CN109679967A

CN109679967A - 一个抗大豆花叶病毒基因GmRDBM的应用

Info

Publication number: CN109679967A
Application number: CN201910081298.6A
Authority: CN
Inventors: 智海剑; 殷金龙; 王丽群; 晋彤彤; 李凯
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2019-04-26

Abstract

本发明公开了一个抗大豆花叶病毒基因GmR_DBM的应用。本发明从抗大豆花叶病毒品种大白麻上克隆了一个编码CC‑NBS‑LRR功能域的基因GmR_DBM。对其进行测序，并通过软件预测获得该基因编码的氨基酸序列。本发明利用Crispr/Cas9技术对大白麻的GmR_DBM序列进行编辑，然后对敲除GmR_DBM的植株进行接种大豆花叶病毒实验，证明了该基因是大白麻品种的抗大豆花叶病毒基因。本发明得到的这个基因及其蛋白序列可以用于大豆对大豆花叶病毒抗性的改良。

Description

一个抗大豆花叶病毒基因GmRDBM的应用

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，涉及一个抗大豆花叶病毒基因GmR_DBM的应用。

技术背景

大豆是我国乃至世界范围内食用油和蛋白的主要来源。其生产受到多种病害的危害。其中大豆花叶病毒病是大豆的主要病害之一。大豆花叶病毒在全国各大豆产区均有发现，根据侵染能力的不同划分为多种株系；大豆花叶病毒造成的大豆产量损失可达15％～70％；同时，大豆花叶病毒也会导致大豆籽粒的种皮产生斑驳，使品质下降。由于目前没有有效杀灭该病毒的药剂，培育抗病品种是控制该病害最为经济、有效的方法，而获得抗病基因是培育抗病品种的物质基础。

植物在与病原的长期共存和对抗中进化形成了多种抵御病原入侵或者降低病原在植株内传播速度的机制。其中抗病基因(R基因)能够识别病原，赋予植物最为有效的抗性性状。目前已证明能够抗大豆花叶病毒的基因很少。

发明内容

本发明提供一个抗大豆花叶病毒的基因GmR_DBM，所述基因cDNA核甘酸序列如SEQID NO.1所示。

所述的抗大豆花叶病毒的基因GmR_DBM编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

本发明所述基因GmR_DBM在培育抗大豆花叶病毒品种中的应用是指将GmR_DBM基因通过转基因转入要改良的大豆品种内，可以提高品种对大豆花叶病毒的抗性。

本发明的优势与价值：

抗大豆花叶病毒育种是当今大豆品种选育的重要目标之一。本发明鉴定分离出的GmR_DBM基因能够抗多个大豆花叶病毒株系，可以通过转基因等方法导入到感大豆花叶病毒的品种中，改良受体品种，提高大豆品种对大豆花叶病毒的抗性，从而保证大豆的产量和品质，提高国产大豆的供给率。

附图说明

图1GmR_DBM的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。其中Marker为TAKARA的DNA marker1kb ladder，GmR_DBM为cDNA扩增结果，Control为阴性对照。

图2GmR_DBM抗大豆花叶病毒基因含有的结构域。通过EMBL-EBI的InterPro工具预测所得。

图3大白麻通过转基因敲除GmR_DBM基因后的测序验证。DBM-WT显示的为野生型未敲除的大白麻测序结果，黑框内为敲除靶向序列；前三个峰图为敲除GmR_DBM基因后形成的的峰图，a、b、c分别代表不同的插入缺失变异。

图4敲除GmR_DBM基因后的大白麻接种大豆花叶病毒SC4 3周后的叶片表型。DBM-GmR_DBMKO指示敲除GmR_DBM基因后的大白麻叶片；NN-WT指示野生型南农1138-2的叶片；DBM-WT指示野生型大白麻叶片；SC4指示接种大豆花叶病毒SC4株系；PBS为接种磷酸缓冲液的阴性对照。

图5敲除GmR_DBM基因后的大白麻接种大豆花叶病毒3周的大豆花叶病毒CP蛋白积累的ELISA检测。纵坐标为ELISA结束后酶标板在波长405nm处的吸光度；误差线为三次生物学重复的标准误差；从吸光度可以看出接种大豆花叶病毒后GmR_DBM基因敲除后的大白麻叶片和南农1138-2病毒CP蛋白积累量远远高于野生型大白麻。

