KR100430785B1

KR100430785B1 - 영양요구성 우성유전자를 함유하는 효모 형질전환 벡터, 이를 함유하는 효모 형질전환체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100430785B1
Application number: KR10-2001-0035249A
Authority: KR
Inventors: 송재만
Original assignee: 송재만
Priority date: 2001-06-21
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2004-05-10
Also published as: WO2003000867A1; KR20020096574A; US20050158861A1

Abstract

본 발명은 영양요구성 우성유전자를 함유하는 효모형질전환 벡터, 이를 함유하는 효모 형질전환체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 아데닌 요구성 우성돌연변이DAD효모균주를 유발하고 상기 돌연변이를 유발하는 유전자DAD1을 분리하여 그 돌연변이부위를 분석한 후 상기DAD1우성유전자를 함유하는 벡터 pCABIOD101(기탁번호 : KCTC 1013BP)를 제작하고 상기 벡터 pCABIOD101을 일배체와 이배체 효모인 실험실 효모균주와 산업 효모균주의 형질전환에 이용하여 성장을 위해 아데닌을 요구하는 영양요구성 형질전환체를 얻음으로써 본 발명 효모형질전환 벡터 시스템은 기존산업에 사용되고 있는 산업효모들의 개량에 이용할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 미생물들의 개량에 응용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

영양요구성 우성유전자를 함유하는 효모형질전환 벡터, 이를 함유하는 효모 형질전환체 및 그 제조방법{Yeast transforming vector containing dominant nutrient-requiring gene, yeast transformant containing it and preparing process thereof}

본 발명은 영양요구성 우성유전자를 함유하는 효모형질전환 벡터, 이를 함유하는 효모 형질전환체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아데닌 요구성 돌연변이를 유발하고, 상기 돌연변이를 유발하는 우성유전자DAD1을 분리하여 그 돌연변이부위를 분석한 후 상기DAD1우성유전자를 함유하는 벡터 pCABIOD101을 제작함으로써, 궁극적으로는 상기 벡터 pCABIOD101을 이용하여 기존의 산업효모들을 비롯하여 다양한 미생물들을 개량시킬 수 있는 형질전환 벡터 시스템을 구축하는 것에 관한 것이다.

효모는 인체에 해가 없고 인류 역사와 더불어 오랜 세월 동안 빵, 맥주, 소주, 포도주 또는 청주 등을 제조하는데 사용되어 왔으며, 현재 GRAS(Generally Regarded As Safe) 생물로 분류되어 있다. 효모를 활용하여 산업적으로 유용한 물질을 탐색하거나 기존의 산업효모들을 개량하기 위한 노력이 꾸준히 이루어져 왔으나, 대부분의 산업효모는 이배체 또는 다배체여서 돌연변이 유발이 용이하지 않을뿐만 아니라 불임이어서 포자형성 및 타효모와의 결합이 용이하지 않아 기타 산업용 세균들에서만큼 성공적인 결과는 얻지 못한 실정이다. 이러한 한계를 극복하기 위하여 최근에는 효모형질전환 시스템을 이용한 유전자 재조합 기술 등이 도입되어 효율성 및 생산성이 향상된 효모 개발이 이루어지고 있다. 미국의 필립스 피트롤리움(Phillips Petroleum, Bartlesville, Oklahoma, USA)사 또는 독일의 라인 바이오텍(Rhein Biotech, Dusseldorf, Germany)사는 각기 다른 산업효모인 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 형질전환 시스템을 개발하여 상품화 하였고, 최근에 일본의 다카라 슈조(Takara Shuzo, Shiga, Japan)사는 항생제 오리오바시딘 에이(aureobasidin A)에 대한 내성유전자를 이용한 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 형질전환 시스템을 상품화하였다. 이외에 야생형 유전자를 이용하거나, 항생제 또는 화학물질 내성 유전자를 이용한여러 효모형질전환 벡터들이 실험실 효모에서 많이 이용되고 있지만, 일반적으로 산업 효모들에서는 오리오바시딘 A, 클로람페니콜, G418/제네티신(G418/geneticin), 제오신(zeocin), 구리(copper), 메토트렉세이트(methotrexate), 메틸글리옥살(methylglyoxal), 설포메투론(sulfometuron), 글리포스테페이트 (glyphosphate)와 같은 항생제 또는 화학물질에 대한 내성유전자들을 이용한 형질전환 벡터들이 사용되고 있다. 그러나, 상기 항생제 또는 화학물질 내성 유전자들을 함유하는 형질전환체들은 산업 특히 식품산업에 이용되는 경우 내성유전자가 내재되어 있음으로 인한 인체에 대한 유해 가능성이 최근 큰 문제점으로 대두되고 있다. 따라서, 기존에 많이 사용되던 항생제 또는 화학물질 내성유전자를 사용하지 않으면서 효모 형질전환에 특수한 숙주 균주의 건축이나 이용을 필요로 하지 않는 효모형질전환 벡터 시스템의 개발이 절실히 요구되고 있다. 상기와 같은 이유로 인하여, 영양요구성 우성유전자와 같은 유전자를 이용한 효모형질전환 벡터 시스템은 기존산업에서 오랜 기간동안 사용되어 온 균주에도 즉시 적용할 수 있으므로 시간이 절약되고 기존설비를 계속 활용할 수 있어 매우 경제적이다. 또한, 상기 효모형질전환 벡터로 형질전환시킨 효모 형질전환체들은 GRAS 생물로 분류될 수 있으므로 식품산업에 사용될 수 있는 유용물질의 대량생산에 적합하다.

