JP2011182740A

JP2011182740A - 新規微生物及びそれを用いる糖型バイオサーファクタントの製造方法

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Publication number: JP2011182740A
Application number: JP2010053209A
Authority: JP
Inventors: Tomotake Morita; 友岳森田; Tokuma Fukuoka; 徳馬福岡; Tomohiro Imura; 知弘井村; Masaru Kitamoto; 大北本
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2010-03-10
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2011-09-22
Anticipated expiration: 2030-03-10
Also published as: JP5565796B2

Abstract

【課題】安全性の高い単離源から得られた微生物であって、かつ高い異性体ＭＥＬ−Ｂの生産能を有する微生物を新たに単離するとともに、該微生物を用いて、異性体ＭＥＬ−Ｂの生産性向上を図る。
【解決手段】食用植物であるシソの葉から、シュードザイマ属に属する新種微生物及びシュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ)に属する新菌株を単離した。これら微生物の使用により、水和性、ベシクル形成能が高く、スキンケア剤等として新たな用途展開が期待される異性体ＭＥＬ−Ｂの生産性向上が可能となる。
【選択図】なし

Description

本発明は、スキンケア剤等として利用可能な糖型バイオサーファクタント（微生物由来の両親媒性脂質）を効率良く製造するために、新たに発見した糖型バイオサーファクタント生産能力が高い微生物を提供する。より具体的には、糖型バイオサーファクタントの一種であるマンノシルエリスリトールリピドを大量に生産する微生物を提供し、マンノシルエリスリトールリピドの高効率な生産を可能にする製造方法に関するものである。

糖脂質は、脂質に１〜１０数個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系・免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていること等が明らかにされつつある。一方で、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する物質は界面活性物質と呼ばれている。

一方、一部の微生物はこれらの界面活性物質を効率良く生産することが知られており、この生物由来界面活性剤（バイオサーファクタント）は、安全性が高く、環境に対する負荷が少ない生分解性に優れた環境先進型界面活性剤として研究が進められている。現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖型、アシルペプチド型、リン脂質型、脂肪酸型及び高分子化合物型の５つに分類されているが、特にこの内の糖型の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母によって生産された多くの種類の物質が報告されている。

これらのバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く適用することは、持続可能社会の実現と高機能製品の提供という、両面を兼ね備えており極めて有意義である。

糖型バイオサーファクタントには、次のようなものが例として挙げられる。

ラムノリピド（Rhamnolipid；以下、ＲＬと省略する。）は、結核菌の抗生物質としてシュードモナスアエルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（緑膿菌）の培養液から最初に発見されている（非特許文献１参照）。
また、これまでにシュードモナス（Pseudomonas）属の細菌から４種類の同族体が報告されており、当初は数ｇ／Ｌ程度の生産量であったが、現在では１００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献２参照）。

トレハロースリピド（Trehalose lipid；以下、ＴＬと省略する。）は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）等の細胞表層物質として発見された。また、類似の物質が、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ロドコッカス（Rodococcus）属細菌からも報告されている（非特許文献３参照）。
一般的に、細胞壁に結合しているために生産量は低いが、ロドコッカスエリスロポリス（Rodococcus erythropolis）を窒素制限下で培養を行うとサクシノイルトレハロースリピドを３２ｇ／Ｌ生産することが報告されている（非特許文献４参照）。

ソホロースリピド（Sophorose lipids；「ソホロリピド」とも言われる；以下、ＳＬと省略する。）は、Ｐ．Ａ．Ｇｏｒｉｎらによってスターメレラ（キャンディダ）・ボンビコーラ（Starmerella（Candida）bombicola）の培養液から発見されている（非特許文献５参照）。
その後、その他の酵母菌、例えば、キャンディダ・ボゴリエンシス（Candida bogoriensis）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）、キャンディダ・グロペンギッセリ（Candida gropengisseri）、キャンディダ・アピコーラ（Candida apicola）によっても、その培養液中に比較的多量に生産されることが報告されている（非特許文献６参照）。
さらに、現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献７参照）。

