CN114787334A

CN114787334A - 单酰基型mel生产菌

Info

Publication number: CN114787334A
Application number: CN202080086063.7A
Authority: CN
Inventors: 森田友岳; 杂贺梓; 福冈德马; 北本大; 菅原知宏; 山本周平; 曾我部敦
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2022-07-22
Also published as: US20230037120A1; EP4074836A1; EP4074836A4; WO2021117580A1; JPWO2021117580A1

Abstract

本文提供单酰基型MEL。产生单酰基型MEL‑B的拟酵母属微生物。

Description

单酰基型MEL生产菌

技术领域

本文公开了涉及生物表面活性剂(更具体地，单酰基型MEL)的生产菌以及应用其制备单酰基型MEL的技术。

背景技术

生物表面活性剂是微生物生产的天然表面活性剂，生物降解性高，环境负荷低，具有多种有益的生理功能。因此，如果用于食品工业、化妆品工业、药物工业、化学工业、环境工业领域等，在实现环境友好型社会方面是有意义的。

生物表面活性剂分类为糖脂质型、酰基肽型、磷脂质型、脂肪酸型和高分子型五种。在它们之中，糖脂质型的表面活性剂的研究最多。作为这样的糖脂质型的生物表面活性剂，已知赤藓糖醇与甘露糖糖苷键连接的甘露糖赤藓糖醇(下文中，也称为ME)中、进一步脂肪酸酯键连接的甘露糖赤藓糖醇脂(下文中，也称为MEL)，以及鼠李糖脂、黑粉菌酸、海藻糖脂和槐糖脂等。

MEL中存在结合的脂肪酸残基以及乙酰基的位置以及数目等不同的各种结构。图1中显示以R₁～R₅示出氢原子、乙酰基、以及碳原子数3～18的脂肪酸残基的MEL的结构式。R₁和R₂是脂肪酸残基、且R₃和R₄是乙酰基的结构物定义为MEL-A，R₃是氢原子、R₄是乙酰基的结构物定义为MEL-B，R₃是乙酰基、R₄是氢原子的结构物定义为MEL-C，R₃和R₄是氢原子的结构物定义为MEL-D。取决于与甘露糖结合的赤藓糖醇的羟甲基来自1位碳或4位碳，得到的ME的结构如图2(a)、(b)所示而不同。以图2(a)所示4-O-β-D-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇(4-O-β-D-mannopyranosyl-erythrito1)为糖骨架的MEL称为4-O-β-D-MEL。已知筑波拟酵母(Pseudozyma tsukubaensis)以图2(b)所示1-O-β-D-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇为糖骨架生产1-O-β-D-MEL-B。1-O-β-MEL-B与4-O-β-MEL-B相比具有水合性提高、囊泡形成能力也高的特征，是作为护肤剂等有希望的生物材料。

据报告，通过仅以葡萄糖作为碳源培养MEL生产菌，生产脂肪酸仅与图1的MEL中的R₂结合，R₁、R₃和R₄是氢原子的单酰基型MEL(单链型MEL)(非专利文献1)。该单酰基型MEL与以往的二酰基型MEL比较亲水性提高(非专利文献1)。

MEL生物合成途径已被报告，通过结合甘露糖和赤藓糖醇的糖转移酶、结合脂肪酸的酰基转移酶、结合乙酰基的乙酰基转移酶的反应，MEL在细胞内合成(非专利文献2)。

本发明人发现，通过使具有生产生物表面活性剂的能力的微生物的酰基转移酶的基因缺失，得到脂肪族酰基仅与图1结构式中R1结合的单酰基型MEL(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利申请2016-191438

非专利文献

非专利文献1：Fukuoka et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.(2007)76：801-810.

