CN114480695B - 茶树s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因启动子区ssr分子标记引物及应用 - Google Patents

茶树s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因启动子区ssr分子标记引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了茶树S‑腺苷甲硫氨酸合成酶基因SSR分子标记(SSR1‑SAMS、SSR2‑SAMS)引物及其应用。研究表明，本发明依据具体特定的基因，在茶树全基因组上开发其SSR引物方法可行，所得引物多态性高、重复性好，具有较好的可行性、针对性。据此，发明人开展了茶树种质资源遗传多态性的研究。综上，本发明的研究方法、SSR分子标记及其引物，可广泛应用于茶树品种鉴定、遗传结构和资源多样性分析、遗传图谱构建，功能基因定位及QTL定位、种子纯度鉴定、分子标记辅助选育种研究中，便于进一步研究茶树生物碱合成以及茶树遗传多态性，促进深入开发茶树资源。

Description

茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因启动子区SSR分子标记引物 及应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，尤其茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因启动子区SSR分子标记引物及应用。
背景技术
茶树是中国重要的木本经济作物，茶是世界上最古老、最受欢迎的含咖啡碱饮料。茶树中含有咖啡碱(Caffeine)、可可碱(Theobromine)和茶叶碱(Theophylline)等嘌呤类生物碱，同时也含有少量嘧啶类生物碱。生物碱是一类来源于生物界的含氮有机化合物，在植物界分布较广，目前已知至少有50多个科120属以上的植物含有生物碱，已发现和分离出的生物碱近6000种。咖啡碱是茶叶重要的滋味物质，其与茶黄素以氢键缔和后形成的复合物具有鲜爽味，因此茶叶咖啡碱含量也常被看做是影响茶叶质量的一个重要因素。此外，咖啡碱对人体具有一定的兴奋作用，因此还具有一定的药理功能。
S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)(E.C.2.5.1.6)催化甲硫氨酸和ATP反应生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM既是植物体内转甲基反应的甲基供体及多胺和乙烯合成的前体，同时也是茶树咖啡碱生物合成过程中甲基化反应的唯一甲基供体。SAM及SAM合成酶基因在茶树中可以参与咖啡因生物合成，并能对逆境中的茶树起保护作用。SAMS是一种胞内酶，除了肺囊虫与沙眼衣原体等之外，它广泛存在于动物、植物及微生物体内，至今已经分别从原核生物细菌和真核生物酵母、拟南芥、烟草、蝴蝶兰、白木香、马铃薯、棉花等克隆到了SAMS基因。2005年，浙江大学的梁月荣等克隆了茶树的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，序列长1303bp，编码394个氨基酸，该基因与中华猕猴桃、番茄、长春花的SAM合成酶基因的核苷酸序列同源性分别为87％，83％和83％；其氨基酸序列(登录号为AB041534)与三角杨、猕猴桃、番茄、长春花等的SAM氨基酸序列同源性为92％～90％。
SAM是茶树咖啡碱生物合成过程中甲基化反应的唯一甲基供体，因此S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因是咖啡碱合成重要关键酶，但是针对S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因SSR分子标记引物开发及应用研究还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因启动子区SSR分子标记引物及应用，以便于进一步研究茶树生物碱合成以及茶树遗传多态性。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SSR分子标记，分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列，标记编号为SSR1-SAMS、SSR2-SAMS。
扩增上述茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SSR分子标记的引物，分子标记SSR1-SAMS、SSR2-SAMS的引物分别包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。
上述SSR分子标记的制备方法，利用特定引物对茶树总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；引物包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。
上述SSR分子标记的制备方法，包括以下操作步骤：
<1>提取DNA
采用试剂盒提取茶树的基因组DNA作为模板；
<2>PCR反应
反应体系：反应总体积为20μL，其中2×PCR Mix 10μL，茶树DNA模板1μL，ddH2O 8μL，正向引物和反向引物各1μL；
反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存；
<3>电泳显色
取5μL PCR产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min；电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。
正向引物为序列表SEQ.ID.No.3、SEQ.ID.No.5的引物，反向引物为序列表SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.6的引物。
茶树DNA模板为1～50ng，正向引物或反向引物的浓度为10μmol/L。
上述SSR分子标记在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
上述SSR分子标记在茶树生物碱的生物合成研究方面的应用。
上述SSR分子标记的引物在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
上述SSR分子标记的引物在茶树生物碱的生物合成研究方面的应用。
针对目前茶树的生物碱合成途径关键酶研究尚少的问题，发明人在‘云抗10号’大叶茶树全基因组公开报道的基础上，利用分子标记技术研究开发了茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SSR分子标记(SSR1-SAMS、SSR2-SAMS)引物及其应用。研究表明，本发明依据具体特定的基因，在茶树全基因组上开发其SSR引物方法可行，所得引物多态性高、重复性好，具有较好的可行性、针对性。据此，发明人开展了茶树种质资源遗传多态性的研究。综上，本发明的研究方法、SSR分子标记及其引物，可广泛应用于茶树品种鉴定、遗传结构和资源多样性分析、遗传图谱构建，功能基因定位及QTL定位、种子纯度鉴定、分子标记辅助选育种研究中，便于进一步研究茶树生物碱合成以及茶树遗传多态性，促进深入开发茶树资源。
附图说明
图1是茶树SSR1-SAMS和SSR2-SAMS引物扩增片段的聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：M：2000bp DNA Marker；各泳道对应茶种质材料分别为：1，7是德保茶；2，8是黄金茶；3，9是紫鹃；4，10是湘波绿；5，11是金牡丹；6，12是罗香2号。各泳道对应引物扩增片段为：泳道1-6为SSR1-SAMS引物扩增片段；泳道7-12为SSR2-SAMS引物扩增片段。