セロビオースリピド（Cellobiose lipid；以下、ＣＬと省略する。）は、ウスチラジン酸（ustilagic acid）、フロキュロシン（flocculosin）とも呼ばれる抗微生物活性の高い糖脂質である。
また、ＣＬはウスチラゴマイディス（Ustilago maydis）により１５ｇ／Ｌ（非特許文献８参照）以上生産されるほか、クリプトコッカス・フミコーラ（Cryptococcus humicola）（非特許文献９参照）、シュードザイマ・フロキュローサ（Pseudozyma flocculosa）（非特許文献１０参照）、シュードザイマ・フジフォルメータ（Pseudozyma fusiformata）（非特許文献１１参照）などからも生産されることが報告されている。

マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）は、高い界面活性作用を有し、界面活性剤又はファインケミカルの種々の触媒として用いられる。ヒト急性前骨髄性白血病細胞性ＨＬ６０株にマンノシルエリスリトールリピドを作用させると顆粒系を分化させる白血病細胞分化誘導作用があり、また、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞にマンノシルエリスリトールリピドを作用させると神経突起の伸長が生ずる神経系細胞分化誘導作用等の生理活性作用を有する。更に、微生物産生の糖脂質として初めて、メラノーマ細胞のアポトーシスを誘導することが可能となり、癌細胞増殖抑制作用がある。これらの生理作用から見て、マンノシルエリスリトールリピドには抗ガン剤等の医薬としての用途が期待される。また、マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）には生分解性があり、高い安全性を有すると考えられる（非特許文献１２等参照）。

ＭＥＬは、マンノースあるいはヒドロキシル基が一部アセチル化したマンノースと、エリスリトールを糖骨格（親水基）として、１〜３本の脂肪酸を親水基として有する糖脂質である。ＭＥＬの一般式１を化１に示す。
一般式１、Ｒ_１〜Ｒ_４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数１〜１４、好ましくは３〜１２の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。
また、Ｒ_３およびＲ_４がアセチル基である構造物はＭＥＬ−Ａ、Ｒ_４がアセチル基でありＲ_３が水素である構造物はＭＥＬ−Ｂ、Ｒ_３がアセチル基でありＲ_４が水素である構造物はＭＥＬ−Ｃ、Ｒ_３およびＲ_４が水素である構造物はＭＥＬ−Ｄと定義されている。

現在ＭＥＬは、洗剤、化粧品等幅広い分野で工業利用が進められており、ＭＥＬの遺伝子導入剤としての利用（特許文献１参照）およびリポソーム形成剤としての利用（特許文献２参照）、ＭＥＬのスキンケアおよびヘアケア剤としての利用（特許文献３参照）、乳化剤・可溶化剤（特許文献４参照）、タンパク質分離用担体（特許文献５参照）などの報告がある。

マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）については、Ｃａｎｄｉｄａｓｐ．ＳＹ１６株を用いて２１１ｇ／Ｌの大豆油から２００時間で９５ｇ／Ｌ（生産速度：０．４７５ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４５％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１３参照）。また、ＣａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａＴ−３４株を用いて大豆油から６日間で４７ｇ／Ｌ（生産速度：０．３２ｇ／Ｌ／ｈ）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１４参照）。Pseudozyma aphidis株を用いて８０質量％の植物油脂から流加培養法により２４時間で１３．９ｇ／Ｌ（生産速度：０．５７ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：９２質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１５参照）。

ところで、ＭＥＬ生産菌の中でも、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓは、エリスリトールの配置が逆になった、糖骨格が異性体であるＭＥＬ−Ｂのみを生産することが知られている。すなわち、この異性体ＭＥＬ−Ｂは、１-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とし、上記のＣａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａＴ−３４株などが生産する４-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とするＭＥＬ−Ｂとは糖骨格が異なっている。また、両者の物理化学的性質には違いがあることが分かっており、異性体ＭＥＬ−Ｂは、水和性が向上しており、ベシクル形成能も高く、スキンケア剤等として有望なバイオ素材と期待される（非特許文献１６参照）。

