶RchemA基因及GroES基因、GroEL基因基因送入原始大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，藉此製成RcG菌株，此時，RchemA基因及GroES基因、GroEL基因基因是透過共存在大腸桿菌體內但未整合到在大腸桿菌DNA的質體來表現；並且，根據前述製備RcGI菌株的轉型作用方式，以pSIT質體攜帶RchemA基因送入原始大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，藉此製成Rc菌株。
接著，將RcGI菌株、RcG菌株及Rc菌株分別接種於2mL的LB培養液中在37℃環境下培養12小時作為前培養液，取RcGI菌株、RcG菌株及Rc菌株的前培養液以2%的接種比例分別接種於裝於250mL錐形瓶中之30mL的MM9培養液(其中含有20g/L的葡萄糖及10g/L的甘油作為碳源，葡萄糖與甘油的重量比為2：1)內。在本測試中，為達到抑制ALA脫水酶活性、提高ALAS表現量及降低成本之效益，使用葡萄糖及甘油所組成的混合碳源，葡萄糖同時作為ALA脫水酶之抑制劑，甘油則可作為第二碳源以增加蛋白質的表達 量，但在其他實施例中仍可視需求選擇單一碳源或是其他類型的碳源而不以此為限。待將RcGI菌株、RcG菌株及Rc菌株接種於MM9培養液之後，將上述RcGI菌株、RcG菌株及Rc菌株置於37℃環境中以200rpm的轉速搖晃養，直到上述RcGI菌株、RcG菌株及Rc菌株的菌液濃度以分光光度計測定達到OD600約為0.6時，上述RcGI菌株、RcG菌株及Rc菌株的菌液中再加入0.1mM的IPTG、4g/L的甘胺酸、1g/L的琥珀酸與50μM的磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)。在上述RcGI菌株、RcG菌株及Rc菌株的菌液中添加IPTG、甘胺酸、琥珀酸與吡哆醛之後，接著在30℃環境中以300-400rpm的轉速持續進行培養30小時，並且在將RcGI菌株、RcG菌株及Rc菌株培養至第4小時、第8小時、第12小時、第24小時及第30小時的時間點，取RcGI菌株、RcG菌株及Rc菌株的菌液，以分光光度計測定RcGI菌株、RcG菌株及Rc菌株的OD600數值，並且依據前述實施例1之ALA生產效率測試方式，測定RcGI菌株、RcG菌株及Rc菌株分別在培養後第12小時、第24小時及第30小時之ALA產量。
RcGI菌株之生長速度及ALA生產效率測試如圖7及圖8所示，直接將RchemA基因及GroES基因、GroEL基因基因整合在大腸桿菌基因中的RcGI菌株其生長速度和ALA產量皆高於以質體方式表現RchemA基因及GroES基因、GroEL基因基因的其他大腸桿菌菌株Rc和RcG。
RcGI菌株之鐵離子添加測試
首先，依照前述RcGI菌株的製備方法準備RcGI菌株，將RcGI菌株接種於2mL的LB培養液中在37℃環境下培養12小時作為前培養液，取RcGI菌株的前培養液以2%的接種比例分別接種於四組裝於250mL錐形瓶中之30mL的MM9培養液(其中含有20g/L的葡萄糖及10g/L的甘油作為碳源，葡萄糖與 甘油的重量比為2：1)內。上述四組其中接種有RcGI菌株的MM9培養液分別命名為第一組至第四組。將RcGI菌株分別接種於第一組至第四組的MM9培養液之後，將第一組至第四組置於37℃環境中以200rpm的轉速搖晃培養，直到第一組至第四組中的菌液濃度以分光光度計測定達到OD600約為0.6時，第一組至第四組的菌液中各自再加入0.1mM的IPTG、4g/L的甘胺酸、1g/L的琥珀酸與50μM的磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)。在第一組至第四組的菌液中添加IPTG、甘胺酸、琥珀酸與吡哆醛之後，將第一組至第四組放置於30℃環境中以300-400rpm的轉速持續進行培養30小時，其中第一組的培養液在開始培養的第0小時就添加0.4mM的檸檬酸鐵，第二組的培養液在培養3小時後添加0.4mM的檸檬酸鐵，第三組的培養液在培養8小時後添加0.4mM的檸檬酸鐵，第四組的培養液在培養12小時後添加0.4mM的檸檬酸鐵，並且在將第一組至第四組中的RcGI菌株培養至第4小時、第8小時、第12小時、第24小時及第30小時的時間點，取第一組至第四組中的200μL菌液，以分光光度計測定第一組至第四組菌液的OD600數值，並且依據前述實施例1之ALA生產效率測試方式，測定第一組至第四組中的RcGI菌株分別在培養後第12小時、第24小時及第30小時之ALA產量。
