CN104911207A

CN104911207A - 一种培育异黄酮和缩合单宁含量增高的转基因植物的方法及专用质粒

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Publication number: CN104911207A
Application number: CN201510329528.8A
Authority: CN
Inventors: 王涛; 苟蓝明; 董江丽
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2035-06-15
Also published as: CN104911207B

Abstract

本发明公开了一种培育异黄酮和缩合单宁含量增高的转基因植物的方法及专用质粒。本发明所提供的一种培育异黄酮和缩合单宁含量增高的转基因植物的方法包括向受体植物中导入编码蛋白质A的核酸分子、编码蛋白质B的核酸分子和编码蛋白质C的核酸分子，得到异黄酮和/或缩合单宁的含量高于所述受体植物的转基因植物。实验证明，利用本发明所提供的方法得到的转基因植物的异黄酮和/或缩合单宁含量增高。

Description

一种培育异黄酮和缩合单宁含量增高的转基因植物的方法及专用质粒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种培育异黄酮和缩合单宁含量增高的转基因植物的方法及专用质粒。

背景技术

苜蓿是重要的豆科牧草，具有适口性好、蛋白含量高、品质优良、生物质产量高等特点，作为牛羊等反刍动物的饲料大量用于畜牧业。但是，由于苜蓿蛋白含量高，反刍动物在消化过程中容易产生大量泡沫，瘤胃中的微生物发酵产生甲烷气体，容易导致胀气病的发生，甚至引起死亡。研究发现，一定含量的缩合单宁能有效阻止胀气病的发生，并且缩合单宁具有抗氧化和清除自由基的能力。然而缩合单宁在苜蓿叶片中含量极低，急需有效手段提高苜蓿被采食部分缩合单宁的含量。

截形苜蓿(Medicago truncatula)又名截型苜蓿、蒺藜苜蓿，是豆科模式植物，被广泛用于豆科作物的生理、遗传和分子生物学研究。

异黄酮和缩合单宁都衍生自苯丙氨酸代谢途径，是一类重要的植物次生代谢产物，主要存在于豆科植物的种子。异黄酮的化学结构与雌激素有一定程度的相似性，其在动物体内具有微弱的雌激素样活性。研究表明，大豆苷元、鹰嘴豆素A、染料木素、芒柄花素等异黄酮类化合物在脂质代谢、蛋白合成、抗氧化等方面表现出有益影响；长期饲喂有助于提高动物生产性能及免疫力。异黄酮和缩合单宁作为一类生长因子，提高其含量是改良牧草品质的重要方向。

发明内容

本发明所要解决的问题是培育高异黄酮和缩合单宁的植物。

为了解决上述问题，我们首先提供了一种培育高异黄酮和缩合单宁的转基因植物的方法。

本发明所提供的一种培育高异黄酮和缩合单宁的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入编码蛋白质A的核酸分子、编码蛋白质B的核酸分子和编码蛋白质C的核酸分子，得到异黄酮和/或缩合单宁的含量高于所述受体植物的转基因植物；

所述蛋白质A可为如下X1)或X2)：

X1)氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白质；

X2)将X1)所示的蛋白质经过1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与蛋白质A具有相同功能的蛋白质；

所述蛋白质B可为如下Y1)或Y2)：

Y1)氨基酸序列如序列表中序列3所示的蛋白质；

Y2)将Y1)所示的蛋白质经过1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与蛋白质B具有相同功能的蛋白质；

所述蛋白质C可为如下Z1)或Z2)：

Z1)氨基酸序列如序列表中序列4所示的蛋白质；

Z2)将Z1)所示的蛋白质经过1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与蛋白质C具有相同功能的蛋白质。

上述方法中，所述编码所述蛋白质A的核酸分子可为如下a1)或a2)或a3)所示的DNA分子：

a1)其编码序列的反向互补序列是序列表的序列1自5’末端第337-1506位核苷酸所示的DNA分子；

a2)与a1)限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质A的DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的DNA分子杂交，且编码所述蛋白质A的DNA分子；

上述方法中，所述编码所述蛋白质B的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

b1)其编码序列是序列表的序列1自5’末端第2256-2912位核苷酸所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质B的DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的DNA分子杂交，且编码所述蛋白质B的DNA分子；

