CN108347890B - 黄瓜植物中产量qtl的基因渗入 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在其基因组的3号染色体上包含产量QTL的栽培黄瓜植物，和涉及产生这类植物的方法，以及其用途。

Description

黄瓜植物中产量QTL的基因渗入
技术领域
本发明涉及黄瓜育种领域。本发明提供了定位于黄瓜基因组的3号染色体上的数量性状基因座(Quantitative Trait Locus(QTL))，其可在栽培黄瓜(原变种)(Cucumissativus var.sativus)中用于增加产量，例如腌制黄瓜(pickling cucumber)(例如美国腌制、欧洲腌制型)，切片黄瓜(slicing cucumber)(例如美国切片)，长黄瓜，短黄瓜，欧洲温室黄瓜，Beit-Alpha型黄瓜，东方网格型黄瓜(oriental trellis type cucumbers)(也以“burpless”出售)，亚洲黄瓜(其可以进一步细分为不同类型，例如印度杂色黄瓜(IndianMottled cucumber)、中国长黄瓜、韩国黄瓜和日本黄瓜类型，其中第一种属于印度黄瓜组，后三种属于东亚黄瓜组)。
本文将所述QTL称作QTL3.1。本发明还提供了这样的栽培黄瓜植物，其在含有QTL3.1的3号染色体上包含基因渗入片段，由此与缺少所述基因渗入的相同的栽培黄瓜相比，所述基因渗入片段使包含所述基因渗入的栽培黄瓜的果实产量显著增加。包含QTL3.1的基因渗入片段来自于黄瓜的野生近缘种。将黄瓜种质(accession)的野生近缘种的一株植物用于制备双单倍体群，其之后用于定位(map)以及用于将QTL渐渗到欧洲长黄瓜型中。可容易地将QTL从该型转移到任何其他栽培黄瓜型中，例如短黄瓜型，或转移到其他长黄瓜育种系或品种中。将包含所述基因渗入片段的种子以登录号NCIMB 42346保藏。
在一方面，本发明提供了在含有QTL3.1的3号染色体上包含基因渗入片段的栽培黄瓜植物，由此与缺少所述基因渗入的相同的栽培黄瓜相比，所述基因渗入片段使包含所述基因渗入的栽培黄瓜的果实产量显著增加。本文也提供一种或多种分子标记物(尤其是单核苷酸多态性或SNP)以及使用这些标记物的方法，所述标记物存在于基因渗入片段上，并且指示基因渗入片段的存在。本发明也同样提供了这样的种子、植物部分、细胞和/或组织，即在其基因组中包含QTL3.1，以及在其基因组中另外包含栽培黄瓜的基因组。应注意的是，术语“栽培黄瓜的基因组”不排除在整个基因中有其他基因渗入片段，例如在其他染色体上和/或针对其他性状。
本发明同样提供了在3号染色体上包含QTL3.1以及在其基因组中另外包含栽培黄瓜的3号染色体的种子、植物部分、细胞和/或组织。在一方面，所述植物、种子、植物部分、细胞和/或组织包含来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段，由此所述基因渗入片段包含QTL3.1，该QTL在物理上位于3号染色体的起始于21.5Mb并终止于27.23Mb的区域中。因此，在一方面，3号染色体的起始于21.5Mb且终止于27.23Mb的区域的全部或部分来自于黄瓜的野生近缘种并且包含正产量(positive yield)QTL(QTL3.1或其变体)。在一方面，3号染色体的其他区域(即从3号染色体的0Mb至21.5Mb和/或从3号染色体的27.23Mb至末端)包含栽培黄瓜染色体区域或由栽培黄瓜染色体区域组成。
在一方面，本发明提供了在3号染色体上包含纯合形式或杂合形式的来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段的栽培黄瓜(原变种)植物，其中所述基因渗入片段包含位于SEQID NO:1(或SEQ ID NO:1的变体)的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_01和SEQ IDNO:27(或SEQ ID NO:1的变体)的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_27之间的数量性状基因座(QTL)，所述QTL赋予了黄瓜果实产量的增加。在一方面，所述QTL位于3号染色体的碱基21,507,892(SNP_01)与碱基27,233,985(SNP_27)之间。
在一方面，QTL3.1(即包含QTL的基因渗入片段)以杂合形式存在于栽培的黄瓜植物、细胞或组织中，特别是在长黄瓜中。在另一方面，QTL3.1(即包含QTL的基因渗入片段)以纯合形式存在于栽培的黄瓜植物、细胞或组织中，特别是在长黄瓜中。在具体的方面，所述栽培的黄瓜植物为F1杂种，尤其是通过杂交两种近交亲本系而产生的F1杂种，因此至少一种亲本株系包含纯合形式的QTL3.1(即包含QTL的基因渗入片段)。在具体的方面，所述栽培的黄瓜在黄瓜基因组的3号染色体上不包含任何其他影响产量的的基因渗入片段。在另一方面，在3号染色体上可有其他基因渗入片段，例如在染色体的不同区域中。
背景技术
栽培黄瓜(黄瓜(原变种)(Cucumis sativus var.sativus L.))是全世界重要的蔬菜作物。它属于葫芦科。它被认为源自东南亚，具有小且苦的果实的野生祖先，例如西南野黄瓜(Cucumis sativus var.hardwickii)。
栽培黄瓜基因组具有7对染色体(n＝7)和尺寸为约367Mb(兆碱基)的单倍体基因组，估计总共约26,682个基因。黄瓜基因组是被测序的第一个植物基因组(Huang etal.2009,Nature Genetics,Volume 41,Number 12,p1275-1283和http://www.icugi.org/ cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/)。
在过去几十年，栽培黄瓜的产量没有显著提高。2002年Shetty和Wehner(CropSci.42:2174-2183)在美国北卡罗来纳州的田间条件下，针对果实品质和果实产量，对USDA黄瓜种质库进行筛选，并且建议在他们的研究中所鉴定的高产量栽培种可用于开发高产栽培种。
由Shetty和Wehner在2002年鉴定的种质中(见上文)，WO2009/082222使用TurkishBeit-Alpha地方品种PI 169383来鉴定在PI 169383的连锁群3和/或4上，用于采收阶段黄瓜的果实重量的QTL，并且将该种质的种子以登录号NCIMB 41532保藏。该供体是黄瓜的Turkish Beit-Alpha地方品种(其不是黄瓜的野生近缘种)并且不包含本发明的SNP标记物。另外，本申请描述了包含整个3号染色体取代(即整个3号染色体来自供体PI 169383)的黄瓜植物。
Wei et al.2014(BMC Genomics 15:1158,p1-10)公开了在从中国黄瓜近交系(CC3)和NC76之间的杂交得到的群体中不成熟和成熟的果实长度以及不成熟的果实重量的定位。NC76是从来自阿富汗的黄瓜(原变种)的地方品种(PI246930)(其不是黄瓜的野生近缘种)开发的，并且具有短果实(7-10cm)。通过将短果实的NC76与长果实的CC3杂交，他们在分离的F2群中定位了(不成熟和成熟的)果实长度和不成熟的果实重量的QTL，如另外的文件6所示。他们发现了在连锁群3(LG3)上不成熟的果实长度的两个QTL(fl3.1和fl3.2)、不成熟的果实重量的两个QTL(fw3.1和fw3.2)，以及成熟的果实长度的一个QTL(mfl3.1)，此外还有在LG1和LG6中发现了不成熟的果实长度的另一个QTL(LG1的fl1.1和LG6的fl6.1)，但是他们未公开关于总果实产量的任何信息。
Fazio et al.2003(Theor Appl Genet 107:864-874)在遗传上定位了许多性状，包括在三次采收时每株植物的累积果实以及形态性状例如小叶(‘ll’)。它们的连锁群6似乎对应于3号物理染色体。他们将一个被称为fpl6.1的QTL(其对三次采收时每株植物的累积果实数目(在三次采收点测量每株植物的果实数目)具有积极作用)定位于位置40.8cM处的标记物OP-AG1-2。它仅在一个位置上检测到。他们还将另一个被称为nfp6.2的QTL(其对每株植物的果实数目具有积极作用)定位于位置38.6cM处的标记物AK5-SCAR。该QTL在一个位置上检测到并且在全部三次采收中均在该位置上检测到。这些QTL在物理上位于3号染色体的下半部(约3.0Mb)，而本发明的QTL位于3号染色体的上半部，在3号染色体的21.50Mb和27.23Mb之间。
然而，仍然需要鉴定黄瓜果实产量的QTL以能够增加现代黄瓜品种的果实产量。
一般定义
不定冠词“一”或“一个”不排除存在多于一个所述元素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个所述元素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。
本文使用的术语“植物”包括完整的植物或其任何部分或衍生物，例如植物器官(如采收的或未采收的储存器官、块茎、果实、叶、种子等)、植物细胞、植物原生质体、可由其再生出完整植物的植物细胞或组织培养物、植物愈伤组织、植物细胞团和植物中完整的植物细胞，或植物的部分，例如胚、花粉、胚珠、子房、果实(例如采收的组织或器官，如采收的黄瓜果实或其部分)、花、叶、种子、块茎、球茎、无性繁殖的植物、根、根状茎(root-stocks)、茎、根尖等。还包括任何发育阶段，例如未成熟和成熟的幼苗等。当提及“植物的种子”时，这些指的是在自体授精或异体受精后可由其长出的植物的种子或植物中产生的种子。
“植物品种”是在已知最低等级的相同植物分类群中的一组植物，所述植物品种可以是基于源自某一特定基因型或基因型组合的特征的表达来定义(无论是否满足《植物育种者权利》(plant breeder's rights)中的认可条件)，可以通过那些特征中的至少一种的表达而将所述植物品种与任何其他组的植物区分开，也可将所述植物品种看作一个实体，因为其可被繁殖而无任何改变。因此，如果一组植物的特征都在于存在1个或2个基因座或基因(或者由这些基因座或基因产生的表型特征)，但是它们又在其它基因座或基因上可以彼此显著不同，那么即使它们是同一类的，也不可以使用术语“植物品种”来表述该组植物。
“F1、F2、F3等”是指两个亲本植物或亲本株系之间杂交后的连续相关世代。由两个植物或株系杂交产生的种子长出的植物称为F1代。F1植物自交产生F2代等。
“F1杂种”植物(或F1杂种种子)是由两个近交的亲本株系杂交得到的世代。因此，F1杂种种子是由其长出F1杂种植物的种子。由于杂种优势，F1杂种更有活力(vigorous)且具有更高的产量。近交株系(inbredline)在基因组中大多数基因座处上是基本纯合的。
“植物株系”或“育种株系”是指植物及其后代。本文使用的术语“近交株系”是指已经被反复自交且几乎为纯合的植物株系。因此“近交株系”或“亲本株系”是指已经历过几代(例如至少5、6、7或更多代)近交的植物，产生具有高度均一性的植物株系。
术语“等位基因”意指特定基因座上基因的一种或多种替代形式中的任一种，所有这些等位基因均与特定基因座处的一种性状(trait)或特征相关。在生物体的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或单个基因座(多个基因座)。一个等位基因存在于一对同源染色体中的每条染色体上。二倍体植物物种可以在特定基因座上包含大量不同的等位基因。这些可以是所述基因的相同等位基因(纯合的)或两个不同的等位基因(杂合的)。因此，例如，在本文中可提及产量基因座QTL3.1的“产量等位基因”。
术语“基因”意指包含区域(转录区)和可操作地连接的调控区域(例如启动子)的(基因组)DNA序列，所述区域在细胞中被转录为信使RNA分子(mRNA)。因此，基因的不同等位基因是基因的不同替代形式，其可以是这样的形式：例如在基因组DNA序列(例如启动子序列、外显子序列、内含子序列等)的一个或多个核苷酸、mRNA和/或所编码的蛋白的氨基酸序列中的差异。
术语“基因座”(多个基因座)意指染色体上的存在例如QTL、基因或遗传标记物的一个或多个具体位置或位点。因此，产量基因座(产量增加的基因座)为黄瓜基因组中的位置，其中存在有QTL3.1。在栽培黄瓜中，所述QTL分别存在于3号染色体中(使用Huang etal.2009,Nature Genetics,Volume 41,Number 12,p1275-1283以及http:// www.icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/的染色体定位)，即将它们从黄瓜的野生近缘种渐渗到栽培黄瓜基因组中(即到3号染色体上)。
“数量性状基因座”或“QTL”是编码影响连续分布(数量)表型的表现度的一个或多个等位基因的染色体基因座。在本文中，将赋予产量的数量性状基因座(或“产量QTL”)命名为QTL3.1。
“黄瓜基因组”和“黄瓜基因组上的物理位置”和“3号染色体”是指栽培黄瓜的物理基因组(万维网icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/)、物理染色体和染色体上的物理位置。因此，例如SNP_01位于物理定位于3号染色体的核苷酸21,507,892处的核苷酸(或“碱基”)处，其物理尺寸为0至39.47Mb(即39,474,669个碱基)。
在同一染色体上的基因座之间(例如分子标记物之间和/或表型标记物之间)的“物理距离”为实际物理距离，其用碱基或碱基对(bp)，千碱基或千碱基对(kb)或者兆碱基或兆碱基对(Mb)表示。
通过交叉频率或重组频率(RF)测量在同一染色体上的基因座之间(例如分子标记物之间和/或表型标记物之间)的“遗传距离”，并且用厘摩(cM)表示。1cM相当于1％的重组频率。如果没有发现重组体，则RF为零并且所述基因座在物理上非常紧密地在一起或它们是相同的。两个基因座的相距越远，RF越高。
“基因渗入片段”或“基因渗入区段”或“基因渗入区域”是指已通过杂交或传统育种技术(例如回交)被引入相同或近缘物种的另一个植株中的染色体片段(或染色体部分或区域)，即基因渗入片段是用动词“渐渗”表示的育种方法(例如回交)的结果。在黄瓜中，野生或原始黄瓜种质(例如，地方品种)或栽培黄瓜的野生近缘种可用于将野生基因组的片段渐渗到栽培黄瓜(黄瓜(原变种))的基因组中。因此这类栽培黄瓜植物具有“栽培黄瓜(原变种)的基因组”，但在基因组中包含了野生或原始黄瓜的片段或黄瓜野生近缘种的片段，例如近缘野生黄瓜(例如西南野黄瓜、锡金黄瓜(Cucumis sativus var.sikkimensis)、西双版纳黄瓜(Cucumis sativus var.xishuangbannesis)，或另一种野生黄瓜或黄瓜的野生近缘种)基因组的基因渗入片段。因此，例如，本文提供的栽培黄瓜包含栽培黄瓜基因组，以及在该基因组中包含栽培黄瓜的3号染色体上的一个基因渗入片段，与缺少基因渗入片段(并且具有栽培黄瓜的3号染色体，但没有基因渗入片段)的栽培黄瓜基因组相比，所述基因渗入片段赋予增加的产量。应理解术语“基因渗入片段”从不包括整条染色体，而仅包括染色体的一部分。所述基因渗入片段可以是大的，例如甚至是染色体的四分之三或一半，但优选地较小，例如约15Mb或更小，例如约10Mb或更小，约9Mb或更小，约8Mb或更小，约7Mb或更小，约6Mb或更小，约5Mb或更小，约4Mb或更小，约3Mb或更小，约2.5Mb或2Mb或更小，约1Mb(等于1,000,000个碱基对)或更小，或约0.5Mb(等于500,000个碱基对)或更小，例如约200,000bp(等于200个千碱基对)或更小，约100,000bp(100kb)或更小，约50,000bp(50kb)或更小，约25,000bp(25kb)或更小。
“栽培黄瓜”(cultivated cucumber或domesticated cucumber)是指黄瓜(原变种)即变种、育种株系或栽培种的植物，其由人类栽培并且具有良好的农学特征，尤其是产生具有优良尺寸、品质和均一性的可食用且可市售的果实；这些植物不是“野生黄瓜”或“原始黄瓜”植物，所述“野生黄瓜”或“原始黄瓜”植物与栽培植物相比通常具有差得多的产量和差得多的农学特征以及遗传上、在其生理和/或形态特征上较低的均一性(uniform)。“野生黄瓜”的“野生植物”包括例如物种的生态型、地方品种或野生种质或野生近缘种。通过基因组中非常少量的SNP(小于2,000,000个SNP)和INDEL(小于5bp的插入/缺失片段；小于150,000个INDEL)，及其非常低的核苷酸变异(nucleotide diversity)(等于或小于2.3x10-3π)，也可以将栽培黄瓜植物(株系或变种)与野生或原始黄瓜种质区分开，如记载于Qiet al,Nature Genetics December 2013,Vol 45,No.12,pages 1510–1518的表1中。SNP数量、INDEL数量及核苷酸变异可以如本文所记载的(尤其是在“在线方法”部分中所记载的)来确定。
“印度黄瓜组”是指来自印度的野生黄瓜或黄瓜的野生近缘种，其在基因组中具有大量的SNP(大于3,000,000个SNP)和INDEL(小于5bp的插入/缺失片段；大于200,000个INDEL)，以及高的核苷酸多样性(大于3.0x 10-3π或甚至大于4.0x 10-3π)。
“欧亚黄瓜组”是指来自亚洲中部或西部、欧洲及美国的栽培黄瓜，其在基因组中具有少量的SNP(小于2,000,000个SNP，或小于1,500,000个SNP)和INDEL(小于5bp的插入/缺失片段；小于150,000个INDEL)，以及低的核苷酸多样性(等于或小于2.3x 10-3π，优选地小于2.0x 10-3π)。
“东亚黄瓜组”是指来自东亚(例如中国、韩国和日本)的栽培黄瓜，其在基因组中具有少量的SNP(小于2,000,000个SNP，或小于1,500,000个SNP)和INDEL(小于5bp的插入/缺失片段；小于150,000个INDEL，优选小于100,000)，以及低的核苷酸多样性(等于或小于2.3x 10-3π，优选地小于2.0x 10-3π或甚至小于1.5x 10-3π)。
“西双版纳黄瓜组”是指来自中国西双版纳地区的黄瓜，其在基因组中具有少量的SNP(小于2,000,000个SNP，或小于1,500,000个SNP或甚至小于100,000个SNP)和INDEL(小于5bp的插入/缺失片段；小于150,000个INDEL，优选小于100,000)，以及低的核苷酸多样性(等于或小于2.3x 10-3π，优选小于2.0x 10-3π或甚至小于1.5x 10-3π)。
“野生黄瓜”或“原始黄瓜”是指黄瓜(原变种)，其通常具有比栽培植物差得多的产量和差得多的农学特征以及遗传上、在其生理和/或形态特征上较低的均一性。野生植物包括例如物种的生态型、地方品种或野生种质或野生近缘种。
“黄瓜的野生近缘种”是指西南野黄瓜、锡金黄瓜、西双版纳黄瓜。
“地方品种”是指在局部地理区域中开发的黄瓜(原变种)的原始栽培种，其通常在它们的基因组中显示出高度遗传变异，并且在地方品种中表现出高度形态和/或生理变异(例如，果实尺寸的巨大变异等)，即其均一性明显低于栽培黄瓜。因此，本文中的地方品种包括于“野生品种”组中，其与“栽培黄瓜”不同。
“均一性”或“均一”涉及植物株系或品种的遗传和表型特征。由于近交株系是通过几代近交而产生，因此其在遗传上是高度均一的。同样地，由这种近交株系产生的F1杂种在其基因型和表型的特征和表现上也是高度均一的。
术语“产量等位基因”是指存在于从黄瓜的野生近缘种渐渗到栽培黄瓜中的产量基因座QTL3.1上(在栽培黄瓜(原变种)的3号染色体上)的等位基因。因此，术语“产量等位基因”也涵盖可从其他黄瓜属(Cucumis)种质获得的产量等位基因。当一个或两个产量等位基因存在于基因组中的基因座处(即以杂合或纯合形式)时，与缺少QTL的遗传对照相比，所述植物株系或品种产生显著更高的果实产量。在缺少基因渗入片段的栽培黄瓜植物中，存在于3号染色体上相同基因座处的黄瓜(原变种)等位基因在本文中被称为“野生型”等位基因(wt)。由于产量QTL是显性的，因此wt/wt植物显示出正常产量，而QTL3.1/wt植物及QTL3.1/QTL3.1植物为具有由产量等位基因所赋予的提高的产量表型的植物。本文所提供的SNP标记物的基因型也指示野生型或者指示纯合或杂合形式QTL。例如指示QTL3.1的SNP_01的基因型为‘TC’(QTL3.1/wt)或‘TT’(QTL3.1/QTL3.1)，而指示野生型(即栽培黄瓜)的基因型为‘CC’(wt/wt)。
如果可以使用传统的育种技术可将赋予性状(例如产量)的遗传元件、基因渗入片段、或基因或等位基因从存在其的植物或种子中转移至不存在其的另一植物或种子(例如株系或品种)中，并且除增加所述遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因所赋予的性状之外不会导致受体植物的表型改变，则称所述遗传元件、基因渗入片段、或基因或等位基因为“可获自”或可以“获自”或“可源自”或可以“源自”或“存在于”或“出现于”植物或种子或组织或细胞。所述术语可互换使用，因此可将所述遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因转移至缺少所述性状的任何其他遗传背景中。不仅可使用保藏的并包含所述遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因的种子，也可使用经选择以保留所述遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因的这些种子的子代/后代，其被涵盖于本文中，例如从保藏的种子或从其后代开发的商业品种。使用本领域中已知的一种或多种技术(例如表型测定、全基因组测序、分子标记物分析、性状定位(mapping)、染色体涂染、等位性试验等)或这些技术的组合，本领域技术人员能够确定植物(或植物的基因组DNA、细胞或组织)是否包含与可从保藏的种子获得的遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因相同的遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因。
“变体”或“直系同源”序列或“变体QTL3.1”是指产量QTL(QTL3.1)，或包含所述QTL的基因渗入片段，其源自除存在于NCIMB42346中的QTL3.1以外的不同黄瓜植物的野生近缘种，但是其变体包含连锁到QTL3.1的一种或多种SNP，并且其中所述变体基因组序列与包含所述SNP的SEQ ID NO:(SEQ ID NO:1-27中任一种)具有基本序列同一性，即至少85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性或更多。因此，当在本文中提及具体基因组序列(选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:27)中某一SNP基因型时，其也涵盖所述基因组序列的变体中的所述SNP基因型，即在与所提及的序列(选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:27)具有至少85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性或更多的基因组序列中的所述SNP基因型。因此，在一方面，本文对SEQ ID NO:1至27中任一个的任何提及也涵盖SEQ ID NO:1至27中任一个的变体，所述变体与所述序列具有至少85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性或更多。