非专利文献2：Hewald et al.，Appl.Environ.Microbiol.(2006)72：5469-5477

发明概述

发明要解决的问题

在如上述的现状下，提供新的MEL是一个问题。

用于解决问题的手段

为了解决这一问题而反复深入研究，结果发现，通过使具有生产生物表面活性剂的能力的微生物的转运蛋白的基因缺失，得到图1的结构式中仅R₁具有脂肪族酰基、R₄结合乙酰基或羟基的单酰基型MEL。基于这些发现进一步反复研究和探讨，结果提供下述代表的发明。

第1项

产生单酰基型MEL-B的拟酵母属(Pseudozyma)微生物。

第2项

第1项中记载的微生物，其缺损编码转运蛋白(PtMMF1)的基因。

第3项

第1或2项中记载的微生物，其进一步产生单酰基型MEL-D。

第4项

第1～3项的任一项中记载的微生物，其中，微生物是筑波拟酵母(Pseudozymatsukubaensis)。

第5项

应用第1～4项的任一项中记载的微生物制备单酰基型MEL-B的方法。

第6项

通过培养第1～4项的任一项中记载的微生物得到的含MEL组合物。

发明效果

提供生产单酰基型MEL-B的手段。

附图简述

[图1]显示MEL的结构。

[图2]显示4-O-β-D-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇(a)以及1-O-β-D-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇(b)的结构。

[图3]显示PtMMF1破坏载体。

[图4]显示转化体的菌落PCR的结果。

[图5]显示用薄层色谱分析PtMMF1破坏株的培养物的结果。

[图6]显示用高效液相色谱-质谱仪分析PtMMF1破坏株的培养物的结果。

[图7]显示用核磁共振光谱法分析PtMMF1破坏株的培养物的结果。

[图8]显示对于PtMMF1破坏株培养液的丙酮提取物测定表面张力的结果。

用于实施发明的方式

优选微生物产生单酰基型MEL-B。单酰基型MEL-B如上述，在图1所示结构式中，R₁是碳原子数2～24的脂肪族酰基，R₂是氢原子，R3是氢原子，R₄是乙酰基。脂肪族酰基的碳原子数优选2～24，更优选6～14。

生产单酰基型MEL-B的微生物的种类没有特别限制。在一个实施方案中，单酰基型MEL-B生产微生物优选属于拟酵母属(Pseudozyma)、莫氏黑粉菌(Moesziomyces)属、黑粉菌(Ustilago)属、孢堆黑粉菌(Sporisorium)属、瘤黑粉菌(Melanopsichium)属、或克氏担孢酵母(Kurtzmanomyces)属。优选的拟酵母属微生物是南极拟酵母(Pseudozymaantarctica)(南极莫氏黑粉菌(Moesziomyces antarcticus))、Pseudozymaparantarctica、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma siamensis、山西拟酵母(Pseudozymashanxiensis)、Pseudozyma crassa、Pseudozyma churashimaensis、蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)(蚜虫莫氏黑粉菌(Moesziomyces aphidis))、湖北拟酵母(Pseudozyma hubeiensis)、和筑波拟酵母(Pseudozyma tsukubaensis)。优选的莫氏黑粉菌属微生物是南极莫氏黑粉菌(Moesziomyces antarcticus)、蚜虫莫氏黑粉菌(Moesziomyces aphidis)。优选的黑粉菌属微生物是大麦坚黑粉菌(Ustilago hordei)和玉米黑粉菌(Ustilago maydis)。优选的孢堆黑粉菌属微生物是玉米孢堆黑粉菌(Sporisorium reilianum)和甘蔗孢堆黑粉菌(Sporisorium scitamineum)。优选的瘤黑粉菌属微生物是宾地瘤黑粉菌(Melanopsichium pennsylvanicum)。优选的克氏担孢酵母(Kurtzmanomyces)属微生物是克氏担孢酵母物种(Kurtzmanomyces sp.)I-11。在优选的一个实施方式中，MEL产生微生物是拟酵母属微生物，更优选属于筑波拟酵母的微生物，更具体地，是筑波拟酵母1E5(JCM16987株)、NBRC1940(ATCC24555、CBS422.96、CBS6389、DBVPG6988、PYCC4855、JCM10324、MUCL29894、NCYC1510、NRRLY-7792)。已知属于筑波拟酵母的微生物选择性生产1-O-β-MEL-B。

