CN113939596A - 用于替代化学表面活性剂的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于替代用于广泛多种的工业应用中的化学表面活性剂的方法和组合物。更具体地，本发明提供具有一种或多种基于期望用途的精确功能特征的多功能生物表面活性组合物的生产。

Description

用于替代化学表面活性剂的组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年3月10日提交的美国临时申请第62/987,529号的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

表面活性剂是在几乎所有行业领域中都有可能应用的表面活性两亲分子。因此，目前由数以千计的不同表面活性分子组成的表面活性剂的市场正在迅速发展。约60％表面活性剂用作清洁剂和用于个人护理产品的化合物。其它用途包含例如药物和补充剂；油气回收；生物修复；农业；化妆品；涂料和油漆；纺织品制造；食品生产和加工；以及建筑。

表面活性分子的性质可以通过亲水-亲油平衡值(HLB)来测量。HLB是表面活性分子的亲水性和亲油性部分的尺寸和强度的平衡。需要特定HLB值以例如形成稳定乳液。在水/油乳液和油/水乳液中，表面活性分子的极性部分朝向水取向，并且非极性基团朝向油取向，从而降低油相与水相之间的界面张力。

HLB值的范围是0到约20，其中较低HLB(例如10或更低)更易溶于油并且适用于油包水乳液，而较高HLB(例如10或更高)更易溶于水并且适用于水包油乳液。例如发泡、润湿、清洁和溶解能力等其它性质也取决于HLB。

合成和化学表面活性剂是有利的，这是因为其可以易于生产并且可以基于其分子结构进行调整以执行期望功能。因此，已研发出数以千计种不同表面活性剂，每一种都具有一定的有限功能。虽然这在生产使用表面活性剂的产品时留下了充足的选择方案，但表面活性剂功能的特殊性意味着需要更多种类和组合的表面活性剂来产生具有多种功能的产品。举例来说，用作润湿剂的表面活性剂可能未必用作清洁剂，并且用作乳化剂的表面活性剂可能未必用作防腐蚀剂。

结果，数十年来过度使用并过度生产化学表面活性剂。随着消费者和监管意识增强，化学表面活性剂的缺点开始显露，所述缺点包含例如其有限活性；对人类和动物的可能的和已知的毒性；在包含水生环境、土壤和地下水的环境中的持久性；生产和应用期间对气候变化的影响；以及与其它化学品的不相容性。

已经尝试制造可生物降解并且具有低毒性的生物基表面活性分子，但是所述分子更难以改性而不能生产具有特定物理和化学特征的产品。一个特定生物表面活性分子基团包含由微生物体产生的生物表面活性分子或生物表面活性剂。生物表面活性剂是一个结构多样的表面活性物质基团，由以下两部分组成：极性(亲水)部分和非极性(疏水)基团。

由于生物表面活性剂具有两亲结构，所有其可以例如增加疏水性水不溶性物质的表面积，增加所述物质的水生物可用度，并改变细菌细胞表面的性质。生物表面活性剂还可以降低水与油之间的界面张力，并因此降低移动截留液体以克服毛细管效应所需的静水压力。生物表面活性剂在界面处积聚，从而降低界面张力并导致溶液中形成聚集胶束结构。胶束的形成提供了用于例如在移动水相中移动油的物理机制。生物表面活性剂形成孔隙和使生物膜去稳定的能力也允许其用作抗细菌剂、抗真菌剂和溶血剂以例如控制害虫和/或微生物生长。

通常来说，生物表面活性剂的亲水基团是糖(例如单糖、二糖或多糖)或肽，而疏水基团通常是脂肪酸。因此，基于例如生物表面活性剂分子的糖类型、糖数量、肽大小、肽中存在哪些氨基酸、脂肪酸长度、脂肪酸饱和度、附加的乙酰化、附加的官能团、酯化、极性和电荷，生物表面活性剂分子有无数可能的变种。

这些变种产生的基团由包括广泛多种的类别的分子组成，包含例如糖脂(例如槐糖脂、鼠李糖脂、纤维二糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖脂)、脂肽(例如表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、节杆菌脂肽和地衣素)、黄酮哌脂(flavolipid)、磷脂(例如心磷脂)、脂肪酸酯化合物和高分子量聚合物(例如脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物)。每一类别内的每一类型的生物表面活性剂可以进一步包括具有另外经修改结构的亚型。

如同化学表面活性剂，每个生物表面活性剂分子都有自己的HLB值，这取决于其结构；然而，与化学表面活性剂的生产不同，化学表面活性剂的生产会产生具有单一HLB值或范围的单个分子，生物表面活性剂生产的一个循环通常会产生生物表面活性剂分子(例如其亚型和异构体)的混合物，每个生物表面活性剂分子都有自己的HLB。因此，从单一微生物培养物中收集的生物表面活性剂混合物通常具有多变的、不精确的HLB值，这归因于参与生物表面活性剂混合物生产的生物过程的多变性。

表面活性剂是全球工业生产力的一个重要方面。由于表面活性剂行业面临的挑战越来越大，包含例如对某些表面活性剂导致的毒性和污染的认识不断提高；环境和健康法规；以及期望“绿色”产品的社会趋势，所以需要用于生产和使用表面活性分子的改良方法。

发明内容

本发明提供用于替代用于广泛多种的工业应用中的化学表面活性剂的方法和组合物。更具体地，本发明提供具有一种或多种基于期望用途的精确功能特征的多功能生物表面活性组合物的生产。有利地，在优选实施例中，这些组合物是无毒的、可生物降解的并且其生产和使用对环境友好。

在某些实施例中，提供了可定制的生物表面活性剂组合物，所述组合物包括一种或多种生物表面活性剂分子，其中，一种或多种生物表面活性剂的身份、比率和/或分子结构经过预先确定以便基于所述组合物的一个或多个期望用途实现所述组合物的特定功能性质。

在某些特定实施例中，提供了具有所期望的一种或多种功能性质的绿色表面活性剂组合物，所述组合物包括一种或多种生物表面活性剂分子，其中，一种或多种生物表面活性剂分子的身份、比率和结构是基于其对所期望的功能性质的贡献来加以选择。

在一些实施例中，功能性质是通过例如亲水-亲油平衡值(HLB)、临界胶束浓度(CMC)和/或贝壳杉脂丁醇值(kauri-butanol value，KB)来测量的。

在某些实施例中，所述组合物包括一种或多种属于选自例如以下的类别的生物表面活性剂分子：糖脂、脂肽、黄酮哌脂、磷脂、脂肪酸酯化合物、脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物。

在一些实施例中，所述组合物包括多种属于相同生物表面活性剂类别的生物表面活性剂分子。在一些实施例中，所述组合物包括属于这些生物表面活性剂类别中超过一种的生物表面活性剂分子。

在一些实施例中，所述组合物包括糖脂，例如槐糖脂、鼠李糖脂、海藻糖脂、纤维二糖脂和/或甘露糖赤藓糖醇脂。在一些实施例中，所述组合物包括脂肽，例如表面活性素、丰原素、节杆菌脂肽、地衣素、伊枯草菌素和/或粘液菌素。

有利地，在所述组合物中以某些预定比率包含多种生物表面活性剂分子产生具有更宽范围的亲水性或疏水性的组合物。另外，所述组合物可以同时用于多种功能，甚至需要例如不同HLB值或HLB范围的功能。换句话说，包括一种或多种生物表面活性剂分子的一种生物产品可以以环境友好的方式替代广泛范围的化学产品(参见图1)。

在附加和/或替代实施例中，基于所述组合物内的生物表面活性剂分子的身份和比率，可以将所述组合物调整为具有特定的HLB值并且在一些情况下非常精确的HLB值。

在某些实施例中，所述组合物可以用于替代包括化学表面活性剂的组合物，所述化学表面活性剂例如是烷基苯磺酸盐、直链烷基苯磺酸盐、醇乙氧基化物、二乙醇胺、三乙醇胺、氯化烷基铵、烷基葡糖苷和本文所描述的其它化学表面活性剂。

在优选实施例中，本发明提供用于产生具有所期望的一种或多种功能性质的“绿色”表面活性剂组合物的方法，所述方法包括识别具有特定功能性质的生物表面活性剂分子，并通过在有利于产生生物表面活性剂的条件下培养产生生物表面活性剂的微生物体来产生生物表面活性剂分子。

