CN103031282B - 紫花苜蓿花青素还原酶基因及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种由紫花苜蓿花青素还原酶基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有花青素还原酶活性的氨基酸序列。本发明还涉及该蛋白的编码基因，以及含有该基因的表达载体和细胞，同时还涉及一种培育单宁含量高的紫花苜蓿的方法和它们的应用。本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因(MsBAN)在紫花苜蓿中的表达可以显著提高紫花苜蓿中单宁的含量。该基因的发现为克服主要牧草植物(特别是豆科植物，如紫花苜蓿)易引发家畜发生鼓胀病提供了基因资源，在基因工程改良牧草的研究中将发挥重要作用。

Description

紫花苜蓿花青素还原酶基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明涉及一种紫花苜蓿花青素还原酶相关基因，还涉及由该基因编码的蛋白，以及含有所述紫花苜蓿花青素还原酶基因的表达载体和细胞，同时还涉及一种培育紫花苜蓿的方法，以及紫花苜蓿花青素还原酶基因及其编码的蛋白和含有该基因的表达载体及细胞在培育高单宁含量的植物中的应用。

背景技术

紫花苜蓿是我国乃至世界上最重要的豆科牧草，被誉为“牧草之王”。长期以来，紫花苜蓿的利用方式以收获干草和调制青贮为主，不宜让家畜在放牧过程中直接利用。这是因为反刍家畜采食新鲜苜蓿后易在瘤胃内形成大量泡沫样物质而不能排出从而导致鼓胀病，从而限制了紫花苜蓿在放牧系统中的应用。

单宁又称单宁酸或鞣质，是多酚中高度聚合的化合物，单宁被认为是一种抗鼓胀病因子，在家畜瘤胃内单宁可与包括紫花苜蓿在内的牧草中的蛋白质形成复合物，产生大量过瘤胃蛋白，使牧草中的蛋白质可在家畜小肠中得到更好的吸收利用，从而使家畜避免鼓胀病的发生。但苜蓿等豆科牧草其含量非常低，在采食新鲜的苜蓿后极易引起家畜的鼓胀病。

随着分子生物学的发展，生物技术在育种中得到了广泛地应用。但对紫花苜蓿中单宁合成的分子机制的研究还相对较少。因此，紫花苜蓿中单宁合成相关的分子生物学机制还有待于进一步的研究。

发明内容

本发明基于对紫花苜蓿中单宁合成相关的分子生物学机制的研究，一方面提供了紫花苜蓿花青素还原酶基因及该基因编码的蛋白，另一方面还提供了含有所述紫花苜蓿花青素还原酶基因的表达载体和细胞，以及培育高单宁含量的紫花苜蓿的方法，还提供了它们的应用。

本发明提供了一种紫花苜蓿花青素还原酶基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有花青素还原酶活性的氨基酸序列。

本发明还提供了一种紫花苜蓿花青素还原酶基因，其中，该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，其中，该表达载体含有本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因。

本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因。

本发明还提供了一种培育紫花苜蓿的方法，其中，该方法包括将本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因导入到紫花苜蓿细胞中，得到单宁含量高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。

本发明还提供了本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因、及其编码的蛋白、含有所述基因的表达载体、含有所述基因的转基因细胞在培育单宁含量高的植物中的应用。

单宁是黄酮类化合物生物合成中的一种重要的分支产物，该途径位于苯丙烷途径下游，主要以花青素作为前体物质，通过一步或多步酶促反应而形成。本发明人经过研究发现，本发明提供的MsBAN基因(SEQ ID NO：1)是紫花苜蓿中的一种花青素还原酶的编码基因，这种源自紫花苜蓿的花青素还原酶是紫花苜蓿中类黄酮物质合成途径中与单宁合成有关的一种重要的酶，可促成单宁的合成。

本发明从紫花苜蓿中克隆的花青素还原酶基因为克服主要牧草植物(特别是豆科植物，如紫花苜蓿)易引发家畜发生鼓胀病提供了基因资源，在基因工程改良牧草植物的研究中将发挥重要作用。

附图说明

图1显示了实施例1中对紫花苜蓿植株进行农杆菌介导的MsBAN基因转化所用的插入有MsBAN基因的pCAMBIA1302载体的结构。

具体实施方式

本发明提供了一种由紫花苜蓿花青素还原酶基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有花青素还原酶活性的氨基酸序列。优选情况下，该蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