한편, 효모(S. cerevisiae)에서 퓨린(아데닌) 생합성 과정에 관여하는 여러 유전자들 중의 하나인ADE3는 일탄소-테트라히드로폴레이트 신타아제(C1-tetrahydrofolate synthase) 유전자로 그에 관한 연구는 로먼(Roman, H., C.R.Lab. Carlsberg, Ser. Physiol. 26, 299-314(1956))에 의해 첫 돌연변이체들의 분리보고 이후 지금까지 여러 연구자들에 의해 많은 수의 돌연변이체들이 분리되어 있다. 그러나, 지금까지 보고된 모든ade3돌연변이체들은 다른 대부분의 영양요구성 돌연변이체들과 같이 유전적으로 열성을 보여주고 있다. 즉, 일배체ade3효모는 아데닌 요구성이지만 일단 이배체ade3/ADE3 ⁺ 효모가 되면 아데닌 요구성을 더 이상 유지하지 못하게 된다. 이러한 이유로 인하여, 영양요구성 열성유전자는 효모형질전환 벡터의 선택유전자로 사용될 수 없다.

따라서, 본 발명에서는 전통적인 유전자 분석방법이 아닌 유전자 재조합방법을 이용하여ADE3유전자에 돌연변이를 유발하여 우성돌연변이를 얻은 후 그 돌연변이부위를 분석하였다. 상기 영양(아데닌) 요구성 우성돌연변이는 효모를 포함한 모든 생물체에서 분자생물학적 수준에서 영양요구성 우성유전자로 규명된 독특한 예이어서 이를DAD1( D ominant ad enine-requiring) 유전자로 명명하였다. 즉, 이배체DAD1/dad1 ⁺ 효모도 일배체DAD1효모와 같이 아데닌 요구성을 갖는다. 상기DAD1유전자는 퓨린 합성과정에서 그 유전자 산물인 일탄소-테트라히드로폴레이트 신타아제의 역할규명에 유익하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 더 나아가 생물산업에 사용될 때 그 산업적 의의 및 가치가 매우 크다.