しかしながら、異性体ＭＥＬ−Ｂの量産に関する報告はなく、該異性体ＭＥＬ−Ｂの量産菌の取得および生産条件の検討による量産化が求められている。

特開２００５−２８１１４６号公報特開２００６−１７４７２７号公報ＷＯ２００７／０６０９５６特開２００７−１８１７８９号公報特開２００６−３１０９５９号公報

「ジャーナルオブザアメリカンケミカルソサイティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」，７１巻，ｐ４１２４−４１２６（１９４９）．「アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，５１巻，ｐ２２−３２（１９９９）．「バイオサーファクタントアンドバイオテクノロジー（ＢｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），マーシャルデッカーインコーポレーションニューヨーク（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）（１９８７）．「ジャーナルオブバイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（英国），１３巻，ｐ２５７−２６６（１９９０）．「カナデアンジャーナルオブケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）」，３９巻，ｐ８４６−８５５（１９６１）．「ジャーナルオブバイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，３３巻，ｐ１４７−１５５（１９９０）．「バイテクノロジーレターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，２０巻，ｐ８０５−８０７（１９９８）．「アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５１巻，ｐ３３−３９（１９９９）．「バイオキミカエトバイオフィジカアクタ（ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ）」，（オランダ），エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），１５５８巻，ｐ１６１−１７０（２００２）．「アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Antimicrobial Agents and Chemiotherapy）４９巻、ｐ１５９７−１５９９（２００５）「フェムスイーストリサーチ（ＦＥＭＳＹＥＡＳＴＲｅｓ．）」，（オランダ），エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），５巻，ｐ９１９−９２３（２００５）．「ジャーナルオブバイオサイエンスアンドバイオテクノロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）９４巻、ｐ１８７−２０１（２００２）．「アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，７０巻，ｐ３９１−３９６（２００６）．「バイテクノロジーレターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，１４巻，ｐ３０５−３１０（１９９２）．「アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，６８巻，ｐ６０７−６１３（２００５）．「カーボハイドレイトリサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．）」，３４３巻，ｐ５５５−５６０（２００８）．

上記マンノシルエリスリトールリピド等のバイオサーファクタントには汎用の界面活性剤と比較して環境適合性、生体適合性に優れ、様々な生理活性が認められているが、既存の界面活性剤と同様の幅広い用途に利用されているとはいえず、例えば食品用途等に使用するには制約があった。これは、多くの場合生産微生物に病原性は知られていないものの、自然界からの単離源が明確でないため、安全性に対する知見に乏しいことによる。特に微生物生産物を食品用途等に展開するためには、使用微生物の単離源が重要視されている。
一方、上記１-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とするマンノシルエリスリトールリピド−Ｂ（以下、異性体ＭＥＬ−Ｂという場合がある。）は、４-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とするＭＥＬ−Ｂと比べ、水和性が向上しており、ベシクル形成能も高く、さらに広い用途展開が期待され、より高い生産性が要求されている。

そこで、本発明の課題は、安全な単離源から採取され、かつ、異性体ＭＥＬ−Ｂの生産性に優れた新たな微生物を提供し、該微生物を用いて異性体ＭＥＬ−Ｂを量産することを通じて、異性体ＭＥＬ−Ｂの適用用途を拡充させる点にある。

本発明者は、上記課題を解決するため、異性体ＭＥＬ−Ｂ生産菌を鋭意探索した結果、食用植物であるシソの葉から、新種のシュードザイマ酵母（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｎｓｐ．）およびシュードザイマツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）に属する新菌株を単離し、当該微生物が異性体ＭＥＬ−Ｂの生産性に優れることを見出し、本発明をなすに至ったものである。

すなわち、本発明の微生物は、以下に示される。
〔１〕１-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とするマンノシルエリスリトールリピド−Ｂの生産能を有し、リビトール及びマンニトール資化性を有するシュードザイマｎｓｐ．１Ｄ９またはシュードザイマツクバエンシス１Ｅ５。
〔２〕下記（ａ）及び（ｂ）で示される菌学的性質を有する上記〔１〕に記載のシュードザイマｎｓｐ．１Ｄ９。
（ａ）形態学的性質
（ｂ）生理学的性質
〔３〕下記（ａ）及び（ｂ）で示される菌学的性質を有する上記〔１〕に記載のシュードザイマツクバエンシス１Ｅ５。
（ａ）形態学的性質
（ｂ）生理学的性質
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の微生物を、培地に培養し、得られた培養物から１-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とするマンノシルエリスリトールリピド−Ｂを採取することを特徴とする、１-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とするマンノシルエリスリトールリピド−Ｂの製造方法。