相应地，本发明还提供了一种紫花苜蓿花青素还原酶基因(MsBAN)，其中，该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。优选地，该基因具有SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列。

本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因(MsBAN)是发明人通过以下方法筛选得到的：

根据截型苜蓿中已经克隆的花青素还原酶基因(Genbank登记号为：AY184243)保守域设计引物(RT-PCR引物为：F：5′-TCAAGATCCTGAGAATGACA-3′；R：5′-ATATCCTCGACATGAGTG A-3′)，从紫花苜蓿(Medicagosativa L.cv.Zhongmu No.1，中苜一号，北京中畜东方草业科技有限责任公司)中进行扩增，回收预期大小为450bp的片段(跑电泳后回收此长度的片段)，将回收的片段连入PMD18-T Vector(Takara)，测序：测序结果在NCBI的非冗余蛋白数据库中进行BLASTx分析；将分析结果中与花青素还原酶类有关的4条序列用DNAstar进行连续开放阅读框(ORF)分析，发现1条具有连续的ORF(长度为452bp)；用该序列设计特异引物(MsBAN-RT-F：GCTAGCTGAAAAGGCTGCAT；MsBAN-RT-R：TCCTCGACATGAGTGAGGA)，且利用该序列设计5’RACE引物与3’RACE引物，以紫花苜蓿荚果组织为材料，获得其全长序列，具体步骤为：

利用SMARTer^TMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)分别对该EST序列进行了5’RACE和3’RACE克隆，最后获得了该基因全长序列(SEQ ID NO：1)。其中，基因克隆的方法为分子生物学领域的常规实验操作，具体方法如下：

RACE-ready cDNA的合成

A.准备基本液体：2.0μl 5×第一链缓冲液，1.0μl DTT(20mM)，1.0μldNTP Mix (10mM)；

B.制备用于5’RACE的cDNA：2.75μl RNA，1.0μl 5′-CDS PrimerA；

制备用于3’RACE的cDNA：3.75μl RNA，1.0μl3′-CDS PrimerA；

C.将准备好的液体放于72℃3分钟，再放于42℃冷却2分钟。

D.向B中5’RACE的cDNA中加入1μl的SMARTer IIA oligo。

E.制备5’RACE和3’RACE-Ready cDNA反应液：4.0μl的步骤A得到的缓冲液，0.25μl RNA酶抑制剂(40U/μl)，1.0μl SMARTScribe逆转录酶(100U)。

F.将步骤E中的液体加入到步骤C中，完成3’RACE-Ready cDNA合成反应液的制备；将步骤E中的液体加入到步骤D中，完成5’RACE-ReadycDNA合成反应液的制备。

G.将制备好的反应液放于42℃中90分钟，最后70℃中10分钟，完成Ready-cDNA的合成。

cDNA末端的快速合成

H.准备基本液体：34.5μl PCR用水，5.0μl 10×Adcantage 2PCR缓冲液，1.0μl dNTP Mix(10mM)，1.0μl 50×Advantage 2聚合酶Mix；

I.制备用于5’RACE的PCR反应：2.5μl 5’RACE-ready cDNA，5.0μlUPM(10×)，1.0μl GSPl 5′-GCAAAGCCACCCACTTGGGGTTATC-3′；41.5μl的步骤H中制备的缓冲液

制备用于3’RACE的PCR反应：2.5μl 3’RACE-ready cDNA，5.0μlUPM(10×)，1.0μl GSP25′-GCTGGTTTTATCATGTCA-3′；41.5μl的步骤H中制备的缓冲液

RACE反应体系为：94℃30秒，72℃3分钟，共5个循环：94℃30秒，70℃3分钟，72℃3分钟，共5个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃3分钟，共20个循环。

取PCR产物于1.0重量％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的条带，连接回收产物与pEGM T-Easy载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒并测序，进行序列拼接，测序结果显示该基因具有SEQ ID：No：1所示的核苷酸序列(1247bp)。

本发明还提供了一种表达载体，其中，该表达载体含有具有以下核苷酸序列的基因：SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明提供的基因可以通过现有的方法构建到表达载体中，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。