在某些实施例中，所述方法进一步包括将所述生物表面活性剂分子与一种或多种附加的生物表面活性剂分子组合，所述生物表面活性剂分子的身份、比率和/或分子结构是基于所述组合物的一个或多个期望用途来确定的。因此，产生具有一种或多种期望功能特征的组合物，所述特征包含例如表面/界面张力降低、粘度降低、乳化、去乳化、溶解力、清洁力和/或抗微生物作用。

在一些实施例中，所述方法包括在将生物表面活性剂分子用于组合物中之前对其结构进行修改。

在一些实施例中，绿色表面活性剂组合物中的生物表面活性剂分子的身份、比率和/或分子结构是基于例如单独分子的HLB、CMC和/或KB来确定的。在一些实施例中，生物表面活性剂分子的身份、比率和/或分子结构是基于所述组合物整体的理论或实际的期望HLB、CMC和/或KB值来确定的。

在优选实施例中，绿色表面活性剂组合物可以代替一种或多种化学表面活性剂用于通常包括所述一种或多种化学表面活性剂的产品中，其中，选择具有与所述一种或多种化学表面活性剂相同或相似的功能性质的一种或多种生物表面活性剂。

因此，在一些实施例中，所述方法包括选择包括一种或多种化学表面活性剂和任选的一种或多种附加组分的已知组合物，并通过使用本发明的绿色表面活性剂组合物代替一种或多种化学表面活性剂来产生已知组合物的环境友好型式。绿色表面活性剂组合物可以与任选的附加组分(如果存在的话)混合。

在一些实施例中，本发明的方法和组合物比利用竞品化学表面活性剂的方法和组合物表现得更好。举例来说，在一些实施例中，根据本发明利用的生物表面活性剂的结构和/或尺寸允许比化学表面活性剂所实现的表面张力降低和/或界面张力降低更强的表面张力降低和/或界面张力降低。有利地，在某些实施例中，为实现表面张力和/或界面张力的期望降低，本发明的生物表面活性剂分子所需的剂量比竞品化学表面活性剂所需的剂量更低。

有利地，本发明的方法和组合物通过减少和/或完全替代对化学表面活性剂的需要来降低通常由表面活性剂的生产和使用造成的成本和环境影响。

附图说明

图1显示了某些化学表面活性剂(顶部)和SLP分子(底部)的HLB值。根据本发明方法的实施例产生的一种SLP组合物(由标有黑星的双向箭头表示)可以替代多种单独的化学表面活性剂。

图2显示了SLP分子的改性可以如何调节所述分子的HLB值。

图3显示了脂肽分子的改性可以如何调节所述分子的HLB值。

图4显示了表面活性分子的应用和所述应用所需的对应HLB值的图表。所述图表还指示所述组合物中是否需要更多的LSL或ASL才能实现所述HLB范围。

图5显示了RLP分子的改性可以如何调节所述分子的HLB值。

图6显示了具有不同数量的糖部分和/或脂肪酸、不同脂肪酸长度和不同脂肪酸饱和度的鼠李糖脂分子的可能性改性形式的清单。这58种类型中的每一种都有不同的特征，包含HLB。

图7显示了MEL分子的改性可以如何调节所述分子的HLB值。

具体实施方式

本发明提供了用于产生“绿色”表面活性剂组合物的材料和方法，所述组合物可以用于油气行业、农业、化妆品、保健和环境净化中以及用于多种其它应用。具体地，本发明提供了用于产生包括一种或多种生物表面活性剂分子的普遍适用的生物表面活性剂基组合物的材料和方法，其中，可以基于其中的生物表面活性剂分子的类型和比率来对所述组合物进行改性以展现出一种或多种精确功能特征。

有利地，根据本发明方法产生的绿色表面活性剂组合物可以包括精确的、预定比率的生物表面活性剂分子，以获得具有例如期望HLB、CMC和/或KB值或这些值的期望范围的特定功能产品。

选定定义

如本文所用，“绿色”化合物或材料意思指至少95％来源于天然、生物和/或可再生资源，例如植物、动物、矿物质和/或微生物体，并且此外，所述化合物或材料是可生物降解的。另外，“绿色”化合物或材料具有对人类极低的毒性并且具有>5000mg/kg的LD50。“绿色”产品优选不含以下中的任一者：非植物基乙氧基化表面活性剂、直链烷基苯磺酸盐(LAS)、醚硫酸盐表面活性剂或壬基酚乙氧基化物(NPE)。

如本文所用，“生物膜”是微生物体例如细菌、酵母或真菌的复合聚集体，其中，细胞彼此粘附和/或使用细胞外基质粘附到表面。生物膜中的细胞在生理上不同于同一生物体的浮游细胞，所述浮游细胞是可以在液体介质中漂浮或游泳的单细胞。

如本文所用，“经分离的”或“经纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽、蛋白质或有机化合物例如小分子(例如下文所描述的小分子)基本上不含与其本质上相关的其它化合物，例如细胞物质。经纯化或经分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))在其天然存在的状态下不含侧接其的基因或序列。经纯化或经分离的多肽在其天然存在的状态下不含侧接其的氨基酸或序列。经分离的微生物菌株意味着菌株是从其在自然界中所存在的环境中移除。因此，经分离的菌株可以作为例如生物学上纯的培养物或作为与载体缔合的孢子(或所述菌株的其它形式)存在。

在某些实施例中，经纯化的化合物是所关注化合物的至少60重量％。优选地，制剂是所关注化合物的至少75重量％，更优选至少90重量％，并且最优选至少98重量％。举例来说，经纯化的化合物是作为期望化合物的按重量计至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)的化合物。纯度是通过任何适当的标准方法，例如通过管柱色谱、薄层色谱或高效液相色谱(HPLC)分析来测量的。

“代谢物”是指代谢产生的任何物质或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物可以是作为代谢的起始材料、中间物或最终产物的有机化合物。代谢物的实例包含但不限于酶、酸、溶剂、醇、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素、氨基酸、生物聚合物和生物表面活性剂。

如本文所用，提及“微生物基组合物”意思指包括因微生物体或其它细胞培养物生长而产生的组分的组合物。因此，微生物基组合物可以包括微生物本身和/或微生物生长的副产物。微生物可以呈植物状态、孢子形式、菌丝体形式、繁殖体的任何其它形式或这些状态/形式的混合状态/形式。微生物可以是浮游微生物或呈生物膜形式或两者的混合。生长的副产物可以是例如代谢物、细胞膜组分、经表达的蛋白质和/或其它细胞组分。微生物可以是完整的或溶解的。微生物可以存在于所述组合物中或从所述组合物中去除。微生物可以与其中生长微生物的液体培养基一起存在于微生物基组合物中。细胞可以以例如至少1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²或更高CFU/毫升所述组合物的浓度存在。

本发明进一步提供“微生物基产品”，所述微生物基产品是将在实践中应用以实现期望结果的产品。微生物基产品可以简单地是从微生物培养过程中收获的微生物基组合物。或者，微生物基产品可以包括已添加的其它成分。这些附加成分可以包含例如稳定剂、缓冲剂、载剂(例如水、盐溶液或任何其它适当的载剂)、用于支持微生物进一步生长的附加营养素、非营养素生长增强剂和/或促进在应用追踪的环境中追踪微生物和/或组合物的试剂。微生物基产品还可以包括微生物基组合物的混合物。微生物基产品还可以包括已经以某种方式处理过的微生物基组合物的一种或多种组分，所述方式例如但不限于过滤、离心、裂解、干燥、纯化等。

本文所提供的范围应理解为所述范围内所有值的简写。举例来说，1到20的范围应理解为包含来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20组成的组的任何数值、数值组合或子范围以及上述整数之间的所有中间小数值例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别考虑从所述范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。举例来说，1到50的示例性范围的嵌套子范围可以在一个方向包括1到10、1到20、1到30和1到40或在另一个方向包括50到40、50到30、50到20和50到10。

如本文所用，“减少”意思指负更改，而“增加”意思指正更改，其中负更改或正更改为至少0.001％、0.01％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

