CN104263736A

CN104263736A - 控制白菜型油菜多室角果基因BrCLV3的克隆及应用

Info

Publication number: CN104263736A
Application number: CN201410424079.0A
Authority: CN
Inventors: 范楚川; 周永明; 武语笛; 杨庆勇
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2014-08-26
Filing date: 2014-08-26
Publication date: 2015-01-07

Abstract

本发明属于农作物分子育种技术领域。具体涉及一种控制白菜型油菜多室角果基因BrCLV3的克隆与应用。该基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，序列全长3527bp，包含3个外显子，2个内含子，编码94个氨基酸。该基因编码的蛋白质具有信号肽和CLE motif，其蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。利用转基因技术获得BrCLV3转化拟南芥clv3-2突变体的植株，7个株系能将突变体的多室角果恢复成两室。同时，体外多肽(SEQ ID NO：2所示)处理实验发现BrCLV3多肽的第9位脯氨酸突变成亮氨酸后丧失了对植株的抑制能力。本发明克隆的基因为油菜产量育种提供了新的基因资源。

Description

控制白菜型油菜多室角果基因BrCLV3的克隆及应用

技术领域

本发明涉及油菜分子育种技术领域，具体涉及到一种控制白菜型油菜多室角果性状的基因BrCLV3的克隆及应用。

背景技术

油菜是十字花科(Cruciferae)重要的油料作物，其角果通常由两心皮的雌蕊发育而来，角果内被假隔膜分为两室、种子着生于其中，外被两片壳状果瓣。在自然界中也发现了一些多室油菜突变体，其角果由多心皮雌蕊发育而成，角果内被假隔膜分为三室、四室或五室，外被3-5片壳状果瓣。这种自发突变材料在白菜型油菜(Brassica rapa,AA,2n＝2x＝20)中较为常见，如印度黄籽沙逊多室油菜和西藏桑日白油菜(Mohammad et al,1942,Indian Journal of Genetics and Plant Breeding 2.112-127；何余堂等,2003,Chinese Journal of Oil Crop Sciences 25.1-4)；在芥菜型油菜(B.juncea,AABB,2n＝4x＝36)中也同样存在，如山西的三筒油菜、贵州的四轮油菜、青海的多室油菜和四川的四棱油菜等(刘后利,2000,China Agricultural University Press)。已有的研究表明，角果多室性状对油菜育种是一种有利突变：(1)多室材料具有较多的每角果粒数，并导致其单株产量显著高于相应的两室油菜，因此多室油菜的多粒特性在油菜的高产育种中具有一定的应用潜力(Varshney等,1987,Euphytica 36.541-544；Katiyar等,1998,Plant Breeding 117.398-399；朱彦涛等,2012,Chinese Journal of Oil Crop Sciences 34.321-325)；(2)多室角果的抗裂角性较强(Kadkol and Halloran,1986,Can J Gene Cytol 28(3):365-373；朱彦涛等,2012,Chinese Journal of Oil Crop Sciences 34.321-325)，可用于抗裂角的研究和育种。目前，一些研究者通过种间杂交和人工选择的方法将白菜型油菜中的多室性状转育到芥菜型和甘蓝型油菜(B.napus,AACC,2n＝4x＝38)中，获得了稳定遗传的多室材料，并实现了每角果粒数和单株产量的显著增加(Katiyar et al.,1998,Plant Breeding 117.398-399；代秉勋等,2004,作物研究,18(1):45-47；Choudhary and Solanki,2007,Plant Breeding 126,104-106)。因此，多室油菜作为一种新的种质资源，阐明其形成的遗传和分子机理不仅可以丰富油菜花器官形态建成的理论，也有助于油菜高产新品种的培育。