图6敲除GmR_DBM基因后的大白麻接种大豆花叶病毒2周的大豆花叶病毒RNA的RT-PCR检测。KO指示敲除GmR_DBM基因后的大白麻叶片RT-PCR结果；NN指示野生型南农1138-2的叶片RT-PCR结果；DBM指示野生型大白麻叶片RT-PCR结果；Tubulin为大豆内源内参基因；从PCR产物的亮度可以看出，在内参基因含量基本一致的情况的下，接种大豆花叶病毒后GmR_DBM基因敲除后的大白麻叶片和南农1138-2病毒RNA含量远远高于野生型大白麻。

图7GmR_DBM基因对更多大豆花叶病毒株系(分离物)抗性的检测。每行表型图片对应两个大豆花叶病毒株系(分离物)，其中前3列图片对应“/”之前的大豆花叶病毒株系(分离物)，后3列图片对应“/”之后的大豆花叶病毒株系(分离物)；叶片上白色方框标记每个叶片右下角放大的叶片细节所在的位置；根据叶片表型可以看出，接种大豆花叶病毒后GmR_DBM基因敲除后的大白麻叶片和南农1138-2叶片花叶皱缩程度高于野生型大白麻。

图8敲除GmR_DBM基因后的大白麻接种更多大豆花叶病毒株系(分离物)后的大豆花叶病毒CP蛋白积累的ELISA检测。纵坐标为ELISA结束后酶标板在波长405nm处的吸光度；误差线为三次生物学重复的标准误差；从吸光度平均值可以看出接种大豆花叶病毒后野生型大白麻病毒CP蛋白积累量低于GmR_DBM基因敲除后的大白麻和南农1138-2。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：GmR_DBM基因的获得

1.RNA的提取：

将大豆品种大白麻播种，出苗后采集嫩叶以备总RNA的提取。将上述叶片0.1g放入离心管中加入液氮迅速研磨，然后加入1ml Trizol(英潍捷基公司)混匀后静置5min；加入0.2ml的三氯甲烷摇晃15sec，静置2min；12000rpm离心10min，吸取400μl上清加入到400μl异丙醇中混匀；离心10min后弃上清，加入1ml 70％的乙醇并涡旋1min；离心5min后弃上清，并置于通风橱晾干；加入50μl的ddH₂O备用。

2.第一链cDNA的合成：

第一链cDNA的合成使用PrimeScript II RTase(TAKARA公司)进行。吸取上述RNA1μl加入到PCR管中，加入Oligo dT Primer及dNTP Mixture各1μl，加入ddH₂O至10μl。混合均匀后65℃保温5min后，冰上迅速冷却。在上述混合液中加入5×PrimeScript II Buffer4μl、RNase Inhibitor 0.5μl、PrimeScript II RTase 1μl和ddH₂O 4.5μl；混匀后于42℃保温60min即可。

3.PCR的扩增与基因克隆

根据大豆的全基因数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，利用Primer5.0软件设计特异性引物：上游引物F1：5'-CTCACGGCTTCCACCACT-3'(SEQ IDNO.3)，下游引物R1：5'-TCCGCATACTCATACACTCCTAC-3'(SEQ ID NO.4)。以上述cDNA为模板进行PCR扩增，所用扩增酶为TAKARA的PrimerSTAR-Max-DNA-Polymerase，具体使用全部按照说明书进行。PCR扩增产物使用1％的琼脂糖凝胶在200V的电压下电泳10min，然后使用EB染料染色并在紫外灯下观察拍照，结果如图1。将扩增产物使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化备用，纯化过程全部按照说明书进行。纯化后的片段使用TAKARA的加A反应试剂盒加A后连接到TAKARA的T-Vector pMD19(Simple)载体上。将连接产物通过热激法转化大肠杆菌菌株DH5a(康为世纪)中，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜。挑取单菌落并使用M13引物检测含有目标插入片段的单菌落送公司(华大基因)进行测序。将测序序列放入生物软件BIOXM，查找其最大的开放读码框，结果见SEQ ID NO.1。将每3个碱基翻译成一个氨基酸，得到的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。将预测的氨基酸序列提交到EMBL-EBI的InterPro工具(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)中进行蛋白结构域的预测，结果显示该GmR_DBM基因编码的蛋白质为含有CC-NB-ARC-LRR结构域的蛋白，见图2。