本発明によれば、シソの葉を単離源とする微生物、より具体的にはシュードザイマｎｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｎｓｐ．）１Ｄ９株およびシュードザイマツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）１Ｅ５株を提供することができる。当該微生物を生産微生物として用いれば、得られた異性体ＭＥＬ−Ｂの安全性を確保するとともに、さらに異性体ＭＥＬ−Ｂの生産効率を向上させることが可能となり、製造コストの低減が可能になり、製品原価の低減も可能になる。したがって、これまで安全性及び供給量の点で、異性体ＭＥＬ−Ｂ利用に制限があった食品用途、医薬品、家畜飼料、魚餌、農業用途に直接使用できる界面活性剤としての利用が見込まれ、バイオサーファクタントの普及の拡大に著しく貢献できるものと期待される。
以上のように、本発明を利用することで、異性体ＭＥＬ−Ｂを高効率に生産可能になり、ＭＥＬ生産コストの低減が可能となり、より低価格なＭＥＬを市場に提供することが可能になる。

実施例１において、１Ｄ９株と１Ｅ５株が生産した異性体ＭＥＬ−Ｂを検出したＴＬＣの結果を示す図である。実施例１において、１Ｄ９株と１Ｅ５株が生産した異性体ＭＥＬ−Ｂの生産量を調べた結果を示す図である。実施例３において、１Ｅ５株による異性体ＭＥＬ−Ｂの生産に対する条件検討を行った結果を示す図である。実施例４において、ジャーファーメンターを用いた、１Ｅ５株による異性体ＭＥＬ−Ｂの生産結果を示す図である。

以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
〈本発明の微生物〉
本発明の微生物は、異性体ＭＥＬ−Ｂ生産に好適な微生物であり、該当する微生物としては、シュードザイマｎｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｎｓｐ．）１Ｄ９株およびシュードザイマツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）１Ｅ５株を挙げることができる。これら菌株はいずれも、本発明者等が日本国内で採取した植物（シソ）の葉から分離した菌株である。

本菌株は、YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃５日間培養で、全縁、扁平状、平滑、鈍光性、湿性で淡桃色のコロニーを形成する。YM平板培地上で、25℃下において、培養３日目に、細胞は楕円形であり、極出芽によって増殖する。また、培養一カ月を経過した時点でも、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
これらの形態学的性質はＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ属の一般的な形態学的特徴と一致し、これら菌株はＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ属に帰属する菌株といえる。

上記１Ｄ９株と１Ｅ５株について、リボゾームRNA遺伝子の26SrDNA−D1/D2領域の塩基配列（rDNA配列）を決定し、DNAデータベース（DDBJ）にアクセスし、FASTAプログラム（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/fasta-j.html）を用いて相同性検索を行ったところ、シュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ)のrDNA配列と一致した（１００％）。また、１Ｅ５株のITS1-５．８SrDNA−ITS2領域の塩基配列は、シュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ) のrDNA配列と高い相同性を示した（９９％以上）。これら相同性検索の結果と１Ｅ５株の生理性状試験の結果も合わせて、本菌株はシュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ)に属する菌株であると考えられる。

しかし、１Ｅ５株は、従来知られているシュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ)の異性体ＭＥＬ−Ｂ生産菌株であるシュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ)ＢＲＣ１９４０（＝ＣＢＳ６３８９）に比して、異性体ＭＥＬ−Ｂ生産収率が極めて高いこと及び生理学的性質も子細にみれば、シュードザイマツクバエンシスＣＢＳ６３８９がＬ−ソルボース資化性を示さず、５０％グルコース存在下（浸透圧ストレス）で生育できないのに対し、１Ｅ５株はＬ−ソルボース資化性を示し、５０％グルコース存在下（浸透圧ストレス）で生育可能である等の点で異なる。