따라서, 본 발명의 목적은 아데닌 요구성 우성돌연변이를 유발하고, 상기 돌연변이를 유발하는 우성유전자를 분리·분석한 후, 상기 유전자를 함유하는 효모형질전환 벡터를 제작함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 효모형질전환 벡터를함유하는 아데닌 요구성 형질전환체를 생산함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 히드록실아민(hydroxylamine)을 사용하여 효모 일탄소-테트라히드로폴레이트 신타아제 유전자에 아데닌 요구성 돌연변이를 유발하고, 상기 돌연변이를 유발하는 유전자DAD1을 분리하여 그 돌연변이 부위를 DNA 시퀀싱으로 분석한 후 상기DAD1우성유전자를 함유하는 벡터 pCABIOD101을 제작하고, 상기 벡터를 일배체와 이배체 효모인 사카로마이세스 세레비시에와 산업 효모균주의 형질전환에 이용하여 성장을 위해 아데닌을 요구하는 아데닌 요구성 형질전환체를 얻음으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 최종 형질전환체의 제조공정을 나타낸 공정도,

도 2는 아데닌 요구성 우성유전자DAD1의 돌연변이부위를 결정하기 위한 플라스미드 결실 분석도,

도 3은 영양요구성 우성유전자인DAD1을 함유하는 본 발명 벡터 pCABIOD101의 제한효소에 의한 개열지도이다.

본 발명은 효모 일탄소-테트라히드로폴레이트 신타아제 유전자에 아데닌 요구성 우성돌연변이를 유발시키는 단계; 상기 영양요구성 우성돌연변이로부터 영양 요구성 우성유전자를 분리하는 단계; DNA 시퀀싱에 의해 상기 우성유전자의 우성돌연변이 부위를 분석하는 단계; 상기 우성유전자를 함유하는 벡터를 제작하는 단계; 상기 본 발명 벡터를 일배체 효모인 사카로마이세스 세레비시에에 형질전환하여 아데닌 요구성을 갖는 형질전환체를 선별하는 단계; 상기 본 발명 벡터를 이배체 효모인 산업 효모균주에 형질전환하여 아데닌 요구성을 갖는 형질전환체를 선별하는 단계로 구성된다.

본 발명에서 사용한 효모ADE3유전자와URA3유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pJS8A는 본 발명자에 의해 Curr. Genet, 16:315-321에 공지된 것을 사용하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 효모 아데닌-요구성 우성유전자를 함유하는 형질전환벡터 제조

제1공정: 아데닌 요구성 우성돌연변이( DAD 효모균주) 유발

효모ADE3유전자와URA3유전자를 포함하는 플라스미드 pJS8A(Song, J.M.과 Liebman, S.W., Curr. Genet. 16, 315-321)에 1M 히드록실아민을 70℃에서 2시간 동안 처리하는 세포외 돌연변이 유발(in vitromutagenesis)을 수행한 후ade2 ura3효모(S. cerevisiae)에 형질전환시켜 유라실은 함유하지 않고 소량의 아데닌(5.0 ㎍/㎖)을 함유하는 배지에서 배양한 결과 빨간색의 Ura⁺형질전환체들을 얻었는데 그 중 하나는 분홍색의 콜로니를 형성하였다. 이러한 현상은 아데닌 생합성 단계 중ade2에 상위(epistatic)한 유전자들(예:ADE3)에 돌연변이가 발생하면ade2의 결과물(CAIR, 5-아미노-4-이미다졸카르복실레이트 리보뉴클레오티드 축적물)로 인하여 빨간색소가 축적되기 전에 아데닌 생합성이 중단되는 정도에 따라 분홍색이나 흰색의 콜로니를 형성하게 되기 때문에 발생하는 것이다. 따라서, 상기 분홍색의 형질전환체는 아데닌 요구성 우성돌연변이가 유발된 플라스미드에 의해 형질전환된 것으로 추론되므로 이 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 대장균(Escherichia coli)을 통해 분리한 후 제한효소인BamHI과SalI으로 처리하여ADE3유전자와 그 주위를 포함하는 6.7kb DNA 단편을 잘라내어 DNA를 추출하고 이를ade3-130효모균주에 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다.

상기 형질전환된 아데닌 요구성 우성돌연변이를Saccharomyces cerevisiaeS68라 명명하고, 생명공학연구소 유전자센터에 2001년 5월 31일에 기탁번호 KCTC 1018BP로 기탁하였다.