在一个实施方式中，单酰基型MEL生产微生物可以通过在生产以往的MEL的微生物中加入突变得到。此处，以往的MEL是二酰基型MEL。突变的种类没有特别限制，优选地，优选是破坏编码MEL生产微生物具有的转运蛋白的基因的突变。基因的破坏意味着基因编码的蛋白质(例如，转运蛋白)变得无功能，其方式没有特别限制。在一个实施方式中，通过破坏编码MEL产生微生物具有的转运蛋白的基因，可以得到生产单酰基型MEL的微生物。MEL生产微生物通常具有转运蛋白(MMF1)。

基因的破坏可以用任意方法进行。例如，基因的破坏可以通过在该基因的碱基序列中导入突变的方法、使该基因的表达控制区(启动子等)破坏或缺失的方法、或抑制该基因的转录产物的翻译的方法实施。这些可以应用例如同源重组法、转座子法、转基因法、转录后基因沉默法、RNAi法、无义介导衰变(Nonsense mediated decay，NMD)法、核酶法、反义法、miRNA(micro-RNA)法、siRNA(小干扰RNA)法等进行。

在一个实施方式中，基因的破坏优选应用同源重组法进行。通过同源重组法破坏基因的方法是公知的。例如，通过同源重组法破坏目标基因是下列方法：制成在目标基因的ORF中插入耐药性或互补营养需求的基因等的选择标记物基因的基因盒，将其整合到适当的载体(例如，质粒)，导入宿主微生物(例如，以往的MEL生产微生物)，通过同源重组在目标基因中插入标记物基因。目标基因被破坏的微生物可以通过上述标记物基因的表达选择。

同源重组法中使用的标记物基因可以使用基因工程中通常使用的转化体的选择标记物基因。例如，列举对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、氯霉素、和G418等药剂赋予抗性的基因，与尿嘧啶合成酶、亮氨酸合成酶、腺嘌呤合成酶、和赖氨酸合成酶等营养需求互补的基因。

在一个实施方式中，目标基因优选MMF1基因。代表性MMF1基因的实例如下。序列编号1是编码来自南极拟酵母(Pseudozyma antaractica)T34株的转运蛋白(PaMMF1)的碱基序列。序列编号2是编码来自南极拟酵母(Pseudozyma antaractica)JCM10317株的转运蛋白(PaMMF1)的碱基序列。序列编号3是编码来自湖北拟酵母(Pseudozyma hubeiensis)SY62株的转运蛋白(PhMMF1)的碱基序列。序列编号4是编码来自筑波拟酵母NBRC1940株的转运蛋白(PtMMF1)的碱基序列。序列编号5是编码来自筑波拟酵母1E5株的转运蛋白(PtMMF1)的碱基序列。序列编号6是编码来自蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)DSM70725株的转运蛋白(MMF1)的碱基序列。可以构建用于基于这些序列信息破坏转运蛋白的基因的载体。另外，南极拟酵母(P.antarctica)T-34也称为“南极莫氏黑粉菌(Moesziomyces antarcticus)T-34”。蚜虫拟酵母(P.aphidis)也称为“蚜虫莫氏黑粉菌(Moesziomyces aphidis)”。

基因破坏中使用的载体的种类是任意的，可以相应于宿主的种类适当选择。作为以拟酵母属为宿主的情形中的载体，例如，可以示例pUXV1 ATCC 77463、pUXV2 ATCC77464、pUXV5 ATCC 77468、pUXV6 ATCC 77469、pUXV7 ATCC 77470、pUXV8 ATCC 77471、pUXV3 ATCC 77465、pU2X1 ATCC 77466、pU2X2 ATCC 77467、pTA2、pUXV1-neo、pPAX1-neo、pPAA1-neo(Appl Microbiol Biotechnol(2016)100：3207-3217、pUC_neo和pUC_T_neo等。

