CN114507645A - 一类新型黄酮还原酶及其应用 - Google Patents

一类新型黄酮还原酶及其应用 Download PDF

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CN114507645A CN202011280203.2A CN202011280203A CN114507645A CN 114507645 A CN114507645 A CN 114507645A CN 202011280203 A CN202011280203 A CN 202011280203A CN 114507645 A CN114507645 A CN 114507645A
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Abstract

本发明涉及新型黄酮还原酶及其应用，具体地，本发明的黄酮还原酶可催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物还原为二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物；以及催化二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物氧化为黄酮类化合物/黄酮醇类化合物。

Description

一类新型黄酮还原酶及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域；更具体地，本发明涉及一类新型黄酮还原酶及其应用。
背景技术
人类食物中一类重要的天然产物是黄酮类化合物，它是自然界最普遍的多酚类化合物，广泛地存在于蔬菜、水果、谷物等植物性食物中。黄酮类化合物在体内和体外实验中对多种细菌有抑制和杀灭作用，对哺乳动物细胞有抗炎、抗肿瘤、抗氧化的生理活性，对心血管疾病患者更可以作为药物用于临床治疗。肠道细菌在肠道环境里与黄酮的共存中，长期受到来自黄酮类化合物的抗菌胁迫，进化出了多种能降解黄酮类化合物的酶，使其经过水解、去羟基、还原等化学催化过程，代谢为酚酸等小分子，既解除了黄酮的生物毒性，又将其分解产生的小分子作为细菌的营养。所以，肠道菌对黄酮类化合物的降解，直接影响了黄酮类化合物的生物学活性和生物利用度。
黄酮和黄酮醇是黄酮类化合物的重要成员，以黄酮醇类最为常见，约占黄酮类化合物种类数的三分之一，其次为黄酮类，占总数的四分之一以上。在已知的黄酮类化合物中，以芹菜素最为典型，生理和药理活性机制得到较充分的研究。
目前负责黄酮降解第一步关键反应——C2-C3双键被加氢还原为二氢黄酮的酶基因尚未被发现和鉴定，内在的反应机理也不清楚，这是目前我们认知微生物代谢黄酮类化合物的一处重要空白。
因此本领域迫切需要开发一种能够催化黄酮/黄酮醇与二氢黄酮/二氢黄酮醇的可逆性的氧化还原反应的酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够催化黄酮/黄酮醇与二氢黄酮/二氢黄酮醇的可逆性的氧化还原反应的酶，并命名为黄酮还原酶(FLR)。
在本发明的另一目的在于提供了不同物种来源的黄酮还原酶的氨基酸序列及其对应的DNA序列信息。
本发明的另一目的在于提供了黄酮还原酶催化的底物和对应的产物信息。
本发明的另一目的在于提供了黄酮还原酶的体外催化体系构建方法和最适催化条件。
本发明的另一目的在于提供了黄酮还原酶的催化特性和酶学参数信息。
本发明第一方面提供了一种分离的黄酮还原酶，所述的黄酮还原酶选自：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮还原酶活性的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％，更佳地，至少98％或99％)的序列相同性，且具有黄酮还原酶活性的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶为选自下组的形式：菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液、或其组合。
在一个优选例中，所述的黄酮还原酶活性是指催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物还原为二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物；以及催化二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物氧化为黄酮类化合物/黄酮醇类化合物的活性。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶催化如下反应：
Figure BDA0002780513240000021
其中，R1为H或OH，R2为OH，R3为H，R4为OH，R5为H，R6为H、OH或-O-C1-C4烷基，R7为OH、H或-O-C1-C4烷基，R8为H为OH。
在另一优选例中，R7为OH、H或O-CH3。
在另一优选例中，经R1-R8取代后的式I化合物、以及经式I化合物转化的式II化合物如下表所示：
Figure BDA0002780513240000031
在另一优选例中，当R为H时，式I化合物为黄酮类化合物，式II化合物为二氢黄酮类化合物。
在另一优选例中，当R为OH式，式I化合物为黄酮醇类化合物，式II化合物为二氢黄酮醇类化合物。
在另一优选例中，所述反应具有选自下组的一个或多个特点：
(i)反应体系的pH为4-10，较佳地，5-9，更佳地，6-8；
(ii)反应温度为20-50℃，较佳地，25-45℃，更佳地，30-42℃，更佳地，35－40℃；
(iii)反应时间为10min－10h，较佳地，20min－5h，更佳地，30min－1.5h；
(iv)催化还原反应的kcat值为0.005s-1－0.040s-1，较佳地，0.012s-1－0.020s-1；
(v)催化还原反应的Km值为2－20μM，较佳地，4－15μM，更佳地，6－10μM；
(vi)催化氧化反应的kcat值为0.015s-1－0.100s-1，较佳地，0.040s-1－0.080s-1；
(vii)催化氧化反应的Km值为3－50μM，较佳地，6－30μM，更佳地，10－20μM。
在另一优选例中，所述黄酮类化合物选自下组：白杨素、芹菜素、木犀草素、香叶木素、或其组合。
在另一优选例中，所述黄酮醇类化合物选自下组：山奈酚、槲皮素、桑色素、杨梅素、异鼠李素、或其组合。