本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有具有以下核苷酸序列的基因：SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。所述细胞可以为单子叶植物的细胞，也可以为双子叶植物的细胞，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄或苜蓿等的细胞。优选为苜蓿细胞，更优选为紫花苜蓿细胞。

本发明还提供了一种培育单宁含量高的紫花苜蓿的方法，其中，该方法包括将具有SEQ ID No：1所示的核苷酸的基导入到紫花苜蓿细胞中，得到单宁含量提高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。

根据本发明所述将有本发明提供的基因导入到紫花苜蓿细胞中的方法为基因工程领域常规的方法，例如可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，之后将转化的植物细胞培育成植株。

本发明还提供了本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因、及其编码的蛋白、含有所述基因的表达载体、含有所述基因的转基因细胞在培育单宁含量高的植物中的应用。优选地，所述植物为紫花苜蓿。

实施例1

农杆菌介导的MsBAN基因转化紫花苜蓿植株

一、材料与试剂

1、植物材料

供试苜蓿品种为紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1，中苜一号，北京中畜东方草业科技有限责任公司)。

发芽7天的无菌苗子叶为遗传转化的受体材料。

2、农杆菌菌株和质粒载体

所用的农杆菌菌株为根癌农杆菌：LBA4404(北京天恩泽基因科技有限公司)

农杆菌培养基：

质粒载体：pCAMBIA1302(购自上海希匹吉生物技术有限公司)。将MsBAN基因插入到pCAMBIA1302中，具体步骤为：设计5’端包含NcoI酶切位点的上游引物和SpeI酶切位点的下游引物(F：5′-CATGCCATGGATGATGGCTAGTATCAAAC-3′，R：5′-GGACTAGTCTACTTCTTCAAGGCCCCCTGAG-3′)，用该引物从cDNA模板中扩增MsBAN的全长阅读框，1302载体和全长片段经NcoI和SpeI双酶切后回收产物，经T4DNA连接酶连接，得到插入有MsBAN基因的pCAMBIA1302载体，其含有CaMV35s启动子、MsBAN基因(SEQ ID NO：1)以及一个潮霉素抗性筛选标记，进行遗传转化的时候可通过潮霉素筛选初步鉴定获得的转基因植株。含有目的片段的质粒载体的结构图1所示。

将插入有MsBAN基因的pCAMBIA1302载体导入到根癌农杆菌LBA4404中，具体步骤如下：

A.向100μl农杆菌感受态细胞LBA4404中加入约1μg质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min；

B.于液氮中速冻1min，立即置于37℃水浴中温育5min；

C.加入800μl YEB液体培养基，28℃150rpm培养4-6h；

D.菌体涂布于含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin Sulfate)和100mg/L链霉素(streptomycin)的YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。

E.挑取单菌落，接种于YEB液体培养基中(含50mg/L Kan和100mg/LStr)，28℃震荡培养过夜。

提取导入有MsBAN基因的农杆菌的质粒并测序，结果显示导入基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：1一致，表明含有目的基因MsBAN的表达载体没有发生丢失现象。

二、实验方法

1、农杆菌的培养

将导入有MsBAN基因的农杆菌于含有50mg/LKan和100mg/L Str的固体培养基上划平板，放于培养箱内，28℃培养。两天后，从平板上挑取单菌落，接种于含有50mg/L Kan和100mg/L Str的20ml YEB液体培养基中，180rpm，28℃培养。用摇好的菌液划平板，28℃培养，待长出单菌落后，将平板放于4℃保存。

2、MsBAN基因的转化

在平板上挑取单菌落，接种于20ml含有50mg/L Kan和100mg/L Str的YEB液体培养基内，在恒温摇床上于28℃，180rpm培养。两天以后取少量菌液，以1∶50-1∶100的比例稀释到含50μg/m1Kan和100μg/m1Str的YEB液体培养基中，28℃培养6-12h至对数生长期。将菌体收集到离心管中，4,000rpm离心10min富集菌体，弃上清，再用约20ml不含抗生素的改良的SH液体培养基重悬菌体，使菌液的OD₆₀₀值为0.6-0.8，待用。