상기 효모균주의 아데닌 요구성은 이배체에서도 유지되어 우성형질임을 다시 확인하였으며, 또한 아데닌 요구성 우성형질은 23℃ 이하의 저온에서 더욱 분명하였다. 상기 아데닌 요구성 우성돌연변이체의 표현형을 하기 표 1에 나타내었다. 상기 표현형은 효모현탁액을 합성복합배지(SC, synthetic complete)와 아데닌 결핍배지(SC-Ade)에 각각 스포팅 방법으로 접종한 후 성장을 비교한 것이다.

본 발명 아데닌 요구성 우성돌연변이체의 표현형

Partial genotype	SC*		SC-Ade*
Partial genotype	30℃	23℃		30℃	23℃
ADE3 ⁺ (ordad1 ⁺ )	+	+		+	+
ade3-130	+	+
DAD1	+	+		±
DAD1/dad1 ⁺	+	+		±	±
* 효모현탁액을 합성복합배지(SC, synthetic complete)와 아데닌 결핍배지(SC-Ade)에 각기 스포팅 방법으로 접종한 후 성장을 비교하였다.효모 성장의 측정 기준: +, good growth by 1 or 2day; ±, some growth by 4 day; ±, some growth by 7 day;, no sign of growth by 7 day.

제2공정: 아데닌 요구성 우성유전자( DAD1 )의 확인

상기 제1공정에서 얻은DAD효모균주에ADE3 ⁺ 외에URA3 ⁺ ,ARS1유전자들을 포함하는 다중 카피(multicopy) 플라스미드 YRpADE3를 형질전환하여 얻은 Ura⁺형질전환체들은 성장을 위해 아데닌을 요구하지 않았다. 즉, 이러한 사실은 1개의 염색체 우성유전인자의 우성이 다중카피의 플라스미드 야생형 유전자에 의해 억제된다는 것을 나타낸다. 따라서,DAD효모균주에 갭 보완(gap repairing) 방법을 수행하기 위해 플라스미드 YRpADE3를 제한효소들인EspI과XhoI,XhoI과AvrII,AvrII와KpnI,KpnI과HpaI,SphI의 각 조합으로 처리하여 갭화한 것으로 형질전환하여 얻은 Ura ⁺ 형질전환체들의 아데닌 유구성을 조사한 결과 도 2에 도시된 바와 같이KpnI과HpaI 제한효소 또는SphI 제한효소를 처리하여 갭화된 플라스미드들로 얻어진 형질전환체들은 모두 아데닌 요구성을 나타내는 것으로부터DAD돌연변이부위는 일탄소-테트라히드로 폴레이트 신타아제 유전자내의KpnI과HpaI 제한효소 부위 사이에 존재함을 알 수 있었으며, 이를DAD1( D ominant ad enine-requiring) 유전자로 명명하였다.

제3공정: DAD1 우성돌연변이의 위치 분석

상기 제2공정에서 확인된DAD1우성돌연변이가 존재하고 있는KpnI-HpaI 제한효소 단편인 497bp의 DNA 염기서열을 미국 바이오케미컬 코퍼레이션(Biochemical Corp.)사의 시쿼나아제 버전2.0 DNA 시퀀싱 키트를 사용한 DNA-시퀀싱 방법으로 시퀀싱하였다.DAD1유전자의 염기 서열을 서열번호 1에 나타내었다. 상기DAD1유전자에 의해 해독(translation)되는 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타내었다.DAD1돌연변이는 효모 일탄소-테트라히드로폴레이트 신타아제 유전자의 총 947개의 코돈(codon)들 중 683번째 코돈의 두 번째 염기가 T T C→T C C로 변한 점돌연변이(point mutation)이었고, 그 결과 아미노산은 Phe 683 → Ser 683으로 변경되었다.

제4공정: DAD1 유전자를 함유하는 플라스미드 pCABIOD101의 제조

상기 제2공정에서KpnI과HpaI 제한효소로 처리하여 갭화된 플라스미드로 얻어진 아데닌 요구성 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 대장균(E. coli)을 통해 분리한 후NheI 제한효소로 처리하고 Klenow 효소로 blunt end로 만든 다음BamHI 제한효소로 처리하여 3.68kb의 DNA 단편을 추출하여 효모의 삽입벡터인 pJS41의406bpBamHI-SmaI 제한효소 부위를 치환함으로써 영양요구성 우성유전자인DAD1을 함유하는 효모 삽입벡터인 플라스미드를 제조하였다.