“产量”或“果实产量”或“平均产量”是指每株植物的平均果实数目(FrPP)和/或每株植物的平均果实重量(克)(GrPP)。测定在相同条件下生长的每个植物株系、杂种或品种(例如具有所述QTL的株系、杂种或品种以及不具有所述QTL的遗传对照)的“产量”或“果实产量”或“平均产量”，并计算每个株系、杂种或品种的平均FrPP和/或GrPP。根据黄瓜的类型，以不同方式来测量果实产量。因此，例如，在某一时期内连续产生果实的类型，例如生鲜市场型(例如长黄瓜型如欧洲温室黄瓜，小型或中型)，当果实达到可市售尺寸时采收，并且在特定的时期(称为“采收期”)内进行采收(例如，采收期在第一批果实达到可市售尺寸时开始，并且长度可以为至少10、11、12或更多周)。因此，例如，每天测量平均FrPP和/或GrPP，并在采收期结束时将所有天数的累加以计算每个株系或品种的累积FrPP和/或GrPP(还参见实施例)。“可市售尺寸”指长度和重量均足以售卖的果实。因此，可市售尺寸的果实是在果实上市和销售的最佳或接近最佳的时间点采收。对于长黄瓜型，例如欧洲温室黄瓜，当果实长度为至少约26cm或27cm并且最小重量为250克时达到可市售尺寸。对于仅在单一时间点采收的黄瓜型，例如腌制黄瓜，“产量”或“果实产量”或“平均产量”指在单一采收时间点时每株植物直径等于或大于1.5cm的果实的平均数目(FrPP)和/或每株植物直径等于或大于1.5cm的果实的平均果实重量(克)(GrPP)。所述单一采收时间点与种植者实践一致，并且选择该时间点以使直径为1.5cm至5.0cm的果实数目最多。根据所需果实尺寸，当约5％、约10％、约15％或约20％的果实的尺寸过大(即果实直径为5.0cm或更大)时，通常达到所述时间点。采收是通过手工或机械采收。因此，在一方面，采收每株植物的所有果实，并且仅对直径为至少1.5cm的果实计数和/或称重(即计数和/或称重直径为至少1.5cm的所有果实，包括尺寸过大的果实)。
“增加的果实产量”或“显著增加的果实产量”是指这样的栽培黄瓜植物株系、杂种或品种，其在3号染色体上包含基因渗入片段，包含QTL3.1，当在相同环境条件下于产量实验中生长时，与在3号染色体上缺少基因渗入片段的遗传对照植物相比，其(因为所述QTL)具有统计学上显著更高的平均果实数量/植物(FrPP)和/或显著更高的平均果实重量/植物(GrPP)。优选地，试验是以以下方式进行：用在3号染色体上包含基因渗入片段和在3号染色体上缺少基因渗入片段(即遗传对照)的足够植物(例如至少8、9、10、15、20、30、40或更多株植物/株系)进行数个重复(2、3或优选3、4、5、6、7、8或更多)。
“遗传对照”为这样的黄瓜株系、品种或杂种，其除了在3号染色体上缺少基因渗入(即3号染色体是“野生型的”)以外，具有与在3号染色体上包含基因渗入的黄瓜植物相同或非常类似的栽培基因组，即栽培黄瓜基因组。例如，以登录号NCIMB 42346保藏的种子是在3号染色体上包含QTL3.1的(长黄瓜型的)基因渗入株系与(长黄瓜型的)良种黄瓜繁育株系(elite cucumber breeding line)之间产生的F1测试杂种的种子，而以NCIMB 42345保藏的遗传对照是所述基因渗入株系的轮回亲本(缺少QTL3.1)与相同的良种黄瓜繁育株系的种子。
术语“标记物测定法”是指这样的分子标记物测定法，即其可用于测试在黄瓜(原变种)3号染色体上是否存在来自黄瓜野生近缘种的基因渗入，所述基因渗入片段包含产量QTL(QTL3.1)(或黄瓜野生近缘种在基因组中是否包含QTL3.1)，这通过下述方法进行：确定任意一种或多种连锁到QTL3.1的标记物的基因型，例如选自SNP_01至SNP_27的一种或多种SNP标记物的基因型，和/或SNP标记物SNP_01至SNP_27之间的任意黄瓜野生近缘种基因组特异性的标记物的基因型，和/或在任意这些标记物的7cM内或5cM、3cM、2cM、1cM内、和/或在任意这些标记物的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的任意黄瓜野生近缘种基因组特异性的标记物的基因型。两个标记物“之间”的标记物在物理上位于染色体上所述标记物之间。
本文提供的SNP标记物(即SNP_01至SNP_27)以给定的次序定位在基因渗入片段上。“连续的”标记物指以相同的连续次序的标记物，从而例如两个连续标记物可以是SNP_01和SNP_02；SNP_02和SNP_03；SNP_03和SNP_04等，三个连续标记物可以是SNP_01和SNP_02和SNP_03；SNP_02和SNP_03和SNP_04等。
本文中“平均值”(average或mean)是指算术平均值，并且这两个术语可以互换使用。因此，术语“平均值”是指数个测量值的算术平均值。本领域技术人员应理解植物株系或品种的表型在一定程度上依赖于生长条件，因此优选地在随机实验设计中(采用数个重复以及在相同实验中于同一条件下生长的适合的对照植物)，对至少8、9、10、15、20、30、40、50或更多株植物(或植物部分)的算术平均值进行测量。“统计学上显著的”或“统计学上显著地”差异或“显著地”差异是指这样的植物株系或品种的特征，即当与适合的对照(例如本文中遗传对照)比较时，所述植物株系或品种在该特征中表现出与对照(的平均值)的统计学上显著性差异(例如，使用ANOVA时，p值小于0.05，p<0.05)。
“重组的染色体”是指通过同源染色体之间的交换而产生的具有新的遗传结构(makeup)的染色体，例如“重组的3号染色体”，即在任一亲本植物中都不存在的并且通过3号染色体对的同源染色体之间罕见的双交换事件产生的3号染色体。在本文中，例如，提供了重组的黄瓜3号染色体，其包含来自黄瓜野生近缘种的基因渗入。
在本文中，术语“传统育种技术”包含全部都是育种者已知的杂交、回交、自交、选择、双单倍体产生、胚胎拯救、原生质融合、标记物辅助选择、突变育种等(即除遗传修饰/转化/转基因方法以外的方法)，通过这些方法，例如，可获得、鉴定和/或转移重组的3号染色体。
“回交”是指一种育种方法，通过其可将(单一)性状(例如产量QTL)从劣等遗传背景(例如野生黄瓜或黄瓜的野生近缘种；也称为“供体”)转移到优良的遗传背景(也称为“轮回亲本”)，例如栽培黄瓜中。将杂交的子代(例如通过杂交野生黄瓜或黄瓜的野生近缘种与栽培黄瓜获得的F1植物；或由自交F1获得的F2植物或F3植物等)“回交”到具有优良遗传背景的亲本中，例如到栽培亲本中。在反复回交后，劣等遗传背景的性状将被掺入到优良遗传背景中。
“标记物辅助选择”或“MAS”是一种利用存在的分子标记物(其被遗传连锁到特定基因座或特定染色体区域(例如基因渗入片段))来选择存在特定基因座或区域(基因渗入片段)的植物的方法。例如，遗传连锁到产量QTL的分子标记物可用于检测和/或选择在3号染色体上包含产量QTL的黄瓜植物。分子标记物与基因座的遗传连锁越近(例如，约7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或更小)，则所述标记物通过减数分裂重组而被从基因座中解离的可能性就越小。同样地，两个标记物彼此连锁得越近(例如7cM或5cM、4cM、3cM、2cM、1cM或更小)，则所述两个标记物彼此分离的可能性就越小(并且它们将作为一个单元被共分离的可能性就越大)。
另一个标记物的“7cM内或5cM、3cM、2cM或1cM内”的标记物是指在遗传上定位于所述标记物侧翼(即所述标记物的任意一侧)的7cM内或5cM、3cM、2cM或1cM区域内的标记物。类似地，另一个标记物的5Mb、3Mb、2.5Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.4Mb、0.3Mb、0.2Mb、0.1Mb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的标记物是指在物理上定位于所述标记物侧翼(即所述标记物的任意一侧)的基因组DNA区域的5Mb、3Mb、2.5Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.4Mb、0.3Mb、0.2Mb、0.1Mb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内。
“LOD评分”(优势对数(以10为底))是指通常用于动物和植物种群中的连锁分析的统计学检验。所述LOD评分比较了如果两个基因座(分子标记物基因座和/或表型形状基因座)的确连锁时，获得的检验数据的可能性与纯粹偶然观察到相同数据的可能性。正的LOD评分支持连锁的存在，并且大于3.0的LOD评分被认为是连锁的证据。+3的LOD评分表明所观察到的连锁并非偶然出现的可能性为1000比1。
“营养繁殖”、“营养生殖”、“克隆繁殖”在本文中可互换使用，意指取植物部分并允许该植物部分至少形成根的方法，其中植物部分被例如定义为或源自(例如通过扦插)叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、细胞、原生质体、分生细胞、根、根尖、雌蕊、花药、花、芽尖(shoottip)、芽、茎、果实、叶柄等。在完整植物是通过营养繁殖再生时，其也被称为营养繁殖。在一方面，本文包括通过嫁接(例如接穗到根茎上)进行的繁殖。
“细胞培养物”或“组织培养物”是指植物细胞或组织的体外培养物。
“再生”是指从细胞培养物或组织培养物或营养繁殖发育出植物。
“非繁殖细胞”指无法再生为完整植物的细胞。
“转基因”或“嵌合基因”是指包含DNA序列的遗传基因座，例如重组基因，其已通过转化(例如农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化)被引入到植物的基因组中。将包含被稳定整合至其基因组中的转基因的植物称为“转基因植物”。
“分离的核酸序列”或“分离的DNA”是指这样的核酸序列，即其不再处于从中分离出其的天然环境中，例如在细菌宿主细胞中或在植物核中或质体基因组中的核酸序列。当本文中提及“序列”时，应理解为提及具有所述序列的分子，例如核酸分子。
“宿主细胞”或“重组的宿主细胞”或“转化的细胞”是这样的术语，即其指由于至少一个已经被引入到所述细胞的核酸分子而产生的新个体细胞(或生物体)。所述宿主细胞优选地为植物细胞或细菌细胞。所述宿主细胞可包含作为染色体外(附加型)复制分子的核酸，或包含整合至宿主细胞的核或质体基因组中的核酸，或作为引入的染色体(例如微型染色体)的核酸。
可通过使用全局或局部比对算法进行的两个肽或两个核苷酸序列的比对来确定“序列同一性”或“序列相似性”。然后，当通过例如程序GAP或BESTFIT或Emboss程序“Needle”(使用默认参数，参见下文)对序列进行最佳比对时，这些序列共有至少某一最小的序列同一性百分比(如下文进一步定义的)时，所述序列可以被称作“基本相同”或“基本相似”。这些程序使用Needleman和Wunsch全局比对算法来在全长上比对两个序列，最大化匹配数并最小化空位数。通常，使用默认参数，其中空位生成(gap creation)罚分＝10，空位延伸(gap extension)罚分＝0.5(对于核苷酸和蛋白质比对均如此)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是DNAFULL，而对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,10915-10919)。例如可以使用计算机程序(例如可在万维网上http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/获得的EMBOSS)来确定用于百分比序列同一性的序列比对和评分。或者，可以通过搜索数据库(例如FASTA、BLAST等)来确定序列相似性或同一性，但是应检索命中并进行成对比对以比较序列同一性。如果百分比序列同一性为至少85％、90％、95％、98％、99％或更多(例如至少99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或更多)(如通过使用默认参数(即，空位生成罚分＝10，空位延伸罚分＝0.5)，对于核酸，使用评分矩阵DNAFULL，对于蛋白质，使用评分矩阵Blosum62的Emboss“Needle”所确定的)，则两个蛋白质或两个蛋白质结构域或两个核酸序列具有“基本序列同一性”。
当提到这样的核酸序列(例如DNA或基因组DNA)时，即所述核酸序列与参考序列具有“基本序列同一性”或与参考序列具有至少80％，例如，至少85％、90％、95％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.9％核酸序列同一性的序列同一性，则在一个实施方案中，所述核苷酸序列被认为是与给定的核苷酸序列基本上相同的，并且可以使用严格杂交条件进行鉴定。在另一个实施方案中，与给定的核苷酸序列相比，所述核酸系列包含一个或多个突变体，但是仍然可以使用严格杂交条件进行鉴定。
“严格杂交条件”可用于鉴定核甘酸序列，其与给定的核苷酸序列基本相同。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下是不同的。通常，所选择的严格条件为在确定的离子强度和pH下，低于具体序列的热熔解温度(Tm)约5℃。所述Tm为50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。通常选择其中在pH 7下盐浓度为约0.02摩尔且温度为至少60℃的严格条件。降低盐浓度和/或增加温度均会提高严格度。RNA-DNA杂交(使用例如100nt探针的RNA印迹法)的严格条件为，例如包括在63℃下于0.2X SSC中至少一次持续20分钟的洗涤的那些，或等同条件。DNA-DNA杂交(使用例如100nt探针的DNA印迹法)的严格条件为，例如包括在至少50℃(通常约55℃)温度下于0.2X SSC中至少一次(通常2次)持续20分钟的洗涤的那些，或等同条件。也可参见Sambrook et al.(1989)和Sambrook and Russell(2001)。
“精细定位”(fine-mapping)指这样的方法，即通过该方法能够更准确地(缩小范围)确定QTL的位置，并且通过该方法减小包含所述QTL的基因渗入片段的尺寸。例如，可制备所述QTL的近等基因系(QTL-NIL)，其在轮回亲本的另外的均一遗传背景中包含基因渗入片段的不同、重叠的片段。这种株系之后可用于定位所述QTL所位于的片段，以及用于鉴定具有包含所述QTL的更短的基因渗入片段的株系。
具体实施方式
本发明涉及包含由黄瓜野生近缘种渐渗的在3号染色体上的产量QTL的栽培黄瓜(原变种)植物。具体而言，增加的产量是由栽培黄瓜3号染色体上的基因渗入片段(包含QTL3.1或其变体)所赋予的，其中所述基因渗入片段是来自黄瓜野生近缘种。
当本文中提及在具有产量QTL的3号染色体上的基因渗入片段时，其包括不同尺寸的基因渗入片段，例如存在于NCIMB 42346中包含所有SNP标记物(对于3号染色体上的片段，SNP_01至SNP_27，或在这些之间的任意标记物)的片段，以及较小的基因渗入片段(包含少于27个SNP标记物，例如仅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个SNP标记物)，但是当在栽培黄瓜基因组中所述基因渗入片段为杂合或纯合形式时，其中所述片段仍然大到足以赋予显著提高的产量(与遗传对照相比)。换言之，所述片段保留QTL3.1或其变体，即当栽培黄瓜基因组中所述基因渗入片段为杂合或纯合形式时，所述片段仍赋予显著提高的产量(与对照相比，例如遗传对照)。
因此，在一方面，本发明提供了包含来自黄瓜的野生近缘种的基因渗入片段的栽培黄瓜植物，其中所述基因渗入片段包含QTL3.1或其变体，并且其中所述基因渗入片段包含起始于3号染色体的核苷酸(或碱基)21,507,892处并终止于3号染色体的核苷酸(或碱基)27,233,985处的区域的全部或部分。换言之，在一方面，起始于3号染色体的核苷酸(或碱基)21,507,892处并终止于3号染色体的核苷酸(或碱基)27,233,985处的区域的全部或部分来自黄瓜的野生近缘种并且包含QTL3.1或其变体。通过例如精细定位可鉴定哪个子区域包含QTL3.1的。因此，例如，如果发现QTL3.1在SNP_01和SNP_10之间，则本发明的植物仅需要包含起始于3号染色体的核苷酸21,507,892(SNP_01)处并终止于3号染色体的核苷酸23,706,444(SNP_10)处的基因渗入区域。
在一方面，QTL3.1(或其变体)位于SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:1的变体序列)中的标记物SNP_01与SEQ ID NO:27(或SEQ ID NO:27的变体序列)中的标记物SNP_27之间。在另一方面，QTL3.1(或其变体)位于SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:1的变体序列)中的标记物SNP_01与SEQ ID NO:10(或SEQ ID NO:10的变体序列)中的标记物SNP_10之间。在另一方面，QTL3.1(或其变体)位于SEQ ID NO:10(或SEQ ID NO:10的变体序列)中的标记物SNP_10与SEQ ID NO:20(或SEQ ID NO:20的变体序列)中的标记物SNP_20之间。在另一方面，QTL3.1(或其变体)位于SEQ ID NO:20(或SEQ ID NO:20的变体序列)中的标记物SNP_20与SEQ IDNO:27(或SEQ ID NO:27的变体序列)中的标记物SNP_27之间。在另一方面，QTL3.1(或其变体)位于SEQ ID NO:06(或SEQ ID NO:06的变体序列)中的标记物SNP_06与SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:23的变体序列)中的标记物SNP_23之间。
在另一方面，本发明的基因渗入片段(包含QTL3.1或其变体)是这样的片段，其包含起始于3号染色体的核苷酸(或碱基)21,507,892处并终止于3号染色体的核苷酸(或碱基)27,233,985处的区域的较小片段(部分)，例如所具有的尺寸为如5.0Mb、4.0Mb、3.0Mb、2.5Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、100kb、50kb、35kb、30kb、20kb或更小并且包含QTL或其变体。在一方面，所述部分的尺寸为至少5kb、10kb、20kb或更大。
在一方面，本发明的栽培黄瓜植物包含来自黄瓜的野生近缘种的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含QTL3.1或其变体，其中所述基因渗入片段包含起始于3号物理染色体的21.50Mb处并终止于3号物理染色体的27.3Mb处的区域的全部或部分。
在一方面，包含QTL3.1或其变体的3号染色体上的基因渗入片段可通过使由NCIMB42346生长出的植物与另一黄瓜植物(特别是栽培黄瓜植物，在一方面中为长黄瓜型)杂交而获得。
在一方面，包含QTL3.1或其变体的本发明的栽培黄瓜植物是这样的植物，即其中3号染色体上的所述基因渗入片段可通过使由以登录号NCIMB 42345保藏的种子生长出的植物与另一黄瓜植物杂交而获得。因此，在一方面，QTL为存在于以登录号NCIMB 42345保藏的种子中的QTL。
当本文中提及SNP标记物时，其指示存在基因渗入片段(以及存在于基因渗入片段上的产量QTL)，应理解为提及了指示基因渗入片段的SNP基因型，即下文表5中提供的SNP基因型。应注意的是，如表中所示，SNP标记物基因型能够在纯合或杂合形式的基因渗入片段之间区分。在纯合形式中，核苷酸是相同的，而在杂合形式中，核苷酸是不同的。缺少基因渗入片段的“野生型”染色体的SNP基因型是另一种基因型，其也列于表5中(在轮回亲本的基因型下)。因此，例如，指示包含QTL3.1的基因渗入片段的SNP_01的基因型为‘TC’(QTL3.1/wt)或‘TT’(QTL3.1/QTL3.1)，而指示野生型/遗传对照(缺少基因渗入片段)的SNP基因型为‘CC’(wt/wt)。因此，当提及包含纯合形式或杂合形式的基因渗入片段的植物或植物部分(例如细胞)时，应理解为连锁到所述基因渗入片段的SNP标记物具有相应SNP基因型。
因此在一方面，本发明提供了在3号染色体上包含纯合形式或杂合形式的基因渗入片段的栽培黄瓜(原变种)植物，其中当在相同条件下生长时，与在3号染色体上缺少基因渗入片段的黄瓜植物(例如遗传对照或对照品种)相比，所述基因渗入片段赋予黄瓜果实产量的增加。
当在相同环境下生长时，与在3号染色体上缺少基因渗入片段的遗传对照株系或品种相比，黄瓜果实产量的增加在表型上表示为(统计学上)显著更高的平均果实数目/植物(FrPP)，所述植物为在3号染色体上包含纯合形式或杂合形式的基因渗入片段的栽培黄瓜植物株系或品种的植物，和/或在相同环境下生长时，与缺少所述基因渗入片段的遗传对照株系或品种相比，黄瓜果实产量的增加在表型上表示为显著更高的平均果实重量/植物(GrPP)，所述植物为包含所述基因渗入片段的植物株系或品种的植物。
当在相同环境下生长时，包含QTL3.1(或其变体)的黄瓜植物中的果实产量(总平均FrPP和/或GrPP)优选地对照(优选遗传对照)中的果实产量高至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％。
因此，本发明的植物包含栽培黄瓜的基因组，其具有至少一个或两个重组染色体，即一个或两个重组的3号染色体(即杂合的或纯合的)。所述重组染色体包含黄瓜的野生近缘种的片段，其可通过分子标记物分析、全基因组测序、染色体图染和类似的技术，来容易地与栽培黄瓜基因组区分。
在一方面，3号染色体上的基因渗入片段来自黄瓜的野生近缘种，包含正产量QTL3.1或其变体，以及包含起始于3号染色体的核苷酸21,507,892处并终止于3号染色体的核苷酸27,233,985处的区域的全部或部分。因此，所述基因渗入片段包含产量QTL3.1或其变体以及选自表5中所示的SNP_01至SNP_27的黄瓜野生近缘种的一种或多种或全部(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27种)SNP标记物。
应理解，对于作为本文所述的较小基因渗入片段的标记物，即缺少本文所列的标记物(例如SNP_01至SNP_27)或这些标记物的亚组的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种标记物，黄瓜野生近缘种的SNP基因型是缺失的(即未检测到供体基因型)，相反检测到所述“缺失的”SNP标记物的栽培黄瓜SNP基因型。
在一方面，植物或植物细胞或植物组织的基因组中(或从其提取的DNA中)3号染色体上存在的基因渗入片段可通过分子标记物测定法来检测，所述分子标记物测定法检测所述基因渗入片段的一种或多种分子标记物。然而，如所提及的，可使用其他技术，例如也可通过测序或通过使用替代性标记物来确定所述标记物的SNP基因型，所述替代性标记物位于本文提供的SNP标记物之间，或在本文提供的标记物的5Mb、3Mb、2.5Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.4Mb、0.3Mb、0.2Mb、0.1Mb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围以内。
当本文中提及通过分子标记物测定法“可检测”一种或多种分子标记物时，这当然意指植物或植物部分在其基因组中包含一种或多种标记物，因为否则所述标记物将无法被检测到。
在3号染色体上包含基因渗入片段(产量QTL3.1)的黄瓜植物
在一方面，本发明提供了包含纯合或杂合形式的3号染色体上来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段的黄瓜(原变种)植物，其中所述基因渗入片段包含位于SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:1的变体)的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_01与SEQ ID NO:27(或SEQ ID NO:1的变体)的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_27之间的数量性状基因座(QTL)，该QTL赋予黄瓜果实产量的增加。在一方面，所述QTL位于3号染色体的碱基21,507,892(SNP_01)与碱基27,233,985(SNP_27)之间。