如本文所用，“表面活性剂”意思指降低两种液体之间或液体与固体之间的表面张力(或界面张力)的化合物。表面活性剂充当例如清洁剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和/或分散剂。“生物表面活性剂”是由活细胞产生的表面活性物质。

短语“生物表面活性剂”和“生物表面活性剂分子”包含任何生物表面活性剂类别(例如糖脂)和/或其亚型(例如槐糖脂)的所有形式、类似物、直系同源物、异构体以及天然和/或人为修饰物。

与“包含”或“含有”同义的过渡性术语“包括”是包容性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。相比之下，过渡性短语“由……组成”排除了权利要求书中未规定的任何要素、步骤或成分。过渡性短语“基本上由……组成”将权利要求书的范围限于规定的材料或步骤“以及那些不会对所要求保护的发明的一个或多个基本和新颖特征产生实质性影响的材料或步骤”。术语“包括”的使用涵盖了“由一种或多种所列举组分组成”或“基本上由一种或多种所列举组分组成”的其它实施例。

除非具体陈述或从上下文显而易见，否则如本文所用的术语“或”应理解为包涵性的。除非具体陈述或从上下文显而易见，否则如本文所用的术语“一个”、“和”以及“所述”应理解为单数或复数的。

除非具体陈述或从上下文显而易见，否则如本文所用的术语“约”应理解为在所属领域的正常容差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可以理解为在所陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非从上下文另外清楚可见，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。

在本文中变量的任何定义中对化学基团清单的叙述包含将所述变量定义为所列基团中的任何单个基团或组合。本文中对变量或方面的实施例的叙述包含作为任何单个实施例或与任何其它实施例或其部分的组合的实施例。

本文所引用的所有参考文献均特此以全文引用的方式并入。

绿色表面活性剂组合物和生产方法

本发明提供了绿色表面活性剂组合物以及生产和使用这些组合物作为化学表面活性剂组合物的替代物的方法。更具体地，本发明提供了包括一种或多种生物表面活性剂分子的普遍适用的生物表面活性剂基组合物的生产，其中，可以基于一个或多个期望用途通过更改生物表面活性剂分子的身份、比率和/或分子结构来对组合物进行改性以展现出一种或多种功能特征。在一些实施例中，功能性质是通过例如亲水-亲油平衡值(HLB)、临界胶束浓度(CMC)和/或贝壳杉脂丁醇值(kauri-butanol value，KB)来测量的。

在优选实施例中，本发明提供用于产生具有所期望的一种或多种功能性质的“绿色”表面活性剂组合物的方法，所述方法包括识别具有特定功能性质的生物表面活性剂分子，并通过在有利于产生生物表面活性剂的条件下培养产生生物表面活性剂的微生物体来产生生物表面活性剂分子。

在某些实施例中，所述方法进一步包括将所述生物表面活性剂分子与一种或多种附加的生物表面活性剂分子组合，所述生物表面活性剂分子的身份、比率和/或分子结构是基于所述组合物的一个或多个期望用途来确定的。因此，产生具有一种或多种期望功能特征的组合物，所述特征包含例如表面/界面张力降低、粘度降低、乳化、去乳化、溶解力、清洁力和/或抗微生物作用。

在一些实施例中，绿色表面活性剂组合物中的生物表面活性剂分子的身份、比率和/或分子结构是基于例如单独分子的HLB、CMC和/或KB来确定的。在一些实施例中，生物表面活性剂分子的身份、比率和/或分子结构是基于所述组合物整体的理论或实际期望HLB、CMC和/或KB值来确定的。

一种或多种生物表面活性剂可以使用小规模到大规模的培养方法生产。最值得注意的是，所述方法可以按比例调整到工业规模，即适用于以满足商业应用所需求的量供应生物表面活性剂的规模，所述商业应用例如是用于增强型油回收的组合物的生产。在优选实施例中，生物表面活性剂在集中位置生产、经任选地改性和混合，在一些实施例中，集中位置距使用绿色表面活性剂组合物的位置不超过300英里、200英里、100英里或10英里。

用于产生生物表面活性剂的微生物体可以是天然或经遗传修饰的微生物体。举例来说，可以用特定基因使微生物体转型以展现出特定特征。微生物体也可以是期望菌株的突变体。如本文所用，“突变体”意思是指参考微生物体的菌株、基因变异体或亚型，其中，突变体与参考微生物体相比具有一种或多种基因变异(例如点突变、错义突变、无义突变、缺失、复制、框移突变或重复扩展)。用于制造突变体的程序在微生物领域中众所周知。举例来说，为此广泛使用了UV诱变和亚硝基胍。

在一个实施例中，微生物体是酵母或真菌。适合于根据本发明使用的酵母和真菌物种包含短梗霉(Aureobasidium)(例如出芽短梗霉(A.pullulans))、布拉霉(Blakeslea)、假丝酵母(例如蜂生假丝酵母、水解假丝酵母、诺达假丝酵母(C.nodaensis))、隐球菌、德巴利酵母(Debaryomyces)(例如汉逊德巴利酵母(D.hansenii))、虫霉、有孢汉逊酵母(例如葡萄汁有孢汉逊酵母)、汉逊酵母、伊萨酵母、克鲁维酵母(例如法弗克鲁维酵母(Kluyveromyces phaffii))、被孢霉、菌根、季也蒙迈耶氏酵母(Meyerozymaguilliermondii)、青霉菌、须霉、毕赤酵母(例如异常毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、西方毕赤酵母、库德毕赤酵母)、侧耳菌属(例如糙皮侧耳)、假酵母菌(例如蚜虫假酵母菌)、酵母菌属(例如布拉酵母菌后遗症、酿酒酵母、圆酵母)、斯塔莫酵母(例如熊蜂生斯塔莫酵母(Starmerella bombicola))、球拟酵母菌、木霉菌(例如里氏木霉菌(Trichodermareesei)、哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)、钩状木霉菌、绿色木霉菌)、黑粉菌(例如玉米黑粉菌)、威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces)(例如异常威克汉姆酵母菌)、拟威尔酵母(Williopsis)(例如木拉克拟威尔酵母(Williopsis mrakii))、接合酵母(例如拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii))以及其它酵母和真菌物种。

在某些实施例中，微生物体是细菌，包括革兰氏阳性菌(Gram-positivebacteria)和革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)。细菌可以是例如农杆菌(例如放射农杆菌)、固氮菌(棕色固氮菌、圆褐固氮菌)、固氮螺菌(例如巴西固氮螺菌)、芽孢杆菌(例如解淀粉芽胞杆菌、环状芽胞杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、莫海威芽孢杆菌、胶质芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌)、伯克霍尔德菌(例如泰国伯克霍尔德菌)、弗拉托菌(Frateuria)(例如金黄弗拉托菌)、微杆菌(例如产左聚糖微杆菌)、粘杆菌(例如橙黄色粘球菌、橙色标桩菌、纤维素堆囊菌、玫瑰小囊藻(Minicystis rosea))、多粘类芽孢杆菌、泛菌(例如成团泛菌)、假单胞菌(例如铜绿假单胞菌、金色绿针假单胞菌亚种(克鲁维)、恶臭假单胞菌)、根瘤菌属、红螺菌(例如深红红螺菌)、鞘氨醇单胞菌(例如少动鞘氨醇单胞菌)和/或氧化硫硫杆菌(酸性氧化硫硫杆菌)。

在某些实施例中，附加微生物体是芽孢杆菌属细菌。在一个具体实施例中，芽孢杆菌属是枯草芽孢杆菌菌株B1、B2或B3(参见美国专利第10,576,519号，所述专利以全文引用之方式并入)或枯草芽孢杆菌亚种基因座B4。在一个具体实施例中，芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-67928(“B.amy”)。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)“B.amy”微生物的培养物已保藏在农业研究服务北部地区研究实验室(NRRL),1400独立大道,美国西南华盛顿哥伦比亚特区,20250。所述保藏已被保藏人指定保藏编号NRRL B-67928，并于2020年2月26日保藏。

本发明培养物的保藏条件确保在本专利申请未决期间，专利与商标局局长根据37CFR 1.14和35U.S.C 122确定有权获得所述培养物的人可以获得所述培养物。根据外国专利法要求，可以在提交本发明申请的副本或其后续物的国家获得保藏物。然而，应当理解，保藏物的可获得性并不构成在背离由政府行为授予的专利权的情况下实践本发明的许可。