针对多室性状形成的遗传机制，研究者在不同类型油菜的多室材料中开展了一些初步工作。一般认为，白菜型油菜中的多室/两室相对性状受到1对主效核基因的控制，两室性状对多室性状表现为完全显性，且无细胞质效应的影响(Mohammad et al.,1942,Indian Journal of Genetics and Plant Breeding 2,112-127；Varshney,1987Euphytica 36,541-544；何余堂等,2003,Chinese Journal of Oil Crop Sciences 25,1-4)；而芥菜型油菜中的多室/两室相对性状受到1对主效核基因或2对独立遗传的主效核基因(Choudhary and Solanki,2007,Plant Breeding 126,104-106)的控制，同样两室性状对多室性状表现为完全显性，且无细胞质效应的影响。最近，Xiao等(2013)和Xu等(2013)分别对芥菜型油菜中A7染色体上的多室基因开展了精细定位的工作(Xiao et al.,2013,Molecular Breeding 32,373-383；Xu et al.,2014,Molecular Breeding 33,425-434)；Paritosh等也将白菜型油菜中的多室基因定位于A4染色体上(Paritosh et al.,2013,BMC Genomics 14,463)，但是到目前为止油菜中还没有多室基因被分离克隆的研究报道。

本发明所涉及的BrCLV3基因位于白菜型油菜A4染色体上，编码一个与茎顶端分生组织调控和多室角果形成的CLV3多肽信号分子，发明人利用图位克隆、植物遗传转化以及体外多肽处理相结合的方法分离克隆了该基因。BrCLV3基因对于油菜产量性状的改良具有巨大的应用潜力和前景，为油菜产量育种提供新的基因资源。

发明内容

本发明从白菜型油菜中分离克隆一个位于A4染色体上的控制角果多室性状的基因，该基因具有提高油菜产量的潜能，申请人将该基因命名为BrCLV3基因。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明利用白菜型油菜黄籽沙逊(B.rapa var.yellow sarson)多室突变体ml4和白菜型油菜黄籽沙逊两室野生型wt(见文献：何余堂等.PCR步行法克隆油菜自交不亲和基因.中国油料作物学报,2005,26(4):1-5)作为亲本进行正反交，根据正反交F1的角果表型以及F2代多室角果的分离，确定该材料中多室性状受一个隐性核基因控制。利用随机F2群体将该多室基因初步定位于A4染色体上。随后从6771株F2中挑选出1704个具有多室表型的单株，进行重组单株的筛选，最终将多室基因定位于分子标记DXP63和DXP94间的38.6kb的范围内。通过对该区间的基因进行预测，确定了其中一个编码拟南芥CLV3多肽信号的同源基因Bra034340为候选基因，并将其命名为BrCLV3。该候选基因共编码94个氨基酸，具有N端的信号肽和C端保守的结构域CLE motif。通过比较测序发现，相对于两室材料(包括wt和白菜Chiifu)的基因型，ml4多室突变体的基因型在CLE motif中存在一个C/T的点突变，导致CLE motif的第9位脯氨酸突变成亮氨酸。为了验证BrCLV3基因的功能，一方面利用转基因技术分别将BrCLV3和Brclv3突变等位基因转化拟南芥clv3-2突变体，发现BrCLV3转基因株系能够恢复拟南芥clv3-2突变体的多室角果表型，而Brclv3突变等位基因的转基因家系不能恢复拟南芥clv3-2突变体的多室角果表型。另一方面，根据两种BrCLV3等位基因的CLE功能域分别合成多肽，对拟南芥和油菜幼苗进行处理，结果发现野生型BrCLV3多肽能够显著抑制植株的主根、根和茎的顶端分生组织的生长，而突变型的BrCLV3_Leu9多肽不能发挥这种抑制作用。

申请人通过图位克隆获得一个控制白菜型油菜多室性状的基因BrCLV3，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1中1-3527位所示。

上述控制白菜型油菜多室性状的基因BrCLV3，它的编码蛋白质具有N端的信号肽和C端的保守结构域CLE motif，其蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

一种人工合成的控制白菜型油菜多室性状的多肽，其蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明的实施效果表明，上述序列表SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的基因可在油菜的多室角果性状改良中的应用。

上述人工合成多肽也能应用于油菜的多室角果性状改良中。

本发明的优点在于：

(1)本发明首次在油菜中克隆了一个控制多室角果形成的基因。为油菜的高产育种特别是为油菜的多室角果性状的改良提供了新的基因资源，也为其它作物利用同源序列法克隆相关基因提供了基因序列。

(2)本方面结合植物的遗传转化和体外多肽的处理方法，快速高效地实现多室基因的功能验证，为其它作物中克隆相关基因提供了技术借鉴。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的BrCLV3基因组序列(其中包括BrCLV3基因编码序列)，序列长度为3527bp；编码序列(CDS)分别为2297-2360bp；2447-2493bp；672-2842bp；起始密码子是2297-2299bp；终止密码子是2843-2845bp。