上述方法中，所述编码所述蛋白质C的核酸分子可为如下c1)或c2)或c3)所示的DNA分子：

c1)其编码序列的反向互补序列是序列表的序列1自5’末端第3915-5480位核苷酸所示的DNA分子；

c2)与c1)限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质C的DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA分子杂交，且编码所述蛋白质C的DNA分子。

本发明还提供了一种DNA分子，所述DNA分子包括表达盒A、表达盒B和表达盒C；所述表达盒A包括启动子、所述蛋白质A的核酸分子和终止子；所述表达盒B包括启动子、所述蛋白质B的核酸分子和终止子；所述表达盒C包括启动子，所述蛋白质C的核酸分子和终止子。

上述DNA分子中，所述启动子可为CaMV35S启动子、NOS启动子或OCS启动子；所述终止子可为NOS终止子或OCS polyA终止子。

上述表达盒A的反向互补序列如序列表序列1的自5’末端第75至1819位所示；上述表达盒B的核苷酸序列如序列表序列1的自5’末端第1870至3646位所示；上述表达盒C的反向互补序列如序列表序列1的自5’末端第3655至6039位所示。

上述表达盒A中：序列表序列1的自5’末端第1513至1819位为NOS启动子的反向互补序列，第337至1506位为蛋白质A的编码基因的反向互补序列，第75至324位为NOS终止子的反向互补序列；上述表达盒B中：序列表序列1的自5’末端第1870至2249位为OCS启动子，第2256至2912位为编码蛋白质A的编码基因，第2919至3646位为OCS polyA终止子；上述表达盒C中：序列表序列1的自5’末端第5487至6039位为CaMV35S启动子的反向互补序列，第3915至5480位为蛋白质C的编码基因的反向互补序列，第3655至3908位为NOS终止子的反向互补序列。

上述DNA分子的核苷酸序列为序列表序列1的自5’末端第75至6039位所示。

含有所述DNA分子的重组质粒、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述含有所述DNA分子的重组质粒的核苷酸序列具体可为序列表的序列1所示。

上述培育高异黄酮和缩合单宁的转基因苜蓿的方法中，所述“向受体植物中导入编码蛋白质A、蛋白质B和蛋白质C的核酸分子”可通过向受体植物中导入所述DNA分子或向受体植物中导入含有所述DNA分子的重组质粒实现。

所述DNA分子在培育高异黄酮和/或缩合单宁的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。

含有所述DNA分子的所述重组质粒、重组微生物或转基因细胞系在培育高异黄酮和/或缩合单宁的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述异黄酮为大豆苷元、鹰嘴豆素A、染料木素和/或芒柄花素。

上述任一所述植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。所述双子叶植物可为豆科植物。所述豆科植物可为苜蓿。所述苜蓿可为截形苜蓿(Medicago truncatula)；所述截形苜蓿(Medicago truncatula)具体可为截形苜蓿(Medicago truncatula)R108生态型。

实验证明，利用本发明所提供的一种培育高异黄酮和缩合单宁的转基因植物的方法得到的三个苜蓿转基因株系C01、C04、C05，三个苜蓿转基因株系C01、C04、C05植株的总异黄酮含量均显著高于苜蓿转空载体阳性植株的总异黄酮含量，分别为苜蓿转空载体阳性植株的总异黄酮含量的7.01倍、13.85倍和6.30倍；三个苜蓿转基因株系C01、C04、C05植株的缩合单宁的含量均显著高于苜蓿转空载体阳性植株的缩合单宁含量，分别达到了0.27、0.31和0.34mg/g鲜重。

附图说明

图1为质粒pDES200-A-B-C的T-DNA区域示意图。

图2为质粒pDES200-A-B-C酶切鉴定图。

图3为转基因植株的DNA水平鉴定结果。

图4为RNA水平鉴定基因的相对表达量。

图5为异黄酮HPLC分离效果图。

图6为三个苜蓿转基因株系的缩合单宁含量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的培养基如下：

SH9液体培养基：溶质及其浓度为：MgSO₄·7H₂O 0.1850g/L，KNO₃2.830g/L，(NH₄)₂SO₄0.4630g/L，CaCl₂·2H₂O0.166g/L，KH₂PO₄ 0.400g/L，MnSO₄·H₂O 10.00mg/L，H₃BO₃ 5.00mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.00mg/L，KI 1.00mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.10mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.20mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.10mg/L，烟酸5.00mg/L，维生素B1 5.00mg/L，维生素B6 5.00mg/L，NaFe·EDTA 0.139g/L，肌醇100mg/L，蔗糖30g/L；溶剂为水；pH 5.8。混匀后高压灭菌。