因此，在一方面，QTL3.1位于SEQ ID NO:1(或其变体)中的SNP_01与SEQ ID NO:27(或其变体)中的SNP_27之间的区域中。
因此，在一方面，本发明提供了包含在3号染色体上的纯合或杂合形式的基因渗入片段的栽培黄瓜(原变种)植物，其中所述基因渗入片段赋予黄瓜果实产量的增加(与缺少所述基因渗入片段的植物，例如遗传对照相比)，并且其中所述基因渗入片段可通过分子标记物测定法来检测(即所述植物包含一种或多种分子标记物)，所述分子标记物测定法检测至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27种选自以下的标记物：
a)SEQ ID NO:1(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_01的TC或TT基因型；
b)SEQ ID NO:2(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_02的TC或TT基因型；
c)SEQ ID NO:3(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_03的TC或TT基因型；
d)SEQ ID NO:4(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_04的TC或TT基因型；
e)SEQ ID NO:5(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_05的GA或GG基因型；
f)SEQ ID NO:6(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_06的TC或TT基因型；
g)SEQ ID NO:7(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_07的TC或TT基因型；
h)SEQ ID NO:8(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_08的TC或TT基因型；
i)SEQ ID NO:9(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_09的CT或CC基因型；
j)SEQ ID NO:10(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_10的CT或CC基因型；
k)SEQ ID NO:11(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_11的TG或TT基因型；
l)SEQ ID NO:12(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_12的AG或AA基因型；
m)SEQ ID NO:13(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_13的TC或TT基因型；
n)SEQ ID NO:14(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_14的AG或AA基因型；
o)SEQ ID NO:15(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_15的CT或CC基因型；
p)SEQ ID NO:16(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_16的CT或CC基因型；
q)SEQ ID NO:17(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_17的GA或GG基因型；
r)SEQ ID NO:18(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_18的CT或CC基因型；
s)SEQ ID NO:19(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_19的GA或GG基因型；
t)SEQ ID NO:20(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_20的CT或CC基因型；
u)SEQ ID NO:21(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_21的AC或AA基因型；
v)SEQ ID NO:22(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_22的TC或TT基因型；
w)SEQ ID NO:23(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_23的CT或TT基因型；
x)SEQ ID NO:24(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_24的GA或GG基因型；
y)SEQ ID NO:25(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_25的GA或GG基因型；
z)SEQ ID NO:26(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_26的GA或GG基因型；
aa)SEQ ID NO:27(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_27的AG或AA基因型；以及任选地
bb)标记物SNP_01和SNP_27之间的任意黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物。
如之前所提及的，当提及变体序列中的SNP，该变体序列包含与所提及的序列至少85％的序列同一性。
在一方面，所述至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27种标记物选自标记物a)至aa)。在一方面，所述至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27种标记物是连续标记物。
如已提及的，本领域技术人员也可开发其他分子标记物，例如黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物，所述标记物在标记物SNP_01和SNP_27之间，和/或在SNP_01至SNP_27中任一种的7cM内或5cM内，和/或在SNP_01至SNP_27中任一种的5Mb、3Mb、2.5Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.4Mb、0.3Mb、0.2Mb、0.1Mb、50kb、20kb、10kb、5kb或更小范围内。这类标记物也可以是一段核苷酸、CAPS标记物、INDEL等。本领域技术人员可以例如对存在于以登录号NCIMB42346保藏的种子中的基因渗入片段进行测序，并且使用序列信息来开发新的标记物和标记物测定法。
另一方面，QTL3.1位于SEQ ID NO:1(或其变体)中的SNP_01与SEQ ID NO:10(或其变体)中的SNP_10之间的区域中。
因此，另一方面，本发明提供了包含在3号染色体上的纯合或杂合形式的基因渗入片段的栽培黄瓜(原变种)植物，其中所述基因渗入片段赋予黄瓜果实产量的增加(与缺少所述基因渗入片段的植物，例如遗传对照相比)，并且其中所述基因渗入片段可通过分子标记物测定法来检测，所述分子标记物测定法检测至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10种选自以下的标记物：
a)SEQ ID NO:1(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_01的TC或TT基因型；
b)SEQ ID NO:2(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_02的TC或TT基因型；
c)SEQ ID NO:3(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_03的TC或TT基因型；
d)SEQ ID NO:4(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_04的TC或TT基因型；
e)SEQ ID NO:5(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_05的GA或GG基因型；
f)SEQ ID NO:6(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_06的TC或TT基因型；
g)SEQ ID NO:7(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_07的TC或TT基因型；
h)SEQ ID NO:8(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_08的TC或TT基因型；
i)SEQ ID NO:9(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_09的CT或CC基因型；
j)SEQ ID NO:10(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_10的CT或CC基因型；以及任选地
k)标记物SNP_01和SNP_10之间的任意黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物。
在一方面，所述至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10种标记物选自标记物a)至j)。在一方面，所述至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10种标记物是连续标记物。
在另一方面，QTL3.1位于SEQ ID NO:10(或其变体)中的SNP_10与SEQ ID NO:20(或其变体)中的SNP_20之间的区域中。
因此，在不同的方面，本发明提供了包含在3号染色体上的纯合或杂合形式的基因渗入片段的栽培黄瓜(原变种)植物，其中所述基因渗入片段赋予黄瓜果实产量的增加(与缺少所述基因渗入片段的植物，例如遗传对照相比)，并且其中所述基因渗入片段可通过分子标记物测定法来检测，所述分子标记物测定法检测至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10或11种选自以下的标记物：
1)SEQ ID NO:10(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_10的CT或CC基因型；
2)SEQ ID NO:11(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_11的TG或TT基因型；
3)SEQ ID NO:12(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_12的AG或AA基因型；
4)SEQ ID NO:13(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_13的TC或TT基因型；
5)SEQ ID NO:14(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_14的AG或AA基因型；
6)SEQ ID NO:15(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_15的CT或CC基因型；
7)SEQ ID NO:16(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_16的CT或CC基因型；
8)SEQ ID NO:17(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_17的GA或GG基因型；
9)SEQ ID NO:18(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_18的CT或CC基因型；
10)SEQ ID NO:19(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_19的GA或GG基因型；
11)SEQ ID NO:20(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_20的CT或CC基因型；以及任选地
12)标记物SNP_10和SNP_20之间的任意黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物。
在一方面，所述至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10或11种标记物选自标记物1)至11)。在一方面，所述至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10或11种标记物是连续标记物。
在另一方面，QTL3.1位于SEQ ID NO:20(或其变体)中的SNP_20与SEQ ID NO:27(或其变体)中的SNP_27之间的区域中。
因此，在另一方面，本发明提供了包含在3号染色体上的纯合或杂合形式的基因渗入片段的栽培黄瓜(原变种)植物，其中所述基因渗入片段赋予黄瓜果实产量的增加(与缺少所述基因渗入片段的植物，例如遗传对照相比)，并且其中所述基因渗入片段可通过分子标记物测定法来检测，所述分子标记物测定法检测至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8种选自以下的标记物：
1)SEQ ID NO:20(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_20的CT或CC基因型；
2)SEQ ID NO:21(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_21的AC或AA基因型；
3)SEQ ID NO:22(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_22的TC或TT基因型；
4)SEQ ID NO:23(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_23的CT或TT基因型；
5)SEQ ID NO:24(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_24的GA或GG基因型；
6)SEQ ID NO:25(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_25的GA或GG基因型；
7)SEQ ID NO:26(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_26的GA或GG基因型；
8)SEQ ID NO:27(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_27的AG或AA基因型；以及任选地
9)标记物SNP_20和SNP_27之间的任意黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物。
在一方面，所述至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8种标记物选自标记物1)至8)。在一方面，所述至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8种标记物是连续标记物。
在甚至另一方面，QTL3.1位于SEQ ID NO:06(或其变体)中的SNP_06与SEQ ID NO:23(或其变体)中的SNP_23之间的区域中。
因此，本发明提供了包含在3号染色体上的纯合或杂合形式的基因渗入片段的栽培黄瓜(原变种)植物，其中所述基因渗入片段赋予黄瓜果实产量的增加(与缺少所述基因渗入片段的植物，例如遗传对照相比)，并且其中所述基因渗入片段可通过分子标记物测定法来检测，所述分子标记物测定法检测至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种选自以下的标记物：
a)SEQ ID NO:6(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_06的TC或TT基因型；
b)SEQ ID NO:7(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_07的TC或TT基因型；
c)SEQ ID NO:8(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_08的TC或TT基因型；
d)SEQ ID NO:9(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_09的CT或CC基因型；
e)SEQ ID NO:10(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_10的CT或CC基因型；
f)SEQ ID NO:11(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_11的TG或TT基因型；
g)SEQ ID NO:12(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_12的AG或AA基因型；
h)SEQ ID NO:13(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_13的TC或TT基因型；
i)SEQ ID NO:14(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_14的AG或AA基因型；
j)SEQ ID NO:15(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_15的CT或CC基因型；
k)SEQ ID NO:16(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_16的CT或CC基因型；
l)SEQ ID NO:17(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_17的GA或GG基因型；
m)SEQ ID NO:18(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_18的CT或CC基因型；
n)SEQ ID NO:19(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_19的GA或GG基因型；
o)SEQ ID NO:20(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_20的CT或CC基因型；
p)SEQ ID NO:21(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_21的AC或AA基因型；
q)SEQ ID NO:22(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_22的TC或TT基因型；
r)SEQ ID NO:23(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_23的CT或TT基因型；以及任选地
s)标记物SNP_06和SNP_23之间的任意黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物。
在一方面，所述至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种标记物选自标记物a)至r)。在一方面，所述至少1种，优选至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种标记物是连续标记物。
因此，所述包含QTL的片段可以是大的(包含SNP_01至SNP_27)，或者可以较小并且缺少具有黄瓜野生近缘种的基因型的标记物(即所述标记物反而具有栽培黄瓜的基因型，还参见表5轮回亲本的基因型)，但是其仍然可赋予栽培黄瓜植物以提高的产量，即其仍然可以包含产量等位基因(QTL3.1或变体)。这类较小的基因渗入片段是本发明的一个实施方案。具有仍赋予提高的产量(即包含产量等位基因)的较小基因渗入片段的植物可使用已知技术(如精细定位或类似的技术)来产生。例如通过以含有存在于以登录号NCIMB 42346保藏的种子中的基因渗入片段的植物开始，使这种植物与另一种栽培黄瓜植物杂交，使所述杂交的子代自交，和/或使所述子代回交，以产生可包含在3号染色体上具有较小基因渗入片段的重组体的植物种群，所述片段与缺少所述基因渗入片段的植物(例如遗传对照，例如由NCIMB 42345保藏的种子生长出的植物)相比仍赋予提高的产量，例如所述片段包含标记物SNP_01至SNP_10(或更小，例如仅包含9、8、7、6、5、4、3、2或1种SNP标记物)、SNP_10至SNP_20(或更小，例如仅包含10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种SNP标记物)、SNP_20至SNP_27(或更小，例如仅包含7、6、5、4、3、2或1种SNP标记物)或SNP_06至SNP_23(或更小，例如仅包含17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种SNP标记物)。可使用标记物测定法确定较小基因渗入片段的尺寸。可缺失一种或多种具有黄瓜野生近缘种的基因型的SNP标记物。然后可针对这些SNP标记物来检测栽培黄瓜基因型。然后可在如本文所述的产量实验中，对包含这种较小基因渗入片段的植物的产量进行比较，即在田间实验中，种植许多包含所述较小基因渗入片段的植物以及适合的对照植物(缺少所述基因渗入片段)。所述对照植物优选地为遗传对照，例如NCIMB 42345。如果平均产量仍然显著性地高于对照，则所述较小基因渗入片段已保留QTL3.1。
或者，可从不同的黄瓜野生近缘种渐渗相同或变体QTL(QTL3.1或变体QTL3.1)，籍此任选地并非本文所公开的全部SNP标记物均会存在。这类替代的黄瓜野生近缘种来源可使用本文提供的SNP标记物鉴定，通过使用标记物测定法筛选黄瓜野生近缘种种质(germplasm或accession)以检测标记物SNP_01至SNP_27，或标记物SNP_01至SNP_10、SNP_10至SNP_20、SNP_20至SNP_27或SNP_06至SNP_23，或甚至仅这些标记物的较小亚组(例如2,3,4,5,6,7,8或更多)的基因型。包含来自其他来源的相同或变体QTL3.1的植物也是本发明的一个实施方案。只要SNP_01至SNP_27的SNP、或SNP_01至SNP_10的SNP、或SNP_10至SNP_20的SNP、或SNP_20至SNP_27的SNP、或SNP_06至SNP_23的SNP中的至少一种或多种(或全部)存在，则所述植物具有产量增加基因型，即所述植物包含QTL3.1(或其变体)。本领域技术人员之后能够将QTL3.1(或其变体)渐渗到栽培黄瓜中以提高本文所述的果实产量并且以确认当所述QTL存在于栽培黄瓜中其提高了产量。
