KR101581185B1

KR101581185B1 - 대장균에서 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 유전자를 이용한 퀘세틴-3-O-갈락토사이드의 대량생산 방법

Info

Publication number: KR101581185B1
Application number: KR1020130163807A
Authority: KR
Inventors: 안중훈; 김봉규; 윤정아
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2015-12-31
Also published as: KR20150075637A

Abstract

본 발명은 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT(Petunia hybrida UDP-dependent glycosyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터, UDP-갈락토오즈 합성 유전자를 포함하는 발현벡터 및 galE(UDP-galactose epimerase) 유전자가 결실된 대장균을 함유하는 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물 제조용 조성물 및 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT(Petunia hybrida UDP-dependent glycosyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 및 UDP-갈락토오즈 합성 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물을 생산하는 대장균에 관한 것이다.

Description

대장균에서 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 유전자를 이용한 퀘세틴-3-O-갈락토사이드의 대량생산 방법{Method for mass production of quercetin-3-O-galactoside using PeF3GalGT gene in Escherichia coli}

본 발명은 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 유전자를 이용한 퀘세틴-3-O-갈락토사이드의 대량생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT(Petunia hybrida UDP-dependent glycosyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터, UDP-갈락토오즈 합성 유전자를 포함하는 발현벡터 및 galE(UDP-galactose epimerase) 유전자가 결실된 대장균을 함유하는 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물 제조용 조성물 및 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 및 UDP-갈락토오즈 합성 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 퀘세틴-3-O-갈락토사이드 화합물을 생산하는 대장균에 관한 것이다.

일반적으로 배양 방법과 유전자 조작기술이 잘 확립되어 있는 대장균과 같은 미생물에 유용한 유전자를 도입함으로써 천연물을 효소학적으로 변형할 수 있는데, 이러한 방법을 생물전환법(biotransformation)이라 한다. 생물전환법을 이용하면 반응중간에 들어가는 값비싼 보조인자(cofactor)를 절약할 수 있는 장점을 가지고있다.

새로운 의약 후보물질로 많은 관심을 불러일으키고 있는 플라보노이드는 식물이 만들어 내는 많은 이차 대사산물 중 하나이다. 플라보노이드는 항산화 작용, 항암효과, 항염 및 항알러지효과 등과 같은 여러 가지 생리활성을 가지는 것으로 보고되고 있다. 이러한 플라보노이드의 당화(glycosylation)는 용해도가 증가되고, 동시에 흡수성이 높아지는 것으로 알려져 있다. 이처럼 천연물이 특정한 구조적 변형이 일어나면 생리활성이 변하는데, 대표적인 구조적 변형 방법은 히드록시기(-OH) 그룹에 당(glucose) 한 분자를 전이시켜 주는 역할을 하는 당전이효소(glycosyltransferases)를 이용하는 것이다.

퀘세틴(Quercetin, 3,3',4',5,7-펜타하이드록시플라본(3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone))은 강력한 항산화활성(Middlton et al., 2000, Pharmacol. Rev. 52:673-751) 외에, 혈소판의 응집 억제 및 접착 억제 작용, 혈관 확장 작용, 항암 작용 등 다양한 생리기능을 갖는 것이 알려져 있다. 특히, 양파에 많이 함유된 퀘세틴 배당체(퀘세틴-4'-β-D-글루코시드(Quercetin-4'-β-D-glucoside) 및 퀘세틴-3,4'-β-D-글루코시드(Quercetin-3,4'-β-D-glucoside)) 쪽이 흡수성이 우수한 것으로 보고되어 있다(Hollman et al., 1998, Arch. Toxicol. Suppl. 20:237-248). 또한, 유사하게 퀘세틴의 3번 탄소 위치에 글루코오스가 β결합한 이소퀘세틴(퀘세틴-3-β-D-글루코사이드(Quercetin-3-β-D-glucoside))은 퀘세틴이나 루틴보다도 흡수성이 높은 것으로 보고되어 있다(Morand et al., 2000, Free Raf. Res. 33:667-676).