实施例2：GmR_DBM基因抗病功能的证明

1.大豆品种大白麻GmR_DBM基因敲除植株的获得

根据实施例1获得的基因序列，筛选可能成为Crispr/Cas9基因编辑系统的靶点，最终选取序列AATGAAAACAACAAGGGCTGTGG作为敲除靶向序列。在华大基因公司合成构建敲除载体所需要的两条引物F2：5’-GGGTTGATGAAAACAACAAGGGCTG-3’(SEQ ID NO.5)和R2：5’-AAACCAGCCCTTGTTGTTTTCATCA-3’(SEQ ID NO.6)。将上述引物使用ddH₂O稀释到10uM，各取1μl到18μl TE缓冲液中混匀。将上述混合产物加热的98℃，然后缓慢降温到室温以便形成双链序列。将上述产物吸取1μl与1μl BsaI酶切后的pCBSG载体混合，加入1μl T4连接酶(NEB公司)、1μl 10x T4buffer和6μl ddH₂O混合均匀后室温放置3小时进行连接。连接后的载体通过实施例1所述的方法转化并提取单菌落的质粒测序。测序所用的引物为U6-SG20-gRNA-CX：GCAAGTGCGGTGACAAGACAAG。将测序正确的质粒通过冻融法转化农杆菌EHA105菌株。然后通过农杆菌侵染成熟的大豆子叶节技术转化大豆品种大白麻。将转化成功的诱导芽移栽的营养土并收取其种子，提取后代植株的基因组DNA，使用引物F3：5’-AGGACAGGCACAACTCTACTA-3’(SEQ ID NO.7)和R3：5’-ATTCACGCCTACGCCAAT-3’(SEQ IDNO.8)扩增基因组基因敲除靶位点序列送测序公司测序。对比测序结果和未敲除的野生型大白麻序列峰图以确认GmR_DBM基因被敲除的植株，见图3。选择上述检测表明敲除纯合的植株收取种子用于后续实验。

2.大白麻GmR_DBM基因敲除植株接种不同大豆花叶病毒株系(分离物)后的表型改变

将不同大豆花叶病毒株系(分离物)接种于感病品种南农1138-2上，待2周后上位叶出现花叶症状，收集新鲜的叶片待用。将大白麻GmR_DBM基因敲除植株的种子(DBM-GmR_DBMKO)、野生型大白麻(DBM-WT)及南农1138-2(NN-WT)各2盆分别播种于温室内，等到第1对真叶完全展开后进行接种大豆花叶病毒实验，同种大豆的不同2盆分别接种大豆花叶病株系SC4和磷酸缓冲液对照(PBS)。接种后3周调查上位叶表现出的性状，并拍照记录，见图5。接种大豆花叶病毒后的大白麻GmR_DBM基因敲除植株与南农1138-2都出现一定程度花叶症状，而接种PBS的大白麻GmR_DBM基因敲除植株和接种大豆花叶病毒的野生型大白麻植株没有明显花叶皱缩现象。说明GmR_DBM基因的敲除会导致大白麻由抗大豆花叶病毒品种变为感病品种，GmR_DBM基因对大白麻抵抗大豆花叶病毒是必须的。

为了探究该病毒是否能够抵抗更多种大豆花叶病毒株系(分离物)，按照上述实验方法对GmR_DBM基因敲除植株、野生型大白麻和南农1138-2接种了3424-1、SC14、4296-1、6101、SJ-3、4213-1、6768-1株系(分离物)。接种2周后上位叶的表型照片如图7所示，GmR_DBM基因的敲除都会导致敲除后的大白麻比野生型的大白麻表现出更为明显的花叶现象。说明GmR_DBM基因能够介导对多个大豆花叶病毒株系(分离物)的抗性。