상기 본 발명 벡터를 pCABIOD101으로 명명하고, 생명공학연구소 유전자센터에 2001년 5월 28일에 기탁번호 KCTC 1013BP로 기탁하였다. 본 발명 벡터 pCABIOD101의 제한효소에 의한 개열지도를 도 3에 나타내었다.

pCABIOD101 플라스미드는 효모 내에서 자체적으로 복제하지 못하고 염색체 DNA에 삽입됨으로써 도입유전자를 효모 내에 안정하게 유지시키는 삽입벡터이다.DAD1유전자 내 단일제한효소부위(AvrII,BglII,BstEII,EspI,RsrII,SacII,XhoI) 중 1개소에 절단된 플라스미드를 형질전환 함으로써 효모 염색체상의dad1 ⁺ 유전자 내에 삽입이 일어난다. 상기와 같은 방법으로 얻어진 형질전환체에서는 한 개 또는 수 개 카피(copy)의 플라스미드가 염색체에 삽입되어 도입유전자가 효모 내에서 안정하게 유지될 수 있다. pCABIOD101 플라스미드는DAD1유전자 외에도 다른 효모 선택유전자인URA3 ⁺ 을 포함하고 있어서 현재 실험실 효모로 많이 애용되고 있는 영양(유라실) 요구성인ura3효모균주의 형질전환에도 쉽게 이용될 수 있다.

실시예 2: 효모형질전환 벡터 pCABIOD101을 이용한 사카로마이세스 세레비시에의 형질전환

상기 제4공정에서 제조한 플라스미드 pCABIOD101을 제한효소BstEII로 처리하여 선형 DNA로 만든 다음 사카로마이세스 세레비시에(S. cerevisiae)들인 GT48(αade3-130 ser1-171 ura3-52)와 S73(αser1-171 ura3-52)에 형질전환하여 나이스타틴 처리방법(nystatin enrichment)으로 아데닌 요구성 형질전환체를 선별하였다. 나이스타틴 처리를 위해서는 형질전환된 효모를 숙주균주(host)와 형질전환체들이 모두 필요로 하는 아미노산 및 황산암모늄을 함유하는 최소배지 0.4㎖에 현탁한 후 30℃, 300rpm에서 6시간 동안 배양하였다. 배양된 효모 세포들을 멸균증류수로 세척한 후 황산암모늄이 함유되지 않은 최소배지 0.4㎖에 현탁한 후 30℃, 300rpm에서 12∼14시간 동안 배양함으로써 질소원결핍(nitrogen starvation)을 유발시켰다. 질소원결핍으로 인해 생장이 중지되었던 세포들을 멸균증류수로 세척한 후 숙주균주의 생장에 요구되는 아미노산과 황산암모늄을 함유하는 최소배지 0.36㎖에 현탁시켰다. 최소배지로 처리된 세포들을 23℃, 300rpm에서 6시간 동안 배양하였다. 숙주균주의 생장이 재기된 효모배양액에 30㎍/㎖의 나이스타틴용액 25∼70㎕를 첨가한 후 23℃, 300rpm에서 1시간 동안 처리하였다. 나이스타틴이 처리된 세포들을 멸균증류수로 세척한 후 상기 과정을 한 번 더 반복하였으며, 두 번째의 나이스타틴용액 처리과정은 1시간 30분동안 실시하였다. 나이스타틴 처리된 세포들을 멸균증류수에 현탁하여 선별배지(아데닌 결핍배지, SC-Ade)에 도말한 후 23℃ 이하의 저온에서 배양하여 성장이 느린 작은 콜로니를 형질전환체로 선발하였다. 상기에서 선발한 작은 콜로니들의 형질전환체로의 진위를 밝히기 위하여 이들을 아데닌 결핍배지(SC-Ade)와 유라실 결핍배지(SC-Ura)에 각각 스포팅방법으로 접종한 후 성장을 비교하여 형질전환체들을 선별하였다. 비교를 위하여 벡터 pJS41을 제한효소NcoI으로 처리하여 선형 DNA로 만든 후 사카로마이세스 세레비시에에 형질전환하여 선별배지(유라실 결핍배지, SC-Ura)에서 형질전환체들을 선별하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