如上文所述，在一个实施方案中，本发明的栽培黄瓜植物包含基因渗入片段，该片段包含具有黄瓜野生近缘种的基因型的SNP标记物的至少一个亚组，即SNP_01至SNP_27、或SNP_01至SNP_10、或SNP_10至SNP_20、或SNP_20至SNP_27、或SNP_06至SNP_23中的至少1、2、3、4或5种标记物。在一方面，栽培黄瓜植物包含SNP_01至SNP_27、或SNP_01至SNP_10、或SNP_10至SNP_20、或SNP_20至SNP_27、或SNP_06至SNP_23的全部标记物或除1种或2种标记物外的全部标记物。
因此，可在标记物测定法中，通过检测一种或多种或全部上述标记物的基因渗入片段(即黄瓜种质的野生近缘种的基因渗入片段)的SNP基因型，可检测所述基因渗入片段(以及包含所述基因渗入片段的栽培黄瓜植物或植物部分，如细胞)。
因此，在一方面，发现数量性状基因座(QTL3.1)存在于黄瓜野生近缘种的3号染色体上，当所述基因座被转移(渐渗)到栽培黄瓜品种或育种系中时并且当以杂合或纯合形式存在时，其赋予所述栽培黄瓜植物以显著提高的果实产量。因此，所述QTL或包含所述QTL(包含产量等位基因)的基因渗入片段是显性的，即在3号染色体上的一条上具有所述基因渗入片段(一条重组的3号染色体)既已足够，而所述对的同源3号染色体可以是缺少所述基因渗入片段的栽培黄瓜(原变种)的(非重组的)3号染色体。
尽管本发明的产量QTL的来源是单一、特定的野生来源，可能有其他黄瓜属(Cucumis)种质的野生近缘种，其在3号染色体上的相同基因座上包含QTL3.1。这类基因座可包含具有稍微不同的核苷酸序列的产量等位基因，即本文所发现的等位基因(QTL)的变体。如本文所述，也可鉴定这类变体QTL并将其渐渗到栽培黄瓜中，以产生包含黄瓜(原变种)的基因组和重组的3号染色体的栽培黄瓜植物，藉此所述重组的3号染色体包含黄瓜物种的野生近缘种基因渗入片段，当所述基因渗入片段以纯合或杂合形式存在时，其赋予栽培黄瓜植物以提高的产量表型。为了鉴定这类包含QTL3.1的黄瓜野生近缘种，例如可在标记物测定法中或通过序列比较或其他方法，筛选野生种质中存在的一种或多种本文提供的SNP标记物。然后例如使用MAS(即使用一种或多种(或全部)本文提供的SNP标记物)，可将推定的产量QTL(或变体QTL)渐渗到栽培黄瓜中，以检测和/或选择包含重组的3号染色体的子代植物(例如回交植物)。然后在产量实验中，对经选择的植物和适合的对照植物(优选至少遗传对照)一起进行表型分析，以确定所述基因渗入片段是否确实导致显著的产量增加，所述经选择的植物即为在3号染色体上包含基因渗入片段的栽培黄瓜植物，其中在3号染色体上的基因渗入片段可通过SNP标记物SNP_01至SNP_27中的一种或多种、SNP标记物SNP_01至SNP_10中的一种或多种、SNP标记物SNP_10至SNP_20中的一种或多种、SNP标记物SNP_20至SNP_27中的一种或多种、或SNP标记物SNP_06至SNP_23中的一种或多种(如本文别处所述)来检测。
黄瓜野生近缘种的种质可获自USDA国家植物种质系统保藏中心(USDA NationalPlant Germplasm System collection)或其他种子保藏中心，并且因此可以使用例如如本文所述的标记物测定法来筛选所述种质中存在有QTL3.1的种质，可将包含一种或多种SNP标记物(例如指示QTL3.1的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或全部27种SNP标记物)的种质与具有正常野生型、非重组的3号染色体的栽培黄瓜杂交。然后可使用本文所述的分子标记物测定法，筛选F1或F2代(或下一代，如F3或回交世代)中具有基因渗入片段或其部分的重组植物。
在一方面，所述基因渗入片段来自黄瓜的野生近缘种，其属于印度黄瓜组，并且其被转移到欧亚黄瓜组的3号染色体上，从而产生包含产量QTL3.1或其变体的栽培黄瓜植物。因此，在一个实施方案中，包含产量QTL3.1的基因渗入片段可源自(或源自)或可获自(或获自；或存在于)属于印度黄瓜组的黄瓜野生近缘种。
在一个具体的实施方案中，包含产量QTL3.1的基因渗入片段可源自(或源自)或可获自(或获自；或存在于)种子(其代表性样品已经以登录号NCIMB 42346保藏)或其子代。所述子代可以是保留了如所述的指示(并连锁到)QTL的一种或多种(或全部)SNP标记物的任何子代，。因此，子代不限于所述保藏物的F1或F2子代，但是可以是通过自交和/或与另一黄瓜植物杂交而获得的任何子代。
在一个实施方案中，所述基因渗入片段可通过以下标记物来鉴定：一种或多种本文另外所述的标记物，特别是3号染色体上的基因渗入片段的标记物SNP_01至SNP_27，或一组标记物，例如一种或多种选自SNP标记物SNP_01至SNP_10，或选自SNP标记物SNP_10至SNP_20，或选自SNP标记物SNP_20至SNP_27，或选自SNP标记物SNP_06至SNP_23的标记物。一方面，本发明提供了栽培黄瓜植物，其具有包含提高的果实产量的栽培(驯化的)黄瓜基因组，其中所述提高的果实产量是由栽培黄瓜的3号染色体上的基因渗入片段所赋予，其中所述基因渗入片段是通过(或可通过)将以登录号NCIMB 42346保藏的种子生长出的栽培植物或该植物的子代(其包含一种或多种连锁到QTL的本文公开的标记物)与栽培黄瓜植物杂交而获得。因此，在一方面，本发明的栽培黄瓜植物包含的基因渗入片段和重组的3号染色体与NCIMB 42346中存在的(包含SNP标记物SNP_01至SNP_27的全部黄瓜野生近缘种基因型)相同，或它包含该基因渗入片段的更短片段，从而所述更短片段保留了赋予提高的果实产量的遗传元件(QTL3.1)。
因此，在一方面，本发明涉及本发明的植物，即在3号染色体上包含纯合或杂合形式的来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段的栽培黄瓜(原变种)植物，其中所述基因渗入片段为这样的基因深入片段，即其“存在于”(as in)/“等同于”(identical to)/“等同于存在于”(the same as in)以登录号NCIMB 42346保藏的种子，或是其更短的片段，但是由于存在QTL3.1仍赋予提高的果实产量。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的植物，即在3号染色体上包含纯合或杂合形式的来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段的栽培黄瓜(原变种)植物，其中所述基因渗入片段为这样的基因渗入片段，即其为以编号NCIMB 42346保藏的基因渗入片段种子的变体，即它包含产量QTL 3.1，但是基因组可能是不同的。由于野生种质是遗传趋异的(genetically divergent)，因此来自其他黄瓜野生近缘种的包含QTL3.1的基因渗入片段的基因组序列最有可能不同于与渐渗到NCIMB 42346中的基因组序列，并且甚至赋予产量的基因(包含启动子、内含子和外显子)可能在核苷酸序列上是趋异的，但是功能是相同的，即赋予提高的果实产量。由于连锁到QTL3.1的某些SNP标记物通常存在于多种种质中，而其他SNP标记物则可能仅存在于特定种质中，因此可以看出所述趋异性。因此例如，并非所有的SNP_01至SNP_27中均会存在于其他黄瓜近缘种中。然而，提高产量的QTL3.1(包含例如所述产量等位基因的变体或直系同源物)仍然可能存在于这类野生种质中。本领域技术人员能够鉴定存在于其他黄瓜野生近缘种中的包含QTL3.1的区域，并将其渐渗到栽培黄瓜中，例如检测包含SNP标记物或其亚组的野生近缘种并将这些SNP标记物(或亚组)转移到栽培黄瓜系或品种，以及评估与缺少所述SNP标记物(或亚组)(即缺少所述基因渗入片段)的株系或品种相比，所述栽培系或品种的果实产量。
在一个实施方案中，可通过分子标记物测定法来检测存在的包含QTL3.1的基因渗入片段或3号染色体区域(或变异或直系同源的3号染色体区域)，所述分子标记物测定法检测至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或更多(或全部27种)选自以下的单核苷酸多态性(SNP)标记物：
a)SEQ ID NO:1(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_01的TC或TT基因型；
b)SEQ ID NO:2(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_02的TC或TT基因型；
c)SEQ ID NO:3(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_03的TC或TT基因型；
d)SEQ ID NO:4(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_04的TC或TT基因型；
e)SEQ ID NO:5(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_05的GA或GG基因型；
f)SEQ ID NO:6(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_06的TC或TT基因型；
g)SEQ ID NO:7(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_07的TC或TT基因型；
h)SEQ ID NO:8(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_08的TC或TT基因型；
i)SEQ ID NO:9(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_09的CT或CC基因型；
j)SEQ ID NO:10(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_10的CT或CC基因型；
k)SEQ ID NO:11(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_11的TG或TT基因型；
l)SEQ ID NO:12(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_12的AG或AA基因型；
m)SEQ ID NO:13(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_13的TC或TT基因型；
n)SEQ ID NO:14(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_14的AG或AA基因型；
o)SEQ ID NO:15(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_15的CT或CC基因型；
p)SEQ ID NO:16(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_16的CT或CC基因型；
q)SEQ ID NO:17(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_17的GA或GG基因型；
r)SEQ ID NO:18(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_18的CT或CC基因型；
s)SEQ ID NO:19(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_19的GA或GG基因型；
t)SEQ ID NO:20(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_20的CT或CC基因型；
u)SEQ ID NO:21(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_21的AC或AA基因型；
v)SEQ ID NO:22(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_22的TC或TT基因型；
w)SEQ ID NO:23(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_23的CT或TT基因型；
x)SEQ ID NO:24(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_24的GA或GG基因型；
y)SEQ ID NO:25(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_25的GA或GG基因型；
z)SEQ ID NO:26(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_26的GA或GG基因型；
aa)SEQ ID NO:27(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_27的AG或AA基因型；以及
bb)任选地，标记物SNP_01和SNP_27之间任意黄瓜的野生近缘种基因组特异性标记物。
在一方面，被检测的所述至少1种，优选地至少2或3种，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27种标记物是连续标记物。
因此，在一个实施方案中，本发明的植物在SEQ ID NO:1的核苷酸75处(称为SNP_01)或在与SEQ ID NO:1具有基本序列同一性的基因组序列中的等同核苷酸处，包含至少一个胸腺嘧啶(T)(即TT或TC基因型)而不是两个胞嘧啶(CC)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胸腺嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:2的核苷酸75处(称为SNP_02)或在与SEQ ID NO:2具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胸腺嘧啶(T)(即TT或TC基因型)而不是两个胞嘧啶(CC)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胸腺嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:3的核苷酸75处(称为SNP_03)或在与SEQ ID NO:3具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胸腺嘧啶(T)(即TT或TC基因型)而不是两个胞嘧啶(CC)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胸腺嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:4的核苷酸75处(称为SNP_04)或在与SEQ ID NO:4具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胸腺嘧啶(T)(即TT或TC基因型)而不是两个胞嘧啶(CC)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胸腺嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:5的核苷酸75处(称为SNP_05)或在与SEQ ID NO:5具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个鸟嘌呤(G)(即GG或GA基因型)而不是两个腺嘌呤(AA)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有鸟嘌呤)；
和/或在SEQ ID NO:6的核苷酸75处(称为SNP_06)或在与SEQ ID NO:6具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胸腺嘧啶(T)(即TT或TC基因型)而不是两个胞嘧啶(CC)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胸腺嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:7的核苷酸75处(称为SNP_07)或在与SEQ ID NO:7具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胸腺嘧啶(T)(即TT或TC基因型)而不是两个胞嘧啶(CC)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胸腺嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:8的核苷酸75处(称为SNP_08)或在与SEQ ID NO:8具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胸腺嘧啶(T)(即TT或TC基因型)而不是两个胞嘧啶(CC)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胸腺嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:9的核苷酸75处(称为SNP_09)或在与SEQ ID NO:9具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胞嘧啶(C)(即CC或CT基因型)而不是两个胸腺嘧啶(TT)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胞嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:10的核苷酸75处(称为SNP_10)或在与SEQ ID NO:10具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胞嘧啶(C)(即CC或CT基因型)而不是两个胸腺嘧啶(TT)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胞嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:11的核苷酸75处(称为SNP_11)或在与SEQ ID NO:11具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胸腺嘧啶(T)(即TT或TG基因型)而不是两个鸟嘌呤(GG)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胸腺嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:12的核苷酸75处(称为SNP_12)或在与SEQ ID NO:12具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个腺嘌呤(A)(即AA或AG基因型)而不是两个鸟嘌呤(GG)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有腺嘌呤)；
和/或在SEQ ID NO:13的核苷酸75处(称为SNP_13)或在与SEQ ID NO:13具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胸腺嘧啶(T)(即TT或TC基因型)而不是两个胞嘧啶(CC)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胸腺嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:14的核苷酸75处(称为SNP_14)或在与SEQ ID NO:14具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个腺嘌呤(A)(即AA或AG基因型)而不是两个鸟嘌呤(GG)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有腺嘌呤)；
和/或在SEQ ID NO:15的核苷酸75处(称为SNP_15)或在与SEQ ID NO:15具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胞嘧啶(C)(即CC或CT基因型)而不是两个胸腺嘧啶(TT)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胞嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:16的核苷酸75处(称为SNP_16)或在与SEQ ID NO:16具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胞嘧啶(C)(即CC或CT基因型)而不是两个胸腺嘧啶(TT)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胞嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:17的核苷酸75处(称为SNP_17)或在与SEQ ID NO:17具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个鸟嘌呤(G)(即GG或GA基因型)而不是两个腺嘌呤(AA)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有鸟嘌呤)；
和/或在SEQ ID NO:18的核苷酸75处(称为SNP_18)或在与SEQ ID NO:18具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胞嘧啶(C)(即CC或CT基因型)而不是两个胸腺嘧啶(TT)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胞嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:19的核苷酸75处(称为SNP_19)或在与SEQ ID NO:19具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个鸟嘌呤(G)(即GG或GA基因型)而不是两个腺嘌呤(AA)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有鸟嘌呤)；
和/或在SEQ ID NO:20的核苷酸75处(称为SNP_20)或在与SEQ ID NO:20具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胞嘧啶(C)(即CC或CT基因型)而不是两个胸腺嘧啶(TT)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胞嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:21的核苷酸75处(称为SNP_21)或在与SEQ ID NO:21具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个腺嘌呤(A)(即AA或AC基因型)而不是两个胞嘧啶(CC)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有腺嘌呤)；