3.大白麻GmR_DBM基因敲除植株接种不同大豆花叶病毒株系(分离物)后的CP蛋白积累的检测和病毒RNA积累的检测

为了进一步确认GmR_DBM基因的敲除后的植株对大豆花叶病毒的抗性丧失或减弱，实验选取不同植株接种不同分离物2或3周后的上位叶进行大豆花叶病毒CP蛋白的ELISA检测。每种处理取3个生物学重复。检测步骤如下：(1)将采集的叶片加入液氮磨碎，加入10倍叶片重量的抽提缓冲液混匀；(2)按照1：800稀释比例用包被抗体缓冲液稀释包被抗体，向每个酶标板的孔中加入稀释后的抗体100μl，室温(21～24℃)放置4小时，然后甩掉板内的液体，每孔加满PBST缓冲液，迅速倒掉。重复6次；(3)每孔中加100μl待测样品，放在保湿盒内室温(21～24℃)放置2.5小时，然后甩掉板内的液体，每孔加满PBST缓冲液，迅速倒掉。重复8次；(4)按照1：800稀释比例用酶标抗体缓冲液稀释酶标抗体，向每个酶标板的孔中加入稀释后的酶标抗体100μl，室温(21～24℃)放置2.5小时，然后甩掉板内的液体，每孔加满PBST缓冲液，迅速倒掉。重复8次；(5)向每个酶标板的孔中加入100μl的1mg/ml的ρNPP溶液，避光、室温(21～24℃)下显色30min，加50μl 3M NaOH终止反应。(6)在酶标仪405nm波长下，测定光密度值(OD)，并计算同一处理不同样品的平均值。ELISA检测结果见图5、图8。CP蛋白的ELISA结果显示，GmR_DBM基因的敲除后的植株其CP蛋白的积累量高于野生型大白麻，说明GmR_DBM基因的存在能够降低大豆花叶病毒CP蛋白的积累。

为了从RNA水平上检测大豆花叶病毒基因组积累的差异，本实验选取了接种SC4和PBS 2周后的叶片进行RT-PCR实验。首先提取样品的RNA，合成其cDNA(同实施例1所述)，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，每个cDNA进行2对引物的PCR扩增，分别用来扩增大豆花叶病毒的基因组序列和大豆内源Tubulin，扩增大豆花叶病毒序列的引物为SMV-F：5’-TTCTGAAAGTCCGTATATGCCTAG-3’(SEQ ID NO.9)，SMV-R：5’-GCCTTTCAGTATTTTCGGAGTT-3’(SEQ ID NO.10)，扩增大豆内源Tubulin的引物为

Tubulin-F：5’-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3’(SEQ ID NO.11)，Tubulin-R：5’-CACTTACGCATCACATAGCA-3’(SEQ ID NO.12)。PCR扩增所用的TAKARA公司的Ex-taq酶，扩增方法按照说明书进行，循环数为30。扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，使用EB染色后在紫外光下拍照。结果如图6所示。GmR_DBM基因的敲除后的植株进行RT-PCR后能够明显检测到病毒基因组的积累，而含有GmR_DBM基因的野生型的大白麻中基本检测不到病毒的基因组。结果与表型症状及ELISA检测结果一致，进一步说明GmR_DBM基因确实能抗大豆花叶病毒。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一个抗大豆花叶病毒基因GmRDBM的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3888