在另一优选例中，所述二氢黄酮类化合物选自下组：柚皮素、乔松素、圣草酚、二氢香叶木素、或其组合。
在另一优选例中，所述二氢黄酮醇类化合物选自下组：二氢桑色素、香橙素、花旗松素、蛇葡萄素、二氢异鼠李素、或其组合。
在另一优选例中，当式I化合物为芹菜素，式II化合物为柚皮素。
在另一优选例中，当式I化合物为白杨素，式II化合物为乔松素。
在另一优选例中，当式I化合物为木犀草素，式II化合物为圣草酚。
在另一优选例中，当式I化合物为香叶木素，式II化合物为二氢香叶木素。
在另一优选例中，当式I化合物为山奈酚，式II化合物为香橙素。
在另一优选例中，当式I化合物为槲皮素，式II化合物为花旗松素。
在另一优选例中，当式I化合物为桑色素，式II化合物为二氢桑色素。
在另一优选例中，当式I化合物为杨梅素，式II化合物为蛇葡萄素。
在另一优选例中，当式I化合物为异鼠李素，式II化合物为二氢异鼠李素。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于人、动物、植物或微生物。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于原核微生物，更优选肠道细菌。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于厚壁菌门的梭菌纲。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于解黄酮梭菌(Clostridiumorbiscindens，fpla)，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，cbe)，艰难梭菌(Clostridium difficile，cdc)，永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii，clj)或丁酸梭菌(Clostridium butyricum，cbut)。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于梭菌属(Clostridium:Clostridiumorbiscindens,fpla；Clostridium beijerinckii NCIMB 8052,cbe；Clostridiumacetobutylicum ATCC 824,cac；Clostridium ljungdahlii,clju；Clostridiumcarboxidivorans,ccar)，链霉菌属(Streptomyces:Streptomyces scabiei,scb)，拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis:Pestalotiopsis fici,pfy)，链格孢属(Alternaria:Alternariaalternata,aalt)。梭杆菌属(Fusobacterium:Fusobacterium varium,fva；Fusobacteriummortiferum,fmo)，螺旋体属(Brachyspira:Brachyspira pilosicoli B2904,bpj；Brachyspira pilosicoli WesB,bpw)。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于解黄酮梭菌(Clostridiumorbiscindens,fpla)，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052,cbe)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC 824,cac)，疮茄病链霉菌(Streptomycesscabiei,scb)，烟草赤星病菌(Alternaria alternata,aalt)，永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii,clju)，食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans,ccar)，可变梭杆菌(Fusobacterium varium,fva)，死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum,fmo)，肠道螺旋体WesB(Brachyspira pilosicoli WesB,bpw)，无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis fici,pfy)，肠道螺旋体B2904(Brachyspira pilosicoli B2904,bpj)。
在另一优选例中，所述的序列(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。
本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸是编码本发明第一方面所述的黄酮还原酶。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:1所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:2－4中任一所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与(b)中所示多核苷酸序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)，且编码SEQ ID NO.:1所示多肽的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸在黄酮还原酶的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。
在另一优选例中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2－4中任一所示。
本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，包括酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。