和/或在SEQ ID NO:22的核苷酸75处(称为SNP_22)或在与SEQ ID NO:22具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胸腺嘧啶(T)(即TT或TC基因型)而不是两个胞嘧啶(CC)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胸腺嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:23的核苷酸75处(称为SNP_23)或在与SEQ ID NO:23具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个胞嘧啶(C)(即CC或CT基因型)而不是两个胸腺嘧啶(TT)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有胞嘧啶)；
和/或在SEQ ID NO:24的核苷酸75处(称为SNP_24)或在与SEQ ID NO:24具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个鸟嘌呤(G)(即GG或GA基因型)而不是两个腺嘌呤(AA)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有鸟嘌呤)；
和/或在SEQ ID NO:25的核苷酸75处(称为SNP_25)或在与SEQ ID NO:25具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个鸟嘌呤(G)(即GG或GA基因型)而不是两个腺嘌呤(AA)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有鸟嘌呤)；
和/或在SEQ ID NO:26的核苷酸75处(称为SNP_26)或在与SEQ ID NO:26具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个鸟嘌呤(G)(即GG或GA基因型)而不是两个腺嘌呤(AA)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有鸟嘌呤)；
和/或在SEQ ID NO:27的核苷酸75处(称为SNP_27)或在与SEQ ID NO:27具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处，包含至少一个腺嘌呤(A)(即AA或AG基因型)而不是两个鸟嘌呤(GG)(换言之，在表5中所示的3号染色体的物理位置处具有腺嘌呤)。
在另一个实施方案中，可通过分子标记物测定法来检测包含QTL3.1的基因渗入片段或3号染色体区域(或变异或直系同源的3号染色体区域)的存在，所述分子标记物测定检测至少1种，优选地至少2,3,4,5,6,7,8或更多种以下亚组的单核苷酸多态性(SNP)标记物，所述亚组由以下构成：SNP_01至SNP10或任何在物理上位于标记物SNP_01和SNP_10之间的黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；SNP_10至SNP_20或任何在物理上位于标记物SNP_10和SNP_20之间的黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；SNP_20至SNP_27或任何在物理上位于标记物SNP_20和SNP_27之间的黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；或SNP_06至SNP_23或任何在物理上位于标记物SNP_06和SNP_23之间的黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物。
所述SNP基因型指两个核苷酸，以及包含这两个核苷酸之一的基因组序列，每条3号染色体上一个。因此，具有SNP_01的TT基因型的植物在两条染色体上具有相同的核苷酸(T)(即是纯合的)，而具有SNP_01的TC基因型的植物，其具有一条在SEQ ID NO:1的核苷酸75处(或在与SEQ ID NO:1具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处)具有T的染色体，以及一条在SEQ ID NO:1的核苷酸75处(或在与SEQ ID NO:1具有基本序列同一性的基因组序列的等同核苷酸处)具有C且是杂合的染色体。由于在来自其他黄瓜野生近缘种的基因渗入片段(即变体或直系同源的3号染色体区域的)中，本文提供的SNP标记物周围的基因组序列可稍微变化，因此显然在所述SNP之前和之后的核苷酸序列与本文提供的序列可能不会100％相同。因此，本文涵盖了与本文提供的序列具有基本序列同一性(当如所定义的，在整个序列上比对时)但是包含相同SNP的序列。
在一方面，可通过上述一种或多种标记物检测的包含QTL(QTL3.1或变体)的基因渗入片段或3号染色体区域(或变体或直系同源3号染色体区域)来自黄瓜野生近缘种，并且在一方面，所述野生近缘种是印度黄瓜组成员。在一方面，它是与以登录号NCIMB42346保藏的种子中3号染色体上存在的基因渗入片段相同的基因渗入片段，或保留所述QTL的更小片段。SNP标记物SNP_01至SNP_27跨越了约5.7Mb的区域。在一方面，3号染色体上的基因渗入片段的尺寸等于或小于10Mb，优选地尺寸等于或小于8Mb，更优选地尺寸等于或小于6、5.7、5、4、3或2.5Mb，例如等于或小于2Mb。在一方面，所述基因渗入片段的尺寸为至少0.2Mb、0.5Mb、1.0Mb、1.5Mb、1.9Mb、2.0Mb、2.5Mb、2.7Mb或3Mb。因此，本文涵盖了不同范围的基因渗入尺寸，例如小于10Mb但是大于0.2Mb的片段，小于6Mb或3Mb但是大于0.2Mb、0.5MB或1Mb等，其保留了QTL3.1以及一种或多种SNP_01至SNP_27，或SNP_01至SNP_10、SNP_10至SNP_20、SNP_20至SNP_27或SNP_06至SNP_23亚组的SNP标记物。如上文所提及的，可通过精细定位来确定在跨越SNP_01至SNP_27的区域中QTL3.1的位置，并且可产生在更小的基因渗入片段上包含QTL3.1的重组体。所述基因深入片段的尺寸可通过例如全基因组测序或下一代测序来容易地确定，例如Qi et al.2013(参见上文)或Hu ang et al.2009(参见上文)中所记载的。特别地，由于基因渗入区域中更大量的遗传变异(SNP、INDEL等)，基因渗入区域可容易地与栽培基因组区域区分开。
为了获得存在于来自保藏的种子(NCIMB 42346)的3号染色体上的基因渗入片段，即为了将包含QTL的基因渗入片段转移到另一栽培黄瓜植物中，由所述种子生长出植物，并且将所述植物与栽培黄瓜植物杂交以获得F1种子。由于NCIMB 42346仅包含一条重组的3号染色体(包含基因渗入片段)，只有约一半(50％)的F1种子和从其生长出的植物包含一条来自NCIMB 42346亲本的重组的3号染色体和一条来自其他栽培亲本的非重组的3号染色体。另一半F1种子F1种子不包含重组的3号染色体，但是仅包含两个拷贝的非重组的3号染色体。因此，通过传统育种能够将来自NCIMB 42346的重组的3号染色体转移到其他栽培黄瓜株系或品种中。通过存在一种或多种上述SNP标记物，可对包含QTL3.1的植物进行筛选和选择，以鉴定包含重组的3号染色体的植物。
为了产生更短的基因渗入片段，需要发生减数分裂，并且需要鉴定包含重组的3号染色体(特别是基因渗入片段内的新减数分裂重组事件)的植物。例如，NCIMB 42346的种子可自交一次或多次以产生F1、F2或F3植物(或进一步的自交世代)，和/或包含重组的3号染色体的F1、F2或F3植物(等)可与栽培亲本回交。通过存在的一种或多种上述SNP标记物可筛选和选择包含重组的3号染色体的植物，以鉴定包含更小的基因渗入片段的植物。之后可通过确定与缺少基因渗入片段的(遗传)对照相比的平均果实产量，测试在这类新重组体在更小的基因渗入片段上存在QTL3.1。
类似地，可使用不同的方法来产生和/或鉴定包含QTL3.1(或其变体)的栽培黄瓜植物。例如，为了获得包含来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段的栽培黄瓜植物，首先鉴定出包含一种或多种本文公开的连锁到QTL3.1的SNP标记物(例如任意一种或多种或全部本文上述标记物)的黄瓜野生近缘种。将鉴定出的植物与栽培黄瓜植物杂交以获得F1种子。所述F1可自交以产生F2、F3等植物，和/或F2植物或F3植物等可与栽培黄瓜亲本回交。通过存在有一种或多种上述SNP标记物，可对包含QTL3.1(或其变体)的植物进行筛选和/或选择，和/或筛选和/或选择与最初的栽培亲本(缺少基因渗入)相比提高的产量表型。可选择地或另外地，可进行QTL定位(mapping)以鉴定其他连锁到QTL3.1(或其变体)的分子标记物，和/或产生在3号染色体上包含基因渗入片段的栽培黄瓜植物，所述基因渗入片段赋予显著提高的产量。
在一个实施方案中，通过分子标记物测定法可检测在栽培黄瓜植物中存在的包含QTL3.1的基因渗入片段，或包含QTL3.1的3号染色体区域(或直系同源的3号染色体区域)，所述分子标记物测定法检测选自以下的标记物中的至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种：
a)SEQ ID NO:1(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_01的TT或TC基因型；
b)SEQ ID NO:27(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_27的AA或GA基因型；
c)在标记物SNP_01和SNP_27之间的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；
d)遗传连锁在标记物SNP_01或SNP_27的7cM、5cM、3cM或更小范围内的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；和
e)物理连锁在标记物SNP_01或SNP_27的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb或0.2Mb或更小范围内的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物。
在一方面，c)的标记物为SNP_02至SNP_26中的一种或多种。在一方面，从上述a)、b)和/或c)的标记物中检测至少一种、两种、至少三种、至少四种或多种标记物。在另一方面，从上述a)、b)、c)、d)和/或e)的标记物中检测至少一种、两种、至少三种、至少四种或多种标记物。在一个实施方案中，检测至少一种a)和/或b)的标记物，以及任选地检测至少一种、两种、三种或多种c)、d)和/或e)的标记物。在一方面，所检测的标记物是连续标记物。
在一个实施方案中，可通过分子标记物测定法检测在栽培黄瓜植物中存在的包含QTL3.1的基因渗入片段或包含QTL3.1的3号染色体区域(或直系同源的3号染色体区域)，所述分子标记物测定法检测选自以下的标记物中的至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种：
a)SEQ ID NO:1(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_01的TT或TC基因型；
b)SEQ ID NO:10(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_10的CC或CT基因型；
c)在标记物SNP_01和SNP_10之间的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；
d)遗传连锁在标记物SNP_01或SNP_10的7cM、5cM、3cM或更小范围内的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；和
e)物理连锁在标记物SNP_01或SNP_10的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb或0.2Mb或更小范围内的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物。
在一方面，c)的标记物为SNP_02至SNP_09中的一种或多种。在一方面，从上述a)、b)和/或c)的标记物中检测至少一种、两种、至少三种、至少四种或多种标记物。另一方面，从上述a)、b)、c)、d)和/或e)的标记物中检测至少一种、两种、至少三种、至少四种或多种标记物。在一个实施方案中，至少检测a)和/或b)的标记物，以及任选地检测至少一种、两种、三种或多种c)、d)和/或e)的标记物。在一方面，所检测的标记物是连续标记物。
在一个实施方案中，可通过分子标记物测定法检测在栽培黄瓜植物中存在的包含QTL3.1的基因渗入片段，或包含QTL3.1的3号染色体区域(或直系同源的3号染色体区域)，所述分子标记物测定法检测选自以下的标记物中的至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种：
a)SEQ ID NO:10(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_10的CC或CT基因型；
b)SEQ ID NO:20(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_20的CC或CT基因型；
c)在标记物SNP_10和SNP_20之间的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；
d)遗传连锁在标记物SNP_10或SNP_20的7cM、5cM、3cM或更小范围内的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；和
e)物理连锁在标记物SNP_10或SNP_20的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb或0.2Mb或更小范围内的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物。
在一方面，c)的标记物为SNP_11至SNP_19中的一种或多种。在一方面，从上述a)、b)和/或c)的标记物中检测至少一种、两种、至少三种、至少四种或多种标记物。另一方面，从上述a)、b)、c)、d)和/或e)的标记物中检测至少一种、两种、至少三种、至少四种或多种标记物。在一个实施方案中，至少检测a)和/或b)的标记物，以及任选地检测至少一种、两种、三种或多种c)、d)和/或e)的标记物。在一方面，所检测的标记物是连续标记物。
在一个实施方案中，可通过分子标记物测定法检测在栽培黄瓜植物中存在的包含QTL3.1的基因渗入片段，或包含QTL3.1的3号染色体区域(或直系同源的3号染色体区域)，所述分子标记物测定法检测选自以下的标记物中的至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种：
a)SEQ ID NO:20(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_20的CC或CT基因型；
b)SEQ ID NO:27(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_27的AA或GA基因型；
c)在标记物SNP_20和SNP_27之间任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；
d)遗传连锁在标记物SNP_20或SNP_27的7cM、5cM、3cM或更小范围内的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；和
e)物理连锁在标记物SNP_20或SNP_27的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb或0.2Mb或更小范围内的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物。
在一方面，c)的标记物为SNP_21至SNP_26的一种或多种。在一方面，从上述a)、b)和/或c)的标记物中检测至少一种、两种、至少三种、至少四种或多种标记物。在另一方面，从上述a)、b)、c)、d)和/或e)的标记物中检测至少一种、两种、至少三种、至少四种或多种标记物。在一个实施方案中，至少检测a)和/或b)的标记物，以及任选地检测至少一种、两种、三种或多种c)、d)和/或e)的标记物。在一方面，所检测的标记物是连续标记物。
在一个实施方案中，可通过分子标记物测定法检测在栽培黄瓜植物中存在的包含QTL3.1的基因渗入片段，或QTL3.1的3号染色体区域(或直系同源的3号染色体区域)，所述分子标记物测定法检测选自以下的标记物中的至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种：
a)SEQ ID NO:06(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_06的TT或TC基因型；
b)SEQ ID NO:23(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_23的CC或CT基因型；
c)在标记物SNP_06和SNP_23之间的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；
d)遗传连锁在标记物SNP_06或SNP_23的7cM、5cM、3cM或更小范围内的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物；和
e)物理连锁在标记物SNP_06或SNP_23的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb或0.2Mb或更小范围内的任何黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物。
在一方面，c)的标记物为SNP_07至SNP_22中的一种或多种。在一方面，从上述a)、b)和/或c)的标记物中检测至少一种、两种、至少三种、至少四种或多种标记物。在另一方面，从上述a)、b)、c)、d)和/或e)的标记物中检测至少一种、两种、至少三种、至少四种或多种标记物。在一个实施方案中，至少检测a)和/或b)的标记物，以及任选地检测至少一种、两种、三种或多种c)、d)和/或e)的标记物。在一方面，所检测的标记物是连续标记物。
在两个标记物之间的任意黄瓜野生近缘种的基因组特异性标记物是指任意的分子标记物，其在遗传上定位于所述两个标记物之间的3号染色体区域，和/或其在物理上位于所述两个标记物之间，并且其指示黄瓜野生近缘种的3号染色体区域。这意指所述标记物在栽培黄瓜基因组与黄瓜野生近缘种的基因组之间是多态性的。在一方面，所述标记物为单核酸多态性(SNP)，但同样可以使用例如RFLP、AFLP、RAPD、DNA测序等的其他分子标记物。
在一方面，本发明的植物中的基因渗入片段为保留QTL的存在于以登录号NCIMB42346保藏的种子中的3号染色体的片段或保留QTL的该片段的更小版本(通过例如所述基因渗入片段内的重组而产生)。
在一方面，所述基因渗入片段的尺寸等于或小于10Mb，优选地尺寸等于或小于8Mb、5Mb、3Mb、2.5Mb、2Mb、1.5Mb、1Mb。在另一方面，所述基因渗入片段的尺寸为至少0.5Mb或至少1Mb。
本发明还提供了从其中可生长出本发明植物的种子，以及从本发明的植物采收的黄瓜果实，并且在其基因组中包含重组的3号染色体。本发明同样提供了包含至少一条重组的3号染色体的植物的或种子的植物细胞、组织或植物部分，其中所述重组的3号染色体包含来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段，并且其中所述基因渗入片段包含赋予显著提高的果实产量的等位基因。
本文所述的分子标记物可根据标准方法来检测。例如，使用KASP测定法(参见www.kpbioscience.co.uk)或其他SNP基因分型测定法，可容易地检测SNP标记物。为进行KASP测定法，例如可选择所述SNP上游的70个碱基对和所述SNP下游的70个碱基对，并且可设计两条等位基因特异性的正向引物和一条等位基因特异性反向引物。参见例如Allen etal.2011,Plant Biotechnology J.9,1086-1099，特别是p097-1098的KASP测定方法。
因此，在一方面，使用KASP测定法来确定SNP标记物以及与产量QTL相关的标记物的存在/不存在，但是同样可使用其他SNP基因分型测定法。例如，同样可使用TaqMan SNP基因分型测定法、高分辨率熔解(HRM)测定法、SNP-基因分型测定法(例如Fluidigm、Illumina等)或DNA测序。
通过多种方法(例如物理定位、测序)或通过使用荧光原位杂交(FISH)图像的基因渗入的可视化，可确定基因渗入片段的物理尺寸(Verlaan et al.2011,Plant Journal68:1093-1103)。
在3号染色体上具有较小基因渗入片段的栽培黄瓜植物可通过产生新的重组植物以及选择具有较小基因渗入尺寸的重组子代而产生，所述新的重组植物来自这样的植物种群，即其源自栽培黄瓜植物(缺少基因渗入)和本发明的植物之间的杂交。因此，在一方面，这类植物源自其中存在所述重组的3号染色体的植物(的子代或后代)，所述植物的种子以NCIMB 42346保藏。本文涵盖了这样的子代或后代，即其保留了QTL3.1，并因此与缺少本文所述的基因渗入的植物相比具有更高的产量。
在番茄中，例如，通过选择重组的子代株系(LA1931-AL-F2)而减小了包含Ty-3等位基因的6号染色体上的较大智利番茄(S.chilense)基因渗入片段(约27cM)，其包含含有Ty-3的小得多的智利番茄基因渗入片段(约6cM)(参见Ji et al.2007,Mol.Breeding 20:271-284)。
本发明的栽培黄瓜植物可以为近交株系、OP(开放授粉品种)或F1杂种。在一方面，F1杂种仅包含一条重组的3号染色体(包含具有QTL的基因渗入片段)，即对于本文所述的基因渗入片段和SNP标记物而言F1杂种是杂合的。这类F1杂种可通过以下方法产生：杂交两种近交亲本株系以及收集来自所述杂交的F1杂种种子，所述两种近交亲本株系之一具有基因渗入片段(优选地为纯合形式，但是不是必须的)。在另一方面，所述F1杂种可包含纯合形式的基因渗入片段，即通过杂交两种近交亲本系(每种包含纯合形式或杂合形式的基因渗入片段)而产生。
所述栽培黄瓜植物可以是任何类型的。优选地，其具有良好的农学特征和良好的果实品质特征。在一方面，所述栽培黄瓜植物在遗传和表型上都是均一的。特别地，果实特征是均一的，例如关于形状、果皮颜色、果皮厚度、果皮花纹条(skin rib)、果皮韧性(toughness)、刺(spine)(刺颜色、刺密度等)、存在/不存在疣(wart)、在可食用和可市售成熟度时的长度和直径、味道等。同样地，种子特征(由其生长出所述植物的种子的特征)也是均一的，例如种子尺寸、种子颜色等。因此，包含纯合或杂合形式的QTL的植物株系或品种产生均一的果实，这意指当果实处于相同的发育阶段时，在相同环境条件下生长的植物的果实之间几乎没有变化(例如，对于定性特征而言，所有植物或植物部分、果实或种子的至少98％、99％或优选地100％是相同；对于定量特征而言，所有植物或植物部分、果实或种子的至少90％、95％、98％是相同的)。