SH9固体培养基：向上述SH9液体培养基中加琼脂至其含量为8g/L得到的培养基。

SH3α液体培养基：向上述SH9液体培养基中加2,4-D 4mg/L、6-BA 0.5mg/L，混匀后高压灭菌。

SH3α固体培养基：向上述SH3α液体培养基中加琼脂至其含量为8g/L得到的培养基。

共培养基：含100μM乙酰丁香酮的SH3α固体培养基。

选择培养基1：含500mg/L羧卞青霉素、10mg/L潮霉素的SH3α固体培养基。

选择培养基2：含250mg/L羧卞青霉素、10mg/L潮霉素的SH3α固体培养基。

下述实施例中的大豆苷元标准品、鹰嘴豆素A标准品、染料木素标准品和芒柄花素标准品均为Sigma公司产品，产品目录编号分别为D7802、D2016、G6649和47752。

下述实施例中所用的苜蓿为截形苜蓿(Medicago truncatula)R108生态型，购自法国农业科学研究院INRA(http://www.inra.fr/)分部BRC-MTR(Biological Resource Centre forthe Model Species Medicago truncatula L.)。截形苜蓿(Medicago truncatula)R108生态型在下文中简称苜蓿。

实施例1、高异黄酮和缩合单宁的转基因苜蓿的获得及其鉴定

一、质粒pDES200-A-B-C的制备

合成质粒1，质粒的核苷酸序列为序列表序列1所示的双链DNA分子，将其命名为质粒pDES200-A-B-C。质粒pDES200-A-B-C的T-DNA区域示意图见图1。质粒pDES200-A-B-C中具有三个表达盒，分别命名为表达盒A、表达盒B和表达盒C。

表达盒A的反向互补序列如序列表序列1的自5’末端第75至1819位所示，其中序列表序列1的自5’末端第1513至1819位为NOS启动子的反向互补序列，第337至1506位为蛋白质A的编码基因的反向互补序列，第75至324位为NOS终止子的反向互补序列；表达盒B的核苷酸序列如序列表序列1的自5’末端第1870至3646位所示，其中序列表序列1的自5’末端第1870至2249位为OCS启动子，第2256至2912位为编码蛋白质A的编码基因，第2919至3646位为OCS polyA终止子；表达盒C的反向互补序列如序列表序列1的自5’末端第3655至6039位所示，序列表序列1的自5’末端第5487至6039位为CaMV35S启动子的反向互补序列，第3915至5480位为蛋白质C的编码基因的反向互补序列，第3655至3908位为NOS终止子的反向互补序列。

蛋白质A的氨基酸序列如序列表序列2所示。

蛋白质B的氨基酸序列如序列表序列3所示。

蛋白质C的氨基酸序列如序列表序列4所示。

合成质粒2，质粒的核苷酸序列为序列表序列5所示的双链DNA分子，将其命名为质粒pDES200。

质粒pDES200-A-B-C的酶切鉴定结果见图2(图2中，M为DNA分子量Marker；泳道1为限制性内切酶Pac Ⅰ的酶切结果；泳道2为限制性内切酶Asc Ⅰ酶切结果；泳道3为限制性内切酶Pac Ⅰ和Asc Ⅰ的酶切结果)。

二、重组根癌农杆菌的获得和苜蓿转基因植株的再生

1、将质粒pDES200-A-B-C电击转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，得到重组农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌接种于含100mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的YEB培养基中，28℃振荡培养至OD_600nm为0.6，4000rpm离心5min，去上清，沉淀用等体积的SH3α液体培养基重悬后，加入乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮在体系中的浓度为100μM。