本发明第五方面提供了一种产生本发明第一方面所述黄酮还原酶的方法，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出黄酮还原酶；和
分离所述黄酮还原酶。
本发明第六方面提供了一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含本发明第一方面所述的黄酮还原酶。
在另一优选例中，所述的酶制剂包括注射剂、和/或冻干制剂。
本发明第七方面提供了一种催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物与二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物的氧化还原反应的方法，包括步骤：
在反应体系中，将黄酮还原酶与反应底物接触。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于人、动物、植物或微生物。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于原核微生物，更优选肠道细菌。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于厚壁菌门的梭菌纲。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于解黄酮梭菌(Clostridiumorbiscindens，fpla)，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，cbe)，艰难梭菌(Clostridium difficile，cdc)，永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii，clj)或丁酸梭菌(Clostridium butyricum，cbut)。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于梭菌属(Clostridium:Clostridiumorbiscindens,fpla；Clostridium beijerinckii NCIMB 8052,cbe；Clostridiumacetobutylicum ATCC 824,cac；Clostridium ljungdahlii,clju；Clostridiumcarboxidivorans,ccar)，链霉菌属(Streptomyces:Streptomyces scabiei,scb)，拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis:Pestalotiopsis fici,pfy)，链格孢属(Alternaria:Alternariaalternata,aalt)。梭杆菌属(Fusobacterium:Fusobacterium varium,fva；Fusobacteriummortiferum,fmo)，螺旋体属(Brachyspira:Brachyspira pilosicoli B2904,bpj；Brachyspira pilosicoli WesB,bpw)。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶来源于解黄酮梭菌(Clostridiumorbiscindens,fpla)，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052,cbe)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC 824,cac)，疮茄病链霉菌(Streptomycesscabiei,scb)，烟草赤星病菌(Alternaria alternata,aalt)，永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii,clju)，食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans,ccar)，可变梭杆菌(Fusobacterium varium,fva)，死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum,fmo)，肠道螺旋体WesB(Brachyspira pilosicoli WesB,bpw)，无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis fici,pfy)，肠道螺旋体B2904(Brachyspira pilosicoli B2904,bpj)。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶为野生型或突变体。
在另一优选例中，所述的黄酮还原酶选自：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮还原酶活性的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％，更佳地，至少98％或99％)的序列相同性，且具有黄酮还原酶活性的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示的序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。
在另一优选例中，所述黄酮还原酶为选自下组的形式：静息细胞、菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液、或其组合。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述黄酮还原酶的浓度为0.01－100μM，较佳地，0.1－50μM，更佳地，0.5－20μM。
在另一优选例中，所述反应的产物的浓度为0.01－1mM，较佳地，0.05－0.5mM，更佳地，0.1－0.2μM。
在另一优选例中，所述反应体系中还包括：FMNH2、FMN。
在另一优选例中，所述反应底物为
Figure BDA0002780513240000071
Figure BDA0002780513240000072
其中，R1为H或OH，R2为OH，R3为H，R4为OH，R5为H，R6为H、OH或O-C1-C4烷基，R7为OH、H或O-C1-C4烷基，R8为H为OH。