本发明的包含QTL3.1(或其变体)的栽培黄瓜植物可为任意类型，例如，其可为以下的黄瓜类型中的一种：腌制黄瓜(例如美国腌制、欧洲腌制型)，切片黄瓜(例如美国切片)，长黄瓜，短黄瓜，欧洲温室黄瓜，Beit-Alpha型黄瓜，东方网格型黄瓜，亚洲黄瓜(例如选自印度杂色黄瓜、中国长黄瓜、韩国黄瓜和日本黄瓜类型)。在一方面，本发明的栽培黄瓜为下述类型黄瓜的近交株系或F1杂种：腌制黄瓜类型、切片黄瓜类型、长黄瓜类型、短黄瓜类型、欧洲温室黄瓜、Beit-Alpha型黄瓜、东方网格型黄瓜、中国长黄瓜类型、韩国黄瓜类型或日本黄瓜类型。在一个具体实施方案中，所述黄瓜为欧洲温室黄瓜的近交株系或F1杂种。
所述植物可为单一杂交F1杂种或近交株系，其包含纯合或杂合形式的QTL。在一方面，所述植物为通过杂交包含纯合形式的QTL3.1(或其变体)的(近交)亲本植物与缺少QTL3.1(即缺少包含所述QTL的基因渗入片段)的(近交)亲本植物而产生的F1杂种。因此，在一方面，所述F1杂种为QTL3.1杂合型的。
在另一方面，所述植物为通过杂交包含纯合形式的QTL3.1(或其变体)的(近交)亲本植物与也包含纯合形式的QTL3.1(或其变体)的(近交)亲本植物而产生的F1杂种。因此，在一方面，所述F1杂种为QTL3.1纯合型的。
在一方面，所述F1杂种为适于传统温室栽培或适于高丝(high-wire)栽培的欧洲温室黄瓜型。在传统的温室栽培方法中，植物的主茎被牵引到悬于地上约2米高度处的水平铁丝。当植物达到这一高度并附于铁丝上时，通过除去植物生长点来将植物“去顶(topped)”以终止进一步繁殖，从而使侧枝开始发育。使这些侧枝向下生长至地上约1米的高度，然后从它们中除去生长点。之后是在茎上和在侧枝或卷须上的开花和果实发育，但是卷须上的果实发育晚于茎上的果实发育。播种之后约6周采收果实。在高丝栽培中，不允许侧向卷须生长并且全部采收均来自于茎。Nunhems已开发出非常适于高丝栽培的特殊品种，它们提供了一种名为“compact”的基因，参见WO2009/059777，例如品种High-Jack、Hi-Power、Hi-Lisa。
因此，在本发明的一方面，所述栽培黄瓜植物另外还包含WO2009/059777中所述的compact基因。所述compact基因优选地以杂合形式存在。
在另一方面，本发明的基因渗入片段存在于长黄瓜型中，例如品种Kasja(Nunhems)，其为产生27-38cm的果实的长黄瓜品种。“长黄瓜型”或“长黄瓜植物”是温室黄瓜，其特征在于果实长度为至少约26cm或27cm至37或38cm或更长(例如40cm、42cm或更长)，优选地形成单性果实。长黄瓜型的实例为Sabrina和Korinda品种，或根据CPVO草案(参见该草案附录1第19点)果实长度得分为7-9的黄瓜植物。其他长黄瓜品种为，例如Bodega、Bologna、Kamaro、Flamingo、Discover、Kalunga、Kasja、Logica、Millagon.Nicola、Milika、Manuela、Frida、Activa、Alaya、Savanna、Sienna、Bella、Sheila、Bornand。
在一方面，欧洲温室黄瓜是其种子以登录号NCIMB 42346保藏的植物或其后代，从而所述后代保留QTL3.1(可通过如本文中其他处所述的一种或多种标记物来检测)。
在另一方面，本发明的植物不是野生黄瓜植物或黄瓜野生近缘种或地方品种。
在另一方面，本发明的植物是欧亚黄瓜组、东亚黄瓜组或西双版纳黄瓜组的栽培黄瓜。另一方面，本发明的植物不是印度黄瓜组的黄瓜。
在本发明的一个实施方案中，包含QTL3.1(或其变体)的栽培黄瓜植物在不授粉的情况下产生无籽果实，即是单性结实的。大多数欧洲温室黄瓜是单性结实的，即雌花在不授粉的情况下产生果实，因此果实保持无籽。单性结实是受遗传控制的，并且育种者已知如何将单性结实性状引入到黄瓜株系或品种(参见例如T.tatlioglu所著的书籍GeneticImprovement of Vegetable Crops的第13章，题目为“黄瓜”，207-209页，编辑G.Kalloo和BO Bergh，Pergamon Press，2012，ISBN0080408265)。
在本发明的另一实施方案中，包含QTL3.1(或其变体)的栽培黄瓜植物主要是纯雌植物或完全是纯雌植物(产生100％雌花)。这意指主要产生雌花或仅产生雌花。该性状也是受遗传控制的，并且育种者已知如何将纯雌性状引入到黄瓜株系或品种中(参见例如T.tatlioglu所著的书籍Genetic Improvement of Vegetable Crops的第13章，题目为“黄瓜”，207-209页，编辑G.Kalloo和BO Bergh，Pergamon Press，2012，ISBN0080408265)。
在一方面，本发明的黄瓜是单性结实和纯雌植物。因此，所述植物主要产生雌花或仅产生雌花，其在不授粉的情况下产生无籽果实。在纯雌黄瓜中，可通过用硝酸银处理来诱导雌花。使用这种方法以产生花粉以及使近交纯雌黄瓜株系自花授粉。
在不同的方面，本发明的黄瓜植物是雌雄同株的(产生雄花和雌花)，任选地为单性结实的和雌雄同株的。
在本发明的另一实施方案中，所述包含QTL3.1(或其变体)的栽培黄瓜植物在关于由所述植物产生的果实的形状特征方面是均一的且遗传上稳定的，例如关于果实形状、果实颜色、果皮厚度、疣等。
果实特征取决于所述黄瓜类型，即在其中渐渗有QTL的栽培遗传背景(基因库)，所述果实特征例如平均果实长度、平均果实直径、果皮厚度、存在/不存在疣、小刺状突起(spininess)、果皮韧性、果皮颜色、果颈形状(fruit neck shape)、果实锥度(fruittapering)、中间横截面形状、存在或不存在种子(单性结实)等。因此，根据黄瓜类型，本文包括多种果实形状、尺寸和果实类型。在一方面，所述果实是无籽的。
目前在美国，两种主要的商业种植的黄瓜果实类型是生鲜市场(切片)型和加工(腌制)型。品种和生产方法通常适应于最终用途。切片黄瓜通常更长、更大且具有更暗和更厚的果皮，而腌制/加工黄瓜具有更短的果实、更薄的果皮，并具有使其更容易被腌制的内部果肉。对于生鲜市场和腌制而言，通常优选无籽品种，因为发育中的和较大的种子口味不佳。
在一方面，本发明的植物是腌制型(加工型)并产生这样的果实，所述果实在可食用成熟度和/或可市售尺寸时的平均果实长度为至少10cm、或至少11cm、或至少12cm、或至少13cm，和/或果实长度与直径的比例为至少2、至少2.5、至少3或更大。
在不同的方面，本发明的植物是生鲜市场型，例如长黄瓜型或切片型，并且产生这样的果实，所述果实在可食用成熟度和/或可市售尺寸时的平均果实长度比腌制型更长，例如至少15cm、16cm、17cm、18cm、19cm、20cm、25cm、26cm、27cm、28cm、29cm、30cm、32cm、40cm或更长。
在一个优选的方面，本发明的植物是产生可市售尺寸的果实(特别是无籽果实)的长黄瓜型。本文还涵盖了可市售尺寸的果实及其部分，以及包含这些的食品或饲料产品。在一个实施方案中，所述SNP标记物在果实、果实部分、或包含这些的食品或饲料产品中是可检测的。
在一方面，所述植物是不确定的(indeterminate)黄瓜。在另一方面，所述黄瓜是确定的。
本文还提供了从其中生长出本发明植物的种子，以及从本发明的植物采收的黄瓜果实。这些在它们的基因组中包含QTL，因此可通过存在一种或多种本文提供的标记物来与其他果实区分开。
在一方面，所述果实在果实的可食用成熟度和/或可市售尺寸时为无苦味的(选自有苦味和无苦味组)。
在另一方面，所述果实在果实的可食用成熟度和/或可市售尺寸时具有薄的果皮(选自厚果皮和薄果皮组)。
在一个不同的实施方案中，将所述QTL渐渗进入称为‘致密的(Compact)’黄瓜类型中，如US8710303B2中所记载的。因此，本发明的黄瓜植物包含纯合或杂合形式的如US8710303B2中所记载的致密基因，例如存在于品种Hi-Jack和Hi-Lisa中(这两种均属于Nunhems)。
本发明的另一个实施方案为本发明的植物或种子的植物细胞、组织或植物部分，其包含至少一条重组的3号染色体，其中所述重组的3号染色体包含来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段，以及其中所述基因渗入片段包含赋予提高的果实产量的QTL。
本文也涵盖包含来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段(所述基因渗入片段包含赋予提高的果实产量的等位基因)的重组的3号染色体用于培育具有提高的果实产量的黄瓜品种的用途。在一方面，所述重组的3号染色体为存在于以登录号NCIMB 42346保藏的种子中的重组的3号染色体，或源自所述重组的3号染色体(例如存在于所述种子中的基因渗入片段的更小片段)。
同样地，本文涵盖了存在于以登录号NCIMB 42346保藏的种子中或其子代中的3号染色体，用于产生在所述3号染色体上包含基因渗入片段的栽培黄瓜植物的用途，其中与缺少所述基因渗入片段的遗传对照黄瓜植物(例如从以NCIMB 42345保藏的种子生长出的植物)相比，所述基因渗入片段赋予提高的果实产量。
类似地，本文涵盖了从以登录号NCIMB 42346保藏的种子生长出的植物或其子代，用于产生具有提高的果实产量的栽培黄瓜植物的用途，其中通过由所述植物或其子代的3号染色体获得的基因渗入片段而赋予所述提高的果实产量。
本发明还提供了从以登录号NCIMB 42346保藏的种子生长出的植物或其子代用于将QTL3.1或包含QTL3.1的基因渗入片段或其亚片段转移到另一黄瓜植物的用途。
本发明还提供了鉴定(检测)在3号染色体上包含基因渗入片段的栽培黄瓜(原变种)植物或植物部分的方法，其中所述基因渗入片段为NCIMB 42346中存在的片段或源自该片段的更小片段，所述方法包括：
a)提供栽培黄瓜(原变种)植物或植物部分，或所述植物或植物部分的DNA，
b)使用分子标记物测定法来筛选所述植物、植物部分或DNA，所述分子标记物测定法检测选自以下的至少一种SNP标记物：
用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27；和
c)鉴定和/或选择包含以下标记物的植物：
i)用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种SNP标记物；或
ii)选自用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种连续标记物；或
iii)由SNP_01至SNP_10、SNP_10至SNP_20、SNP_20至SNP_27、SNP_06至SNP_23组成的组中的至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多种标记物；或
vi)由SNP_01至SNP_10、SNP_10至SNP_20、SNP_20至SNP_27、SNP_06至SNP_23组成的组中的至少2、3、4、5、6、7、8或更多种连续标记物。
本发明还提供了产生包含赋予了提高的果实产量的基因渗入片段的黄瓜F1杂种植物，所述方法包括：
a)提供包含纯合形式的重组的3号染色体的第一近交黄瓜植物，所述重组的3号染色体具有包含赋予提高的产量的等位基因的基因渗入片段，任选地其中所述基因渗入片段为NCIMB 42346中的片段或更小的片段，
b)提供第二近交黄瓜植物，
c)将所述a)的黄瓜植物与所述b)的黄瓜植物杂交，
d)从所述杂交收集F1杂种种子。
所收集的F1杂种种子也是本发明的一个实施方案。
另一方面，本发明提供了用于产生NCIMB 42346的子代的方法，所述方法包括：
a)从以登录号NCIMB 42346保藏的种子中生长出植物；
b)将所述植物自交一次或多次和/或将所述植物与另一黄瓜植物杂交一次或多次以产生子代种子；
c)使用分子标记物测定法来筛选所述子代种子或从所述种子生长出的植物或所述种子或植物的部分，所述分子标记物测定法检测选自以下的至少一种SNP标记物：
用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27；
d)鉴定和/或选择包含以下标记物的子代植物：
i)用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27中的至少1种SNP标记物；或
ii)选自用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27的至少2、3或4种连续标记物；或
iii)由用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_10、SNP_10至SNP_20、SNP_20至SNP_27、SNP_06至SNP_23组成的标记物组中的至少1、2或3种标记物；或
iv)由用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_10、SNP_10至SNP_20、SNP_20至SNP_27、SNP_06至SNP_23组成的标记物组中的至少2、3或4种连续标记物。
步骤b中的黄瓜植物优选地为栽培黄瓜，例如欧洲温室黄瓜或长黄瓜型。
所述方法任选地还包括以下步骤：鉴定与对照相比具有提高的果实产量的子代植物。
通过上述方法产生的子代植物也是本发明的一个方面。所述子代植物可包含比NCIMB 42346中存在的基因渗入片段更短的基因渗入片段，其保留了QTL3.1。
本发明还提供含有或包含可从其中生长出本发明植物的种子的容器和包装。这些可以被标记为含有产生提高的或高的果实产量的栽培黄瓜种子。
本发明还提供了本发明的植物的子代种子和子代植物，其保留包含QTL3.1(或变体)的在3号染色体上的基因渗入，或包含仍然赋予提高的产量的更小的基因渗入(例如可源自NCIMB 42346中存在的片段)，即其仍包含QTL3.1。子代可为通过一次或多次自交本发明的黄瓜植物和/或杂交本发明的黄瓜植物与另一黄瓜植物而获得的任意世代。因此，子代为由第一次杂交(F1)或自交(S1)而产生的世代(种子)，或为通过杂交和/或自交(F2、F3等)和/或将F1和/或S1和/或BC1世代中的一株或多株所选择的植物(或任何其他世代如F2的植物)与另一黄瓜植物(和/或与黄瓜野生近缘种)进行回交(BC1、BC2等)而产生的任何其他世代。优选地，选择保留包含来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段的重组的3号染色体的子代。因此，子代也具有增加的产量表型，优选地至少具有与在最初杂交或自交中使用的植物相同的产量。包含所述QTL的基因渗入片段的存在(或保留)可在表型上确定和/或使用本文所述的分子标记物测定法确定。关于表型评估，当然需要考虑QTL的显性性质(dominancenature)。
在另一方面，本发明提供了本发明的黄瓜植物的部分。部分包括例如细胞和细胞培养物、组织培养物、营养植物组织(叶、根等)、花、花粉、胚、果实、果实部分等。所述植物部分包括如所述的并且可使用所述的一种或多种标记物检测的，在3号染色体上的基因渗入片段。而且，在由这类黄瓜部分(例如细胞、细胞或组织培养物)再生出完整植物时，则所述再生植物包含重组的3号染色体，以及所述产量表型。
因此，本发明还提供的是包含至少一条重组的3号染色体的本发明植物或种子的植物细胞、组织或植物部分，其中所述重组的3号染色体包含来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段，并且其中所述基因渗入片段包含赋予提高的果实产量的等位基因。
本文也涵盖了包含所述重组的3号染色体的细胞或组织的体外细胞培养物和体外组织培养物。优选地，所述细胞或组织可被再生成完整黄瓜植物，即所述细胞为可再生的细胞，所述组织包含可再生的细胞。因此，本文中的一个实施方案也为本发明植物的营养繁殖。因此，本发明提供了包含如本文所述的重组的3号染色体的营养繁殖的栽培黄瓜植物。在一个不同的方面，本文涵盖包含QTL3.1的非繁殖细胞，同样也涵盖包含这类细胞的组织。
在具体的方面，本发明提供了由本发明植物采收的黄瓜果实。可市售的黄瓜果实(尤其是用于生鲜市场(切片)的)，通常按照采收后的果实尺寸和品质特征来分级。参见例如1985年3月1日生效且1997年1月再版的美国农业部的美国黄瓜等级标准。在本文中，区分不同等级的黄瓜。因此，在一方面，本发明提供了美国观赏(Fancy)级、美国特1级(U.S.Extra No.1grade)、美国1级、美国小1级(U.S.No.1Small grade)、美国大1级(U.S.No.1Large grade)、美国2级的采收果实。本发明也提供了包含所采收的黄瓜果实或由其组成的容器或包装。通过存在的重组的3号染色体(如可在一种或多种分子标记物测定法中确定)，也可区分所述果实的细胞与其他黄瓜果实的细胞。
另一方面，所述黄瓜是长黄瓜型，并且本发明提供了采收和任选地加工的(例如，切片的或切丁的)果实。
另一方面，所述黄瓜是腌制型，并且提供了采收和任选地经腌制的果实。
本发明还提供包含本文所述的植物部分(优选黄瓜果实或其部分)和/或来自本文所述的植物部分的提取物的食品或饲料产品，或由本文所述的植物部分和/或来自本文所述的植物部分的提取物组成的食品或饲料产品。所述食品或饲料产品可为新鲜的或经加工的，例如腌制、罐装、蒸、煮、油炸、漂白和/或冷冻的等。例如，本文也提供包含例如本文所述的植物部分如果实或果实部分(新鲜和/或经加工的)的容器(例如罐(can)、盒(box)、板条箱(crate)、袋(bag)、硬纸盒(carton)、气调包装(Modified Atmosphere Packaging)、膜(例如可生物降解的膜)等)。
本发明的方法和用途
在另一个实施方案中，本发明提供生产如本文所述的在3号染色体上包含纯合或杂合形式的基因渗入片段(其赋予提高的产量)的新的栽培黄瓜植物的方法。所述方法包括使作为雄性亲本或作为雌性亲本的本发明的植物或其子代植物与第二黄瓜植物(或黄瓜野生近缘种)杂交一次或多次，和/或使本发明的黄瓜植物或其子代植物自交一次或多次，并且从所述杂交和/或自交中选择子代。
因此，本发明提供用于将包含产量QTL的重组的3号染色体从一种(栽培)黄瓜植物转移至另一种(栽培)黄瓜植物中的方法，特别是转移至其果实产量应当被增加的黄瓜品种或育种株系中。
所述方法包含步骤：
a)提供包含具有纯合形式的基因渗入片段的重组的3号染色体的第一栽培黄瓜植物，所述基因渗入片段包含赋予提高的果实产量的等位基因，
b)提供第二栽培黄瓜植物，特别是具有野生型(非重组的)3号染色体的植物，
c)使所述a)的黄瓜植物与所述b)的黄瓜植物杂交，
d)收集来自所述杂交的F1杂种种子，以及
e)任选地使由所述F1杂种种子生长出的植物自交以产生F2种子或进一步的自交世代，并且任选地选择具有重组的3号染色体的F2种子或进一步的自交世代种子，以及
f)任选地用从所述F1或F2或进一步的世代自交种子生长出的植物进行进一步育种，以产生具有良好农学特征且包含纯合或杂合形式的基因渗入片段的黄瓜植物。
通过本文所述的一种或多种分子标记物测定法和/或通过与步骤b)的植物相比产量是否显著增加，来确定所述重组的3号染色体的存在或不存在，以及所述基因渗入片段的存在或不存在。步骤f)中的进一步育种可包括自交、杂交、双单倍体产生、回交及其组合(例如回交和自交)等。本文涵盖可通过上述方法获得的植物、植物部分和种子。在一方面，步骤a)的植物可为从以NCIMB 42346保藏的种子生长出的植物，或其子代，或包含存在于以NCIMB 42346保藏的种子中的3号染色体上的基因渗入片段，或该片段的更小片段的植物。
本发明还提供了产生在3号染色体上包含产量QTL的栽培黄瓜F1杂种植物的方法，所述方法包括：
a)提供第一近交黄瓜植物，其包含含有基因渗入片段的至少一条重组的3号染色体，所述基因渗入片段包含选自QTL3.1或其变体的产量QTL，
b)提供第二近交黄瓜植物，其包含含有基因渗入片段的至少一条重组的3号染色体，所述基因渗入片段包含选自QTL3.1或其变体的产量QTL，
c)使所述a)的黄瓜植物与所述b)的黄瓜植物杂交，
d)收集来自所述杂交的F1杂种种子。
所述a)和b)的近交黄瓜植物可为3号染色体上的基因渗入片段的纯合型和/或杂合型，并且它们可含有具有不同尺寸和/或不同起源(即来自不同黄瓜野生近缘种)的基因渗入片段。因此，例如a)中的基因渗入片段可与b)中的基因渗入片段相同或不同。在一方面，a)的近交黄瓜植物包含纯合形式的QTL3.1或其变体，和/或b)的近交黄瓜植物包含纯合形式的QTL3.1或其变体。在一方面，包含QTL3.1的基因渗入片段为存在于NCIMB 42346中的片段或其更小片段。
所述F1杂种种子优选地包含至少一条重组的3号染色体，并且与遗传对照比较，从所述种子生长出的F1植物确实因此产生提高的果实产量。
本文涵盖可通过上述方法获得的植物和种子。
在一个不同的方面，本发明提供了用于产生在3号染色体上包含基因渗入片段的栽培黄瓜植物的方法，其中所述基因渗入片段包含产量QTL，所述方法包括步骤：
a)提供第一栽培黄瓜植物，
b)提供第二黄瓜野生近缘种，其中所述植物包含QTL3.1(或其变体)，这可通过存在如本文所述的一种或多种SNP标记物来确定，
c)使所述a)的黄瓜植物与所述b)的黄瓜植物杂交，
d)收集来自所述杂交的F1种子，使F1植物与a)的黄瓜植物回交以产生回交(BC1)种群，或使所述F1植物自交一次或多次以产生F2或F3或更高世代自交种群，
e)任选地，使d)的植物与a)的黄瓜植物回交一次或多次以产生更高世代回交种群，以及
f)鉴定在3号染色体上包含基因渗入的F2、F3或更高世代自交种群，或BC1或更高世代回交植物，其中所述基因渗入片段包含QTL3.1(或其变体)。
当在所述方法中提及回交种群时，所述回交种群也可自交，即BC1S1、BC1S2、BC2S1、BC2S2或其他。
在步骤b)至f)的一步或多步中，通过实施如本文中别处所述的分子标记物测定法，可测试所述QTL(或包含QTL的基因渗入片段)的存在(并且可选择植物)，例如通过确定所述植物是否包含一种或多种SNP标记物(例如SNP_01至SNP_27中的一种或多种；或SNP_01至SNP_10中的一种或多种；或SNP_10至SNP_20中的一种或多种；或SNP_20至SNP_27中的一种或多种；或SNP_06至SNP_23中的一种或多种；和/或任意这些标记物之间的任意黄瓜野生近缘种的基因组特异性标记物)。
使用该方法，可以产生和/或选择包含来自野生来源(例如黄瓜野生近缘种)的含有QTL3.1(或其变体)的基因渗入片段的新的栽培黄瓜植物。
在一方面，用于产生在3号染色体上包含基因渗入片段的栽培黄瓜植物的方法，其中所述基因渗入片段包含产量QTL，包括以下步骤：
a)提供第一栽培黄瓜植物，
b)提供包含本文所提供的一种或多种SNP标记物的第二黄瓜野生近缘种，
c)使所述a)的植物与所述b)的植物杂交，
d)收集来自所述杂交的F1种子，并使F1植物与a)的黄瓜植物回交以产生回交(BC1)种群，或使所述F1植物自交一次或多次以产生F2或F3种群
e)任选地，使所述回交种群自交以产生例如BC1S1或BC1S2种群，
f)鉴定包含所述(一种或多种)SNP标记物和/或包含在所述SNP标记物之间的任意黄瓜野生近缘种的基因组特异性标记物的F2、F3、BC1、BC1S1或BC1S2植物。
本发明还提供用于鉴定在3号染色体上包含产量QTL的黄瓜野生近缘种的方法，所述方法包括：
A)提供黄瓜野生近缘种的一种种质或多种种质；
B)使用分子标记物测定法筛选所述种质，所述分子标记物测定法检测至少一种(或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)选自SNP_01至SNP_27(或SNP标记物的亚组，例如SNP_01至SNP_10，SNP_10至SNP_20，SNP_20至SNP_27，SNP_06至SNP_23)的SNP标记物；
C)鉴定和/或选择b)中的包含至少一种或多种以下标记物的种质：
a)SEQ ID NO:1(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_01的TC或TT基因型；
b)SEQ ID NO:2(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_02的TC或TT基因型；