一方、１Ｄ９株のITS1-５．８SrDNA−ITS2領域の塩基配列（配列番号１）は、シュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ) のrDNA配列と最も高い相同性を示したが、９８．１％であり、９９％以上の相同性は示さなかった。これに加えて、１Ｄ９株の生理性状試験の結果、シュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ) ＣＢＳ６３８９の生育温度が３０℃以下であるのに対し、１Ｄ９株の耐熱性は非常に高く、３７℃でも生育可能である点が、明らかに異なる。

また、上記１Ｅ５株及び１Ｄ９株は、リビトール及びマンニトール資化性を有する点で共通しているのに対し、上記異性体ＭＥＬ−Ｂ生産菌であるＰｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓＣＢＳ６３８９は、リビトール及びマンニトール資化性を有していない。
これらの点から、上記１Ｅ５株は、シュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ)に属する新菌株と考えられ、上記１Ｄ９株は担子菌門の一種であるシュードザイマ属の新たな種である可能性が考えられる。

形態学的観察結果と生理性状試験の結果は、上記の表１、２（１Ｄ９株）および表３、４（１Ｅ５株）に示すとおりである。１Ｄ９株と１Ｅ５株は、平成２２年２月３日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）にそれぞれ受託番号ＦＥＲＭＰ−２１９０１（１Ｄ９株）およびＦＥＲＭＰ−２１９０２（１Ｅ５株）として寄託されている。

（産生バイオサーファクタント）
本発明の微生物が産生するバイオサーファクタントは、１-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とするＭＥＬ−Ｂであり、ＭＥＬ−Ｂとしては、以下の一般式２において、Ｒ_３が水素、Ｒ_４がアセチル基であって、Ｒ_１およびＲ_２が、炭素原子数１〜１６、好ましくは４〜１４の飽和若しくは不飽和の脂肪酸である化合物が挙げられる。

〈培地・培養条件〉
培養形態は液体培地を用いた回分培養あるいは培養系に炭素源および/または有機窒素源を連続添加する流加培養であり、通気攪拌することが望ましい。培地の初期ｐHは酸性から中性の範囲であれば特に問題は無いが、３．０−９．０に調整することが好ましく、６．０−８．０に調整することがより望ましい。培養に適した温度範囲は２０−３０℃、より好ましくは２２−２７℃である。
特に、本発明の上記シュードザイマ（pseudozyma） nsp. １Ｄ９株の生育温度範囲は広く、従来のシュードザイマツクバエンシスの異性体ＭＥＬ−Ｂ生産菌の生育上限温度を超える３０〜３７℃でも生育し、異性体ＭＥＬ−Ｂの生産が可能となり、異性体ＭＥＬ−Ｂ生産時の温度管理が容易であり、この点でも生産効率の向上に寄与する。

本発明において、培地は一般的な半合成培地を用いればよく、主原料として炭素原料にグルコース、ショ糖、廃糖蜜などの糖質、あるいは油脂類などを炭素源として用いることが望ましい。窒素源としては、有機窒素源と無機窒素源を組み合わせて用いることが望ましい。
糖類は当該酵母が資化できるものあれば特に限定されるものではない。例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトースなどの単糖類、ショ糖、マルトースなどの二糖類が用いられるが、好ましくはグルコースである。培養初発濃度は１０−２００ｇ／Ｌ、好ましくは５０−１５０ｇ／Ｌで用いられる。