3、将在温室生长4至6周的苜蓿叶片剪下并消毒，然后用灭菌蒸馏水清洗2-3次，切掉叶柄叶缘，将叶片切成5×5mm小块。

4、完成步骤3后，将步骤3得到的苜蓿叶片放入步骤2制备的农杆菌侵染液中，真空(实际应用中低于0.09个大气压均可)处理30min后缓慢恢复至常压；然后黑暗条件下，室温、80rpm振荡培养2h，然后将苜蓿叶片转移到共培养基上，黑暗环境共培养3天后，依次在选择培养基1、选择培养基2、SH9固体培养基和1/2MS固体培养基上培养，然后将生根后的苜蓿幼苗转移到温室，得到T_O代再生植株。

将得到的各个T₀代再生植株进行自交并获得后代，该T₀代植株及其自交后代为一个株系。

随机取10个转基因苜蓿株系，依次分别命名为株系C01、株系C02、株系C03、株系C04、株系C05、株系C06、株系C07、株系C08、株系C09和株系C10，然后进行DNA水平和RNA水平的鉴定。

用质粒pDES200代替质粒pDES200-A-B-C依次进行上述步骤1-4，得到苜蓿转空载体T_O代再生植株。

三、转基因苜蓿植株的鉴定

1、DNA水平鉴定

分别提取步骤二中T_O代再生植株的幼嫩叶片基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以引物对1、引物对2和引物对3分别进行PCR扩增；用质粒pDES200-A-B-C代替苜蓿转基因植株的幼嫩叶片DNA，作为阳性对照；用未转基因的野生型苜蓿的幼嫩叶片基因组DNA代替苜蓿转基因植株的幼嫩叶片基因组DNA，作为阴性对照。引物对1的靶基因的反向互补序列为序列表中的序列1的自5’末端第337-1500位所示，引物对2的靶基因为序列表中的序列1的自5’末端第2268-2907位所示，引物对3的靶基因的反向互补序列为序列表中的序列1的自5’末端第4056-5255位所示。

引物对1：F1：5′-AGCGTAGCTGAGATCAGGCAGGCAC-3′和R1：5′-TCAGATGGCCACACTATGCAAAACAAC-3′。

引物对2：F2：5′-AGCGCGGTTCAGGTGGAGTTCCTG-3′和R2：5′-CTATAATGCCGTGGCTCAATACCGC-3′。

引物对3：F3：5′-GGCTCCATGCCAACCGTCGTTACC-3′和R3：5′-CAGCACTTGCAGGTCAAAGCATTGG-3′。

如果分别显示约1164bp、640bp和1202bp的条带，则该苜蓿转基因植株即为苜蓿转基因阳性植株。结果见图3(图3中+为质粒pDES200-A-B-C，WT为未转基因的野生型苜蓿，1为转基因苜蓿株系C01，2为转基因苜蓿株系C02,3为转基因苜蓿株系C03，4为转基因苜蓿株系C04，5为转基因苜蓿株系C05,6为转基因苜蓿株系C06，7为转基因苜蓿株系C07，8为转基因苜蓿株系C08,9为转基因苜蓿株系C09，10为转基因苜蓿株系C10)结果表明，株系C01、株系C02、株系C03、株系C04、株系C05、株系C06、株系C07、株系C08、株系C09和株系C10均为阳性的苜蓿转基因植株。

2、RNA水平鉴定

通过TRIzol法提取苜蓿植株(未转基因的野生型苜蓿植株、步骤1中鉴定为阳性的苜蓿转基因植株或苜蓿转空载体阳性植株)的幼嫩叶片总RNA，分别以引物对4、引物对5和引物对6为引物对上述RNA中的分别编码蛋白质A、蛋白质B和蛋白质C的基因的表达量进行定量分析。内参为MtActin2基因，内参的引物为5′-CCCACTGGATGTCTGTAGGTT-3′和5′-AGAATTAAGTAGCAGCGCAAA-3′。