c)SEQ ID NO:3(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_03的TC或TT基因型；
d)SEQ ID NO:4(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_04的TC或TT基因型；
e)SEQ ID NO:5(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_05的GA或GG基因型；
f)SEQ ID NO:6(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_06的TC或TT基因型；
g)SEQ ID NO:7(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_07的TC或TT基因型；
h)SEQ ID NO:8(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_08的TC或TT基因型；
i)SEQ ID NO:9(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_09的CT或CC基因型；
j)SEQ ID NO:10(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_10的CT或CC基因型；
k)SEQ ID NO:11(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_11的TG或TT基因型；
l)SEQ ID NO:12(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_12的AG或AA基因型；
m)SEQ ID NO:13(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_13的TC或TT基因型；
n)SEQ ID NO:14(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_14的AG或AA基因型；
o)SEQ ID NO:15(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_15的CT或CC基因型；
p)SEQ ID NO:16(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_16的CT或CC基因型；
q)SEQ ID NO:17(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_17的GA或GG基因型；
r)SEQ ID NO:18(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_18的CT或CC基因型；
s)SEQ ID NO:19(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_19的GA或GG基因型；
t)SEQ ID NO:20(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_20的CT或CC基因型；
u)SEQ ID NO:21(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_21的AC或AA基因型；
v)SEQ ID NO:22(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_22的TC或TT基因型；
w)SEQ ID NO:23(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_23的CT或TT基因型；
x)SEQ ID NO:24(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_24的GA或GG基因型；
y)SEQ ID NO:25(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_25的GA或GG基因型；
z)SEQ ID NO:26(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_26的GA或GG基因型；
aa)SEQ ID NO:27(或其变体)中单核苷酸多态性标记物SNP_27的AG或AA基因型；以及任选地
bb)标记物SNP_01和SNP_27之间的任意黄瓜野生近缘种基因组特异性标记物，以及任选地
D)使来自所述野生种质的所述QTL渐渗到栽培黄瓜中(例如通过回交)。
在步骤B)、C)和D)中，也可使用本文中别处所述的其他分子标记物测试。因此，当采用这种方法时，可以筛选黄瓜野生近缘种中一种或多种标记物的存在，从而筛选QTL3.1(或它们的变体)的存在，并使所述QTL渐渗到栽培黄瓜植物中。通过该方法获得的植物和种子也是本发明的一个实施方案。
在另一方面，本发明提供了用于鉴定在3号染色体上包含基因渗入片段的栽培黄瓜植物的方法，其中所述基因渗入片段包含产量QTL，所述方法包括：使用分子标记物测定法来筛选栽培黄瓜植物、或栽培黄瓜植物的种群、或这类黄瓜植物的部分(例如果实、细胞、DNA)，所述分子标记物测定法检测如本文中别处所述的至少一种指示(连锁到)QTL3.1的SNP标记物(优选地2、3、4、5或更多种；优选地连续的SNP标记物)。
在该方法中，可使用如本文中别处所述的任意分子标记物测试。因此，当使用该方法时，可以检测在栽培黄瓜植物或植物部分中，3号染色体上的包含QTL3.1的基因渗入片段的存在。
在另一方面，本发明提供检测栽培黄瓜植物是否在3号染色体上包含基因渗入片段的方法，其中所述基因渗入片段包含QTL3.1，所述方法包括：
a)提供栽培黄瓜植物或植物部分，
b)使用分子标记物测定法筛选所述植物或所述植物部分(或获自所述植物或所述植物部分的DNA)，所述分子标记物测定法检测选自以下的至少一种(优选至少2、3、4、5或多种)SNP标记物：
SNP_01至SNP_27和/或标记物SNP_01和SNP_27之间任意黄瓜野生近缘种的基因组特异性标记物。
显然，分子标记物筛选包括获得植物材料和分析所述材料的基因组DNA中的标记物基因型。
在该方法中，也可使用如本文中别处所述的其他分子标记物测试。
本文也涵盖用于产生在3号染色体上包含基因渗入片段的栽培黄瓜植物的方法，其中所述基因渗入片段含有QTL3.1，所述方法包括：
a)提供缺少包含QTL3.1的基因渗入片段的第一栽培黄瓜植物，
b)提供第二栽培黄瓜植物，其选自从以登录号NCIMB 42346保藏的种子生长出的植物或其子代，
c)使所述a)的植物与所述b)的植物杂交，
d)收集来自所述杂交的F1种子，并且任选地，使所述F1植物自交一次或多次以产生F2或F3或进一步的自交种群，
e)任选地，使F1植物或F2或F3或进一步的自交植物与a)的植物回交，以产生回交种群，
f)任选地，使所述回交种群自交一次或多次，
g)鉴定F1、F2、F3、进一步的自交或回交植物，其包含一种或多种或全部的SNP标记物基因型，所述SNP标记物基因型指示在3号染色体上的基因渗入片段。
在另一方面，本发明提供产生F1杂种植物的方法，所述方法包括：
a)提供第一近交黄瓜植物，其包含至少一条具有含QTL3.1的基因渗入片段的重组的2号染色体，其中所述基因渗入片段为存在于NCIMB42346中的片段，或这种基因渗入片段的更小片段，
b)提供第二近交黄瓜植物，其具有或不具有重组的3号染色体，
c)使所述a)的植物与所述b)的植物杂交，
d)收集来自所述杂交的F1杂种种子。
在另一方面，本发明提供用于产生保留QTL3.1的NCIMB 42346子代的方法，所述方法包括：
a)从以登录号NCIMB 42346保藏的种子中生长出植物；
b)使所述植物自交一次或多次，或使所述植物与另一栽培黄瓜植物杂交一次或多次以产生子代种子；
c)使用分子标记物测定法筛选所述子代种子或从所述种子生长出的植物或者所述种子或植物的部分，所述分子标记物测定法检测至少一种本文公开的SNP标记物；
d)鉴定和/或选择包含至少1、2、3或更多种SNP标记物的子代植物，所述SNP标记物指示包含QTL3.1的基因渗入片段(如本文中别处所述)；以及
e)任选地，确认所述子代植物的提高的果实产量。
在一方面，优选地，当在相同条件下生长时，e)中的产量为至少与从NCIMB 42346中生长出的植物的产量相同的产量。
本发明提供了用于产生NCIMB 42346子代的方法，所述方法包括：
a)从以登录号NCIMB 42346保藏的种子中生长出植物；
b)使所述植物自交一次或多次，或使所述植物与另一栽培黄瓜植物杂交一次或多次以产生子代种子；
c)使用分子标记物测定法筛选所述子代种子或从所述种子生长出的植物或者所述种子或植物的部分，所述分子标记物测定法检测至少一种选自以下的SNP标记物：
用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27；
d)鉴定和/或选择包含以下标记物的子代植物：
i)用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27的至少一种SNP标记物；或
ii)选自用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27的至少2、3或4种连续标记物；
e)任选地，确认所述子代植物的提高的果实产量。
在一方面，优选地，当在相同条件下生长时，e)中的产量为至少与从NCIMB 42346中生长出的植物的产量相同的产量。
通过任意上述方法产生的子代植物也是本发明的一个方面。
人们也可以使用本文中所述的方法和标记物来减小包含QTL的基因渗入片段的尺寸，即产生或选择在3号染色体上具有更小基因渗入片段但保留所述基因渗入片段的提高产量部分的重组体。
在一方面，本发明涵盖了包含来自黄瓜野生近缘种的基因渗入片段的重组的3号染色体用于培育具有提高的果实产量的黄瓜品种的用途，所述基因渗入片段包含产量QTL。
本发明也提供存在于以登录号NCIMB 42346保藏的种子或其子代中的3号染色体用于产生包含所述3号染色体的基因渗入片段的栽培黄瓜植物的用途。
本发明也提供从以登录号NCIMB 42346保藏的种子中生长出的植物或其子代用于产生具有提高的果实含量的栽培黄瓜植物的用途，其中所述的提高的果实产量是由从所述植物或子代的3号染色体获得的基因渗入片段所赋予的。
本发明的DNA和染色体
在一方面，本文提供经修饰(重组)的栽培黄瓜的3号染色体，其包含黄瓜野生近缘种的基因渗入片段，如本说明书通篇所述。在一方面，将所述重组染色体从其自然环境中分离。在另一方面，其存在于植物细胞中，尤其是黄瓜细胞中，特别是在栽培黄瓜细胞中。本文也提供包含QTL的重组染色体的分离部分。
在另一方面，本发明提供包含本发明的产量等位基因的重组核酸分子，特别是重组DNA分子。在一方面，所述产量等位基因可通过一种或多种本文所述的分子标记物测定法来检测。本发明也提供包含重组DNA的DNA载体。重组DNA分子或DNA载体均可为分离的核酸分子。所述包含产量等位基因的DNA可存在于微生物中，例如细菌(例如农杆菌属(Agrobacterium))。
本文涵盖这种(分离或提取的)核酸分子和/或这种重组染色体或其部分用于产生包含产量等位基因的植物细胞和植物的用途。在一方面，其可用于产生转基因植物细胞和转基因植物，例如包含产量等位基因的黄瓜细胞、黄瓜植物和部分(例如果实)，并且所述植物包含提高的果实产量表型。
因此，在其基因组中包含所述的重组的3号染色体的转基因植物细胞(例如转基因黄瓜细胞)，和/或包含产量等位基因的重组核酸分子也是本发明的一个实施方案。在一方面，包含所述产量等位基因的DNA分子被稳定地整合至黄瓜基因组中。
也可以克隆产量等位基因并且可以制备嵌合基因，例如将植物表达启动子可操作地连接到产量等位基因上。这种嵌合基因可被引入到植物细胞，并且所述植物细胞可被再生成完整植物以产生转基因植物。在一方面，所述转基因植物为黄瓜植物或甜瓜植物。
因此，本文提供包含产量等位基因且具有增加的果实产量的转基因植物，特别是转基因栽培黄瓜或甜瓜植物。
特别地，包含本发明的重组的3号染色体的细胞或细胞培养物是一个实施方案，这与所述重组的3号染色体是通过转基因方法还是通过育种方法引入无关。所述细胞为例如体外的，并且可被再生成包含本发明的重组的3号染色体的植物。
本文还涵盖本文公开的分子标记物序列(和包含该序列的分离核酸分子)，以及在任意所提及的分子标记物之间的分子标记物，其连锁到产量QTL3.1，以及其在检测和/或产生包含所述QTL的黄瓜植物中的用途。
种子保藏
包括含杂合形式的QTL3.1的基因渗入片段的长黄瓜型的杂种黄瓜(原变种)的种子的代表性样本(被称为CUCYLD-3)以及缺少所述基因渗入片段和QTL的遗传对照(GC)的种子的代表性样本(被称为CUYLD-GC)是由Nunhems B.V.根据布达佩斯条约按照ExpertSolution(EPC 2000,Rule 32(1))于2014年12月17日保藏于国家工业、食品和海洋微生物保藏中心(NCIMB Ltd.)(英国苏格兰，阿伯丁郡AB219YA，巴克斯本，克莱伯斯通区，弗格森大厦)。种子被给予以下保藏号：NCIMB 42346(CUCYLD-3)和NCIMB 42345(CUYLD-GC)。
申请人要求，依据Rule 32(1)EPC或具有类似条款和规章的国家或条约的相关法规，所述生物材料及其衍生的任何材料的样本只向指定的专业人员提供，直至专利授权公告或者提交之日起20年(如果所述申请被驳回、撤回或视为撤回)。
在本申请未决期间，由美国专利局主任确定的有资格的人员可请求并获得所述保藏物。受37C.F.R.§1.808(b)的制约，在专利授权时，保藏者针对所保藏材料的公众可获得性而提出的所有限制都会被永久取消。所述保藏物将被维持30年，或在最近一次请求之后5年的时间，或被维持到专利的有效寿命期，以较长时间为准，在此期间如果所述保藏物一旦不能存活，都要将其替换。申请人不会放弃任何本专利申请或植物品种保护法(7USC2321et seq.)所授予的任何权利。
以下非限制性实施例描述了如何可以获得本发明的植物，其包含QTL3.1。除非实施例中另有说明，根据在Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,以及Sambrook andRussell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY；以及Volumes 1and 2of Ausubel et al.(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA中所记载的标准方案实施所有的重组DNA技术。用于植物分子工作的标准材料和方法记载于Plant Molecular BiologyLabfax(1993)by R.D.D.Croy,jointly published by BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)and Blackwell Scientific Publications,UK中。标准育种方法记载于‘Principles of Plant breeding’,Second Edition,Robert W.Allard(ISBN 0-471-02309-4)中。
实施例
实施例1-鉴定产量QTL
种群开发
将获自USA的黄瓜野生近缘种种质与北欧和北美温室黄瓜市场的育种计划中专用的长黄瓜育种株系HMRKC杂交。HMRKC是用于长温室黄瓜计划的良种株系。
已从HMRKC和野生种质的杂交中开发出QTL-发现种群。在种群开发期间，只保留雌性开花植物以利于产量测量。
已在几个世代中使用SNP标记物以选择长果实和优化基因组覆盖度和纯合性。BC2S2种群用于构建遗传图谱。
将220株BC2S2植物自花授粉以产生BC2S3植物。也将BC2S2植物与来自育种计划的良种株系(株系CUZL0176)杂交以产生测试杂种。还通过杂交HMRKC与CUZL0176来产生遗传对照。将220株测试杂种与所述遗传对照用于产量试验中。
产量实验
产量实验的目的是测量在荷兰夏秋季节期间长温室黄瓜的产量。实验由220株测试杂种和30株遗传对照重复组成。
因此，在2009年6月，使用岩棉塞(rockwool plug)在250块样地(plot)人工播种到盘中。将盘在至少24℃的温度下保持4天。在播种后4天，将含有发芽的种子的塞(plug)转移到岩棉块。在约3周中，将岩棉盆保持在特定的温室隔间中植物升高区域(plant-raisingarea)。在该区域中，使所述植物生长直到其已准备好种植在温室中。
播种后约4周，将约30cm高的植物转移到种植区(grower)。在种植区，保持每块样地8株植物。实验共由250块样地*8株植物组成。记录每块样地的准确的植物数目。植物以所述传统的荷兰方式生长。这表示所述植物垂直地生长，由丝线支撑直到达到约220cm高。在这个高度下，将植物去顶并使植物继续侧向生长。移植后约3周，采收第一批果实(即可市售尺寸的果实)。采收期开始于八月并持续到十月末。通过采摘可市售的果实，每周人工采收植物3至7次。
以两种不同的方法对产量进行测量。对每块样地采收的果实总数量计数并且除以这块样地的植物数量。这产生了以(平均)果实数量/植物(FrPP)表示的产量。第二种测量采用每块样地的果实重量，并且除以植物数量以获得以克/植物(GrPP)为单位的(平均)产量。
2009年，在荷兰进行了两次田间试验。
产量数据用于进行QTL检测分析。检测3号染色体上的QTL，其在遗传图谱的89.347cM处出现峰值(LOD得分6.3)(LOD区间开始于3号染色体的位置76.214cM并终止于93.377cM)。
表1和表2示出了在3号染色体上具有来自野生黄瓜近缘种的基因渗入的测试杂种的表现对比在3号染色体上缺少所述基因渗入的遗传对照的表现。对于两次试验，以GrPP表示时由于QTL3.1导致的平均产量增加为6％，以FrPP表示时的平均产量增加为16％。
表1——在3号染色体上包含基因渗入(QTL3.1)的测试杂种的产量对比在3号染色体上缺少所述基因渗入的遗传对照杂种(通过杂交HMRKC与CUZL0176产生)的产量。产量数据是基于在荷兰(NL)进行的2次试验。
Figure BDA0001537124510000671
表2——在3号染色体上包含基因渗入(QTL3.1)的测试杂种的产量对比在3号染色体上缺少所述基因渗入的遗传对照杂种(通过杂交HMRKC与CUZL0176产生)的产量。产量数据是基于在荷兰(NL)进行的2次试验。
Figure BDA0001537124510000672
根据QTL检测试验的结果，选择一个在3号染色体上包含基因渗入的特定的BC2S3株系。将该BC2S3株系与良种株系CUZL0176杂交以产生被称为PRE.N1.1168的测试杂种。还将BC2S3株系回交到良种株系HMRKC以产生BC3。将BC3自花授粉两次以产生仅在包含来自黄瓜野生近缘种的3号染色体上的基因渗入的BC3S2株系。将该BC3S2株系与良种株系CUZL0176杂交以产生新的测试杂交杂种，其种子以登录号NCIMB 42346保藏。NCIMB 42346具有来自黄瓜野生近缘种的基因渗入，其包含3号染色体上的QTL3.1。因此，NCIMB 42346是QTL3.1杂合型的。
为了进行对比，将良种株系HMRKC与良种株系CUZL0176杂交，产生遗传对照杂种，其种子以登录号NCIMB 42345保藏。
在2011年进行两次使用PRE.N1.1168的田间试验。从2011年6月开始，到2011年10月结束，进行这两次试验。两次试验的采收从第31周至第43周。表3示出了两次试验的平均产量增加为20％(以(平均)果实/植物表示)。两次试验的平均产量增加(以(平均)克/植物表示)为10％(数据未示出)。
表3——产量试验2011，2次试验，每次试验4次重复
Figure BDA0001537124510000681
在2014年，使用包含QTL3.1的NCIMB 42346和遗传对照NCIMB 42345进行了另一次产量试验。在2014年6月至9月期间，该试验在荷兰进行。从第29周至第39周采收果实。NCIMB42346和遗传对照NCIMB 42345重复种植8次。
表4示出了以平均果实/植物表示的由于QTL3.1导致的产量增加为3.4％。以平均克/植物为单位的产量增加为2.2％。
表4——产量试验2014，8次重复。产量以平均采收果实/植物(FrPP)和平均采收克/植物(GrPP)表示。
FrPP GrPP
NCIMB 42345(遗传对照，缺少QTL3.1) 38.7 15781
NCIMB 42346(包含QTL3.1) 40.0 16130
由于QTL3.1导致的产量增加 3.4％ 2.2％
实施例2
鉴定跨越(spanning)所述基因渗入片段的单核苷酸多态性标记物(SNP)，并测定它们在物理黄瓜图谱上的位置。
表5–QTL3.1基因渗入片段的SNP标记物
Figure BDA0001537124510000691
Figure BDA0001537124510000701
Figure BDA0001537124510000711
Figure BDA0001537124510000721
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Claims (5)

1.一种用于鉴定在3号染色体上包含基因渗入片段的栽培黄瓜原变种植物的方法，其中所述基因渗入片段为存在于NCIMB 42346中，所述方法包括：
a) 提供栽培的黄瓜原变种植物的种群；
b) 使用分子标记物测定法来筛选所述种群，所述分子标记物测定法检测选自以下的至少一种SNP标记物：
用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27；
c) 鉴定和/或选择包含以下的植物：
i) 用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP标记物SNP_01至SNP_27中的至少1种；或
ii) 选自用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27的至少2、3或4种连续标记物；
其中
SEQ ID NO: 1的核苷酸75处的SNP_01具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 2的核苷酸75处的SNP_02具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 3的核苷酸75处的SNP_03具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 4的核苷酸75处的SNP_04具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 5的核苷酸75处的SNP_05具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 6的核苷酸75处的SNP_06具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 7的核苷酸75处的SNP_07具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 8的核苷酸75处的SNP_08具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 9的核苷酸75处的SNP_09具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 10的核苷酸75处的SNP_10具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 11的核苷酸75处的SNP_11具有TG或TT基因型；