此外，将根据《微生物体保藏布达佩斯条约》的规定对本发明培养物保藏物进行储存并向公众提供，即，将其妥善保藏以使其保持活力和不受污染在最近一次要求提供保藏物样本之后至少五年时段，并且在任何情况下，在保藏日之后至少30(三十)年时段或持续可能发布公开培养物的任何专利的可执行期限。保藏人承认，当保藏人由于保藏条件而无法按要求提供样本时，保藏人有责任替换保藏物。在授权公开本发明培养物保藏物的专利时，将不可撤销地移除对公众可获得本发明培养物保藏物的所有限制。

在一个实施例中，所述方法包括使包括液体生长培养基的发酵反应器接种产生生物表面活性剂的微生物体以产生培养物；并在有利于产生生物表面活性剂的条件下培育培养物。

根据本发明使用的微生物生长容器可以是用于工业用途的任何发酵罐或培养反应器。在一个实施例中，容器可以具有功能控制器/传感器或可以连接到功能控制器/传感器以测量培养过程中的重要因素，例如pH、氧气、压力、温度、搅动器轴功率、湿度、粘度和/或微生物密度和/或代谢物浓度。

在其它实施例中，容器还能够监测容器内微生物体的生长(例如细胞数量和生长阶段的测量)。或者，可以从容器中取出样本用于计数、纯度测量、生物表面活性剂浓缩和/或可见油位监测。举例来说，在一个实施例中，采样可以每24小时发生一次。

根据本发明方法的微生物接种剂优选包括可以使用任何已知的发酵方法来制备的期望微生物体的细胞和/或繁殖体。如果期望的话，接种剂可以与水和/或液体生长培养基预混合。

在某些实施例中，培养方法利用液体生长培养基中的深层发酵。在一个实施例中，液体生长培养基包括碳源。碳源可以是碳水化合物，例如葡萄糖、右旋糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇和/或麦芽糖；有机酸，例如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和/或丙酮酸；醇类，例如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和/或甘油；脂肪和油，例如芥花油、大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、葵花籽油、芝麻油和/或亚麻籽油；糖蜜粉等。这些碳源可以独立地使用或以两种或更多种的组合形式使用。在优选实施例中，使用亲水性碳源例如葡萄糖和疏水性碳源例如油或脂肪酸。

在一个实施例中，液体生长培养基包括氮源。氮源可以是例如酵母提取物、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素和/或氯化铵。这些氮源可以独立地使用或以两种或更多种的组合形式使用。

在一个实施例中，液体生长培养基中还可以包含一种或多种无机盐。无机盐可以包括例如磷酸二氢钾、磷酸一钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、氯化钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙、硝酸钙、硫酸镁、磷酸钠、氯化钠和/或碳酸钠。这些无机盐可以独立地使用或以两种或更多种的组合形式使用。

在一个实施例中，培养基中包含用于微生物体的生长因子和痕量营养素。当生长不能产生其所需要的所有维生素的微生物时，这是特别优选的。培养基中也可以包含无机营养素，所述无机营养素包含痕量元素，例如铁、锌、铜、锰、钼和/或钴。此外，可以包含维生素、必需氨基酸、蛋白质和微量元素的来源，例如玉米粉、蛋白胨、酵母提取物、马铃薯提取物、牛肉提取物、大豆提取物、香蕉皮提取物等，或其呈经纯化形式。也可以包含氨基酸，例如适用于蛋白质生物合成的氨基酸。

培养方法可以进一步为生长培养物提供氧处理。一个实施例利用空气的缓慢运动来去除含氧量低的空气并引入含氧空气。含氧空气可以是通过机械装置每天补充的环境空气，所述机械装置包含用于机械搅动液体的叶轮和用于向液体供应气泡以将氧气溶解到液体中的空气喷射器。在某些实施例中，溶解氧(DO)含量被维持在空气饱和度的约25％至约75％、约30％至约70％、约35％至约65％、约40％至约60％或约50％下。

在一些实施例中，培养方法可以进一步包括在培养过程之前和/或期间在液体培养基中添加附加的酸和/或抗微生物剂。抗微生物剂或抗生素(例如链霉素、土霉素)用于保护培养物免受污染。然而，在一些实施例中，酵母培养物产生的代谢物提供足够的抗微生物作用以防止培养物受到污染。

在一个实施例中，在接种之前，液体培养基的组分可以任选地被灭菌。在一个实施例中，液体培养基的灭菌可以通过将液体培养基的组分置于约85℃-100℃温度的水中来实现。在一个实施例中，灭菌可以通过将组分以1:3(w/v)的比率溶解于1％到3％过氧化氢中来实现。

在一个实施例中，用于培养的设备是无菌的。培养设备例如反应器/容器可以与灭菌单元例如高压釜隔开、但与其连接。培养设备还可以具有在开始接种之前进行原位灭菌的灭菌单元。衬垫、开口、管道和其它设备部件可以喷有例如异丙醇。可以通过所属领域中已知的方法对空气进行灭菌。举例来说，环境空气在被引入容器中之前可以穿过至少一个过滤器。在其它实施例中，培养基可以被巴氏灭菌，或任选地根本不向其添加热，其中可以利用pH和/或低水活性来控制不合需要的微生物生长。

培养物的pH应该适用于所关注的微生物体，并且可以视需要对其加以更改以便在培养物中产生特定的生物表面活性剂分子。缓冲剂和pH调节剂例如碳酸盐和磷酸盐可以用于稳定pH以接近优选值。

在一些实施例中，pH是约2.0到约7.0。在一些实施例中，pH是约2.5到约5.5、约3.0到约4.5或约3.5到约4.0。在一个实施例中，培养可以在恒定pH下连续进行。在另一个实施例中，培养可以经受变化pH。

在一个实施例中，培养方法在约5℃到约100℃、约15℃到约60℃、约20℃到约45℃、约22℃到约30℃或约24℃到约28℃下进行。在一个实施例中，培养可以在恒定温度下连续进行。在另一个实施例中，培养可以经受变化温度。

根据本发明方法，可以在发酵系统中培养微生物体足以实现期望效果的时间段，所述期望效果例如是产生期望量的细胞生物质或期望量的一种或多种微生物生长副产物。微生物体所产生的一种或多种微生物生长副产物可以被保留在微生物体中和/或被分泌到生长培养基中。生物质含量可以是例如5g/l到180g/l或更多或10g/l到150g/l。

在某些实施例中，酵母培养物的发酵发生约48小时到150小时，或约72小时到150小时，或约96小时到约125小时，或约110小时到约120小时。

在一些实施例中，在发酵循环完成后，所述方法可以包括提取、浓缩和/或纯化生物表面活性剂分子。

在某些实施例中，本发明的方法可以以使得产生最少到零废物的方式进行，从而减少垃圾填埋场中被排入污水和废水系统中和/或被处理掉的发酵废物的量。

在提取生物表面活性剂之后从培养物中收集的细胞生物质通常会被灭活并被处理掉。然而，本发明方法可以进一步包括收集细胞生物质并将其以活或非活性形式用于多种目的，包括但不限于作为土壤改良剂、牲畜饲料补充剂、油井处理物和/或护肤品。细胞生物质可以直接使用，或其可以与专用于预期用途的添加剂混合。

在一些实施例中，用于提取和/或纯化生物表面活性剂的水或其它无毒液体可以含有残留的生物表面活性剂、营养素和/或细胞物质。因此，在某些实施例中，液体可以用于灌溉滴灌线或喷灌器中作为植物的土壤或叶面处理物；作为人类和动物的安全营养和/或水合作用补充剂；作为清洁组合物；和/或用于减少发酵废物的无数其它用途。

在一些实施例中，所述方法包括在将生物表面活性剂分子添加到组合物中之前对其结构进行修改。

在一些实施例中，调节发酵参数引起培养物中一种或多种特定生物表面活性剂分子改性和/或产生和/或特定比率的多种生物表面活性剂分子产生。这些参数可以包括例如使用特定的微生物体菌株、调节生长培养基组成、将微生物与拮抗微生物和/或影响微生物共培养、向营养培养基中添加抑制剂和/或刺激化合物、调节发酵的温度、pH和/或曝气等。