用いる油脂類としては、特に限定されるものではない。植物油、脂肪酸またはそのエステル類を用いても良い。
使用する植物油としては、例えばダイズ油、ナタネ油、コーン油、綿実油、ヒマワリ油、カポック油、ゴマ油、コメ油、落花生油、ベニバナ油、オリーブ油、アマニ油、キリ油、ヒマシ油、パーム油、パーム核油、ヤシ油もしくはこれらの混合物等が挙げられる。
使用する脂肪酸および脂肪酸エステルには、炭素鎖が１０−２４のもの、好ましくは炭素鎖が１６−１８の脂肪酸または脂肪酸エステルを用いることができる。これらの脂肪酸または脂肪酸エステルは分子内に１−３個の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、デカン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの飽和脂肪酸またはそのエステル、あるいはトウハク酸、リンデル酸、ツズ酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノール酸、リノエライジン酸、γ−リノレン酸、リノレン酸、アラキドン酸などの不飽和脂肪酸またはそのエステルが挙げられる。
培地に添加する上記油脂類の濃度は、１０−１００ｇ／Ｌ、好ましくは２０−６０ｇ／Ｌの範囲である。流加培養の様式をとる場合には、培地中濃度が上記の範囲に収まるように培養期間中に連続的もしくは断続的に添加する。

使用する有機窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カザミノ酸、尿素などの内、一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは酵母エキスを１−８ｇ／Ｌの濃度範囲で用いるとよい。
無機窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アンモニアなどの内、一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは硝酸ナトリウムを用いるとよい。

（マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）の分離）
本発明の異性体ＭＥＬ−Ｂ生産菌の培養により、培養液中に蓄積された異性体ＭＥＬ−Ｂは、本菌株培養後、培養液を抽出することにより培養液から分離できる。抽出は、酢酸エチル、クロロホルム、メタノール、エタノール、ヘキサン、プロパノール等の有機溶媒を用い当技術分野において通常行われる方法にしたがって行えばよい。
有機溶媒によって抽出されたマンノシルエリスリトールリピドは、異性体ＭＥＬ−Ｂのみであり、異性体ＭＥＬ−Ｂを単離するのに格別の手段は必要とはしない。原料等に由来する脂肪酸成分が混在する場合、更に精製するにはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の手段を用いる。

〈ＭＥＬの構造決定〉
上記により得られる糖脂質成分の構造決定は、以下のようにして行う。シュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ) １Ｅ５株を、大豆油を炭素源として培養して得られたＭＥＬの構造決定手法を例にして以下説明する。単離した糖脂質成分は、ＴＬＣプレート上で、アンスロン硫酸試薬で青緑色に呈色することにより糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質について、¹Ｈ―ＮＭＲ解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知である異性体ＭＥＬ―Ｂのデータ（非特許文献１６参照）とを比較することで、構造解析を行う。

〈ＭＥＬの定量分析方法〉
全糖脂質量はアンスロン硫酸法を用いることで測定できる。ＭＥＬ同属体の含有量と存在比は薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することで測定できる。

以下に、本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。

実施例１
（１Ｄ９株と１Ｅ５株による糖型バイオサーファクタントの生産)
〈種培養〉
ディープフリーザー（−８０℃）で冷凍保存された１Ｄ９株と１Ｅ５株を３０ｍＬのＹＭ培地（グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ）に０．５ｍＬ播種し、２８℃で１日間、振蕩培養した。
〈本培養〉
３００ｍＬ容量の三角フラスコに３０ｍＬのＭＥＬ生産用培地を表５（ＭＥＬ生産培地組成）のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。上述の種培養液を１．５ｍＬを播種し、２５℃で５日間、振蕩培養を行った。培養終了後の培養液からＭＥＬ標品を酢酸エチルにて抽出した。抽出液中のＭＥＬ濃度はシリカゲルカラム（イナートシルＳｉｌ−１００Ａ）を接続したＨＰＬＣを用い、定量分析を行った。溶離液にはクロロホルム／メタノール混合溶媒を用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで混合比が１０：０から０：１０まで変化するように設定したグラジエントシステムにより溶出した。検出は蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ−ＬＴ、島津製作所製）を用いた。精製したＭＥＬを用いて検量線を作成し、ピークエリアからＭＥＬ濃度を算出した。

〈薄相クロマトグラフィー分析〉
図１に示すように、１Ｄ９株と１Ｅ５株は、スタンダードに用いたＭＥＬ−Ｂと同じ移動度の糖脂質を大量に生産した。すなわち、１Ｄ９株の糖脂質の移動度は０．５１、１Ｅ５株の糖脂質の移動度は０．５１であり、スタンダードに用いたＭＥＬ−Ｂの移動度も０．５１であった。なお、シュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ) ＮＢＲＣ１９４０株はコントロール株として用いた。さらに、これらの構造は下記実施例２に記載の構造解析の結果から、いずれも異性体ＭＥＬ−Ｂであることが分かった。各炭素源を使用した場合の、異性体ＭＥＬ−Ｂのそれぞれの生産量を測定した結果は図２に示した。