载体向宿主细胞的导入可以用任意方法进行，可以相应于宿主细胞和载体的种类等适当选择。载体的导入可以通过例如电穿孔、磷酸钙共沉淀法、脂质转染、显微注射以及醋酸锂法等实施。

优选微生物除单酰基型MEL-B外还产生单酰基型MEL-D。这样的微生物也可以通过上述的转运蛋白基因破坏得到。在一个实施方式中，优选微生物产生单酰基型MEL-B、单酰基型MEL-D、和二酰基型MEL-B。这样的微生物也可以通过上述的转运蛋白基因破坏得到。

应用上述微生物的单酰基型MEL-B、单酰基型MEL-D和/或二酰基型MEL-B的生产可以通过任意方法进行。例如，可以通过在适于上述微生物的培养的培养基中培养生产单酰基型MEL-B、单酰基型MEL-D和/或二酰基型MEL-B。作为这样的培养基，没有特别限制，例如，碳原料期望应用葡萄糖、蔗糖、废糖蜜等糖质。附加于或代替糖质，也可以应用油脂类等作为碳源。油脂类的种类没有特别限制，例如，优选添加植物油脂、或脂肪酸或其酯类。

在一个实施方式中，优选在培养基中添加植物油脂。植物油脂的种类没有特别限制，可以相应于作为目标的MEL的种类等适当选择。例如，可以列举大豆油、橄榄油、菜籽油、红花油、芝麻油、棕榈油、葵花油、椰子油、可可油以及蓖麻油等。作为脂肪酸，例如，可以列举辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、山嵛酸和神经酸等。在一个实施方式中，优选的脂肪酸是油酸。

在一个实施方式中，可以在仅包含葡萄糖作为碳源的培养基中培养生产单酰基型MEL-B、单酰基型MEL-D和/或二酰基型MEL-B的微生物。作为氮源，可以组合应用有机氮源和无机氮源。例如，作为有机氮源，可以应用选自酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨、聚蛋白胨、玉米浆、酪蛋白氨基酸和尿素的一种或组合应用二种以上。

作为无机氮源，可以应用选自硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵和氨的一种或组合应用二种以上。在另一实施方案中，提供制备单酰基型MEL-B、单酰基型MEL-D和/或二酰基型MEL-B的方法，包括在添加了脂肪酸和甘油的培养基中培养上述微生物。

脂肪酸和油脂类的量没有特别限制，例如，可以以各培养基中的浓度为0.1～40容量％的方式添加。

微生物的培养条件没有特别限制。例如，可以在pH5～8、优选pH6、温度20～35℃、优选22～28℃的条件培养3～7天。

上述微生物产生的单酰基型MEL-B、单酰基型MEL-D和/或二酰基型MEL-B的提取可以通过任意方法进行。例如，离心分离培养液或菌体破碎液，回收上清，在上清中加入适当的提取溶剂，回收提取溶剂层，根据需要进行进一步纯化，可以得到单酰基型MEL。在一个实施方式中，单酰基型MEL的提取中应用的提取溶剂优选选自乙酸乙酯、甲醇、乙醇和丙酮和它们的混合物的一种以上。

优选培养上述微生物的培养物(或其提取物)是包含单酰基型MEL-B的组合物，包含单酰基型MEL-B和单酰基型MEL-D的组合物，或包含单酰基型MEL-B、单酰基型MEL-D和二酰基型MEL-B的组合物。在一个实施方式中，优选含MEL组合物包含单酰基型MEL-B、单酰基型MEL-D和二酰基型MEL-B，优选各MEL占总MEL的比例是单酰基型MEL-B为约50质量％、单酰基型MEL-D为约17质量％、二酰基型MEL-B为约33质量％。这样的含MEL组合物(MEL混合物)可以更高浓度溶解于水性溶剂。

实施例

在下文中，通过实施例对本发明进一步详细地说明，但本发明不限于此。

1.材料

·使用菌体

筑波拟酵母(Pseudozyma tsukubaensis)1E5株(JCM16987)