在一些实施例中，从发酵循环获得的一种或多种生物表面活性剂分子可以在发酵后通过例如酯化、聚合、添加氨基酸、添加金属和更改脂肪酸链长度来加以改性。

有利地，在所述组合物中以某些预定比率包含多种生物表面活性剂分子产生具有更宽范围的亲水性或疏水性的组合物。另外，所述组合物可以同时用于多种功能，甚至需要例如不同HLB值或HLB范围的功能。换句话说，包括一种或多种生物表面活性剂分子的一种生物产品可以以环境友好的方式替代广泛范围的化学产品(参见图1)。

在附加和/或替代实施例中，基于所述组合物内的生物表面活性剂分子的身份和比率，可以将所述组合物调整为具有特定的HLB值并且在一些情况下非常精确的HLB值。

在某些实施例中，所述组合物包括一种或多种属于选自例如以下的类别的生物表面活性剂分子：糖脂、脂肽、黄酮哌脂、磷脂、脂肪酸酯化合物、脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物。

在一些实施例中，所述组合物包括多种属于相同生物表面活性剂类别的生物表面活性剂分子。在一些实施例中，所述组合物包括属于这些生物表面活性剂类别中超过一种的生物表面活性剂分子。

在一些实施例中，所述组合物包括糖脂，例如槐糖脂、鼠李糖脂、海藻糖脂、纤维二糖脂和/或甘露糖赤藓糖醇脂。

在一个具体实施例中，所述组合物可以包括0重量％到100重量％、5重量％到95重量％、10重量％到90重量％、15重量％到85重量％、20重量％到80重量％、25重量％到75重量％、30重量％到70重量％、35重量％到65重量％、40重量％到60重量％、45重量％到55重量％或50重量％槐糖脂分子。“槐糖脂”或“槐糖脂分子”可以包含例如酸性(线性)(ASL)和内酯(LSL)槐糖脂和其所有可能性衍生物，包含例如单乙酰化槐糖脂、二乙酰化槐糖脂、酯化槐糖脂、具有不同疏水链长度的槐糖脂、槐糖脂-金属复合物、具有脂肪酸-氨基酸复合物的槐糖脂以及如本文所描述的其它槐糖脂衍生物。

在一个具体实施例中，所述组合物可以包括0重量％到100重量％、5重量％到95重量％、10重量％到90重量％、15重量％到85重量％、20重量％到80重量％、25重量％到75重量％、30重量％到70重量％、35重量％到65重量％、40重量％到60重量％、45重量％到55重量％，或50重量％鼠李糖脂分子。“鼠李糖脂”或“鼠李糖脂分子”可以包含例如单鼠李糖脂和二鼠李糖脂以及其中的所有可能性衍生物以及如本文所描述的其它形式。

在一个具体实施例中，所述组合物可以包括0重量％到100重量％、5重量％到95重量％、10重量％到90重量％、15重量％到85重量％、20重量％到80重量％、25重量％到75重量％、30重量％到70重量％、35重量％到65重量％、40重量％到60重量％、45重量％到55重量％或50重量％甘露糖赤藓糖醇脂分子。“甘露糖赤藓糖醇脂”或“甘露糖赤藓糖醇脂分子”可以包含例如三酰化MEL、二酰化MEL、单酰化MEL、三乙酰化MEL、二乙酰化MEL、单乙酰化MEL和非乙酰化MEL以及其立体异构体和/或结构异构体。在某些具体实施例中，MEL被表征为以下群组：MEL A(二乙酰化)、MEL B(在C4处单乙酰化)、MEL C(在C6处单乙酰化)、MEL D(非乙酰化)、三乙酰化MEL A、三乙酰化MEL B/C以及如本文所描述的其它形式。

在一些实施例中，所述组合物包括0重量％到100重量％、5重量％到95重量％、10重量％到90重量％、15重量％到85重量％、20重量％到80重量％、25重量％到75重量％、30重量％到70重量％、35重量％到65重量％、40重量％到60重量％、45重量％到55重量％或50重量％脂肽，例如表面活性素、丰原素、节杆菌脂肽、地衣素、伊枯草菌素和/或粘液菌素。

在一些实施例中，两种或更多种经纯化生物表面活性剂分子彼此混合。在一些实施例中，将两种或更多种未经纯化或粗制形式的生物表面活性剂彼此混合，其中粗制形式可以包括例如残留的营养培养基、微生物细胞和/或发酵期间产生的其它微生物代谢物。在一些实施例中，经纯化生物表面活性剂分子可以与粗制形式的生物表面活性剂混合。

在优选实施例中，绿色表面活性剂组合物可以代替一种或多种化学表面活性剂用于通常包括所述一种或多种化学表面活性剂的产品中，其中，选择具有与所述一种或多种化学表面活性剂相同或相似的功能性质的一种或多种生物表面活性剂。

因此，在一些实施例中，所述方法包括选择包括一种或多种化学表面活性剂和任选的一种或多种附加组分的已知组合物，并通过使用本发明的绿色表面活性剂组合物代替一种或多种化学表面活性剂来产生已知组合物的环境友好型式。绿色表面活性剂组合物可以与一种或多种任选的附加组分(如果存在的话)混合。

在某些实施例中，组合物可以用于替代包括化学表面活性剂的组合物。典型的化学或合成表面活性剂(意为非生物表面活性剂)包括疏水基团，所述疏水基团通常是可以或不可以分支的长烃链(C8-C18)，而亲水基团是由例如羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐(阴离子)、醇、聚氧乙烯化链(非离子)和季铵盐(阳离子)的部分形成。

可以利用本发明的方法和组合物在表面活性剂组合物中被替代的非生物表面活性剂包含但不限于：阴离子表面活性剂、月桂基硫酸铵、月桂基硫酸钠(也称为SDS、十二烷基硫酸钠)、烷基-醚硫酸盐月桂基醚硫酸钠(sodium laureth sulfate/sodium laurylether sulfate(SLES))、肉豆蔻硫酸钠；多库酯、磺基琥珀酸二辛基钠、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、全氟丁烷磺酸盐、直链烷基苯磺酸盐(LAB)、烷基-芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐；羧酸盐、烷基羧酸盐(肥皂)、硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠、羧酸盐基含氟表面活性剂、全氟壬酸盐、全氟辛酸盐；阳离子表面活性剂、pH依赖性伯胺、仲胺或叔胺、奥替尼啶二盐酸盐、永久带电季铵阳离子、烷基三甲基铵盐、溴化鲸蜡基三甲基铵(CTAB)(又名溴化十六烷基三甲基铵)、氯化鲸蜡基三甲基铵(CTAC)、氯化鲸蜡基吡啶鎓(CPC)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷、氯化二甲基二(十八烷基)铵、西曲溴铵、溴化二(十八烷基)二甲基铵(DODAB)；两性离子(两性)表面活性剂、磺基甜菜碱CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐)、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂；非离子表面活性剂、乙氧基化物、长链醇、脂肪醇、鲸蜡醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、油醇、聚氧乙二醇烷基醚(Brij)：CH3–(CH2)10–16–(O-C2H4)1–25–OH(八乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十二烷基醚)、聚氧丙二醇烷基醚：CH3–(CH2)10–16–(O-C3H6)1–25–OH、葡萄糖苷烷基醚：CH3–(CH2)10–16–(O-葡萄糖苷)1–3–OH(癸基葡萄糖苷、月桂基葡萄糖苷、辛基葡萄糖苷)、聚氧乙二醇辛基苯酚醚：C8H17–(C6H4)–(O-C2H4)1–25–OH(Triton X-100)、聚氧乙二醇烷基苯酚醚：C9H19–(C6H4)–(O-C2H4)1–25–OH(壬苯醇醚-9)、甘油烷基酯(月桂酸甘油酯)、聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯(聚山梨糖醇酯)、脱水山梨糖醇烷基酯(spans)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、十二烷基二甲胺氧化物、聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物(泊洛沙姆(poloxamer))以及聚乙氧基化牛油胺(POEA)。