実施例２
１Ｅ５株が生産する糖脂質の構造解析
（糖脂質（ＭＥＬ）の精製）
実施例１と同様に培養した培養液から、酢酸エチルを用いて糖脂質を抽出・回収し、シリカゲルカラムを用いて、糖脂質を精製した。精製した糖脂質成分を用いて、下記の構造解析を行った。
（糖脂質成分のＮＭＲ解析）
重水素化メタノール（CD₃OD）を溶媒とする¹H-ＮＭＲ解析により、上記糖脂質の構造の同定を行った。その結果、１Ｅ５株が生産する糖脂質は全て、マンノース６位の位置にアセチル基を有するＭＥＬ−Ｂであって、エリスリトールの配位特徴のある、異性体ＭＥＬ−Ｂであることがわかった。¹H-ＮＭＲ解析において帰属された化学シフトを表６に示す。なお、シュードザイマツクバエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ) ＮＢＲＣ１９４０株による異性体ＭＥＬ−Ｂを比較対象として記載した。

（糖脂質成分のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ解析）
上記で得られた異性体ＭＥＬ−Ｂの分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによって解析した結果、異性体ＭＥＬ−Ｂの分子量は６３４であった。

実施例３
（１Ｅ５株による異性体ＭＥＬ−Ｂの生産条件の検討：培地成分）
１Ｅ５株による異性体ＭＥＬ−Ｂ生産における最適植物油脂（Ａ）、植物油脂濃度（Ｂ）、有機栄養源（Ｃ）、酵母エキス濃度（Ｄ）を調べた。結果を図３に示した。実施例１と同様にして１Ｅ５株を培養した。使用した植物油脂は全て良好な炭素源となった。最適な植物油脂（オリーブ油）の濃度は１２０ｇ／Ｌであった。最適な有機栄養源は酵母エキスであり、その最適濃度は５．０ｇ／Ｌであった。

実施例４
（１Ｅ５株による異性体ＭＥＬ−Ｂの生産条件の検討：ジャーファーメンター培養）
５０００ｍＬ容量のジャーファーメンターに３０００ｍＬのＭＥＬ生産用培地を表５（ＭＥＬ生産培地組成）のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。実施例１と同様にして１Ｅ５株を培養した後の培養液を、このジャーファーメンターに無菌状態で移し込んだ。その後、２５℃、７００ｒｐｍの条件で連続的に培養を行った。初発のオリーブ油が消費された培養開始から５５時間後に、１００ｇ／Ｌのオリーブ油を追加添加（流下）して、さらに培養を１６８時間まで継続した。この時の、異性体ＭＥＬ−Ｂ、残存油脂量、乾燥菌体重量を、図４に示した。その結果、１Ｅ５株は、１６８時間で７０ｇ／Ｌ以上の異性体ＭＥＬ−Ｂを培養液中に生産し、蓄積した。

Claims

１-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とするマンノシルエリスリトールリピド−Ｂの生産能を有し、リビトール及びマンニトール資化性を有するシュードザイマｎｓｐ．１Ｄ９またはシュードザイマツクバエンシス１Ｅ５。
下記（ａ）及び（ｂ）で示される菌学的性質を有する請求項１に記載のシュードザイマｎｓｐ．１Ｄ９。
（ａ）形態学的性質
（ｂ）生理学的性質
下記（ａ）及び（ｂ）で示される菌学的性質を有する上記〔１〕に記載のシュードザイマツクバエンシス１Ｅ５。
（ａ）形態学的性質
（ｂ）生理学的性質
上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の微生物を、培地に培養し、得られた培養物から１-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とするマンノシルエリスリトールリピド−Ｂを採取することを特徴とする、１-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とするマンノシルエリスリトールリピド−Ｂの製造方法。