序列表SEQ ID NO：2是BrCLV3基因的蛋白质的序列(也是本发明人工合成的特异性多肽)，编码94个氨基酸。

图1.本发明的技术流程图。

图2.白菜型油菜黄籽沙逊(B.rapa var.yellow sarson)多室突变体ml4的显微观察。图中标记：图2中A：不同发育时期的两室亲本wt和多室突变体ml4的雌蕊横切片(bar＝10μm)。图2中B：不同发育时期wt和ml4的茎顶端分生组织(SAM)的观察。从左至右分别为胚胎时期SAM的微分干涉显微镜观察(bar＝10μm)、10d幼苗的SAM和主花序SAM的纵切片(bar＝10μm)、主花序SAM的扫描电镜照片(bar＝100μm)。

图3.随机F2定位群体中单株多室角果比例的频率分布。白菜型油菜黄籽沙逊(B.rapa var.yellow sarson)两室和白菜型油菜黄籽沙逊(B.rapa var.yellow sarson)多室单株的分离比例符合3:1(χ²＝2.48,P>0.05)。

图4.白菜型油菜多室基因BrCLV3的初步定位于白菜型油菜A4染色体上。图中标记：图谱左侧数字代表标记间遗传距离。

图5.白菜型油菜多室基因BrCLV3的精细定位。标记之间的数字代表各标记与多室基因间的重组单株数，黑点代表预测基因的位置。

图6.BrCLV3的基因结构以及两亲本等位基因间的碱基变异。图中标记：A，黑色方块表示基因编码区、ATG和TAA分别标记起始密码子和终止密码子的位置。通过对两个亲本的BrCLV3基因区域(包括基因编码区、2.3kb的启动子区和2.5kb的3，端侧翼序列)进行比较测序，发现它们间存在3个单核苷酸突变和一个ATAT的插入/缺失。B，BrCLV3氨基酸序列比较。箭头前面的为信号肽，下划线为CLE motif，黑色背景标示脯氨酸/亮氨酸变异。

图7.是本发明应用的常用商业载体pMDC32结构示意图。

图8.35S::BrCLV3载体转化拟南芥clv3-2突变体的转基因植株表型。图中标记：图8.中A，拟南芥Ler；图8中B，突变体clv3-2；图8.中C-E，苗期具有不同表型的转基因家系，包括能形成正常SAM的株系(图8.中C)、SAM的缺失和叶片畸形的株系(图8.中AD)以及植株丛生的株系(图8.中AE)；图8中F，Ler的花序；clv3-2突变体的花序；转基因株系；图8中I，转基因株系能产生两室角果；图8中J：转基因植株的BrCLV3基因表达量检测，分别提取7个转基因株系10d幼苗的总RNA，18S rRNA为内参基因。图8中K，转基因家系、Ler和clv3-2突变体的角果心皮数目的统计。大写字母代表0.01水平下的差异显著性。

图9.多肽处理对拟南芥和白菜型油菜的SAMs大小的影响。

图10.是本发明制备的重组遗传表达载体35S:BrCLV3(全长12305bp)结构示意图。其中BrCLV3为白菜型油菜多室基因的野生型等位基因，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示。依据基因命名一般惯例，将白菜型油菜多室基因的两种基因型分别命名为BrCLV3(野生型基因型)和Brclv3(突变体基因型)，其中BrCLV3为显性等位基因型，Brclv3为隐性等位基因型。

图11是本发明制备的重组遗传表达载体35S:Brclv3(全长12305bp)结构示意图。其中Brclv3为白菜型油菜多室基因的突变体等位基因，相比野生型基因型BrCLV3，其序列在第三个外显子的第116位的碱基C已替换成碱基T。