3、外植体的准备：

将4-5天大小的紫花苜蓿子叶用手术刀从无菌苗上切下，切成3-4mm长的小块，放于改良的SH液体培养基内，防止干枯，待用。外植体准备完成后，将浸泡于改良的SH液体培养基内的外植体，倒于灭好菌的滤头里，回收外植体。将回收的外植体放于步骤2中准备好的菌液中，进行农杆菌浸染。每隔一会，摇动几下，有助于农杆菌吸附到外植体上。浸染15分钟后，倒于无菌的滤头上，回收外植体。将外植体放于无菌的滤纸上，吸去多余菌液，于空白的共培养培养基上28℃暗培养4天。

经共培养4天后的外植体，转移到含有2mg/L 2，4-D、0.2mg/L KT、40mg/L潮霉素和300mg/L Cef的改良的SH固体培养基上，诱导产生愈伤组织；待培养20天后，将诱导产生的愈伤组织转移到含有0.2mg/L KT、2g/L水解酪蛋白，50mg/L潮霉素和300mg/L Cef的UM培养基上，诱导产生胚状体；当胚状体成熟以后(大约培养30天)，将胚状体移植到1/2MS培养基上，诱导生根，从而完成植株的再生。

再生过程中各步培养基的组成如下：

共培养培养基：改良的SH培养基；

诱导愈伤培养基：改良的SH培养基+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L KT；

胚状体诱导培养基：UM培养基+0.2mg/L KT+2g/L水解酪蛋白+50mg/L Hyg+300mg/L Cef；

对比例1

转空载体对照植物的获得

用质粒pCAMBIA1302转化农杆菌，获得重组农杆菌，用重组农杆菌转化紫花苜蓿，得到转空载体的对照植株，方法如实施例1。

实施例2

检测30株的对比例1中得到的转空载体的紫花苜蓿和30株的实施例1中得到的转插入有MsBAN基因的pCAMBIA1302载体的紫花苜蓿中的单宁含量，具体方法如下：

A.制备Folin-Denis显色剂：50g钨酸钠，10g磷钼酸，加入375mL蒸馏水溶解，再加入25mL 85％的H₃PO₄，水浴回流2h，冷却后定容至500mL棕色瓶中；

B.样品的浸提：供试样品烘干并粉碎后，准确称取1g，于250mL锥形瓶中加入50mL 1∶5的乙醇溶液，振荡浸提60min，双层快速滤纸过滤；

C.绘制标准曲线：准确称取单宁标准品50mg，定容为500mL，吸取单宁标准溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5mL，加入步骤A中的F-D试剂2.5mL，摇匀，再加入饱和碳酸钠溶液5.0mL，定容为50mL，放置30min后，在760nm处分别测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，单宁含量为横坐标，绘制标准曲线；

D.测定：吸取步骤B中获得的滤液1mL，用30mL水稀释，加入步骤A中的F-D试剂2.5mL，加入饱和碳酸钠溶液5.0mL，摇匀，定容至50mL，静置30min后，以1∶5的乙醇溶液作为空白对照，在760nm波长处测定吸光度，单宁提取率按以下公式计算：

单宁含量(重量％)＝p×V_总×100/V×W

W-样品质量，mg；

V_总-提取液总体积，mL

V-比色时所吸取体积，mL

P-标准曲线查得的提取液所含单宁，mg/mL

结果显示，转pCAMBIA1302空载体的紫花苜蓿中的单宁含量为0.7重量％以下，而转插入有MsBAN基因的pCAMBIA1302载体的紫花苜蓿中的单宁含量平均达到1.62重量％以上。

由此可以看出，本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因(MsBAN)在紫花苜蓿中的表达可以显著增强紫花苜蓿中单宁的含量。该基因的发现为克服主要牧草植物(特别是豆科植物，如紫花苜蓿)易引发家畜发生鼓胀病提供了基因资源，在基因工程改良牧草植物的研究中将发挥重要作用。

Claims (8)

1.一种由紫花苜蓿花青素还原酶基因编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

2.一种紫花苜蓿花青素还原酶基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示。

4.一种表达载体，其特征在于，该表达载体含有权利要求2所述的基因。

5.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求2所述的基因。

6.根据权利要求5所述的转基因细胞，其中，所述转基因细胞为紫花苜蓿转基因细胞。

7.一种培育紫花苜蓿的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求2所述的基因导入到紫花苜蓿细胞中，得到单宁含量高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。

8.权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的基因、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的转基因细胞在培育单宁含量高的植物中的应用，其中，所述植物为紫花苜蓿。