실험실 효모 형질전환체들의 표현형

Strain [Plasmid]*	SC**		SC-Ade**		SC-Ura**
Strain [Plasmid]*	30℃	23℃		30℃	23℃	30℃	23℃
GT48 [None]	+	+
[pJS41][pCABIOD101]	++	++		±		++	++
S73 [None]	+	+		+	+
[pJS41][pCABIOD101]	++	++		+±	+±	++	++
* 이용된 효모균주들은 GT48(αade3-130 ser1-171 ura3-52)과 S73(αser1-171 ura3-52)이고, 플라스미드 pJS41은 제한효소NcoI으로 pCABIOD101은 제한효소BstEII로 각각 처리된 후에 형질전환되었다.** 효모현탁액을 합성복합배지(SC, Synthetic complete), 아데닌 결핍배지(SC-Ade) 및 유라실 결핍배지(SC-Ura)에 각기 스포팅방법으로 접종한 후 성장을 비교하였다.효모 성장의 측정 기준: +, good growth by 1 or 2day; ±, some growth by 4 day; ±, some growth by 7 day;, no sign of growth by 7 day.

실시예 3: 효모형질전환 벡터 pCABIOD101을 이용한 산업 효모균주의 형질전환

본 실시예에서는 상기 실시예 1의 제4공정에서 제조한 플라스미드 pCABIOD101을 제한효소BglII로 처리하여 선형(linearized) DNA로 만든 다음 산업 효모균주인 빵효모(이배체)에 형질전환하여 상기 실시예 2에서 사용한 나이스타틴 처리방법 또는 다른 영양요구성 증진방법인 트리티움 자살방법(trithium suicide enrichment)을 사용하여 아데닌 요구성 형질전환체를 선별하였다. 트리티움 자살방법을 위해서는 형질전환된 효모 배양액을 아데닌을 함유하는 최소배지(아미노산을 함유하지 않는 YNB(yeast nitrogen base) 7g/ℓ, 덱스트로스 10g/ℓ) 10㎖에 0.1 O.D₅₅₀이 되도록 접종하였으며, 상기 접종된 효모배양액을 30℃, 300rpm에서 5시간 동안 배양시켰다. 배양액 1㎖을 취하여 스크루-캡 튜브(screw-cap tube)로 옮긴 후, 트리티움으로 라벨링(labeling)하기 위하여³H-소디움 포르메이트(sodium formate[³H]) 25μCi/㎖을 배양액에 첨가하였다. 트리티움으로 라벨링된 세포들을 23℃, 300rpm으로 배양하면서 일정한 시간 간격마다 각각의 O.D₅₅₀를 측정하였다. 4시간 30분 후 O.D₅₅₀값이 증가하지 않았을 때, 즉 더 이상 세포들의 수가 증가하지 않을 때 라벨링된 배양액에 얼음을 처리함으로써 라벨링을 중지하였다. 라벨링된 세포들을 멸균증류수로 2회 세척한 후 1X YNB(0.7% 아미노산을 함유하지 않는 YNB) 1㎖에 재현탁하여 라벨링된 세포들을 4℃에 보관하였다. 4℃에서 세포들의 성장은 느리게 진행되고 트리티움 자살(trithium suicide)이 진행되기 때문에 2일마다 일정수의 세포들을 YPD 배지에 접종한 후 생존세포수(survivors)를 확인하였다. 트리티움 자살에 의해 세포생존율(cell viability)이 10% 미만이 된 16일째에서 선별을 중지하였다. 트리티움 자살 처리된 세포들을 멸균증류수에 현탁하여 선별배지(아데닌 결핍배지, SC-Ade)에 도말한 후 23℃ 이하의 저온에서 배양하여 성장이 느린 작은 콜로니를 형질전환체로 선발하였다. 상기에서 선발한 작은 콜로니들의 형질전환체로의 진위를 밝히기 위하여 이들을 합성최소배지(SD, synthetic dextrose)와 아데닌 첨가배지(SD+Ade)에 스포팅방법으로 접종한 후 성장을 비교하였다. 그결과를 하기 표 3에 나타내었다. 또한, 상기 형질전환체들에 대하여 PCR을 실시하여 본 발명 플라스미드 pCABIOD101이 도입된 형질전환체임을 확인하였다.