具体实施方式

根据图1所述的技术路线，以白菜型油菜黄籽沙逊多室突变体(B.rapa var.yellow sarson)的(文献见后，本发明该突变体命名为ml4)和两室野生型wt作为材料进行突变表型的比较观察，同时以它们为亲本进行杂交和自交，获得正反交F1和F2群体，实现多室性状的遗传分析。在此基础上，利用随机F2群体将多室基因初步定位于A4染色体上。随后扩大F2定位群体(6771株)，利用新开发的SSR和SNP标记进行重组单株的筛选，最终将多室基因定位于分子标记DXP63和DXP94间的38.6kb的范围内。通过对该区间的基因进行预测，确定了其中一个编码拟南芥CLV3多肽信号分子的同源基因(基因登录号At2g27250)为候选基因，并将其命名为BrCLV3。该候选基因共编码94个氨基酸，具有N端的信号肽和C端保守的结构域CLE motif。通过对ml4和wt的比较测序，同时结合已发表的白菜Chiifu(两室表型)基因组序列，结果发现多室突变体相对于两室材料，它们的BrCLV3基因型仅在CLE motif中存在一个C/T的点突变，导致CLE motif的第9位脯氨酸突变成亮氨酸。为了验证BrCLV3基因的功能，一方面利用转基因技术分别将BrCLV3和Brclv3突变等位基因转化拟南芥clv3-2突变体，发现BrCLV3的转基因株系能够恢复拟南芥clv3-2突变体的多室角果表型，而Brclv3突变等位基因的转基因家系不能恢复拟南芥clv3-2突变体的多室角果表型。另一方面，根据两种BrCLV3等位基因的CLE功能域分别合成多肽，对拟南芥和油菜幼苗进行处理，结果发现野生型BrCLV3多肽能够显著抑制植株的主根、根和茎的顶端分生组织的生长，而突变型的BrCLV3_Leu9多肽不能发挥这种抑制作用。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了BrCLV3基因的分离克隆及功能验证。

实施例1：多室突变材料的表型观察和多室基因的遗传分析

1.多室突变体的角果相关性状观察

以白菜型油菜黄籽沙逊的多室突变体(拉丁文命名：B.rapa var.yellow sarson；参见文献1：G.P.KADKOLAN D G.M.HALLORAN等，Inheritance of siliqua strength in Brassica campestris L.I.Studies of Fz and backcross populations，CAN.J.GENET.CYTOL.VOL.28,1986；P365-373和文献2：S.K.VARSHNEY等，INHERITANCE OF SILIQUA CHARACTERS IN INDIAN COLZA I.LOCULE NUMBER AND SILIQUA POSITION，Euphytica 36(1987)541-544，本发明将该突变体命名为ml4，本发明命名的该突变体的材料与文献1和2报道的用拉丁文命名的生物材料为同一个生物材料；或参见刘后利著，《油菜的遗传育种学》，中国农业大学出版社，北京，2000版)以及白菜型油菜黄籽沙逊两室野生型材料wt(wt是本发明对该材料的命名)作为材料进行突变表型的比较观察，统计它们的单株多室角果比例、角果长度、每角果粒数和百粒重等性状。性状的测定方法如下：单株多室角果比例是在角果成熟时收获全株角果，统计多室角果所占比例；在每个植株上随机取30个角果测量角果长度和每角果粒数；成熟的油菜籽粒自然干燥4周以上，从每个单株中随机选取100粒饱满籽粒进行称重，重复测定3次，取其平均数为该单株的百粒重。根据性状考察结果可知(表1)，多室突变体(ml4)相对于两室亲本(Wt)，角果长度极显著变短，每角果粒数极显著增加，百粒重无显著差异。

表1白菜型油菜多室和两室亲本及其正反交F1的性状表现

说明：大写字母代表0.01水平的差异显著性

2.多室突变体的显微观察

为确定多室形成的时期，本发明白菜型油菜黄籽沙逊对多室突变体ml4和野生型白菜型油菜黄籽沙逊wt的不同发育时期的雌蕊进行石蜡切片的制作与观察，结果发现在花的发育早期雌蕊中就已经形成了多个心皮(图2中A)，说明角果的多室是由早期雌蕊的心皮数目增加引起的。

已有研究表明，心皮数目的增加一般与茎顶端分生组织的增大有关(Clark et al.,1995,Development 121,2057-2067)。因此，本发明对不同发育时期的茎顶端分生组织的大小进行了显微观察。结果发现，在种子胚中，ml4多室突变体的茎顶端分生组织稍大于wt；在生长10d的幼苗中，这种差异更加明显；在初花期多室突变体ml4的茎顶端分生组织大约是wt的两倍(图2中B)。该结果表明多室角果的形成与茎顶端分生组织的增大有关。