·培养基

YM培养基：在去离子水1L中溶解酵母提取物3g、麦芽提取物3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g而配制。按需要添加琼脂20g成为琼脂培养基。

添加甘油的YM培养基：在去离子水1L中溶解酵母提取物3g、麦芽提取物3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、甘油50g而配制。

MEL生产培养基：在去离子水1L中溶解酵母提取物5g、硝酸钠3g、磷酸二氢钾0.3g、硫酸镁七水合物0.3g、甘油20g而配制。5-FOA琼脂培养基：在去离子水1L中溶解酵母氮基质w/o AA(Yeast nitrogen base w/o AA)1.7g、硫酸铵5g、葡萄糖20g、尿嘧啶0.5g、5-FOA2g、琼脂20g而配制。

1.尿嘧啶需求性突变株的取得

将1接种环的筑波拟酵母1E5株接种在YM培养基2ml中，在25℃、180rpm的条件振荡培养24小时。将培养液铺在培养皿中，在距UV灯(Panasonic公司制GL15灭菌灯)45cm的位置配置板。照射UV，回收0.2ml培养液。将回收的培养液在25℃温育3小时，在5-FOA琼脂培养基中涂布接种。将接种的板在25℃温育10天，使菌落生长。用牙签将在5-FOA琼脂培养基中生长的菌落在YM琼脂培养基中继续接种，将菌体的一部分供给菌落PCR和序列分析。PCR的引物应用具有下述碱基序列的那种。

seq_PtURA3_F1：GCTGCTGTGTCCGCTGCACG(序列编号7)

seq_PtURA3_F2：GAGATGTCGTCGGCTGGAGC(序列编号8)

seq_PtURA5_F1：GAGTGCCGACGGTGGACGTC(序列编号9)

seq_PtURA5_F2：CAGAACTCAAAGGTCGTGTC(序列编号10)

序列分析的结果是，确认PtURA5基因中插入突变。另外，进行得到的尿嘧啶需求性突变体的营养需求性试验，确认具有尿嘧啶需求性。此外，也确认维持MEL生产能力。

2.PtMMF1基因的破坏株的取得

2-1.PtMMF1载体的构建

以筑波拟酵母1E5株的基因组DNA为模板用PCR扩增PtMMF1基因区(包含基因的上游、下游2kb)。PCR的引物应用具有下述碱基序列的那种。

PtMMF1_pUC18_IF_F：CTCTAGAGGATCCCCTTATCCACCTGCCCGTTTTAGCAC(序列编号11)

PtMMF1_pUC18_IF_R：TCGAGCTCGGTACCCATAACCTCTGTGTTACTGACCGTGC(序列编号12)

将扩增的DNA片段与pUC18载体连接，制备pUC-PtMMF1载体。

2-2.PtMMF1破坏载体的构建

以筑波拟酵母1E5株的基因组DNA为模板用PCR进行PtURA5基因区(包含基因的上游1kb和下游0.5kb)的扩增，取得PtURA5基因片段。PCR的引物应用具有下述碱基序列的那种。

PtMMF1_URA5_IF_F：GCACAAGGACACATCCCGAAGGTCATGGTGTTCCCGGTG(序列编号13)

PtMMF1_URA5_IF_R：AGAAGGTCATGGCATACAAGCCAGATCAAGTTCGTCATG(序列编号14)

然后，以pUC-PtMMF1载体为模板用PCR进行线性化pUC-PtMMF1载体的扩增，取得基因片段。PCR的引物应用具有下述碱基序列的那种。

PtMMF1_pUC18_inverse_F：ATGCCATGACCTTCTTCCAAGTGTG(序列编号15)

PtMMF1_pUC18_inverse_R：GATGTGTCCTTGTGCTTGCCTGAAG(序列编号16)

连接上述中得到的线性化pUC-PtMMF1载体和PtURA5基因片段，制备PtMMF1破坏载体。通过PtMMF1破坏载体的序列分析确认插入目的片段。PtMMF1破坏载体的结构示于图3。图中URA5-P表示PtURA5基因的上游1kb，URA5-T表示PtURA5基因的下游0.5kb。