本測試結果如圖9及圖10所示，在培養開始之後就添加鐵離子會造成菌株生長壓力，當延後添加鐵離子時間，可以使RcGI菌株的生長速度和ALA產量進一步提升。
RcGI菌株之發酵槽量產效率測試
首先，依照前述RcGI菌株的製備方法準備RcGI菌株。接著，將RcGI菌株接種於2mL的LB培養液中在37℃環境下培養12小時作為前培養液， 取RcGI菌株的前培養液以2%的接種比例接種於裝於1L的小型發酵槽中之300mL的MM9培養液(其中含有20g/L的葡萄糖及10g/L的甘油作為碳源，葡萄糖與甘油的重量比為2：1)內進行培養，上述發酵槽中的RcGI菌株在37℃環境中以200rpm的轉速搖晃培養，直到上述發酵槽中的菌液濃度以分光光度計測定達到OD600約為0.6時，上述發酵槽的發酵液中再加入0.1mM的IPTG、4g/L的甘胺酸、1g/L的琥珀酸與50μM的磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)。上述發酵槽在添加IPTG、甘胺酸、琥珀酸與吡哆醛之後，上述發酵槽的RcGI菌株在30℃環境中以300-400rpm的轉速持續進行培養30小時，發酵槽中的發酵液在培養12小時後加入甘胺酸。在將RcGI菌株開始培養的第0小時以及培養至第4小時、第8小時、第12小時、第24小時、第26小時、第29小時及第30小時的時間點，取200μL的RcGI菌株的菌液，以分光光度計測定RcGI菌株在前述各個取樣時間點的OD600數值，並且依據前述實施例1之ALA生產效率測試方式，測定RcGI菌株在前述各個取樣時間點的ALA產量。同時，測定RcGI菌株在前述各個取樣時間點的醋酸含量，若無醋酸產生則表示大部分的碳源都進入生物代謝過程中的檸檬酸循環途徑，即大部分的碳源被充分運用於ALA生產中。
上述RcGI菌株之發酵槽量產效率測試結果如圖11所示，在發酵槽量產製程中，當RcGI菌株培養到第30小時，ALA產量可達15.6g/L，產率可達0.52g/L/h。
本實施例3之大腸桿菌A-RcYI
本實施例3提供一種大腸桿菌A-RcYI，A-RcYI菌株中包含RchemA基因、pdxY基因和額外插入的pRARE質體。pRARE質體能夠提供tRNA協助蛋白質的表現，本實施例3係進一步測試，將RchemA基因與pdxY基因的協 同作用加上大腸桿菌體內tRNA表現量的提升對於大腸桿菌生產ALA的效率提升效果。本實施例3的A-RcYI菌株的製備方法如下所述。
首先，準備如圖1所示之CRIM質體、如圖12所示之pCT-PY質體和pRARE質體以及大腸桿菌菌株BL21(DE3)。接著，將RchemA基因插入CRIM質體中，另pdxY基因是以pCT-PY質體方式進入大腸桿菌中。根據實施例1中的轉型方式，將帶有RchemA基因的CRIM質體插入大腸桿菌BL21(DE3)的HK022位點，同時將帶有pdxY基因的pCT-PY質體插入大腸桿菌BL21(DE3)的P21位點，隨後根據實施例1的方法將pAH69質體送入大腸桿菌BL21(DE3)體內，以剔除菌株中的卡那黴素基因。最後，根據實施例1中的轉型方式，將pRARE質體送入大腸桿菌BL21(DE3)體內，即可製備出A-RcYI菌株。此時A-RcYI菌株的DNA中具有如序列表中所示之SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2之序列，並且A-RcYI菌株體內還具有pRARE質體。
上述實施例3係揭示透過CRIM質體和pCT-PY質體分別將RchemA基因及pdxY基因送入A-RcYI菌株體內使其表現RchemA基因及pdxY基因，但在其他實施例中，亦可透過現有已知的其他載體、其他啟動子或是其他方式，來使大腸桿菌菌株表現RchemA基因及pdxY基因，不以本實施例3為限。此外，本實施例3所選用的大腸桿菌菌株品種為BL21(DE3)，但在其他實施例中，亦可選用其他大腸桿菌菌株品種來表現RchemA基因、pdxY基因與pRARE質體。