阴离子表面活性剂在其头部含有阴离子官能团，例如硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根。突出的烷基硫酸盐包含月桂基硫酸铵、月桂基硫酸钠(也称为SDS、十二烷基硫酸钠)和相关的烷基醚硫酸盐月桂基醚硫酸钠(sodium laureth sulfate/sodium lauryl ethersulfate(SLES))以及肉豆蔻硫酸钠。羧酸盐是最常见的表面活性剂，并且包括烷基羧酸盐(肥皂)，例如硬脂酸钠。

具有阳离子头部基团的表面活性剂包含：pH依赖性伯胺、仲胺或叔胺；奥替尼啶二盐酸盐；永久带电的季铵阳离子，例如烷基三甲基铵盐：溴化鲸蜡基三甲基铵(CTAB)，又名溴化十六烷基三甲基铵；氯化鲸蜡基三甲基铵(CTAC)；氯化鲸蜡基吡啶鎓(CPC)；苯扎氯铵(BAC)；苄索氯铵(BZT)；5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷；氯化二甲基二(十八烷基)铵；西曲溴铵；和溴化二(十八烷基)二甲基铵(DODAB)。

两性离子(两性)表面活性剂具有连接到同一分子的阳离子中心和阴离子中心。阳离子部分基于伯胺、仲胺或叔胺或季铵阳离子。阴离子部分更加可变并且包含磺酸盐。两性离子表面活性剂通常具有带有胺或铵的磷酸根阴离子，所述带有胺或铵的磷酸根阴离子例如在磷脂磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和鞘磷脂中发现到。

具有不带电的亲水部分的表面活性剂例如乙氧基化物是非离子的。许多长链醇都展现出一些表面活性剂性质。

组合物

在某些实施例中，提供了包括一种或多种生物表面活性剂分子的多功能生物表面活性剂基组合物。在具体实施例中，可以通过调整一种或多种生物表面活性剂分子的身份、比率和/或结构来针对特定目的定制所述组合物。

在一些实施例中，调整一种或多种生物表面活性剂分子的身份、比率和/或结构以实现期望的亲水-亲油平衡(HLB)。在某些实施例中，所述组合物中的每个单独的生物表面活性剂分子单独地作用于环境，使得例如组合物可用于需要高HLB的功能和需要低HLB的功能。举例来说，可以生产能够进行水包油乳化的组合物(HLB 13-18)和能够进行油包水乳化的组合物(HLB 3-6)。示例性组合物的O/W乳化强度相对于W/O乳化强度将取决于一种或多种高HLB分子与一种或多种低HLB分子的比率。

在某些附加和/或替代的实施例中，生物表面活性剂基组合物的特征在于整体上特定且在一些情况下精确的HLB值，其中可以通过调整所述组合物中的一种或多种生物表面活性剂分子的比率来特定地调节特定HLB值。

在一些实施例中，调整一种或多种生物表面活性剂分子的身份、比率和/或结构以实现期望的临界胶束浓度(CMC)值。CMC是表面活性分子或组合物的浓度，其中形成胶束聚集体并且所添加的所有其它表面活性剂形成胶束。在达到CMC之前，表面张力随着表面活性剂浓度增加而降低。在达到CMC之后，表面张力相对恒定。

在一些实施例中，调整一种或多种生物表面活性剂分子的身份、比率和/或结构以实现期望的贝壳杉脂丁醇(kauri-butanol，KB)值。KB用于描述物质的溶剂强度以及物质的清洁力。

根据特定用途的需要，可以将其它组分添加到所述组合物中。添加剂可以是例如缓冲剂、载剂、在相同或不同设施生产的其它微生物基组合物、粘度调节剂、防腐剂、用于微生物生长的营养素、用于植物生长的营养素、溶剂、药物、营养品、追踪剂、杀虫剂、除草剂、动物饲料、消毒剂、构建剂、辅表面活性剂、香料、食品成分和专用于预期用途的其它成分。

本发明进一步提供了这些产品在许多环境中的用途，所述环境包含例如改进的生物修复、采矿和油气生产；废物处置和处理；增强的人类健康；增强的牲畜和其它动物的健康；食品添加剂，例如防腐剂和/或乳化剂；化妆品添加剂；或增强的植物健康和生产力。

在一些实施例中，本发明的方法和组合物比利用竞品化学表面活性剂的方法和组合物表现得更好。举例来说，在一些实施例中，根据本发明利用的生物表面活性剂的结构和/或尺寸允许比化学表面活性剂所实现的表面张力降低和/或界面张力降低强的表面张力降低和/或界面张力降低。有利地，在某些实施例中，需要比竞品化学表面活性剂所需的剂量低的剂量的本发明的生物表面活性剂分子来实现表面张力和/或界面张力的期望降低。

在某些实施例中，本发明的生物表面活性剂分子和/或胶束的尺寸小于10nm，优选地小于8nm，更优选地小于5nm。在一个具体实施例中，尺寸是0.8nm到1.5nm或约1.0nm到1.2nm。有利地，这种小尺寸允许增强生物表面活性剂渗透到纳米尺寸的空间和孔隙中，所述空间和孔隙例如是地下含油地层中、植物和动物细胞之间、细胞膜中和生物膜基质中的空间和孔隙。

根据现有技术培养微生物生物表面活性剂是需要多个阶段的复杂、耗时且耗费资源的过程。有利地，本发明方法不需要复杂的设备或高能耗，因此降低了大规模生产微生物体和其代谢物的资金和劳动力成本。此外，仅需要根据本发明生产的一种产品来执行广泛多种的表面活性功能，所述表面活性功能可以用于使用表面活性剂的任何应用，例如油气工业、农业和/或化妆品行业。因此，本发明可以用于替代和/或减少这些行业中化学表面活性剂的使用。

实例

可以从以说明方式给出的以下实例中更深入地理解本发明和其许多优点。以下实例说明了本发明的一些方法、应用、实施例和变型。所述实例不被认为是对本发明的限制。可以对本发明作出多种改变和修改。

实例1–槐糖脂生产

槐糖脂是由例如斯塔莫酵母演化支的各种酵母产生的糖脂生物表面活性剂。SLP由与长链羟基脂肪酸连接的二糖槐糖组成。其可以包括以β-葡萄糖苷方式连接到17-L-羟基十八烷酸或17-L-羟基-Δ9-十八碳烯酸的部分乙酰化2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-D-吡喃葡萄糖单元。羟基脂肪酸一般具有16或18个碳原子，并且可以含有一个或多个不饱和键。此外，槐糖残基可以在一个或多个6位和/或6'位上被乙酰化。脂肪酸羧基可以是游离的(酸性或线性形式(通式1))或在4”位处内部酯化(内酯形式(通式2))。熊蜂生斯塔莫酵母产生特定酶，所述酶称为熊蜂生斯塔莫酵母内酯酯酶，所述酶催化线性SLP的酯化以产生内酯SLP。

在优选实施例中，本发明的SLP由通式(1)和/或通式(2)表示，并且以30种或更多种类型的具有不同脂肪酸链长(R3)并且在某些情况下在R1和/或R2处具有乙酰化或质子化的结构同系物的集合形式获得。

在通式(1)或(2)中，R⁰可以是氢原子或甲基。R¹和R²各自独立地是氢原子或乙酰基。R³是饱和脂肪烃链或具有至少一个双键的不饱和脂肪烃链，并且可以具有一个或多个取代基。

取代基的非限制性实例包含卤素原子、羟基、低碳数(C1-6)烷基、卤代低碳数(C1-6)烷基、羟基低碳数(C1-6)烷基、卤代低碳数(C1-6)烷氧基等。R³通常具有11到20个碳原子，优选地13到17个碳原子，并且更优选地14到16个碳原子。

为了产生SLP，向发酵反应器接种熊蜂生斯塔莫酵母。发酵温度保持在23℃到28℃下。约22小时到26小时后，使用20％NaOH将培养物的pH设定为约3.0到4.0或约3.5。发酵反应器包括监测pH并控制用于管理底座的泵的计算机，以使得pH保持在3.5。