3.多室性状的遗传分析

本发明以白菜型油菜黄籽沙逊的多室突变体ml4和两室野生型白菜型油菜黄籽沙逊wt为亲本进行杂交，正交和反交的F1都表现为两室亲本的表型(表1)，说明多室对两室表现为完全隐性，且无胞质效应。在包含183个单株的F₂随机群体中，单株多室角果频率表现为双峰分布，卡方测验表明两室角果单株与多室角果单株比例符合3:1分离(χ²＝2.48<χ² _0.05＝3.84)(图3)。因此，在该材料中多室性状由1个隐性核基因控制。

实施例2：多心皮基因的定位和候选基因的确定

1.分子标记的开发

本发明根据已经公布的白菜型油菜的基因组序列(http://brassicadb.org/brad/)开发SSR和 SNP分子标记。SSR标记的开发基于网络版的SSR查找工具(http://www.geboc.org/index)；SNAPER程序(Drenkard et al.,2000,Plant Physiology 124,1483-1492)用于SNP标记的开发。本发明中开发和使用到的标记信息详见表2所示。

表2本发明开发的分子标记

说明：部分引物序列中的下划线代表引入的错配碱基；产物大小是参考Chiifu-401序列(http://brassicadb.org/brad/)；forward 1和reverse配对扩增ml4基因型，forward 2和reverse配对扩增wt基因型；DXP94和DXP96是通过PCR产物测序确定基因型。

2.多心皮基因的初步染色体定位

首先，利用136个在亲本间有多态性的共显性SSR标记对随机F2群体中的6个两室表型和8个多室表型的单株进行了基因型分析，鉴定到一个与多室性状紧密连锁的SSR标记(DXP21)。通过BLAST分析发现DXP21的序列和位于A4染色体上的Scaffold000094序列高度相似。基于Scaffold000094序列，开发了SSR标记A4_18、A4_20、A4_26、A4_38和A4_43。然后，利用这些标记对整个随机F2群体进行基因型分析。同时，考察随机F2群体的每个单株的角果表型，并将各单株的多室/两室角果表型作为一个显性的多室基因标记，即凡具有多室角果的单株记为A基因型(多室隐性表型)，其它单株记为C基因型(两室显性表型)。最后，使用Mapmaker/Exp 3.0软件(Lincoln et al.,1992)将随机F2群体的所有分子标记和多室基因标记一起进行连锁分析，最终将多室基因定位在A4染色体的分子标记A4_18和A4_38区间内(图4)。

3.多心皮基因的精细定位

为了进一步的缩小多室基因的定位区间，从6771株的F2中挑选出1704个具有多室表型的单株，用于重组单株的筛选。首先用SSR标记A4_18和A4_38进行筛选，从1704个单株中找到了48个重组单株。然后，利用在SSR标记A4_18和A4_38间的区段内开发的6个SNP标记分析这48个重组单株，结果发现在DXP72和多室基因之间存在17个重组单株，DXP67和多室基因之间存在6个交换单株，DXP96和多室基因之间有2个交换单株。特别是在DXP63和DXP94分别与多室基因之间各有2个交换单株，并且DXP58和A4_26与多室基因共分离。因此，多室基因最终定位于DXP63和DXP94间的约38.6kb的物理范围内(图5)。

4.多心皮候选基因的确定

上述候选基因区段包含Bra034338～Bra034343等6个基因。BLAST分析表明它们分别与拟南芥的At2g27230～At2g27285等6个基因同源(表3)。其中，拟南芥At2g27250(CLV3)是一种小的分泌性多肽信号分子，对维持茎顶端分生组织中的干细胞数目发挥重要作用，该基因突变后会引起茎顶端分生组织中干细胞的异常积累，最终导致花器官数目的增加和多室角果的形成(Fletcher et al.,1999,Science 283.1911-1914)。由于Bra034340是白菜基因组中与拟南芥At2g27250(CLV3)同源最高的基因(79％相似性)，并且与多室基因共分离的分子标记A4_26位于Bra034340基因内部，因此申请人认为Bra034340为多室基因，并将该基因命名为BrCLV3。