图2是位于SAMS基因间区(intergenic)的其它SSR-SAMS引物扩增片段的聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：各泳道对应茶种质材料分别为：1，7，13，19，25，31是德保茶；2，8，14，20，26，32是黄金茶；3，9，15，21，27，33是紫鹃；4，10，16，22，28，34是湘波绿；5，11，17，23，29，35是金牡丹；6，12，18，24，30，36是罗香2号。各泳道对应引物扩增片段为：泳道1-6为SSR13-SAMS引物扩增片段；泳道7-12为SSR14-SAMS引物扩增片段；泳道13-18为SSR15-SAMS引物扩增片段；泳道19-24为SSR16-SAMS引物扩增片段；泳道25-30为SSR17-SAMS引物扩增片段；泳道31-36为SSR18-SAMS引物扩增片段；
图3是位于SAMS基因间区intergenic的其它SSR-SAMS引物扩增片段的聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：各泳道对应茶种质材料分别为：1，7，13，19，25，31是德保茶；2，8，14，20，26，32是黄金茶；3，9，15，21，27，33是紫鹃；4，10，16，22，28，34是湘波绿；5，11，17，23，29，35，是金牡丹；6，12，18，24，30，36是罗香2号；m+4为M(2000bp DNA Marker)与湘波绿PCR产物混合样。各泳道对应引物扩增片段为：泳道1-6为SSR37-SAMS引物扩增片段；泳道7-12为SSR38-SAMS引物扩增片段；泳道13-18为SSR39-SAMS引物扩增片段；泳道19-24为SSR40-SAMS引物扩增片段；泳道25-30为SSR41-SAMS引物扩增片段；泳道31-36为SSR42-SAMS引物扩增片段。
具体实施方式
茶树生物碱合成途径S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因SSR分子标记研究
(1)从NCBI上下载茶树生物碱合成途径S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)(GenBank:AB041534)基因序列。
(2)下载茶树‘云抗10号’全基因组序列(下载地址：http:// www.plantkingdomgdb.com/tea_tree/dat)。在茶树全基因组中运用SSR search软件寻找其SSR标记，提取SSR序列及其上下游特定长度(默认100bp)的序列。运用primer3进行引物设计，获得引物序列、SSR重复基元和重复长度、预扩增片段长度等。据此合成制备S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因相关的50对SSR分子标记引物序列。
(3)采用天根生物有限责任公司生产的试剂盒HYQspin TM CT Plant DNA Kit提取德保茶、紫鹃、黄金茶、湘波绿、金牡丹和罗香2号共6个茶树种质资源的基因组DNA。
(4)从步骤(2)中获得的50对SSR引物中，以步骤(3)提取的6个茶树种质资源基因组DNA为模板开展SSR-PCR反应，并利用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳及快速银染法检测PCR扩增产物。
PCR反应体系：反应总体积为20μL，其中2×PCR Mix 10μL，茶树DNA模板(1～50ng)1μL，ddH2O 8μL，正向引物(10μmol/L)和反向引物(10μmol/L)各1μL。
PCR反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存。
电泳显色：取5μL PCR产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min。电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。
PCR扩增电泳染色部分结果如图1至图3所示，50对SSR引物中，仅有图1的2对SSR引物(表1)扩增的片段有差异性，其多态性好、主带清晰，它们位于SAMS基因启动子upstream区域。
表1基于茶树SAMS基因筛选获得的2对多态性好的SSR分子标记引物信息
序列表
<110> 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所）
<120> 茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因启动子区SSR分子标记引物及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attgtagctc gtgaaacctt ggagagtgag tgagtgagtg agtgagtgag tgagttcggt 60
tcggataaat gaatgaatgt 80
<210> 2
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagagcaaga caaagagagc tgtgttgtgt ggtgtggtgt ggtgtggtgc gagcgaaaga 60
ggggttcgag gggtgagggc tctagggatt tcggagaagc gggctttata gagagaggaa 120
tggaggagtc aagtccgaat tt 142
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attgtagctc gtgaaacctt ggag 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acattcattc atttatccga accg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagagcaaga caaagagagc tgtg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaattcggac ttgactcctc catt 24

Claims (7)

1.茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SSR分子标记，其特征在于，所述SSR分子标记为
SSR1-SAMS、SSR2-SAMS；所述SSR1-SAMS如序列表SEQ.ID.No.1所示碱基序列，
SSR2-SAMS如序列表SEQ.ID.No.2所示碱基序列。
2.扩增权利要求1所述茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SSR分子标记的引物，其特征在于，扩增分子标记SSR1-SAMS的引物如序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4所示碱基序列，扩增分子标记SSR2-SAMS的引物如序列表SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6所示碱基序列。
3.权利要求1所述SSR分子标记的制备方法，其特征在于，利用引物对茶树总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；所述引物包括扩增分子标记SSR1-SAMS的引物和扩增分子标记SSR2-SAMS的引物；所述扩增分子标记SSR1-SAMS的引物如序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4所示碱基序列，扩增分子标记SSR2-SAMS的引物如序列表SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6所示碱基序列。
4.权利要求1所述SSR分子标记在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
5.权利要求1所述SSR分子标记在茶树生物碱的生物合成研究方面的应用。
6.权利要求2所述SSR分子标记的引物在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
7.权利要求2所述SSR分子标记的引物在茶树生物碱的生物合成研究方面的应用。
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