CN110734923B

CN110734923B - 一种提高植物ACC含量的AdMsrB1及其应用

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Publication number: CN110734923B
Application number: CN201911074200.0A
Authority: CN
Inventors: 殷学仁; 傅蓓凌; 张爱迪
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-11-06
Filing date: 2019-11-06
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2039-11-06
Also published as: CN110734923A

Abstract

本发明提供了一个提高植物ACC含量的AdMsrB1及其应用，该基因来源于猕猴桃。利用所克隆到的AdMsrB1基因cDNA序列，构建植物表达载体，过量表达于普通烟草叶片，显著增加植株中乙烯生物合成途径中间产物1‑氨基环丙烷羧酸(ACC)的含量由2.52nmol g^‑1提高至5.41nmol g^‑1，增幅量约为两倍。可利用过量表达该甲硫氨酸亚砜还原酶基因增加ACC的含量，进而影响植株中的乙烯生物合成。

Description

一种提高植物ACC含量的AdMsrB1及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及甲硫氨酸亚砜还原酶AdMsrB1。涉及到一个来源于猕猴桃的甲硫氨酸亚砜还原酶的基因，命名为AdMsrB1。本发明还涉及该基因编码的氨基酸序列、含有这类基因的载体，以及该基因在提高乙烯生物合成途径中1-氨基环丙烷羧酸(ACC)产物含量的基因工程中的应用。

背景技术

猕猴桃属于猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)，为多年生落叶藤本植物，果实酸甜可口，富含氨基酸、维生素、矿质元素等多种营养成分。在全球范围内，猕猴桃的种植面积逐年扩大。中国是猕猴桃的起源中心，伴随着猕猴桃商业化栽培技术提升和产业的快速发展，我国种植面积和总产量居世界之首。

猕猴桃为呼吸跃变型果实，成熟过程存在乙烯峰并对外源乙烯非常敏感，采后外源乙烯处理可加速猕猴桃果实后熟软化。货架期的猕猴桃果实后熟进程过快或过慢皆会影响果实风味及品质，且难以控制果实销售期，难以保证长期市场供应。因此，探究可迅速响应外源乙烯处理的基因，对调控猕猴桃果实贮藏期限以及保持果实贮藏品质具有重要的产业意义。

利用生物技术分离了猕猴桃甲硫氨酸亚砜还原酶编码基因，发现AdMsrB1受乙烯处理诱导，并可促进乙烯生物合成途径1-氨基环丙烷羧酸(ACC)产物的含量，参与果实采后成熟进程的调控。

发明内容

本发明的目的是提供一个甲硫氨酸亚砜还原酶AdMsrB1，是一个与猕猴桃成熟相关的甲硫氨酸亚砜还原酶AdMsrB1及其编码基因。本发明所提供的AdMsrB1基因来源于猕猴桃(Actinidia deliciosa[A.Chev.]C.F.Liang et A.R.Ferguson var.deliciosacv.Hayward)，是甲硫氨酸亚砜还原酶家族中的一员，其核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ:NO.1和SEQ:NO.2；其中氨基酸残基序列是由140个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量约为15.22kD，等电点6.29，基因全长423bp。

本发明的另一目的是提供AdMsrB1在提高植物乙烯生物合成途径中间产物1-氨基环丙烷羧酸(ACC)含量中的应用，所用植物为普通烟草。所有包含AdMsrB1基因序列(SEQ:NO.1)的表达载体，均在本发明专利保护范畴以内。

本发明提供了一个甲硫氨酸亚砜还原酶AdMsrB1基因及其蛋白、cDNA序列，该基因来源于猕猴桃。利用所克隆到的AdMsrB1基因cDNA序列，构建植物表达载体，过量表达于普通烟草叶片，植株中乙烯生物合成途径中间产物1-氨基环丙烷羧酸(ACC)的含量由2.52nmol g^-1提高至5.41nmol g^-1，增幅量约为两倍。可利用过量表达该甲硫氨酸亚砜还原酶基因增加ACC的含量，进而影响植株中的乙烯生物合成。

附图说明

图1是果实中AdMsrB1响应外源乙烯处理的基因表达模式图。

图2是瞬时过量表达35S::AdMsrB1基因的烟草叶片中ACC含量测定。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1.AdMsrB1基因在空气(对照)和外源乙烯处理下的表达模式

研究方法：

‘海沃德’猕猴桃成熟果实于2015年采收于陕西省商业果园，实验果挑选标准为果形大小均一，无机械伤病虫害。在20℃条件下，将果实密封在20L的桶内，分别用100μl/L乙烯和空气(作为对照)处理24小时，然后取出贮藏于20℃，取样点为乙烯处理组0、0.5、1、2、4、8d，对照组为0、1、2、4、8d。果实样品收集时只取果肉，去掉果皮、带籽部分和中柱。经液氮冷冻后，存放于-80℃保存。

使用在线软件Primer 3.0(v.0.4.0；http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)对AdMsrB1设计实时荧光定量PCR引物对(SEQ:NO.3和SEQ:NO.4)，并通过溶解曲线分析和PCR产物测序双重确认，反应体系为10μl

480SYBR GreenⅠMaster(Roche，德国)，引物对SEQ:NO.3和SEQ:NO.4各1μl(10μM)，2μl cDNA，6μl DEPC-H₂O，反应体系共20μl。

PCR反应程序为95℃5min；95℃10s，60℃10s，75℃15s，50个循环。以猕猴桃Actin作为内参(基因编号EF063572)，数据处理方法采用相对定量2^{-^Ct}。