빵효모 형질전환체들의 표현형

균주	플라스미드	SD+Ade	SD
균주	플라스미드	30℃	23℃	30℃	23℃
빵효모	無	+	+	+	+
빵효모	pCABIOD101	+	+	±	±-
효모성장의 측정기준: +는 하루 또는 이틀 동안 성장이 우수함을 나타냄;±는 4일 동안 조금 성장됨을 나타냄; ±는 7일 동안 조금 성장됨을 나타냄;는 7일 동안 성장됨이 없음을 나타냄.

이상, 상기 실시예에서 설명한 바와 같이 본 발명은 아데닌 요구성 우성돌연변이DAD를 유발하고 상기 돌연변이를 유발하는 유전자DAD1을 분리하여 그 돌연변이부위를 분석한 후 상기DAD1우성유전자를 함유하는 벡터 pCABIOD101을 제작하여 일배체와 이배체 효모인 실험실효모와 산업효모의 형질전환에 이용하여 영양요구성 형질전환체를 얻음으로써 기존의 산업에 사용되고 있는 산업효모들의 개량을 비롯한 다양한 미생물들의 개량에 이용할 수 있는 형질전환 벡터 시스템을 구축할 수 있으므로 생물 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

하기의 단계를 포함함을 특징으로 하는 아데닌 요구성 우성유전자를 함유하는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 형질전환체의 제조방법:

효모 유래의 일탄소-테트라히드로폴레이트 신타아제 유전자(ADE3)와URA3유전자를 함유하는 플라스미드 pJS8A에 히드록실아민을 처리하여 세포외 돌연변이를 유발하는 단계;

상기 플라스미드 pJS8A를ade2 ura3효모(Saccharomyces cerevisiae)에 형질전환시킨 후 -Ura±Ade 배지에서 배양하는 단계;

ade2에 상위(epistatic)한 유전자ADE3에 돌연변이 발생으로 기인되는 분홍색 또는 흰색 콜로니인 아데닌 요구성 우성돌연변이 DAD 효모균주를 선별하는 단계;

상기로부터 선별된 돌연변이에서 아데닌 요구성 우성유전자 DAD1( D ominant ad enine-requiring)을 확인하는 단계;

상기 DAD1 돌연변이는 효모 일탄소-테트라히드로폴레이트 신타아제 유전자의 947 코돈 중 683번째 코돈의 TTC가 TCC로 변한 점돌연변이임을 분석하고, 아데닌 요구성 우성돌연변이 DAD로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 단계;

상기DAD1유전자를 함유하는 대장균(E. coli) 유래의 재조합 벡터의 제조단계; 및

상기 재조합 벡터를 효모 균주에 도입시키고 나이스타틴 처리방법(nystatin enrichment) 또는 트리티움 자살방법(trithium suicide enrichment)을 이용하여 아데닌 요구성 우성유전자를 함유하는 형질전환체를 선별하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기DAD1유전자는 서열목록 서열번호 1의 염기 서열로 표시됨을 특징으로 하는 아데닌 요구성 우성유전자를 함유하는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 형질전환체의 제조방법.
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제 1항에 있어서, 상기DAD1유전자를 함유하는 재조합 벡터는 제3도에 기재된 개열지도를 갖는 pCABIOD101임을 특징으로 하는 아데닌 요구성 우성유전자를 함유하는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 형질전환체의 제조방법.
서열목록 서열번호 1의 아데닌 요구성 우성유전자DAD1을 함유한 재조합 발현벡터 pCABIOD101로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) S68 KCTC 1018BP.
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