在另一优选例中，当所述反应底物为式I化合物时，所述反应产物为式II化合物。
在另一优选例中，当所述反应底物为式II化合物时，所述反应产物为式I化合物。
在另一优选例中，所述反应具有选自下组的一种或多种特征：
(i)反应体系的pH为4-10，较佳地，5-9，更佳地，6-8；
(ii)反应温度为20-50℃，较佳地，25-45℃，更佳地，30-42℃，更佳地，35－40℃；
(iii)反应时间为10min－10h，较佳地，20min－5h，更佳地，30min－1.5h；
(iv)催化还原反应的kcat值为0.005s-1－0.040s-1，较佳地，0.012s-1－0.020s-1。；
(v)催化还原反应的Km值为2－20μM，较佳地，4－15μM，更佳地，6－10μM；
(vi)催化氧化反应的kcat值为0.015s-1－0.100s-1，较佳地，0.040s-1－0.080s-1；
(vii)催化氧化反应的Km值为3－50μM，较佳地，6－30μM，更佳地，10－20μM。
本发明第八方面提供了一种本发明第一方面所述的黄酮还原酶或本发明第四方面所述的宿主细胞的用途，用于催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物还原为二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物；和/或催化二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物氧化为黄酮类化合物/黄酮醇类化合物；或被用于制备催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物还原为二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物；和/或催化二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物氧化为黄酮类化合物/黄酮醇类化合物的催化制剂。
在另一优选例中，所述黄酮类化合物/黄酮醇类化合物具有式I所示的结构：
Figure BDA0002780513240000081
其中，R1为H或OH，R2为OH，R3为H，R4为OH，R5为H，R6为H、OH或O-C1-C4烷基，R7为OH、H或O-C1-C4烷基，R8为H为OH。
在另一优选例中，所述二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物具有式II所示的结构：
Figure BDA0002780513240000091
其中，R1为H或OH，R2为OH，R3为H，R4为OH，R5为H，R6为H、OH或O-C1-C4烷基，R7为OH、H或O-C1-C4烷基，R8为H为OH。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了黄酮还原酶的发现和鉴定，图1a显示了肠道微生物降解黄酮和黄酮醇为芳香族衍生物(只显示了母核，侧链基团未示出)，图1b显示了异黄酮还原酶IFR能催化异黄酮的C2-C3双键的还原，但不能催化黄酮的还原，图1c显示了通过对黄酮降解途径下游基因的比较基因组学分析预测黄酮还原酶候选基因，图1d显示了A4U99_05915在大肠杆菌中表达并鉴定为黄酮还原酶基因；
发酵条件：TB培养基(5ml)，N2(0.2MPa)，5％的接种量(v/v)。
图2显示了建立黄酮还原酶的体外催化体系和对黄酮还原酶酶学特性的分析，其中图2a显示了FLR酶液的紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱谱显示FMN是可能的辅因子，图2b显示了偶联NADH生成FMNH2的反应体系中，芹菜素被黄酮还原酶还原为柚皮素，图2c显示了液相色谱验证FLR可以催化芹菜素和柚皮素的相互转化，图2d显示了液相色谱-质谱联用验证FLR可以催化芹菜素和柚皮素的相互转化，图2e显示了FLR的最适催化条件和米氏曲线的鉴定，图中显示为3次生物学重复的结果。
图3显示了FLR是一类可特异性催化黄酮和黄酮醇母核C2-C3键加氢的还原酶。
图4显示了FLR在不同微生物中普遍存在，图4a显示了常见梭菌中黄酮还原酶的蛋白序列及保守氨基酸残基分析，图4b显示了不同微生物来源的FLR蛋白的进化关系，图4c显示了12种不同微生物宿主来源的FLR蛋白的体外酶活测定，图4d显示了图4c中的黄酮还原酶对应的物种名称和基因编号。
具体实施方式
通过广泛而深入的研究，本发明人通过大量筛选，意外的筛到了可催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物(式I化合物)与二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物(式II化合物)的氧化还原反应的黄酮还原酶。具体地，本发明首次发现，本发明的黄酮还原酶可催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物还原为二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物；以及催化二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物氧化为黄酮类化合物/黄酮醇类化合物。在此基础上，完成了本发明。
基团定义
如本文所用，术语“-O-C1-C4烷基”是指具有(C1-C4烷基)-O-结构的基团，例如，CH3-O-、C2H5-O-、C3H8-O-、或类似基团。
酶
本发明中揭示的黄酮还原酶可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植物或微生物。此外，所述的酶也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组酶。优选的，本发明可应用重组的酶。
所述黄酮还原酶包括全长的酶或其生物活性片段(或称为活性片段)。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的酶的氨基酸序列也包括在本发明中。酶的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的酶的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长酶的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长酶的55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、或100％的活性。酶或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/CummingsPub.Co.P224。