引物对4：F4：5′-ATGGTTAGCGTAGCTGAGATCA-3′和R4：5′-GTGGTCACTGTTGGTGATTCTG-3′。

引物对5：F5：5′-TGAAGCCGCAGCCATTGAAAAG-3′和R5：5′-CCGCCGCTGATACAGCCTTGTT-3′。

引物对6：F6：5′-GACGCCTCACTTACGACAACTCT-3′和R6：5′-TTGGGCCATAACCCTAAGGAAC-3′。

部分实验结果见图4(图4中，WT为未转基因野生型苜蓿植株，VC为苜蓿转空载体T_O代再生植株，株系C01、株系C04和株系C05分别为不同的苜蓿转基因阳性植株。结果表明，苜蓿转基因阳性植株株系C01中编码蛋白质A、蛋白质B和蛋白质C的基因的相对表达量分别为0.99、0.89和1.16；苜蓿转基因阳性植株株系C04中编码蛋白质A、蛋白质B和蛋白质C的基因的相对表达量分别为1.08、0.81和0.81；苜蓿转基因阳性植株株系C05中编码蛋白质A、蛋白质B和蛋白质C的基因的相对表达量分别为1.00、1.01和0.66。结果表明，苜蓿转基因阳性植株株系C01、株系C04和株系C05均为阳性的苜蓿转基因植株。

四、转空载体植株的获得

用质粒pDES200代替质粒pDES200-A-B-C依次进行步骤二和步骤三，得到苜蓿转空载体阳性植株。

五、转基因苜蓿植株异黄酮和缩合单宁的含量检测

以步骤三经过DNA水平和RNA水平鉴定为阳性的苜蓿转基因株系C01、C04和C05的T₂代植株为实验材料，对苜蓿转基因株系C01、C04和C05中总异黄酮和缩合单宁的含量进行测定。实验重复三次，每次测定中每个株系5个植株(即5个生物学重复)。

1、测定异黄酮的含量

本实施例中，异黄酮的含量＝大豆苷元的含量+鹰嘴豆素A的含量+染料木素的含量+芒柄花素的含量。

采用单点外标法(混标)同时测定待测样品中大豆苷元的含量、鹰嘴豆素A的含量、染料木素的含量和芒柄花素含量。具体步骤如下：

1.1、混合标样的制作与测定

准确称取大豆苷元标准品5mg于5mL容量瓶中，用无水甲醇水溶液溶解并定容至5mL，配成浓度为1mg/mL的大豆苷元标准品单标。

按照上述方法，将大豆苷元标准品分别替换为鹰嘴豆素A标准品、染料木素标准品和芒柄花素标准品，分别得到鹰嘴豆素A标准品单标、染料木素标准品单标和芒柄花素标准品单标。

取浓度为1mg/mL的大豆苷元标准品单标、鹰嘴豆素A标准品单标、染料木素标准品单标和芒柄花素标准品单标各200μL混合，然后加入1200μL无水甲醇配制成为100ppm的混合标样。然后用继续用无水甲醇稀释，分别配制成10ppm和1ppm的混合标样。

选择1ppm的混合标样，采用高效液相色谱(HPLC)测定混标中大豆苷元、鹰嘴豆素A、染料木素和芒柄花素的保留时间和峰面积。

1.2、异黄酮的提取

取温室生长7周的苜蓿转基因株系C01的幼苗叶片，液氮速冻后磨成粉末，精确称取0.1g加入1ml 80％甲醇水溶液，在超声波中振荡提取2h，离心得到上清1和沉淀1；向沉淀1中加入1ml 80％甲醇水溶液，在超声波中振荡提取2h，离心得到上清2和沉淀2；向沉淀2中加入1ml 80％甲醇水溶液，在超声波中振荡提取2h，离心得到上清3和沉淀3。将上清1、上清2和上清3混合后蒸发去溶剂，残留物加入β-葡糖苷酶解液消化过夜。然后用乙酸乙酯萃取苷元，蒸发去乙酸乙酯，加入200μl无水甲醇溶解，获得异黄酮的混合提取物。

1.3、异黄酮的定性及定量分析

使用配有Agilent C18反相柱(5.0μm，4.6mm×250mm)的Agilent 1200液相色谱仪分析步骤1.2中的异黄酮的混合提取物。流动相由0.5％乙酸水溶液(A)和甲醇(B)组成，流速为1.0mL/min，使用流动相B递增、流动相A递减的梯度洗脱条件进行梯度洗脱，具体如下(％均为体积百分比)：0-7min，34％B；7-10min，34-38％B；10-15min，38％B；15-40min，38-65％B；40-55min，65％B。检测波长为260nm。