研究结果：

发现与空气(对照)处理的果实相比，100μl/L外源乙烯处理可极显著增强果实中AdMsrB1的基因表达量200倍(附图1)，即AdMsrB1可极显著的响应外源乙烯的诱导。

实施例2.瞬时过量表达35S::AdMsrB1的烟草叶片中ACC含量测定

研究方法：

1.烟草叶片瞬时过量表达

将AdMsrB1的编码区全长搭载到pGreen II 002962-SK双元表达载体，所用引物序列为SEQ:NO.5和SEQ:NO.6。将该重组载体用电击法转化至GV3101菌株，保存甘油菌。将含有35S::AdMsrB1和空SK载体的农杆菌活化，重悬浮于渗透液(10mM MES，150mM乙酰丁香酮，10mM MgCl₂，pH5.6)并调节OD₆₀₀至0.75。目标基因(35S::AdMsrB1重组载体)和阴性对照(空SK载体)分别注射于普通烟草第五片真叶的主叶脉两侧，重复至少5次。注射后的烟草置于人工气候室培养5天，分别取样用于后续生理数据的测定。

2.ACC含量测定：

称取1g已磨碎的烟草叶片样品加入4ml 95％乙醇中混合均匀，于95℃烘箱中放置20min，期间每隔10min颠倒混匀一次。4℃10000g离心15min，收集上清；残渣中加入3ml80％乙醇，混合均匀后于70℃烘箱中放置30min，期间每隔10min颠倒混匀一次。4℃10000g离心15min，收集上清。合并两次所得的上清，35℃旋转蒸干，向残留物中加入1ml氯仿和2ml水振荡混匀以溶解色素。4℃过夜，8000g离心10min，取水相，即为ACC提取液。

取1ml ACC提取液于容积为20ml的具塞试管，加入40μl 25mmol/L氯化汞，密封试管，冰浴10min平衡温度。用注射器往里加入200μl提前预冷的5％NaClO-饱和NaOH混合液，迅速振荡5s，冰浴平衡5min。顶空抽取1ml气体，气相色谱法测定乙烯生成量。

ACC转化率计算：取同一处理样品ACC提取液两份，其中一份加入20μl 0.1mmol/LACC标准品作为内标物，按照前面叙述的方法进行测定。两份样品乙烯生成量之差即为所添加的ACC转化为乙烯的量。

根据气相色谱法测得顶空气体中乙烯含量，计算每克样品中ACC的含量，以nmol/gm_F表示。计算公式：

式中c—气谱法测得样品气体中乙烯含量，μl/L；V₁—样品瓶剩余空间体积，ml；V—样品提取液总体积，ml；R—ACC向乙烯转变的效率，％；V_s—测定时所取样品提取液体积，ml；m—样品质量，g；22.4—标准状况下1mol气体体积常数，L/mol。

研究结果：

与注射空载体SK的烟草叶片相比，瞬时过量表达35S::AdMsrB1基因的烟草叶片中ACC含量显著增加(附图2)。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种提高植物ACC含量的AdMsrB1及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 423

<212> DNA

<213> 猕猴桃(Actinidia deliciosa [A. Chev.] C.F. Liang et A.R.Ferguson var. deliciosa cv. Hayward)

<400> 1

atggccgcac ctacctcctc cgctcagaaa tcagaggaag aatggagggc gattctctct 60

cctgagcagt tccgaatcct tcgtcagaaa ggaacagagc taagaggcac tggcgaatat 120

gacaagttct ataacgatgg cgtctacaac tgtgctggct gtgggacccc actctataaa 180

tctaccacca aatttaactc tggctgtggt tggcctgctt tttacgaggg tttccctgga 240

gccatcagtc gctttcccga tccagatggg agaagaaccg aaattacatg tacagcttgt 300

ggcggtcact taggccatgt tttcaaaggc gagggcttct cgacgcctac tgatgaacgc 360

cattgtgtca acagtgttgc aatcaagttt gctccagccg agacttcgtc tgcttccctg 420

tga 423

<210> 2

<211> 140

<212> PRT

<400> 2

Met Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ala Gln Lys Ser Glu Glu Glu Trp Arg

1 5 10 15

Ala Ile Leu Ser Pro Glu Gln Phe Arg Ile Leu Arg Gln Lys Gly Thr

20 25 30

Glu Leu Arg Gly Thr Gly Glu Tyr Asp Lys Phe Tyr Asn Asp Gly Val

35 40 45

Tyr Asn Cys Ala Gly Cys Gly Thr Pro Leu Tyr Lys Ser Thr Thr Lys

50 55 60

Phe Asn Ser Gly Cys Gly Trp Pro Ala Phe Tyr Glu Gly Phe Pro Gly

65 70 75 80

Ala Ile Ser Arg Phe Pro Asp Pro Asp Gly Arg Arg Thr Glu Ile Thr

85 90 95

Cys Thr Ala Cys Gly Gly His Leu Gly His Val Phe Lys Gly Glu Gly

100 105 110

Phe Ser Thr Pro Thr Asp Glu Arg His Cys Val Asn Ser Val Ala Ile

115 120 125

Lys Phe Ala Pro Ala Glu Thr Ser Ser Ala Ser Leu

130 135 140

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 3

gttggcctgc tttttacgag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 4

gacacaatgg cgttcatcag 20

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 5

gcccaagctg agctcatggc cgcacctacc tcc 33

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 6

cagcccgggg gatcctcaca gggaagcaga cgaagt 36

Claims

1.一种提高植物1-氨基环丙烷羧酸含量的AdMsrB1基因，其特征在于，所述AdMsrB1基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。

2.权利要求1所述的AdMsrB1基因在提高植物乙烯生物合成途径中间产物1-氨基环丙烷羧酸含量中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物为普通烟草。