本发明也可采用经修饰或改良的黄酮还原酶，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/的效力而加以修饰或改良的酶。所述经过修饰或改良的酶可以是与天然存在的酶具有较小的共同点，但也能发挥与野生型相同或基本相同的功能，且不会带来其它不良影响。也就是说，任何不影响酶的生物活性的变化形式都可应用于本发明中。
本发明还包括了编码所述黄酮还原酶的生物活性片段的分离的核酸，也可以是其互补链。作为本发明的优选方式，可对酶的编码序列进行密码子优化，以提高表达效率。编码酶的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的酶的生物活性片段的DNA序列之后，将其连入合适的表达构建物(如表达载体)中，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，得到所要的蛋白。
本发明还包括了包含编码所述黄酮还原酶的生物活性片段的核酸分子的表达构建物。所述的表达构建物可包括编码所述酶的基因表达盒，还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。所述的表达调控序列的设计是本领域公知的。表达调控序列中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及化合物生产，有利于工业化应用。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明的蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物与二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物的氧化还原反应的方法
本发明公开一种利用微生物异源生产黄酮类化合物/黄酮醇类化合物或二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物的方法。利用生物工程技术，表达相关的酶，体外催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物与二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物之间的氧化还原反应。
一种生产黄酮类化合物/黄酮醇类化合物或二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物的方法是：重组表达本发明的黄酮还原酶，较佳地，利用宿主细胞(原核细胞或真核细胞，如常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等)重组表达上述酶。表达获得的酶或能够表达上述酶的宿主细胞与底物黄酮类化合物/黄酮醇类化合物或二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物接触，从而催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物与二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物之间的氧化还原反应。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，本发明的黄酮还原酶可特异性的催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物与二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物之间的氧化还原反应。
(2)本发明首次发现，本发明的黄酮还原酶催化的FMN依赖型的黄酮还原反应是可逆反应。
(3)本发明首次发现，本发明的黄酮还原酶是黄素依赖型的氧化还原酶。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。
实施例1黄酮还原酶FLR的发现及验证
实验方法：
人体肠道菌群可进行黄酮类化合物的代谢，其中，最主要的两类化合物——黄酮和黄酮醇代谢途径中负责起始反应的关键酶尚未被发现和鉴定(图1a)。通过比较基因组学的方法预测了黄酮还原酶可能的候选基因，并将候选基因被逐一克隆至质粒上并导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，在添加芹菜素的培养基中进行厌氧发酵，测定是否有目标的二氢黄酮的生成。
实验步骤：
1)、我们测试已报道的黄酮类化合物还原酶——异黄酮还原酶IFR是否能催化黄酮的的还原反应，发现IFR只能特异性地催化异黄酮还原。说明黄酮还原反应由独特的还原酶负责。见图1b。
1)、我们首先利用position-specific iterative(PSI)-BLAST工具在Clostridium orbiscindens找到了上述两个基因的同源基因A4U99_05920和A4U99_15225。
2)、1)中的两个基因被输入STRING软件中用于进一步分析，我们发现与A4U99_05920和A4U99_15225在基因组结构上有临近或共现关系的基因分别是4和10个(图1c)，这14个基因中可能存在我们所寻找的黄酮还原酶。
3)、2)中的14个基因被逐一克隆至质粒上并导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，在添加芹菜素的培养基中进行厌氧发酵，测定是否有目标的二氢黄酮的生成(图1d)。
实验结果：
14个预测的基因被逐一克隆至质粒上并导入E.coli BL21(DE3)中进行表达。正如我们所预期，含有A4U99_05915基因的E.coli菌株能将培养基中的芹菜素还原为柚皮素(图1d)，这暗示该基因的编码产物极有可能是我们的目标蛋白——黄酮还原酶FLR。在此，该酶被命名为FLR。(图1d)。
实施例2黄酮还原酶的生化特性分析
实验方法：
构建了一个基于黄素辅因子的耦合反应体系，实现黄酮还原酶的体外催化反应，在不同pH值、不同温度和不同底物浓度下检测酶的黄酮还原反应和二氢黄酮氧化反应的催化效率，用于分析FLR的酶学性质。