培养约6-7天(120小时+/-1小时)后，如果有7.5ml SLP层可见并且没有油可见并且没有检测到葡萄糖，则已准备好收取批料。

在发酵期间改性SLP产品

可以通过更改发酵参数以多种方式修改通过本发明方法产生的SLP分子的结构。一种方法是在营养培养基中包含长链脂肪醇(例如C₄到C₂₆醇)。所得的SLP分子将包括长度至多C₃₆的疏水部分，并将提高所述组合物的疏水性、乳化和清洁能力。

另一种方法是限制发酵培养基中的糖和/或油的量。举例来说，在一些实施例中，将葡萄糖的量限于约25g/L到约75g/L，且/或将芥花油的量限于约25ml/L到约75ml/L。在某些实施例中，这将增加于培养物中产生的ASL的量。

为了增加疏水性SLP分子(例如LSL和一些ASL)的量，在约22℃到约28℃的温度和约2.5到4.0的pH下培养酵母，其中pH始于约4.0并在培养期间降低到约2.5并稳定在约2.5。

为了增加培养物中的ASL的量，在约5.5的pH和约35℃的温度下培养酵母。另外，利用奎假丝酵母(Candida kuoi)可以产生仅包括ASL的组合物，这是因为这种酵母仅产生ASL。

在发酵之后改性SLP产品

SLP分子的一些改性发生在培养循环结束之后。举例来说，可以使无机酸、碱性物质和/或盐与SLP混合以更改溶解度。

此外，除了SLP之外，酵母还会在酵母培养物中产生酶，例如脂肪酶和酯酶。某些酶催化氨基酸与SLP分子的结合。因此，可以将氨基酸添加到酵母培养物中，并基于氨基酸的特征和一种或多种SLP分子的期望特征进行选择。阳离子、阴离子、极性和非极性氨基酸在与SLP分子结合时可以将SLP分子的性质更改为阳离子、阴离子、极性或非极性的。

另外，某些酶在醇和脂肪酸存在的情况下催化SLP分子的酯化。

当发酵循环完成时，将选自甲醇、乙醇、异丙醇、己醇或庚醇的醇(例如10％v/v)添加到酵母培养物中。液体发酵培养基优选已经包括脂肪酸源，例如芥花油。然而，如果期望某种酯化产品，则可以添加附加的脂肪酸，例如经纯化形式的脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、蓖麻油酸、月桂酸和肉豆蔻酸。

将酵母培养物与醇和脂肪酸混合24小时。24小时后，停止混合，并且培养物将含有SLP酯，所述SLP酯含有所添加的醇、槐糖和脂肪酸酯，例如甲醇槐糖脂油酸酯，其是在使用甲醇和油酸时形成的。

实例2–样本SLP组合物

经纯化LSL

使用根据本发明的一个实施例的方法产生和纯化的LSL包括83.5％SLP(45.13％LSL和38.36％ASL)。脂肪酸(7.5％)和水(9％)构成产品的剩余部分。HLB是在1.65与2.99之间。

不论ASL存在于经纯化产品中的事实如何，其并未被视为杂质。ASL一般本质上是亲水的，而LSL一般本质上是亲油的。此处，ASL展现出亲油性质。因此，所述组合物的性质与更高纯度的LSL一致，尤其是在HLB方面如此。

经纯化ASL

使用根据本发明的一个实施例的方法产生和纯化的ASL包括92％SLP(80％ASL和12％LSL)。脂肪酸(6％)、葡萄糖(2％)和水(0.5％)构成产品的剩余部分。HLB≥20。

此处，ASL展现出典型的亲水性质，而少量的亲油性LSL被视为杂质，所述杂质可以通过进一步纯化来去除。

实例3–调整包括SLP的组合物以获得期望功能

当调整组合物中的SLP分子的类型和/或比率时参考以下原则(表1；也参见图2):

实例4–SLP组合物分析

重复熊蜂生斯塔莫酵母的发酵50次，从而产生50批具有以下比率的LSL与ASL的SLP(表2)：

使用所述批次中的ASL百分比执行线性回归分析。获得以下等式：

0.17+(0.365×ASL％)＝HLB值

这个等式可以用于使用SLP中的ASL百分比来预测HLB值。混合不同比率的LSL与ASL以查看实际数据如何拟合假设曲线。结果支持如下文所示的计算公式(表3)：

实例5–调整包括RLP的组合物以获得期望功能

在一些实施例中，所述组合物包括鼠李糖脂(RLP)。鼠李糖脂包括糖基头部基团(即，鼠李糖)部分和3-(羟基烷酰氧基)链烷酸(HAA)脂肪酸尾，例如3-羟基癸酸。存在两种主要的鼠李糖脂亚型，即单鼠李糖脂和二鼠李糖脂，其分别包括一个或两个鼠李糖部分。HAA部分的长度和支化程度可以变化，这取决于例如生长培养基和环境条件。

本发明的鼠李糖脂可以具有以下结构：

其中m是2、1或0，

n是1或0，

R¹和R²彼此独立地是具有2到24个、优选地5到13个碳原子的相同或不同的有机官能团，特别是被取代或未被取代、支化或未支化的烷基官能团，所述官能团也可以是不饱和的，

其中烷基官能团是具有8到12个碳原子的直链饱和烷基官能团，或是壬基或癸基官能团或其混合官能团。

根据本发明，还包含这些化合物的盐。在本发明中，术语“二鼠李糖脂”应理解为意思指上式化合物或其盐，其中，n是1。因此，“单鼠李糖脂”在本发明中应理解为意思指通式化合物或其盐，其中，n是0。

如图3-4中所示，RLP分子的结构可以显著地影响功能。

实例6–调整包括MEL的组合物以获得期望功能

在一些实施例中，所述组合物包括甘露糖赤藓糖醇脂(MEL)，即一类包括4-O-B-D-吡喃甘露糖基-内消旋-赤藓糖醇或1-O-B-D-吡喃甘露糖基-内消旋-赤藓糖醇作为亲水部分和脂肪酸基团和/或乙酰基作为疏水部分的生物表面活性剂。

MEL亚型可以包括不同的碳长度链或不同数量的乙酰基和/或脂肪酸基团。MEL亚型可以包含例如三酰化MEL、二酰化MEL、单酰化MEL、三乙酰化MEL、二乙酰化MEL、单乙酰化MEL和非乙酰化MEL以及其立体异构体和/或结构异构体。此外，可以存在一到三个链长是6到12个或更多个碳的酯化脂肪酸。

在某些具体实施例中，MEL被表征为以下群组：MEL A(二乙酰化)、MEL B(在C4处单乙酰化)、MEL C(在C6处单乙酰化)、MEL D(非乙酰化)、三乙酰化MEL A、三乙酰化MEL B/C，并且进一步包含这些群组的成员的所有可能性异构体。本发明的MEL可以具有以下结构：

其中，R₂和R₃＝C₂-C₁₈脂肪酸，并且

MEL A：R₄＝R₆＝乙酰基；

MEL B：R₄＝H，R₆＝乙酰基；

MEL C：R₄＝乙酰基，R₆＝H；并且

MEL D：R₄＝R₆＝H

如图5中所示，MEL分子的结构可以显著地影响功能。

实例7–调整包括脂肽的组合物以获得期望功能

在一些实施例中，所述组合物包括脂肽。脂肽是使用大型多酶复合物由细菌合成的寡肽。其常用作抗生素化合物，并且除了表面活性剂活性之外，还展现出宽作用抗菌谱。所有脂肽共用一个共同的环状结构，所述环状结构由整合到肽部分中的β-氨基或β-羟基脂肪酸组成。

表面活性素脂肽由含有具有13到15个碳原子的β-羟基脂肪酸的七肽组成。包含巴斯他汀(plipastatin)的丰原素脂肽是具有β-羟基脂肪酸的十肽。由例如伊枯草菌素A、抗霉菌枯草杆菌素和杆菌抗霉素代表的伊枯草菌素脂肽是具有β-氨基脂肪酸的七肽。

已经识别出展现出多种有用特征的其它脂肽。这些脂肽包含但不限于库斯塔金(kurstakins)、节杆菌脂肽、粘液菌素、球孢菌素(glomosporin)、安非辛(amphisin)和丁香霉素，仅举几例。