<212> DNA

<213> 大豆品种大白麻(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 1

atgggggata ttgttctttc catcgtagca aagttagcag aatatacagt gggcccaatt 60

ttagaccatg ctcgatactt gtgttgtttc aacaacattg ctgggaatct tccaaatgcc 120

aaggaagaat tggaattaac ccgaaacagt gtgaaggaac gagttgaaga agctattatg 180

aggactgaaa taattgaacc agcagttgag aagtggctga aagatgttga gaaagtctta 240

gaagaagtgc atatgcttca aggaagaatt tcggaagtaa gcaagagcta tttcagaagg 300

caattccaat attttcttac aaaagaaata gcaagaaaaa ttgagaaaat ggctcaactc 360

aaccacaaca gcaagtttga gccattttct aagattgccg aacttccagg catgaagtac 420

tattcatcca aagattttgt tcgtttcaaa tcaagagaat cgacttatga gaaccttttg 480

gaagcattaa aggataaaag cgcttgcacg attggactag ttggactagg aggctcagga 540

aaaactactt tggcgaaaga ggttggtaag aaagctgagg agttaaaact ttttgagaag 600

gttgtcatgg caacagtctc tcaaactcca aatatcacaa gcatccaaat gcaaattgct 660

gataagttgg gtttgaaatt tgaggaaaaa acagaggaag gtagagcaca aagactatca 720

gagagattaa ggacaggcac aactctacta atcttggatg atgtatggga aaagctagaa 780

tttgaggcta ttggtattcc atacaatgaa aacaacaagg gctgtggagt aattttaacc 840

actcggagta gagaagtatg catttccatg caatgccaaa caataattga gcttaatctc 900

ttagctggca atgaagcttg ggatttgttc aaattgaatg caaacataac tgatgagtcc 960

ccatatgcat tgaaaggcgt tgcaacaaaa attgtagatg aatgcaaagg attggctatt 1020

gcaattgtga cggtgggaag cacactgaag ggcaaaactg ttaaagagtg ggaattagca 1080

ttgtcaagac taaaagattc tgaaccacta gatattccaa aaggcttaag aagtccttat 1140

gcctgtcttg gattgagtta tgataatttg accaatgaat tagccaagtc cttgttcttg 1200

ttgtgttcta tatttccaga ggatcatgaa attgatttgg aagatttatt tcgatttgga 1260

aagggaatgg gcctacctgg gacttttgga acaatggaga aagcaaggag ggagatgcag 1320

atagctgtta gcatcctcat tgattgttat ttgttgttgg aggccagtaa aaaagaaagg 1380

gtgaaaatgc atgacatggt tcgtgatgta gccttgtgga tagcatctaa aactggtaaa 1440

gcaattttgg caagtaccgg aatggatcca agaatgttgt tagaggatga aaccataaaa 1500

gataagaggg caatatcctt atgggatttg aaaaatggcc agcttcttga tgatgatcaa 1560

ttgaattgtc catcacttga aattctcttg tttcattcaa ccgaggttga ctttgatgta 1620

tcaaatgctt gttttgaaag gctaaaaatg attaaaatcc tggcaatctt aacatctagc 1680

ttaatttggc gtaggcgtga attgatgaag ccatttggta catcgtatct ctccttgtca 1740

ctgccacaat caatggagtc attacaaaat cttcatactc tgtgcttgag aggtcatata 1800

ttaggtgaca tctccatttt ggaaagccta caagcacttg aggttcttga cttgcgtaat 1860

tcttctttta tagaattgcc taatggaatc gcgtcattaa agaaattgaa gcttctggat 1920

ttgttcaatt gtgtcattcg ggaacataat gcttacgagg ttataggaag atgtttgcag 1980

ctgaatgaat tgtatttgtg tatatattta tgtgcatatg aggaatttcc gcataatatc 2040

tccttgtcaa gattagagag gtatgtttta aattttaaaa tgtacagcca gagctggact 2100

gacatgatgg aagaacatag accatgtaga gctttatgca taaatggttt taatgcctca 2160

gttcaaagtt ttatatcatt accaatcaag gatttctttc aaaaagcaga gtaccttcat 2220

ttgagggacc ttaagggagg ttacgaaaat gtaatcccat ccatggttcc acaaggcatg 2280

aatcacttga ctttcctaat cctcgaagat tgtccagaga taaaatgcgt ctttgatggt 2340

accacaatgc aaactgaaga tgcgttctcc agcctagtca ttttacgctt gtatgaattg 2400

gataaccttg aagaagtgtt taatgacccc tcttccagat gttctctcaa aagtttagaa 2460