实验步骤：
1)、根据酶提取液的全波长扫描结果中出现的380nm和447nm的两个特征吸收峰(图2a)，初步判断FLR是黄素依赖型的氧化还原酶。
2)、构建了一个基于黄素辅因子的耦合反应体系用于分析FLR的酶学性质。如图2b所示，该反应体系通过NADH依赖型的黄素氧化还原酶产生还原态的黄素辅因子——FMNH2，并以此作为电子供体，用于下一步黄酮还原酶催化FMNH2还原芹菜素的反应。
3)、利用2)中构建的酶反应体系，在不同pH值、不同温度和不同底物浓度下检测酶的催化效率，通过高效液相色谱测定单位时间内产物的生成量(图2d)。
实验结果：
正如我们所预期的，酶活性测定结果表明，当辅因子为FMNH2时，FLR能将芹菜素中的C2-C3双键还原为饱和的单键，从而生成柚皮素(图2c,d)，证明FLR是一种FMN依赖型的氧化还原酶。当我们将反应体系中的黄素辅因子FMNH2换成其氧化态的FMN时，FLR能够反向催化上述反应，即将柚皮素的C2-C3饱和单键氧化为双键，从而重新生成芹菜素(图2c)。说明FLR催化的FMN依赖型的黄酮还原反应是可逆反应。
我们进一步测试了FLR的最适反应条件。结果显示，当FLR的浓度为0.1μM，底物芹菜素浓度为100μM时，FLR的最适反应pH值和温度分别是7.0和37℃。在这个条件下，FLR催化芹菜素还原为柚皮素反应的kcat和Km值分别为1.65×10-2s-1和8.36μM；当FLR的浓度为0.1μM，底物柚皮素浓度为100μM时，而催化其逆反应，即柚皮素氧化生成芹菜素反应的kcat和Km值分别为5.77×10-2s-1和12.27μM(图2e)。
实施例3黄酮还原酶底物的普遍性
实验方法：
在已构建的酶催化体系下，选取不同种类且具有代表性的黄酮底物测试黄酮还原酶的催化活性。
实验步骤：
我们从黄酮类化合物的主要几类(黄酮、黄酮醇、异黄酮、花青素和色酮)选取有代表性的黄酮类化合物共14种，进行酶活测试。
实验结果：
结果表明，FLR对这几种物质都具有催化活性，显示了良好的底物适应性(图3)。而且，通过比较发现，这些黄酮的B环上如果出现较多或较大的取代基团，均会降低FLR对底物的的催化效率。例如，FLR催化还原白杨素、芹菜素、木犀草素的能力呈递减趋势，而且FLR催化还原母核上含有较大甲氧基的黄酮(香叶木素)的效率明显低于其他几种黄酮，对桔红素和川陈皮素，FLR则没有活性(图3)。鉴于黄酮醇在结构上与黄酮极其相似(差异仅在于C环在C3位的H是否被OH)，我们也测试了FLR是否能够还原黄酮醇类底物。结果表明,FLR对几种主要的黄酮醇——山奈酚，槲皮素，桑色素和杨梅素都具有催化活性(图3)，且底物C3位-OH的取代并未对酶活力产生重大影响，但随着母核上取代基团的增多，催化效率逐步降低(山奈酚＞桑色素＞槲皮素＞杨梅素)(图3)。
随后，也测试了FLR是否还能催化其他黄酮类化合物，如矢车菊素和飞燕草(属于花青素)、大豆素(属于异黄酮)和色酮(属于色原酮)，但均没有观察到催化活性(图3)。
上述结果表明，FLR是一类可特异性催化黄酮和黄酮醇母核C2-C3键加氢的还原酶,不同于黄酮合酶和黄酮醇合酶只能单独特异性的催化二氢黄酮/二氢黄酮醇氧化为对应的黄酮/黄酮醇，FLR具有广阔的底物谱，使其能对黄酮和黄酮醇这类两大类黄酮类化合物同时起到催化活性，这对黄酮代谢途径底物的广谱性有重要意义，保证拥有该酶肠道菌能广泛降解不同种类的黄酮类化合物。
实施例4黄酮还原酶分布的普遍性
实验方法：
将黄酮还原酶的氨基酸序列输入BLASTP中比对，揭示黄酮还原酶分布的普遍性，并选取不同物种来源的FLR蛋白进行体外酶活测定，为筛选更优催化性能的黄酮还原酶提供参考。
实验步骤：
进一步通过tblastn工具在NCBI数据库中进行比对寻找黄酮还原酶FLR的同源基因。选取具有代表性的常见物种来源的FLR蛋白进行序列比对展示，建立种系发育树，并从中挑选具有代表性的FLR同源蛋白纯化，测定其黄酮还原酶的活性。
实验结果：
发现与FLR编码基因序列高度相似的潜在黄酮还原酶基因广泛存在不同种类的微生物中(图4b)，其中最主要的是原核微生物，且绝大部分为肠道细菌，又以厚壁菌门的梭菌纲最为常见，包括常见的解黄酮梭菌(fpla)，拜氏梭菌(cbe)，艰难梭菌(cdc)，永达尔梭菌(clj)和丁酸梭菌(cbut)等(图4a)。从中挑选了12种不同微生物宿主来源的FLR同源蛋白进行体外酶活测试(图4d)，发现这些FLR蛋白均具有黄酮还原酶活性(图4c)，图4d显示了图4c中的黄酮还原酶对应的物种名称和基因编号。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 安徽吐露港生物科技有限公司
<120> 一类新型黄酮还原酶及其应用
<130> P2020-1941
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Met Lys Ile Leu Gly Ile Ser Gly Gly Met Arg Asn Gly Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gly Met Cys Ile Glu Ala Leu Met Gly Ala Lys Glu Met Gly Ala Glu
20 25 30
Val Glu Phe Ile Gln Leu Gln Asn Leu His Ile Glu His Cys Thr Gly
35 40 45
Cys Thr Ala Cys Val Gln Ser Val Leu Gly Gly Arg Gly Gly Lys Cys
50 55 60
Val Leu Lys Asp Asp Phe Asp Trp Leu Leu Asp Lys Met Leu Asp Ala
65 70 75 80
Asp Gly Ile Val Phe Ser Thr Pro Ile Phe Glu Lys Gly Ala Thr Gly
85 90 95
Leu Phe His Thr Ile Thr Asp Arg Phe Gly Pro Arg Met Asp Arg Gly
100 105 110
Asn Asn Ile Ile Gly Thr Lys Ile Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Ala
115 120 125
Pro Asp Pro Arg Ile Leu Lys Asp Lys Val Ile Ser Phe Met Ser Val