采用高效液相色谱(HPLC)分析并测定步骤1.2中的异黄酮的混合提取物。以1ppm的混合标样为标准品采用单点外标法进行定量分析待测样品中大豆苷元的含量，计算公式为：

上式中，S_标1为1ppm混标中大豆苷元产生的峰面积；S_样1为步骤1.2中的异黄酮的混合提取物中大豆苷元所对应的峰面积；m_样为步骤1.2中的异黄酮的混合提取物对应的苜蓿幼苗叶片的鲜重，单位g；V_样为步骤1.2中的异黄酮提取物总体积，单位μL；M_大豆苷元为大豆苷元的摩尔质量，单位g/mol。

按照上述方法，将大豆苷元分别替换为鹰嘴豆素A、染料木素和芒柄花素，其它步骤均不变，分别得到苜蓿转基因株系C01中鹰嘴豆素A的含量、染料木素的含量或芒柄花素的含量。

将上述步骤1.1-1.3中苜蓿转基因株系C01的幼苗叶片分别替换为苜蓿转基因株系C04的幼苗叶片、苜蓿转基因株系C05的幼苗叶片、苜蓿转空载体阳性植株的幼苗叶片和未转基因野生型苜蓿植株的幼嫩叶片，其它步骤均不变，分别得到苜蓿转基因株系C04、苜蓿转基因株系C05、苜蓿转空载体阳性植株和未转基因野生型苜蓿中的大豆苷元含量、鹰嘴豆素A含量、染料木素含量、芒柄花素含量和总异黄酮的含量。实验结果见表1。

表1.转基因苜蓿植株异黄酮含量的测定

注：表1中N.D.表示未检测到相应物质，^**表示差异显著。

实验结果见图5(图5中，四个色谱峰代表的物质分别为：1号大豆苷元，保留时间为30.322min；2号芒柄花素，保留时间为38.856min；3号染料木素，保留时间为39.750min；4号鹰嘴豆素A，保留时间为48.240min)和表1。结果表明，与未转基因野生型苜蓿植株和苜蓿转空载体阳性植株相比，在三个苜蓿转基因株系中均检测到大豆苷元，苜蓿叶片中存在大豆苷元鲜有报道；三个苜蓿转基因株系植株的总异黄酮含量均显著高于苜蓿转空载体阳性植株的总异黄酮含量，分别为苜蓿转空载体阳性植株的总异黄酮含量的7.01倍、13.85倍和6.30倍。

2、缩合单宁的含量的测定

2.1、单宁酸标准曲线的制作

实验重复三次，取平均值。

准确称取单宁酸标准品(sigma公司产品，产品编号为V900190)5mg于5mL容量瓶中，用无水甲醇水溶液溶解并定容至5mL，配成1mg/mL单宁酸母液。然后用盐酸-正丁醇(5:95)稀释配制成0、50、100、150、200、250、300、350、400、450μg/mL系列单宁酸标准品溶液(总体积5mL)。采用分光光度计测定不同浓度的单宁酸标准品在550nm波长下的吸光度A₁，作为各自的背景吸光度。然后将上述不同浓度的单宁酸标准品溶液放入沸水中煮沸1h，立即放在冰上冷却，得到不同浓度的单宁酸标准品煮沸液，然后采用分光光度计测定不同浓度的单宁酸标准品煮沸液在550nm波长下的吸光度A₁’。以不同浓度单宁酸含量(μg/mL)为横坐标，煮沸前后吸光值增量B1(B1＝A₁’-A₁)为纵坐标，绘制单宁酸标准曲线。

所得单宁酸测定标准曲线为y＝0.0015x(R²＝0.9963)，其中y为吸光值，x为单宁酸含量(μg/ml)，单宁酸含量在0-450μg/ml线性关系良好。

2.2、缩合单宁含量的测定

实验重复三次，取平均值。

取温室生长7周的苜蓿转基因株系C01的幼苗叶片，液氮速冻后磨成粉末，精确称取0.1g，依次加入氯仿和正己烷抽提弃去上清液，沉淀中加入1ml正丁醇-盐酸提取液(体积比为95:5)，室温超声提取1h，2500g离心10min，得到待测样品溶液上清液，然后采用分光光度计测定待测上清液在550nm波长下的吸光度A₂。将上述待测样品溶液上清液放入沸水中煮沸1h，立即放在冰上冷却，得到待测样品溶液上清液煮沸液，然后采用分光光度计测定待测样品溶液上清液煮沸液待测样品溶液在550nm波长下的吸光度的吸光值A₂’。计算得到待测样品在煮沸前后吸光度增量B2(B2＝A₂’-A₂)，然后根据单宁酸测定标准曲线计算苜蓿转基因株系C01中缩合单宁的含量。单宁含量计算公式为：