gagctaagca tagagagttg cagacaattg tacaatattt cctttcccaa gaactcaaag 2520

ctatgccatc tcaagttctt gacaatagat cattgcccga tgctaacttg tatcttcaag 2580

ccatccattg tccaaactct agagctgcta gaacaagtga caatatctga ctgctttgaa 2640

ttgaagcaga taatagaaga agtggaagaa gggagtgttg attatgttag cagtcaaagt 2700

catacctctt tgatgcttcc aaaattaagg acacttacta ttcttcgatg tcacagcttg 2760

gaatatatat tccctatgtg ttatgctcat gggctagcaa gtttggaaga gctgaacatt 2820

ggattttgtg ataagttgaa gtatgtattt ggcagtgaaa aggaacatga tcttagagtg 2880

taccagcacc agagtcatcc tcagactaat attcacatca atttccttaa tttggaaact 2940

ctacggttga cggagttgcc gaatttggtt gagatttggc ctaaatattt tgatccacat 3000

ttaccaaatt tgaaagagct acaatgcatt gattgtccaa gactgcctga ctcttgggtg 3060

cgtagggtga tgattattga ttcagatctg caacaagact caactacaac ggagaaggaa 3120

ttactatgct cggttaccac cacattcaac caattatccg atcaagtgct ttcttctaaa 3180

cttagacatc ttcaattgta tggtcttgga gtaaaaggtc ttttccaatt ccaaatcaga 3240

gaacatggga gcaacacaga acttgctcct ttaaacttgg atctaattta tgctgaattg 3300

agtgatctac ctgagctcga gttcatatgg aagggcccca caaattttct aagcctccag 3360

atgcttgacg tgatttatgt gaatagatgt ccaaaattga aagtcatctt ctcccctacc 3420

attgttagaa gcttaccaat gctgagaaca ctggaaataa cccattgtga ggaattggag 3480

caaatatttg attcaggtga tgcacaaacc ctatatactt gttcacaaca agtgtgcttc 3540

ccaaatctcc attatatttg tgtcgaaaag tgcaacaagt tgaaatacct ttttcataat 3600

tttgtggctg gtcactttca caatctgatc gcgttggaaa taaaagactg ctctcagtta 3660

cagaaggttt ttgcttttga atgtgaaact gatgacgatg atcaagaagg gattgttatg 3720

gatggagaaa aagtactact acgtaacctg ctacgtataa gactcagccg tttgccaaac 3780

ttcaaagaga ttcaccatgg attcaagtta aaagatgatg ttgaagaaca tatcataaat 3840

gattgtccta aatattatcc aagtttatat ctacacacag aagagtaa 3888

<210> 2

<211> 1295

<212> PRT

<213> 大豆品种大白麻(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 2

Met Gly Asp Ile Val Leu Ser Ile Val Ala Lys Leu Ala Glu Tyr Thr

1 5 10 15

Val Gly Pro Ile Leu Asp His Ala Arg Tyr Leu Cys Cys Phe Asn Asn

20 25 30

Ile Ala Gly Asn Leu Pro Asn Ala Lys Glu Glu Leu Glu Leu Thr Arg

35 40 45

Asn Ser Val Lys Glu Arg Val Glu Glu Ala Ile Met Arg Thr Glu Ile

50 55 60

Ile Glu Pro Ala Val Glu Lys Trp Leu Lys Asp Val Glu Lys Val Leu

65 70 75 80

Glu Glu Val His Met Leu Gln Gly Arg Ile Ser Glu Val Ser Lys Ser

85 90 95

Tyr Phe Arg Arg Gln Phe Gln Tyr Phe Leu Thr Lys Glu Ile Ala Arg

100 105 110

Lys Ile Glu Lys Met Ala Gln Leu Asn His Asn Ser Lys Phe Glu Pro

115 120 125

Phe Ser Lys Ile Ala Glu Leu Pro Gly Met Lys Tyr Tyr Ser Ser Lys

130 135 140

Asp Phe Val Arg Phe Lys Ser Arg Glu Ser Thr Tyr Glu Asn Leu Leu

145 150 155 160

Glu Ala Leu Lys Asp Lys Ser Ala Cys Thr Ile Gly Leu Val Gly Leu

165 170 175

Gly Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Glu Val Gly Lys Lys Ala

180 185 190

Glu Glu Leu Lys Leu Phe Glu Lys Val Val Met Ala Thr Val Ser Gln

195 200 205

Thr Pro Asn Ile Thr Ser Ile Gln Met Gln Ile Ala Asp Lys Leu Gly

210 215 220

Leu Lys Phe Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gly Arg Ala Gln Arg Leu Ser