당전이효소는 핵산당(nucleotide sugar)을 당 공여체(donor)로 이용하는데, 본 발명은 새로운 구조의 핵산당을 대장균에서 만들기 위해 대장균의 핵산당 대사경로를 분석하고 핵산당 합성경로에 있는 물질들을 기질로 사용할 수 있는 대장균 유래 galE 유전자 및 벼 유래의 OsUGE(Oryza sativa UDP-glucose epimerase) 유전자를 대장균에 도입하였다. OsUGE 유전자는 UDP-글루코오즈(UDP-D-glucose)를 이용하여 UDP-D-갈락토오즈(UDP-D-galactose)를 만들며, 이렇게 만들어진 UDP-D-갈락토오즈는 당전이효소에 의해 퀘세틴의 당화에 이용된다. 본 발명은 기질로 퀘세틴을 사용하였고, 상기와 같은 반응을 통해 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside)를 합성하였다.

이러한 물질을 합성하는 생물전환법(효소학적 합성 방법)은 화학적 합성법으로 물질을 변형하기 어려운 위치 선택성과 키랄 선택성을 가지기 때문에 화학적 합성법에 비하여 여러 가지 장점을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 페튜니아 플라보노이드 갈락토스 당전이효소 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자를 가지고 대장균을 이용한 생물전환법은 퀘세틴-3-O-갈락토사이드를 생산할 수 있는 새로운 방법이 될 수 있을 것이다.

한국등록특허 제1282329호에는 '케르세틴-3-글루코사이드의 화학적 대량 합성 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0001907호에는 '아스퍼질러스 나이거 유래의 람노시데이즈를 이용한 루틴에서 퀘세틴-3-글루코사이드를 제조하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '대장균에서 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 유전자를 이용한 퀘세틴-3-O-갈락토사이드의 대량생산 방법'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균에서 퀘세틴-3-O-갈락토사이드가 대량 생산되는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명에서는 UDP-글루코오즈에서 UDP-갈락토오즈로 전환해주는 galE 유전자가 결손된 대장균 BL21(DE3)를 이용함으로써, 대장균을 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환할 때, 동시에 UDP-갈락토오즈 합성 유전자인 대장균 유래 galE 유전자 및 벼 유래의 OsUGE(Oryza sativa UDP-glucose epimerase) 유전자를 각각 대장균에 발현시킨 결과, 벼 유래의 OsUGE 유전자를 발현시킨 대장균에서 더 많은 퀘세틴-3-O-갈락토사이드가 생산되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT(Petunia hybrida UDP-dependent glycosyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터, UDP-갈락토오즈 합성 유전자를 포함하는 발현벡터 및 galE(UDP-galactose epimerase) 유전자가 결실된 대장균을 함유하는 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물 제조용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

a) 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT(Petunia hybrida UDP-dependent glycosyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 대장균을 형질전환시키는 단계;

b) 상기 발현벡터를 대장균에 UDP-갈락토오즈 합성 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질전환시키는 단계; 및

c) 상기 형질전환 대장균을 배양하면서 퀘세틴을 기질로 첨가하는 단계를 포함하는 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT(Petunia hybrida UDP-dependent glycosyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 및 UDP-갈락토오즈 합성 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물을 생산하는 대장균을 제공한다.