2-3.转化体的配制

应用限制酶KpnI和XbaI处理上述2-2.中得到的PtMMF1破坏载体而成的那种线性化后，用电穿孔法转化上述1.中得到的尿嘧啶需求性突变株。转化体的选择中使用尿嘧啶需求性消失。用菌落PCR和序列分析确认目的DNA片段通过同源重组插入目的基因组位置。PCR的引物应用具有下述碱基序列的那种。

引物对A_F：TCGGTGGACTCAGCTGCTCC(序列编号17)

引物对A_R：TGAATGTGTAGGCAGAGGTG(序列编号18)

引物对B_F：AGCTTTCCTCTCTTCAGGCAAGCAC(序列编号19)

引物对B_R：ACATTTAAGGATTCTACACACTTGG(序列编号20)

引物对C_F：AGAGGAGCGGACACTGAATTTTGG(序列编号21)

引物对C_R：GTTCATGTGAGGGTGGTTGCCACG(序列编号22)

图4显示转化体的菌落PCR的结果。图中ΔPtMMF1表示PtMMFl破坏株，箭头表示引物。此外，图中(a)表示菌落PCR中应用的引物的结合位置，(b)表示通过引物对A的菌落PCR的结果，(c)表示通过引物对B的菌落PCR的结果，(d)表示通过引物对C的菌落PCR的结果。菌落PCR的结果是，取得破坏了PtMMF1基因的突变株5株。

3.PtMMF1基因破坏株的生产物的评价

3-1.PtMMF1基因破坏株的培养

将PtMMF1基因破坏株5株分别用添加甘油的YM培养基2mL在25℃、250rpm振荡培养2天，得到预培养液。然后，在MEL生产培养基中添加了6％橄榄油的培养基20mL中接种预培养液1mL，在25℃、250rpm振荡培养7天。

3-2.PtMMF1基因破坏株的培养物的提取

将上述3-1中得到的菌体培养液以3,000rpm离心，回收培养上清。回收的上清于-20℃冷冻，然后进行冷冻干燥。在干燥后的上清中添加丙酮，涡旋搅拌后在室温静置一夜。静置后，回收丙酮层，用0.45μm的滤器过滤，作为丙酮提取物。

3-3.提取物中的MEL的评价

用薄层色谱(TLC)分析各丙酮提取物中包含的MEL。在展开相的组成为氯仿∶甲醇∶12％氨水＝55∶25∶2进行。向展开后的TLC板喷雾2％蒽酮硫酸试剂，95℃加热5分钟检出MEL的点。

培养PtMMF1基因破坏株的结果示于图5。图中ΔPtMAT1表示PtMAT1破坏株，ΔPtMAC2表示PtMAC2破坏株，ΔPtMMF1表示PtMMFl破坏株。分析的结果确认，PtMMF1基因破坏株中二酰基型MEL-B的生产量减少，代替地，单酰基型MEL-D和结构未知的糖脂质的生产占优势。

4.结构未知的糖脂质的分析

4-1.通过高效液相色谱-质谱仪(LC-MS)的分析

用LC-MS分析丙酮提取PtMMF1基因破坏株的培养物的样品。分析的条件如下述。

HPLC条件

柱：Asahipak NH2P-40-2D(SHODEX公司制)