如图6中所示，脂肽分子的结构可以显著地影响功能。

在某些实施例中，脂肽具有以下通用结构之一，其中通用结构A是伊枯草菌素，通用结构B是表面活性素，并且通用结构C是丰原素。

实例8—基于预期性质的表面活性剂HLB值

商业表面活性剂基产品用于食品制造、药物、化妆品、个人护理产品、清洁剂、油漆、纺织品、燃料、天然和合成油以及许多其它应用中。在农业中，其可以用作杀虫剂和/或肥料。其还可以用于矿石富集、异型生物质修复以及用于油气回收中。

一种或多种表面活性剂的选择取决于特定的预期用途并基于一个或多个HLB值来确定。表4显示了基于期望性质的示例性HLB值(也参见图7)。

实例9—基于预期用途的表面活性剂HLB值–石油工业

表面活性剂广泛用于油气回收中，包含例如原油回收增强；油气井增产(以改善油流入井筒中)；从例如杆、管、衬里、罐和泵的设备中去除污染物和/或障碍物，例如石蜡、沥青质和水垢；油气生产和运输设备的腐蚀防止；原油和天然气中的H₂S浓度降低；原油粘度降低；将重质原油和沥青质升级为较轻质烃级分；清洗罐、流线和管道；通过选择性和非选择性堵塞增强水溢流期间的油流动性；和压裂液。

一种或多种表面活性剂的选择取决于特定的预期用途并基于一个或多个HLB值来确定。以下是基于期望用途的示例性HLB值。有利地，本发明方法提供了表面活性组合物，所述组合物可以被调整以执行如下表5中所示的所有功能以用于油气回收：

在一个具体示例性实施例中，胶束尺寸是在油气工业中使用生物表面活性剂的另一个有利方面。化学表面活性剂和含纳米颗粒的流体常用于增强地层中从孔隙和水力压裂进行的油回收。这些化合物的尺寸范围可以是15-18nm，至多约100nm。举例来说，在某些含有页岩的地层中，地层孔径在低纳米范围内，通常是13nm到18nm；因此，利用具有例如小于1.5nm尺寸的本发明的生物表面活性剂提供了到达最小孔隙以移出油的手段，这是其它处理不能做到的。

因此，提供了用于从孔径小于20nm、小于18nm、小于15nm和/或小于13nm的含油地层中回收油的方法，其中，将包括根据本发明产生的生物表面活性剂的井处理液引入地层中，并且其中，处理液接触存在于孔隙中的油并从其中移出油，使得以大于在井处理液中使用化学表面活性剂情况下的量的量从地层中回收油。

实例10—基于预期用途的表面活性剂HLB值–农业

表面活性剂广泛用于农业中。一种或多种表面活性剂的选择取决于特定的预期用途并基于一个或多个HLB值来确定。以下是基于期望用途的示例性HLB值。有利地，本发明方法提供了表面活性组合物，所述组合物可以被调整以执行如下表6中所示的所有功能以用于农业：

在一个具体示例性实施例中，胶束尺寸是在农业中使用生物表面活性剂的另一个有利方面。在某些情况下，小胶束尺寸允许生物表面活性剂以及水和溶解营养物渗透和吸收到植物根部和脉管系统中，从而降低植物内的表面张力，增加营养物和水向植物细胞的运输，并增加毒素和废物从细胞中分泌出。因此，可以增加植物健康和生长。

实例11—基于预期用途的表面活性剂HLB值–化妆品和个人护理

表面活性剂广泛用于化妆品和个人护理产品行业中。一种或多种表面活性剂的选择取决于特定的预期用途并基于一个或多个HLB值来确定。以下是基于期望用途的示例性HLB值。有利地，本发明方法提供了表面活性组合物，所述组合物可以被调整以执行如下表7中所示的所有功能以用于化妆品和个人护理：

实例12—基于预期用途的表面活性剂HLB值–清洁用品

表面活性剂广泛用于家庭、机构和工业(HI&I)清洁用品中。一种或多种表面活性剂的选择取决于特定的预期用途并基于一个或多个HLB值来确定。以下是基于期望用途的示例性HLB值。有利地，本发明方法提供了表面活性组合物，所述组合物可以被调整以执行如下表8中所示的所有功能以用于HI&I清洁用品：

实例13—基于预期用途的表面活性剂HLB值–建筑

表面活性剂广泛用于建筑中。一种或多种表面活性剂的选择取决于特定的预期用途并基于一个或多个HLB值来确定。以下是基于期望用途的示例性HLB值。有利地，本发明方法提供了表面活性组合物，所述组合物可以被调整以执行如下表9中所示的所有功能以用于建筑：

实例14—基于预期用途的表面活性剂HLB值–家畜健康

表面活性剂广泛用于动物健康中。一种或多种表面活性剂的选择取决于特定的预期用途并基于一个或多个HLB值来确定。以下是基于期望用途的示例性HLB值。有利地，本发明方法提供了表面活性组合物，所述组合物可以被调整以执行如下表10中所示的所有功能以用于家畜和其它家养动物健康：

在一个具体示例性实施例中，胶束尺寸是在畜牧业中使用生物表面活性剂的另一个有利方面。在一些情况下，小胶束尺寸允许生物表面活性剂以及水、溶解营养物和药物渗透和吸收通过肠上皮细胞，并增加毒素和废物从细胞中分泌出。在某些情况下，小胶束尺寸也有益于渗透和破坏表面上的生物膜，包括GI道的生物膜，这可以有助于减少肠道产甲烷生物膜以及其它病原生物膜。

应当理解，本文所描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且所属领域的技术人员将鉴于此提出各种修改或改变，并且所述修改或改变将被包含在本申请的精神和范围内。

本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开以全文引用的方式并入，包含所有附图和表格，达到其与本说明书的明确教导内容不矛盾的程度。

Claims (16)

1.一种用于产生具有所期望的一种或多种功能性质的绿色表面活性剂组合物的方法，所述方法包括识别具有特定功能性质的生物表面活性剂分子，并通过培养产生生物表面活性剂的微生物体来产生所述生物表面活性剂分子，

其中，所述组合物和/或所述生物表面活性剂分子的所述功能性质是通过HLB值、CMC值和/或KB值来测量的。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将所述生物表面活性剂分子与具有特定功能性质的一种或多种附加的生物表面活性剂分子以将产生对于所述绿色表面活性剂组合物为所期望的所述一种或多种功能性质的比率混合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在产生所述生物表面活性剂期间通过在培养所述产生生物表面活性剂的微生物体的同时更改发酵参数来修改所述生物表面活性剂分子的结构。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，在产生所述生物表面活性剂之后修改所述生物表面活性剂分子的所述结构。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物表面活性剂分子是糖脂或脂肽。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述产生生物表面活性剂的微生物体是解淀粉芽孢杆菌NRRL B-67928。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述解淀粉芽孢杆菌NRRL B-67928产生一种或多种选自由表面活性素、地衣素、丰原素和伊枯草菌素组成的组的脂肽。

8.一种具有所期望的一种或多种功能性质的绿色表面活性剂组合物，所述组合物包括一种或多种生物表面活性剂分子，

其中，所述一种或多种生物表面活性剂分子的身份、比率和结构是基于其对所期望的所述功能性质的贡献来加以选择的。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述一种或多种生物表面活性剂分子是选自由槐糖脂、鼠李糖脂、海藻糖脂和甘露糖赤藓糖醇脂组成的组的糖脂。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述一种或多种生物表面活性剂分子是选自由表面活性素、地衣素、丰原素和伊枯草菌素组成的组的脂肽。

11.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述一种或多种生物表面活性剂分子是由解淀粉芽孢杆菌NRRL B-67928产生。

12.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述一种或多种生物表面活性剂分子是由熊蜂生斯塔莫酵母产生。

13.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述一种或多种生物表面活性剂分子是由异常威克汉姆酵母产生。

14.根据权利要求8所述的组合物，用于替代和/或减少化学表面活性剂。

15.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述生物表面活性剂具有小于5nm的胶束尺寸。

16.一种从孔径小于20nm的含油地层中回收油的方法，其中，将包括根据权利要求5所述的组合物的井处理液引入所述地层中，并且其中，所述处理液接触存在于所述小于20nm的孔隙中的所述油并从其中移出所述油，使得以大于在所述井处理液中使用化学表面活性剂情况下的量的量从所述地层中回收所述油。

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