225 230 235 240

Glu Arg Leu Arg Thr Gly Thr Thr Leu Leu Ile Leu Asp Asp Val Trp

245 250 255

Glu Lys Leu Glu Phe Glu Ala Ile Gly Ile Pro Tyr Asn Glu Asn Asn

260 265 270

Lys Gly Cys Gly Val Ile Leu Thr Thr Arg Ser Arg Glu Val Cys Ile

275 280 285

Ser Met Gln Cys Gln Thr Ile Ile Glu Leu Asn Leu Leu Ala Gly Asn

290 295 300

Glu Ala Trp Asp Leu Phe Lys Leu Asn Ala Asn Ile Thr Asp Glu Ser

305 310 315 320

Pro Tyr Ala Leu Lys Gly Val Ala Thr Lys Ile Val Asp Glu Cys Lys

325 330 335

Gly Leu Ala Ile Ala Ile Val Thr Val Gly Ser Thr Leu Lys Gly Lys

340 345 350

Thr Val Lys Glu Trp Glu Leu Ala Leu Ser Arg Leu Lys Asp Ser Glu

355 360 365

Pro Leu Asp Ile Pro Lys Gly Leu Arg Ser Pro Tyr Ala Cys Leu Gly

370 375 380

Leu Ser Tyr Asp Asn Leu Thr Asn Glu Leu Ala Lys Ser Leu Phe Leu

385 390 395 400

Leu Cys Ser Ile Phe Pro Glu Asp His Glu Ile Asp Leu Glu Asp Leu

405 410 415

Phe Arg Phe Gly Lys Gly Met Gly Leu Pro Gly Thr Phe Gly Thr Met

420 425 430

Glu Lys Ala Arg Arg Glu Met Gln Ile Ala Val Ser Ile Leu Ile Asp

435 440 445

Cys Tyr Leu Leu Leu Glu Ala Ser Lys Lys Glu Arg Val Lys Met His

450 455 460

Asp Met Val Arg Asp Val Ala Leu Trp Ile Ala Ser Lys Thr Gly Lys

465 470 475 480

Ala Ile Leu Ala Ser Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Leu Leu Glu Asp

485 490 495

Glu Thr Ile Lys Asp Lys Arg Ala Ile Ser Leu Trp Asp Leu Lys Asn

500 505 510

Gly Gln Leu Leu Asp Asp Asp Gln Leu Asn Cys Pro Ser Leu Glu Ile

515 520 525

Leu Leu Phe His Ser Thr Glu Val Asp Phe Asp Val Ser Asn Ala Cys

530 535 540

Phe Glu Arg Leu Lys Met Ile Lys Ile Leu Ala Ile Leu Thr Ser Ser

545 550 555 560

Leu Ile Trp Arg Arg Arg Glu Leu Met Lys Pro Phe Gly Thr Ser Tyr

565 570 575

Leu Ser Leu Ser Leu Pro Gln Ser Met Glu Ser Leu Gln Asn Leu His

580 585 590

Thr Leu Cys Leu Arg Gly His Ile Leu Gly Asp Ile Ser Ile Leu Glu

595 600 605

Ser Leu Gln Ala Leu Glu Val Leu Asp Leu Arg Asn Ser Ser Phe Ile

610 615 620

Glu Leu Pro Asn Gly Ile Ala Ser Leu Lys Lys Leu Lys Leu Leu Asp

625 630 635 640

Leu Phe Asn Cys Val Ile Arg Glu His Asn Ala Tyr Glu Val Ile Gly

645 650 655

Arg Cys Leu Gln Leu Asn Glu Leu Tyr Leu Cys Ile Tyr Leu Cys Ala

660 665 670

Tyr Glu Glu Phe Pro His Asn Ile Ser Leu Ser Arg Leu Glu Arg Tyr

675 680 685

Val Leu Asn Phe Lys Met Tyr Ser Gln Ser Trp Thr Asp Met Met Glu

690 695 700

Glu His Arg Pro Cys Arg Ala Leu Cys Ile Asn Gly Phe Asn Ala Ser

705 710 715 720

Val Gln Ser Phe Ile Ser Leu Pro Ile Lys Asp Phe Phe Gln Lys Ala

725 730 735

Glu Tyr Leu His Leu Arg Asp Leu Lys Gly Gly Tyr Glu Asn Val Ile

740 745 750

Pro Ser Met Val Pro Gln Gly Met Asn His Leu Thr Phe Leu Ile Leu

755 760 765

Glu Asp Cys Pro Glu Ile Lys Cys Val Phe Asp Gly Thr Thr Met Gln

770 775 780

Thr Glu Asp Ala Phe Ser Ser Leu Val Ile Leu Arg Leu Tyr Glu Leu

785 790 795 800

Asp Asn Leu Glu Glu Val Phe Asn Asp Pro Ser Ser Arg Cys Ser Leu

805 810 815

Lys Ser Leu Glu Glu Leu Ser Ile Glu Ser Cys Arg Gln Leu Tyr Asn

820 825 830

Ile Ser Phe Pro Lys Asn Ser Lys Leu Cys His Leu Lys Phe Leu Thr

835 840 845

Ile Asp His Cys Pro Met Leu Thr Cys Ile Phe Lys Pro Ser Ile Val

850 855 860

Gln Thr Leu Glu Leu Leu Glu Gln Val Thr Ile Ser Asp Cys Phe Glu

865 870 875 880

Leu Lys Gln Ile Ile Glu Glu Val Glu Glu Gly Ser Val Asp Tyr Val

885 890 895

Ser Ser Gln Ser His Thr Ser Leu Met Leu Pro Lys Leu Arg Thr Leu

900 905 910

Thr Ile Leu Arg Cys His Ser Leu Glu Tyr Ile Phe Pro Met Cys Tyr

915 920 925

Ala His Gly Leu Ala Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ile Gly Phe Cys Asp