流动相A：10mM甲酸铵

流动相B：乙腈

梯度：分析开始时A∶B＝5∶95，分析20分钟A∶B＝60∶40，从分析20.1分钟至分析结束时(35分钟)A：B＝5：95

流速：0.1mL/min

柱温度：25℃

样品注入量：5uL

MS条件

电离模式：DUIS

扫描范围：50-2000m/z

LC-MS分析的结果示于图6。如图6所示，确认PtMMF1破坏株生产的结构未知的MEL的质量数与单酰基型MEL-B(辛酸加合物)的甲酸离子加合物一致。

4-2.通过核磁共振光谱法(NMR)的分析

将丙酮提取物供给应用硅胶柱(Wakosil C-200、富士胶片和光纯药公司制)的开放柱，纯化结构未知的MEL。作为溶剂，应用氯仿和丙酮。

将用硅胶柱纯化的结构未知的MEL50mg溶解于1mL d4-甲醇，用Bruker AVANCE400(400MHz)进行分析。1H-NMR和2维NMR(COSY)的结果示于图7(a)(b)。如图7所示，在2.10ppm附近检测到1个来自乙酰基的质子的信号，并且与甘露糖第1位的信号(4.75ppm)的积分比是1∶3，因此判定结构未知的MEL是结合了一个乙酰基的单乙酰型MEL。此外，-COCH₂ -的信号(2.43ppm)与甘露糖第1位的信号(4.75ppm)的积分比是1∶2，因此判定结构未知的MEL是结合了一条脂肪酸链的单酰基型MEL。

如图7所示，甘露糖第6位的信号在4.23-4.48ppm低磁场偏移，此外作为PtMMF1破坏株的亲本株的筑波拟酵母1E5株生产在甘露糖第6位结合了乙酰基的MEL-B，因此考虑结构未知的MEL是MEL-B。此外，甘露糖第2位的信号在5.38-5.39ppm低磁场偏移，此外筑波拟酵母1E5株生产在甘露糖第2位和第3位结合了脂肪酸链的MEL-B，因此考虑脂肪酸链与甘露糖第2位结合。根据以上的结果判定，PtMMF1破坏株生产的结构未知的MEL是在甘露糖第2位结合了1条脂肪酸链的单酰基型MEL-B。

5.PtMMF1破坏株生产的MEL混合物的表面张力的测定

进行丙酮提取PtMMF1破坏株的菌体培养液得到的MEL混合物的表面活性能力的评价，该MEL混合物包含单酰基型MEL-B为主成分，单酰基型MEL-D和二酰基型MEL-B、二酰基型MEL-D为副成分。将丙酮提取物供给应用硅胶柱(Wakosil C-200、富士胶片和光纯药公司制)的开放柱，除去提取物中的残存油脂和残存脂肪酸。表面张力的测定应用协和表面科学株式会公司制的Dropmaster DMo-501进行，测定各种浓度的MEL混合物的表面张力。

如图8所示，表面张力的值伴随MEL混合物的浓度升高而减少，达到临界胶束浓度(CMC)时变为恒定。另外，根据图8，MEL混合物的CMC是4.0mg/mL。根据作为MEL混合物的主成分的单酰基型MEL-B(辛酸加合物)的分子量452计算时，可以换算为CMC＝8.88x10^-3M。此外，γCMC是33.1mN/m。

在亲本株生产的二酰基型MEL-B的情况下，已知CMC是3.1x10^-6M(T.Fukuoka等，Carbohydrate Research.，351(2012)81-86)。PtMMF1破坏株生产的MEL混合物的CMC比二酰基型MEL-B高1000倍以上，即使高浓度也作为单一MEL分子在水中均一分散，水溶性提高，可在水中迅速溶解。即，PtMMF1破坏株生产的MEL混合物在水系中的易用性优异。

根据图6所示结果推定，PtMMF1破坏株生产的MEL的约33质量％是二酰基型MEL-B，约50质量％是单酰基型MEL-B，约17质量％是单酰基型MEL-D。

Claims

1.产生单酰基型MEL-B的拟酵母属(Pseudozyma)微生物。

2.权利要求1所述的微生物，其缺损编码转运蛋白(PtMMF1)的基因。

3.权利要求1或2所述的微生物，其进一步产生单酰基型MEL-D。

4.权利要求1-3的任一项所述的微生物，其中，微生物是筑波拟酵母(Pseudozymatsukubaensis)。

5.应用权利要求1-4的任一项所述的微生物制备单酰基型MEL-B的方法。

6.通过培养权利要求1-4的任一项所述的微生物得到的含MEL组合物。