表3在候选基因区段内的B.rapa基因及其与拟南芥最同源的基因

实施例3：BrCLV3的基因结构和等位基因间的碱基变异

1.BrCLV3的基因结构分析

利用RNA抽提试剂盒(TRIZOL reagent，购自Invitrogen公司)从白菜型油菜黄籽沙逊野生型wt(何余堂等.PCR步行法克隆油菜自交不亲和基因.中国油料作物学报,2005,26(4):1-5)的主花序顶端分生组织中提取总RNA，经过反转录试剂盒(TransScript RT Kit,Beijing,China)获得总cDNA。然后，根据拟南芥CLV3基因(基因登录号At2g27250)的cDNA序列信息，设计引物对(5’-TTAATTAAGGAGGTTTAAGGGATATGAGA-3’and 5’-GGCGCGCCTACAAAATGGATTCGAGGACTC-3’)从中扩增BrCLV3的基因编码区。扩增产物按照pMD18-T试剂盒(Takara，宝生物工程(大连)有限公司)的使用说明书连入pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司制备通用商业载体)，阳性克隆采用载体上的通用引物M13F和M13R(由武汉华大基因科技有限公司提供引物及测序)进行测序。

通过比较克隆的BrCLV3基因的cDNA序列和相应的基因组序列达到了BrCLV3基因的结构：该基因包含包3个外显子，2个内含子，起始外显子长64bp，中间外显子长47bp，末端外显子长174bp；第一内含子长86bp，第二内含子长182bp。因此，BrCLV3基因的阅读框长285bp，共编码94个氨基酸，该基因的序列如SEQ ID NO：1所示(1-3527bp)。该基因编码的蛋白质具有N端信号肽和C端保守的结构域CLE motif(图6)。

2.比较测序确定BrCLV3等位基因间的碱基变异

为确定白菜型油菜多室突变体ml4和野生型wt中BrCLV3等位基因间的碱基变异，分别对它们的BrCLV3基因区域进行测序，包括2,260bp的启动子区域、基因编码区和2,541bp的3’下游区。

比较测序用到3对PCR引物，它们的扩增产物可以覆盖整个目标区段，这些引物序列如下：

1F 5’-GTTGTTCTTTACTCTGGTAATGAGATAGGA-3’

1R 5’-TGTGACGCTTTAGGTAGTAGGCAG-3’

2F 5’-TTAATTAACACGGGATGTTTAGAACACGGGA-3’

2R 5’-TACCAACGTCTTCATCGCCCAACT-3’

3F 5’-GCAAAGTGGTGACGTGAGCGAAAT-3’

3R 5’-CCATGGATCTATTTAGGTACCCCAT-3’

扩增产物按照pMD18-T试剂盒(Takara，宝生物工程(大连)有限公司)的使用说明书连入pMD18-T载体，阳性克隆采用载体上的通用引物进行测序。为了保证测序的准确性，每个扩增片段测3-4个重复。得到的测序片段再使用Sequencher 3.1.2软件(Gene Codes Corporation,USA)分别进行序列拼接。

结果表明：白菜型油菜多室突变体ml4的BrCLV3基因组序列相对于wt具有3个单核苷酸突变和一个ATAT的缺失(图6中A)，其中有三个突变位于内含子或3’下游区，仅有一个C/T单核苷酸突变位于外显子，并导致了CLE motif中的第9位脯氨酸突变成亮氨酸。进一步将白菜型油菜多室突变体ml4与Chiifu(已公布全基因组序列的大白菜品种，两室角果表型)的参考基因组序列进行比较，发现该C/T单核苷酸突是多室和两室材料间唯一的共同碱基变异。在拟南芥中，CLE motif由12个保守的氨基酸组成，是实现CLV3多肽信号分子的功能域(Kondo et al.,2006,Science 313,845-848)。其中，CLE motif中的第9位脯氨酸对于內源CLV3多肽信号维持茎顶端分生组织的功能至关重要(Kondo et al.,2008,Science 313,845-848；Song et al.,2012,Molecular Plant 5,515-523)。因此，该脯氨酸突变可能造成BrCLV3功能的丧失，导致多室角果的形成。