930 935 940

Lys Leu Lys Tyr Val Phe Gly Ser Glu Lys Glu His Asp Leu Arg Val

945 950 955 960

Tyr Gln His Gln Ser His Pro Gln Thr Asn Ile His Ile Asn Phe Leu

965 970 975

Asn Leu Glu Thr Leu Arg Leu Thr Glu Leu Pro Asn Leu Val Glu Ile

980 985 990

Trp Pro Lys Tyr Phe Asp Pro His Leu Pro Asn Leu Lys Glu Leu Gln

995 1000 1005

Cys Ile Asp Cys Pro Arg Leu Pro Asp Ser Trp Val Arg Arg Val Met

1010 1015 1020

Ile Ile Asp Ser Asp Leu Gln Gln Asp Ser Thr Thr Thr Glu Lys Glu

1025 1030 1035 1040

Leu Leu Cys Ser Val Thr Thr Thr Phe Asn Gln Leu Ser Asp Gln Val

1045 1050 1055

Leu Ser Ser Lys Leu Arg His Leu Gln Leu Tyr Gly Leu Gly Val Lys

1060 1065 1070

Gly Leu Phe Gln Phe Gln Ile Arg Glu His Gly Ser Asn Thr Glu Leu

1075 1080 1085

Ala Pro Leu Asn Leu Asp Leu Ile Tyr Ala Glu Leu Ser Asp Leu Pro

1090 1095 1100

Glu Leu Glu Phe Ile Trp Lys Gly Pro Thr Asn Phe Leu Ser Leu Gln

1105 1110 1115 1120

Met Leu Asp Val Ile Tyr Val Asn Arg Cys Pro Lys Leu Lys Val Ile

1125 1130 1135

Phe Ser Pro Thr Ile Val Arg Ser Leu Pro Met Leu Arg Thr Leu Glu

1140 1145 1150

Ile Thr His Cys Glu Glu Leu Glu Gln Ile Phe Asp Ser Gly Asp Ala

1155 1160 1165

Gln Thr Leu Tyr Thr Cys Ser Gln Gln Val Cys Phe Pro Asn Leu His

1170 1175 1180

Tyr Ile Cys Val Glu Lys Cys Asn Lys Leu Lys Tyr Leu Phe His Asn

1185 1190 1195 1200

Phe Val Ala Gly His Phe His Asn Leu Ile Ala Leu Glu Ile Lys Asp

1205 1210 1215

Cys Ser Gln Leu Gln Lys Val Phe Ala Phe Glu Cys Glu Thr Asp Asp

1220 1225 1230

Asp Asp Gln Glu Gly Ile Val Met Asp Gly Glu Lys Val Leu Leu Arg

1235 1240 1245

Asn Leu Leu Arg Ile Arg Leu Ser Arg Leu Pro Asn Phe Lys Glu Ile

1250 1255 1260

His His Gly Phe Lys Leu Lys Asp Asp Val Glu Glu His Ile Ile Asn

1265 1270 1275 1280

Asp Cys Pro Lys Tyr Tyr Pro Ser Leu Tyr Leu His Thr Glu Glu

1285 1290 1295

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcacggctt ccaccact 18

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccgcatact catacactcc tac 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggttgatga aaacaacaag ggctg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaccagccc ttgttgtttt catca 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggacaggca caactctact a 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attcacgcct acgccaat 18

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttctgaaagt ccgtatatgc ctag 24

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcctttcagt attttcggag tt 22

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggagttcaca gaggcagag 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cacttacgca tcacatagca 20

Claims

1.抗大豆花叶病毒的基因GmR_DBM在抗大豆花叶病毒品种培育中的应用，所述的抗大豆花叶病毒的基因GmR_DBM,其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将GmR_DBM的基因通过转基因方法转入要改良的品种，从而获得抗大豆花叶病毒的品种。