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Trp Val Thr Arg Thr Gln Cys Asp Ala Gly Met Leu
145 150 155 160
Ala Leu Thr Pro Met Trp Lys Val Ile Asp Asn Glu Val Phe Pro Trp
165 170 175
Ala Leu Ser Ile Leu Val Glu Asp Glu Arg Val Ala Arg Ala His Gln
180 185 190
Ile Gly Arg Asn Ile Ala Glu Ala Ala Lys Asp Ile Glu His Ala Gln
195 200 205
Tyr Gln Gly Asp Ala Gly Val Cys Pro His Cys His Ser Arg Asn Phe
210 215 220
His Leu Gln Asp Gly Lys Ala Ile Cys Cys Leu Cys Gly Leu Glu Gly
225 230 235 240
Glu Ile His Asn Glu Gly Gly Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Pro Ala Glu
245 250 255
Gln Leu Glu His Ala His Asp Thr Leu Ser Gly Lys Phe Ile His Gly
260 265 270
Asn Asp Ile Lys Glu Asn Thr Gly Lys Lys Ile Ala Asn Met Gln Thr
275 280 285
Glu Lys Tyr Lys Ala Arg Gln Ala Ala Tyr Arg Ala Phe Ile Thr Ala
290 295 300
Thr Val Pro Glu Lys Gly
305 310
<210> 2
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
atgaaaattt tgggtatttc cggcggtatg cgcaacggca gcaacgacgg tatgtgcatc 60
gaggccctga tgggggccaa ggagatgggc gccgaggtgg agttcatcca gctgcagaac 120
ctgcacatcg agcactgcac cggctgcacc gcctgcgtgc agagcgtgct gggcggccgc 180
ggcggcaagt gcgtgctgaa ggacgacttt gactggctgc tggacaagat gctggacgcc 240
gacggcattg tcttctccac ccccatcttt gagaagggcg ccaccggcct cttccacacg 300
attaccgacc gctttggccc ccgcatggat cgcggcaaca acatcatcgg caccaagatc 360
gccgaggaga ccggcggcac cgcccccgat ccccgcatcc tgaaggacaa ggtcatctcc 420
ttcatgtccg tgggcggctc cgactgggtg acccgcaccc agtgtgacgc cggcatgctg 480
gccctgaccc ccatgtggaa ggtcattgac aacgaggtgt tcccctgggc gctgtccatc 540
ctggtggagg acgagcgggt ggcccgcgcc caccagatcg gccgcaacat tgccgaggcc 600
gccaaggaca tcgagcacgc ccagtaccag ggcgacgccg gcgtgtgccc ccactgccac 660
agccgcaact tccacctgca ggacggcaag gccatctgct gcctgtgcgg cctggagggc 720
gagatccaca acgagggcgg caagtactcc ttcaccttcc ccgccgagca gctggagcac 780
gcccacgaca ccctgtccgg caagttcatc cacggcaacg acatcaagga gaataccggc 840
aagaagatcg ccaacatgca gaccgagaag tacaaggccc gccaggccgc gtaccgcgcc 900
tttatcaccg ccaccgtgcc cgagaagggc tga 933
<210> 3
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
atgaaagtta tgggaatagt tgctggaaga cataatggaa acagcgaaat tttagtaaaa 60
caagctttaa cagctgtaaa agatgcagga ggagaggcta tacttattaa tttatttgat 120
tatgatataa agccttgctc aggctgcgaa tcatgtacaa taggcatgga gaaagcattt 180
aaagaaaaaa aagaatataa aggctgcatc tacaaagaaa aagatgatat ggacaaaata 240
gttaatgtta tgaatgaatg cgaaggtata atagttggct gtcctactta tgatttgctt 300
ccttcttcat tatatttatc atttgctcag agatttttgg cttatgaatt atcatttaga 360
ataaagatag gacaagtaaa aaaagaccct cacacagtag caggacttat aggagtggga 420
ggctctaaac atgattggca gactatgagt ttggaggggc ttgctgctac aatgtttact 480
caatctatca cagtagttga tatgtattta gctacaagcg ttggaagacc aggaaacgtt 540
ctcatacata aagactattt ggagagagct tacaaaatag gtaaaaacat agtacaagca 600
attaatacac ctgttgaaga gaggaaatgg ctaggagatc ctaatttagg tttatgccca 660