单宁含量(mg/g鲜重)＝0.667*P*V₁/W

W为苜蓿幼苗叶片的鲜重，g；V₁为待测样品溶液总体积，mL；P为从单宁酸测定标准曲线查得的待测样品溶液单宁含量mg/mL。

将上述步骤2.2中苜蓿转基因株系C01的幼苗叶片分别替换为苜蓿转基因株系C04的幼苗叶片、苜蓿转基因株系C05的幼苗叶片、苜蓿转空载体阳性植株的幼苗叶片和未转基因野生型苜蓿植株的幼嫩叶片，其它步骤均不变，分别得到苜蓿转基因株系C04、苜蓿转基因株系C05、苜蓿转空载体阳性植株和未转基因野生型苜蓿中的缩合单宁的含量。

实验结果见图6(图6中，WT为未转基因野生型苜蓿植株，VC为苜蓿转空载体阳性植株，C01为苜蓿转基因株系C01，C04为苜蓿转基因株系C04，C05为苜蓿转基因株系C05)。结果表明，苜蓿转基因株系C01、C04、C05中缩合单宁的含量均显著高于苜蓿转空载体阳性植株的缩合单宁含量，分别达到了0.27、0.31和0.34mg/g鲜重。未转基因野生型苜蓿植株和苜蓿转空载体阳性植株的缩合单宁含量无明显差异。

Claims

1.一种培育转基因植物的方法，包括向受体植物中导入编码蛋白质A的核酸分子、编码蛋白质B的核酸分子和编码蛋白质C的核酸分子，得到异黄酮和/或缩合单宁的含量高于所述受体植物的转基因植物；

所述蛋白质A为如下X1)或X2)：

X1)氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白质；

所述蛋白质B为如下Y1)或Y2)：

Y1)氨基酸序列如序列表中序列3所示的蛋白质；

所述蛋白质C为如下Z1)或Z2)：

Z1)氨基酸序列如序列表中序列4所示的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述编码所述蛋白质A的核酸分子为如下a1)或a2)或a3)所示的DNA分子：

所述编码所述蛋白质B的核酸分子为如下b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

所述编码所述蛋白质C的核酸分子为如下c1)或c2)或c3)所示的DNA分子：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“向受体植物中导入编码蛋白质A、蛋白质B和蛋白质C的核酸分子”通过向受体植物中导入权利要求4或5所述DNA分子或向受体植物中导入权利要求6或7所述重组质粒实现。

4.DNA分子，包括表达盒A、表达盒B和表达盒C；表达盒A包括启动子、权利要求1或2所述蛋白质A的核酸分子和终止子；表达盒B包括启动子、权利要求1或2所述蛋白质B的核酸分子和终止子；表达盒C包括启动子，权利要求1或2所述蛋白质C的核酸分子和终止子。

5.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于：所述启动子为CaMV35S启动子、NOS启动子或OCS启动子；所述终止序列为NOS终止子或OCS polyA终止子。

6.含有权利要求4或5所述DNA分子的重组质粒、重组微生物或转基因细胞系。

7.如权利要求6所述的所述重组质粒、重组微生物或转基因细胞系，其特征在于：所述重组质粒如序列表的序列1所示。

8.权利要求4或5所述DNA分子在培育高异黄酮和/或缩合单宁的转基因植物中的应用。

9.权利要求6或7所述重组质粒、重组微生物或转基因细胞系在培育高异黄酮和/或缩合单宁的转基因植物中的应用。

10.根据权利要求1或2所述的方法、权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述异黄酮为大豆苷元、鹰嘴豆素A、染料木素和/或芒柄花素。