A-RcYI菌株之發酵槽量產效率測試
首先，依照前述A-RcYI菌株的製備方法準備A-RcYI菌株。接著，將A-RcYI菌株接種於2mL的LB培養液中在37℃環境下培養12小時作為前培養液，取A-RcYI菌株的前培養液以2%的接種比例接種於裝於1L的小型發酵 槽中之300mL的MM9培養液(其中含有20g/L的葡萄糖及10g/L的甘油作為碳源，葡萄糖與甘油的重量比為2：1)內進行培養。
上述發酵槽中的A-RcYI菌株在37℃環境中以300-400rpm的轉速搖晃培養，直到上述發酵槽中的菌液濃度以分光光度計測定達到OD600約為0.6時，上述發酵槽的發酵液中再加入0.1mM的IPTG、6g/L的甘胺酸、1g/L的琥珀酸與50μM的吡哆醛。上述發酵槽在添加IPTG、甘胺酸、琥珀酸與吡哆醛之後，上述發酵槽的A-RcYI菌株在30℃環境中以300-400rpm的轉速持續進行培養35小時，發酵槽中的發酵液在培養12小時後加入最終濃度為6g/L的甘胺酸。在將A-RcYI菌株開始培養的第0小時以及培養至第4小時、第8小時、第12小時、第24小時、第30小時、第32小時及第35小時的時間點，取A-RcYI菌株的菌液，以分光光度計測定A-RcYI菌株在前述各個取樣時間點的OD600數值，並且依據前述實施例1之ALA生產效率測試方式，測定A-RcYI菌株在前述各個取樣時間點的ALA產量。
上述A-RcYI菌株之發酵槽量產效率測試結果如圖13所示，在發酵槽量產製程中，當A-RcYI菌株培養到第35小時，ALA產量可以達到16.3g/L，產率可達0.47g/L/h。
如上所述，上述經過基因轉殖而能夠生產ALA的大腸桿菌，包括PIECE菌株、RcGI菌株及A-RcYI菌株，其為生長速度快同時具有高ALA產量的菌株，並且使用該等菌株生產ALA之方法能夠快速且高產量地生產ALA。
本發明在上文中已以較佳實施例揭露，然熟習本項技術者應理解的是，該實施例僅用於描繪本發明，而不應解讀為限制本發明之範圍。應注 意的是，舉凡與該實施例等效之變化與置換，均應設為涵蓋於本發明之範疇內。因此，本發明之保護範圍當以申請專利範圍所界定者為準。
Figure pseq-0
Figure pseq-1
Figure pseq-2
Figure pseq-3
Figure pseq-4
Figure pseq-5
Figure pseq-6
Figure pseq-7

Claims (9)

  1. 一種大腸桿菌，其具有雙倍的 pdxY基因，該大腸桿菌可生產五胺基酮戊酸。
  2. 如請求項1所述之大腸桿菌，其中該大腸桿菌更包含 RchemA基因。
  3. 如請求項2所述之大腸桿菌，其中該大腸桿菌更包含pRARE質體。
  4. 一種大腸桿菌，其具有SEQ ID NO.1之序列，該大腸桿菌可生產五胺基酮戊酸。
  5. 如請求項4所述之大腸桿菌，當該大腸桿菌更具有SEQ ID NO.2之序列。
  6. 如請求項5所述之大腸桿菌，該大腸桿菌更包含pRARE質體。
  7. 一種生產五胺基酮戊酸的方法，包含以下步驟： (a) 提供如請求項1-6中任一項所述之大腸桿菌；及 (b) 將該大腸桿菌接種於含有碳源、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、甘胺酸、琥珀酸與吡哆醛的培養基中進行培養，以產生五胺基酮戊酸。
  8. 如請求項7所述之方法，其中該碳源為由葡萄糖及甘油組成的混合碳源。
  9. 如請求項7述之方法，其中該培養基中含有鐵離子。
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期刊 Yi, Y. C., Xue, C., & Ng, I. S. Low-Carbon-Footprint Production of High-End 5-Aminolevulinic Acid via Integrative Strain Engineering and RuBisCo-Equipped Escherichia coli. ACS Sustainable Chemistry & Engineering 9(46) 2021 15623-15633

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