agatgtcatt cttctttaat atatccaggc gaagagcatt gggacggagt taagtttaat 720
tttgaatgtg ctgtttgcgg tgcgggagga gatttagtaa aaagagaaaa tggaaagtat 780
aaatttgtgc ttgctgaaaa cggacttata agagacagaa acattaaaga agcaagggca 840
gtgcatttac aagagataat ggagacaaga gataatttca tgtctaaaaa gggagagata 900
gaagaagaat ataaaagatt tagagagatg aaatttgaaa ctataaaata g 951
<210> 4
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
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gtatcatggg tccatgttcc gtcggtcgaa atacctagga atcctaagcc cttgaagact 180
gctgccgaca tctcgctcgg caaggtcacc tcaatgaaag caggcgcctc ttcgtcgcca 240
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gaggcaggcg accccaagtt caaggatcaa gtcgccgatg cccgggtgct caagcctaga 480
gtcgtgggct tcttggttgt ggccggatcc aagtacagtg agcattacac aatggctttg 540
ccgactctac accaatttgt ttatcccatc cacgcaaagg tcgtggacca gatcatcttt 600
tctgggtttg ccagccccgg ctcggtcatc ttcaaggatg gcggaagttg tgttgagcgg 660
gcgaagcttc tgggcaagaa tgttgcaagt cagcttggga aaaagttcga cgatgccact 720
tatcttggcc ccaagacaga aggatcatgc ccctactgcc atctttcgca atttgagttc 780
attggaggaa ccaccaatga gatttgctgt gtcatctgtg gcatgagggg aacgttggtg 840
gcccagggca acgcaatcaa gtcagtctgg tcatcagacg cgagccagag ttgcatcacc 900
atggaaggca aattcctgca tgctgaccat atccaagatg cgggcatgga ggaagcgcaa 960
gctcgccagg cctttacgcc ccaaaagctc gagaccgtta aatcggattt gcttggtctt 1020
gatattccgg tgctaccatt gccaagcaca aagcgatcac aaaatctgag caaaagctcc 1080
agcttctgct ctgtgatgta g 1101

Claims (10)

1.一种分离的黄酮还原酶，其特征在于，所述的黄酮还原酶选自：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮还原酶活性的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％，更佳地，至少98％或99％)的序列相同性，且具有黄酮还原酶活性的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的黄酮还原酶，其特征在于，所述黄酮还原酶催化如下反应：
Figure FDA0002780513230000011
其中，R1为H或OH，R2为OH，R3为H，R4为OH，R5为H，R6为H、OH或-O-C1-C4烷基，R7为OH、H或-O-C1-C4烷基，R8为H为OH。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸是编码权利要求1所述的黄酮还原酶。
4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种产生权利要求1所述黄酮还原酶的方法，其特征在于，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达出黄酮还原酶；和
分离所述黄酮还原酶。
7.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求1所述的黄酮还原酶。
8.一种催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物与二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物的氧化还原反应的方法，其特征在于，包括步骤：
在反应体系中，将黄酮还原酶与反应底物接触。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应底物为
Figure FDA0002780513230000021
其中，R1为H或OH，R2为OH，R3为H，R4为OH，R5为H，R6为H、OH或-O-C1-C4烷基，R7为OH、H或-O-C1-C4烷基，R8为H为OH。
10.一种权利要求1所述的黄酮还原酶或权利要求5所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物还原为二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物；和/或催化二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物氧化为黄酮类化合物/黄酮醇类化合物；或被用于制备催化黄酮类化合物/黄酮醇类化合物还原为二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物；和/或催化二氢黄酮类化合物/二氢黄酮醇类化合物氧化为黄酮类化合物/黄酮醇类化合物的催化制剂。
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