实施例4：BrCLV3的功能验证

1.拟南芥clv3-2突变体的遗传互补测验

载体的构建和植物的遗传转化：设计分别带有PacI和AscI酶切接头的引物对(5’-TTAATTAAGGAGGTTTAAGGGATATGAGA-3’和5’-GGCGCGCCTACAAAATGGATTCGAGGACTC-3’)分别从wt和ml4的基因组DNA中扩增BrCLV3的基因编码区，并利用引物中引入的酶切位点将其连入到pMDC32表达载体(一种常用的商业载体，结构参见图7)。筛选的阳性克隆经测序验证序列正确后转入到农杆菌中，获得分别具有BrCLV3和Brclv3突变等位基因的表达载体，并记为35S:BrCLV3和35S:Brclv3。拟南芥的遗传转化采用花蕾真空浸蘸法(Clough and Bent,1998,Plant Journal 16,735-743)，转化受体为拟南芥clv3-2突变体(购自美国Arabidopsis Biological Resource Center)。

通过以上转基因实验，获得了35S:BrCLV3和35S:Brclv3两种载体转化拟南芥clv3-2突变体的阳性植株。其中，至少7个独立的35S:BrCLV3转基因株系能够将clv3-2突变体的多室角果恢复成两室角果(图8)；而35S:Brclv3的转基因家系不能恢复拟南芥clv3-2突变体的多室角果表型。

2.体外的多肽处理

在拟南芥中，CLV3多肽信号的功能主要由CLE motif完成。根据CLV3的CLE motif合成12氨基酸的多肽可以抑制根和茎的顶端分生组织的生长(Kondo et al.,2006,Science 313,845-848)。为了进一步明确BrCLV3中第9位脯氨酸/亮氨酸对该基因功能的影响，本发明合成了野生型的BrCLV3多肽(RTVPSGPDPLHH)和突变型多肽BrCLV3_Leu9(RTVPSGPDLLHH，第9位为亮氨酸)，纯度>95％(Biology Corporation of GenScript,Nanjin,China)。

多肽处理时，将拟南芥和油菜种子进行表面消毒，然后播种在添加不同多肽的0.5×MS无机盐琼脂培养基(Murashige and Skoog salt agar培养基上)，以不添加多肽的0.5×Murashige and Skoog salt agar培养基为对照。培养皿置于植物生长箱中进行垂直培养，生长7d，统计主根长度和根顶端分生组织的长度。结果发现，野生型的BrCLV3多肽能够显著抑制植株的主根和根顶端分生组织的生长，而突变型的多肽不能发挥这种抑制作用(表4和5)。

为了确定合成的多肽对茎顶端分生组织大小的影响，本发明采用Fiers等所发表液体培养法(Fiers et al.,2006,Plant Physiology 141,1284-1292)处理白菜型油菜和拟南芥，将表面消毒的种子放入装有6ml液体培养基的50ml离心管中培养，同时添加不同的多肽，以未添加多肽的液体培养基作为对照。将离心管放在光照培养室中震荡培养。培养10d后，在解剖镜下分离幼苗的茎顶端分生组织，用透明剂透明后在微分干涉显微镜下观察并照相，用Image J软件对SAM的面积进行测量。结果发现野生型的BrCLV3多肽能够显著抑制植株的茎顶端分生组织的生长，而突变型的多肽不能发挥这种抑制作用(图9)。

表4多肽处理对油菜和拟南芥幼苗根长(mm)的影响

说明:表中**代表0.01水平的差异显著性。

表5多肽处理对油菜和拟南芥幼苗根顶端分生组织长度(μm)的影响

说明:表中**代表0.01水平的差异显著性。

在本说明书中，多室突变体ml4，ml4多室突变体与白菜型油菜多室突变体ml4和白菜型油菜黄籽沙逊(B.rapa var.yellow sarson)多室突变体ml4和为同一个生物材料。白菜型油菜黄籽沙逊野生型wt，两室野生型wt和野生型wt为同一个生物材料。

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Claims

1.一种分离的控制白菜型油菜多室性状的基因BrCLV3，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:1中1-3527位所示。

2.一种分离的控制白菜型油菜多室性状的基因BrCLV3，它的编码蛋白质具有N端的信号肽和C端的保守结构域CLE motif，其蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

3.一种人工合成的控制白菜型油菜多室性状的多肽，其蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求1或2所述的基因在油菜的多室角果性状改良中的应用。

5.权利要求3所述的多肽在油菜的多室角果性状改良中的应用。