SEQ ID NO: 12的核苷酸75处的SNP_12具有AG或AA基因型；
SEQ ID NO: 13的核苷酸75处的SNP_13具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 14的核苷酸75处的SNP_14具有AG或AA基因型；
SEQ ID NO: 15的核苷酸75处的SNP_15具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 16的核苷酸75处的SNP_16具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 17的核苷酸75处的SNP_17具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 18的核苷酸75处的SNP_18具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 19的核苷酸75处的SNP_19具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 20的核苷酸75处的SNP_20具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 21的核苷酸75处的SNP_21具有AC或AA基因型；
SEQ ID NO: 22的核苷酸75处的SNP_22具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 23的核苷酸75处的SNP_23具有CT或TT基因型；
SEQ ID NO: 24的核苷酸75处的SNP_24具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 25的核苷酸75处的SNP_25具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 26的核苷酸251处的SNP_26具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 27的核苷酸75处的SNP_27具有AG或AA基因型。
2.一种用于检测栽培黄瓜植物是否包含3号染色体上的基因渗入片段的方法，其中所述基因渗入片段赋予提高的果实产量，且所述基因渗入片段为存在于NCIMB 42346中，所述方法包括：
a) 提供栽培的黄瓜植物或植物部分；
b) 使用分子标记物测定法来筛选所述植物或植物或者从所述植物或植物部分获得的DNA，所述分子标记物测定法检测选自以下的至少一种SNP标记物：
SNP_01至SNP_27；其中SEQ ID NO: 1的核苷酸75处的SNP_01具有TC或TT基因型；SEQID NO: 2的核苷酸75处的SNP_02具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 3的核苷酸75处的SNP_03具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 4的核苷酸75处的SNP_04具有TC或TT基因型；SEQ ID NO:5的核苷酸75处的SNP_05具有GA或GG基因型；SEQ ID NO: 6的核苷酸75处的SNP_06具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 7的核苷酸75处的SNP_07具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 8的核苷酸75处的SNP_08具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 9的核苷酸75处的SNP_09具有CT或CC基因型；SEQ ID NO: 10的核苷酸75处的SNP_10具有CT或CC基因型；SEQ ID NO: 11的核苷酸75处的SNP_11具有TG或TT基因型；SEQ ID NO: 12的核苷酸75处的SNP_12具有AG或AA基因型；SEQ ID NO: 13的核苷酸75处的SNP_13具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 14的核苷酸75处的SNP_14具有AG或AA基因型；SEQ ID NO: 15的核苷酸75处的SNP_15具有CT或CC基因型；SEQ ID NO: 16的核苷酸75处的SNP_16具有CT或CC基因型；SEQ ID NO: 17的核苷酸75处的SNP_17具有GA或GG基因型；SEQ ID NO: 18的核苷酸75处的SNP_18具有CT或CC基因型；SEQID NO: 19的核苷酸75处的SNP_19具有GA或GG基因型；SEQ ID NO: 20的核苷酸75处的SNP_20具有CT或CC基因型；SEQ ID NO: 21的核苷酸75处的SNP_21具有AC或AA基因型；SEQ IDNO: 22的核苷酸75处的SNP_22具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 23的核苷酸75处的SNP_23具有CT或TT基因型；SEQ ID NO: 24的核苷酸75处的SNP_24具有GA或GG基因型；SEQ ID NO:25的核苷酸75处的SNP_25具有GA或GG基因型；SEQ ID NO: 26的核苷酸251处的SNP_26具有GA或GG基因型；SEQ ID NO: 27的核苷酸75处的SNP_27具有AG或AA基因型。
3.一种用于鉴定在3号染色体上包含存在于NCIMB 42346中的片段的黄瓜野生近缘种的方法，所述方法包括：
A) 提供黄瓜野生近缘种的一种种质或多种种质；
B) 使用分子标记物测定法筛选所述种质，所述分子标记物测定法检测至少一种选自SNP_01至SNP_27的SNP标记物；其中SEQ ID NO: 1的核苷酸75处的SNP_01具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 2的核苷酸75处的SNP_02具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 3的核苷酸75处的SNP_03具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 4的核苷酸75处的SNP_04具有TC或TT基因型；SEQID NO: 5的核苷酸75处的SNP_05具有GA或GG基因型；SEQ ID NO: 6的核苷酸75处的SNP_06具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 7的核苷酸75处的SNP_07具有TC或TT基因型；SEQ ID NO:8的核苷酸75处的SNP_08具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 9的核苷酸75处的SNP_09具有CT或CC基因型；SEQ ID NO: 10的核苷酸75处的SNP_10具有CT或CC基因型；SEQ ID NO: 11的核苷酸75处的SNP_11具有TG或TT基因型；SEQ ID NO: 12的核苷酸75处的SNP_12具有AG或AA基因型；SEQ ID NO: 13的核苷酸75处的SNP_13具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 14的核苷酸75处的SNP_14具有AG或AA基因型；SEQ ID NO: 15的核苷酸75处的SNP_15具有CT或CC基因型；SEQ ID NO: 16的核苷酸75处的SNP_16具有CT或CC基因型；SEQ ID NO: 17的核苷酸75处的SNP_17具有GA或GG基因型；SEQ ID NO: 18的核苷酸75处的SNP_18具有CT或CC基因型；SEQ ID NO: 19的核苷酸75处的SNP_19具有GA或GG基因型；SEQ ID NO: 20的核苷酸75处的SNP_20具有CT或CC基因型；SEQ ID NO: 21的核苷酸75处的SNP_21具有AC或AA基因型；SEQ ID NO: 22的核苷酸75处的SNP_22具有TC或TT基因型；SEQ ID NO: 23的核苷酸75处的SNP_23具有CT或TT基因型；SEQ ID NO: 24的核苷酸75处的SNP_24具有GA或GG基因型；SEQ ID NO: 25的核苷酸75处的SNP_25具有GA或GG基因型；SEQ ID NO: 26的核苷酸251处的SNP_26具有GA或GG基因型；SEQ ID NO: 27的核苷酸75处的SNP_27具有AG或AA基因型；
C) 鉴定和/或选择b)中的包含至少一种或多种以下标记物的种质：
a) SEQ ID NO: 1的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_01的TC或TT基因型；
b) SEQ ID NO: 2的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_02的TC或TT基因型；
c) SEQ ID NO: 3的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_03的TC或TT基因型；
d) SEQ ID NO: 4的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_04的TC或TT基因型；
e) SEQ ID NO: 5的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_05的GA或GG基因型；
f) SEQ ID NO: 6的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_06的TC或TT基因型；
g) SEQ ID NO: 7的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_07的TC或TT基因型；
h) SEQ ID NO: 8的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_08的TC或TT基因型；
i) SEQ ID NO: 9的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_09的CT或CC基因型；
j) SEQ ID NO: 10的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_10的CT或CC基因型；
k) SEQ ID NO: 11的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_11的TG或TT基因型；
l) SEQ ID NO: 12的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_12的AG或AA基因型；
m) SEQ ID NO: 13的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_13的TC或TT基因型；
n) SEQ ID NO: 14的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_14的AG或AA基因型；
o) SEQ ID NO: 15的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_15的CT或CC基因型；
p) SEQ ID NO: 16的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_16的CT或CC基因型；
q) SEQ ID NO: 17的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_17的GA或GG基因型；
r) SEQ ID NO: 18的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_18的CT或CC基因型；
s) SEQ ID NO: 19的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_19的GA或GG基因型；
t) SEQ ID NO: 20的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_20的CT或CC基因型；
u) SEQ ID NO: 21的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_21的AC或AA基因型；
v) SEQ ID NO: 22的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_22的TC或TT基因型；
w) SEQ ID NO: 23的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_23的CT或TT基因型；
x) SEQ ID NO: 24的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_24的GA或GG基因型；
y) SEQ ID NO: 25的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_25的GA或GG基因型；
z) SEQ ID NO: 26的核苷酸251处的单核苷酸多态性标记物SNP_26的GA或GG基因型；
aa) SEQ ID NO: 27的核苷酸75处的单核苷酸多态性标记物SNP_27的AG或AA基因型。
4.一种用于产生NCIMB 42346的子代的方法，所述方法包括：
a) 从以登录号NCIMB 42346保藏的种子中生长出植物；
b) 将所述植物自交一次或多次和/或将所述植物与另一黄瓜植物杂交一次或多次以产生子代种子；
c) 使用分子标记物测定法来筛选所述子代种子或从所述种子生长出的植物或所述种子或植物的部分，所述分子标记物测定法检测选自以下的至少一种SNP标记物：
用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27；
d) 鉴定和/或选择包含以下标记物的子代植物：
i) 用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27中的至少1种SNP标记物；或
ii) 选自用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_27的至少2、3或4种连续标记物；或
iii) 由用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_10、SNP_10至SNP_20、SNP_20至SNP_27、SNP_06至SNP_23组成的标记物组中的至少1、2或3种标记物；或
iv) 由用于检测3号染色体上的基因渗入片段的SNP_01至SNP_10、SNP_10至SNP_20、SNP_20至SNP_27、SNP_06至SNP_23组成的标记物组中的至少2、3或4种连续标记物，
其中
SEQ ID NO: 1的核苷酸75处的SNP_01具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 2的核苷酸75处的SNP_02具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 3的核苷酸75处的SNP_03具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 4的核苷酸75处的SNP_04具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 5的核苷酸75处的SNP_05具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 6的核苷酸75处的SNP_06具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 7的核苷酸75处的SNP_07具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 8的核苷酸75处的SNP_08具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 9的核苷酸75处的SNP_09具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 10的核苷酸75处的SNP_10具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 11的核苷酸75处的SNP_11具有TG或TT基因型；
SEQ ID NO: 12的核苷酸75处的SNP_12具有AG或AA基因型；
SEQ ID NO: 13的核苷酸75处的SNP_13具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 14的核苷酸75处的SNP_14具有AG或AA基因型；
SEQ ID NO: 15的核苷酸75处的SNP_15具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 16的核苷酸75处的SNP_16具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 17的核苷酸75处的SNP_17具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 18的核苷酸75处的SNP_18具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 19的核苷酸75处的SNP_19具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 20的核苷酸75处的SNP_20具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 21的核苷酸75处的SNP_21具有AC或AA基因型；
SEQ ID NO: 22的核苷酸75处的SNP_22具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 23的核苷酸75处的SNP_23具有CT或TT基因型；
SEQ ID NO: 24的核苷酸75处的SNP_24具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 25的核苷酸75处的SNP_25具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 26的核苷酸251处的SNP_26具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 27的核苷酸75处的SNP_27具有AG或AA基因型。
5.一种用于产生在3号染色体上包含基因渗入片段的栽培黄瓜植物的方法，其中所述基因渗入片段为存在于NCIMB 42346中，所述方法包括：
a) 提供在3号染色体上缺少基因渗入片段的第一栽培黄瓜植物，其中所述基因渗入片段为存在于NCIMB 42346中，
b) 提供第二栽培黄瓜植物，其选自从以登录号NCIMB 42346保藏的种子生长出的植物或其子代，
c) 使所述a)的植物与所述b)的植物杂交，
d) 收集来自所述杂交的F1种子，并且任选地，使所述F1植物自交一次或多次以产生F2或F3或进一步的自交种群，
e) 任选地，使F1植物或F2或F3或进一步的自交植物与a)的植物回交，以产生回交种群，
f) 任选地，使所述回交种群自交一次或多次，
g) 鉴定F1、F2、F3、进一步的自交或回交植物，其包含一种或多种或全部的SNP标记物基因型，所述SNP标记物基因型指示在3号染色体上的基因渗入片段，
其中
SEQ ID NO: 1的核苷酸75处的SNP_01具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 2的核苷酸75处的SNP_02具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 3的核苷酸75处的SNP_03具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 4的核苷酸75处的SNP_04具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 5的核苷酸75处的SNP_05具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 6的核苷酸75处的SNP_06具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 7的核苷酸75处的SNP_07具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 8的核苷酸75处的SNP_08具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 9的核苷酸75处的SNP_09具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 10的核苷酸75处的SNP_10具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 11的核苷酸75处的SNP_11具有TG或TT基因型；
SEQ ID NO: 12的核苷酸75处的SNP_12具有AG或AA基因型；
SEQ ID NO: 13的核苷酸75处的SNP_13具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 14的核苷酸75处的SNP_14具有AG或AA基因型；
SEQ ID NO: 15的核苷酸75处的SNP_15具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 16的核苷酸75处的SNP_16具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 17的核苷酸75处的SNP_17具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 18的核苷酸75处的SNP_18具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 19的核苷酸75处的SNP_19具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 20的核苷酸75处的SNP_20具有CT或CC基因型；
SEQ ID NO: 21的核苷酸75处的SNP_21具有AC或AA基因型；
SEQ ID NO: 22的核苷酸75处的SNP_22具有TC或TT基因型；
SEQ ID NO: 23的核苷酸75处的SNP_23具有CT或TT基因型；
SEQ ID NO: 24的核苷酸75处的SNP_24具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 25的核苷酸75处的SNP_25具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 26的核苷酸251处的SNP_26具有GA或GG基因型；
SEQ ID NO: 27的核苷酸75处的SNP_27具有AG或AA基因型。
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