본 발명의 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 유전자를 이용한 퀘세틴-3-O-갈락토사이드의 생산 방법을 이용하면, 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside)의 대량생산이 가능하므로, 이를 기능성분으로 이용하는 각종 식품, 의약품 및 화장품 등에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 기질 퀘세틴으로부터 화합물인 퀘세틴-3-O-갈락토사이드를 합성하는 것을 도식화한 그림이다.
도 2는 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자를 형질전환시킨 대사조절된 대장균을 이용하여 퀘세틴을 기질로 생물전환을 실시하여 얻은 반응물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석한 결과이다. (A); pEGX 벡터, (B); PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자가 클로닝된 pEGX 벡터, S; 퀘세틴, P; 퀘세틴-3-O-갈락토사이드.
도 3은 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자를 형질전환시킨 대사조절된 대장균을 이용하여 퀘세틴을 기질로 생물전환을 실시하여 얻은 반응물을 질량분석(MS)한 결과이다. (A); PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자가 클로닝된 pEGX 벡터, (B); pEGX 벡터
도 4는 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자와 대장균의 galE 유전자 또는 벼 유래 OsUGE(Oryza sativa UDP-glucose epimerase) 유전자를 포함하는 발현 벡터로 대사조절된 대장균에 형질전환하여 화합물의 생산량을 비교한 결과이다. A; PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자(qGEX)와 galE(pCDF)를 포함하는 대장균 BL21을 이용하여 생산한 화합물, B; PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자(qGEX)와 OsUGE(pDCF)를 포함하는 대장균 BL21을 이용하여 생산한 화합물.
도 5는 페튜니아 유래 당전이효소 PeFGalGT 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 pGEX 벡터와 벼 유래 OsUGE 유전자를 포함하는 pCDF 벡터로 형질전환시킨 대장균 BL21(DE3)에서 단백질 발현 유도 배양 조건 중 시간별로 퀘세틴-3-O-갈락토사이드의 합성량을 조사한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT(Petunia hybrida UDP-dependent glycosyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터, UDP-갈락토오즈 합성 유전자를 포함하는 발현벡터및 galE(UDP-galactose epimerase) 유전자가 결실된 대장균을 함유하는 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물은 하기 화학식 1과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 PeF3GalGT 단백질의 범위는 페튜니아(Petunia hybrida)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 상기 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로 상기 유전자 상동체는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예: pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, 대장균 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 galE 유전자가 결실된 대장균은 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서는 UDP-글루코오즈에서 UDP-갈락토오즈로 전환해주는 UDP-갈락토오즈 합성 유전자가 결손된 대장균 BL21(DE3)를 이용하였다. 따라서, 대장균에서 퀘세틴-3-O-갈락토사이드를 생산하기 위해 UDP-갈락토오즈 합성 유전자를 포함하는 발현벡터를 동시에 형질전환시켰다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 UDP-갈락토오즈 생합성 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 벼 유래의 OsUGE 유전자 또는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 대장균 유래의 galE 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 벼 유래의 OsUGE 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

b) 상기 형질전환된 대장균에 UDP-갈락토오즈 합성 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질전환하는 단계; 및

c) 상기 형질전환 대장균을 배양하면서 퀘세틴을 기질로 첨가하는 단계를 포함하는 대장균에서 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 아미노산 서열의 기능적 동등물이 본 발명의 범위 내에 포함되는데 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166:557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 대장균은 재조합 단백질의 대량생산에 이용되고 있는 대장균일 수 있으며, 바람직하게는 galE 유전자가 결실된 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 방법에서, 퀘세틴-3-O-갈락토사이드 생산을 위한 상기 형질전환 대장균의 단백질 발현 유도 배양 조건은 15~30℃의 온도, 배양 시간 12~72시간 및 세포농도 OD₆₀₀=2~10일 수 있고, 바람직하게는 17~19℃의 온도, 배양 시간 12~20시간, 세포 농도는 OD₆₀₀=2~5, 가장 바람직하게는 18℃의 온도, 18시간 배양 및 세포농도 OD₆₀₀=3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 대장균에서, 상기 페튜니아 유래 당전이효소 PeF3GalGT 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 아미노산 서열의 기능적 동등물이 본 발명의 범위 내에 포함되는데 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 대장균에서, 상기 대장균은 재조합 단백질의 대량생산에 이용되고 있는 대장균일 수 있으며, 바람직하게는 galE 유전자가 결실된 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 대장균에서, 상기 UDP-갈락토오즈 합성 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 벼 유래의 OsUGE 유전자 또는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 대장균 유래의 galE 유전자일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 벼 유래의 OsUGE 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 페튜니아 당전이효소 유전자의 클로닝 및 대장균 발현벡터 제작

페튜니아 당전이효소 유전자의 분리

페튜니아 식물체 전체를 액체질소로 곱게 갈아 총 DNA를 분리했다. 분리한 총 DNA를 EcoRI 제한효소 자리를 삽입하여 만든 정방향(5'-ATGGAATTCGATGTCCAATTACCATGTTGC-3'; 서열번호 5, 밑줄; EcoRI 자리) 및 역방향(5'-TTCACGTCCAGCAATTCCTTGAGCCTCAACAT-3'; 서열번호 6) 프라이머 조합과 정방향(5'-ATGTTGAGGCTCAAGGAATTGCTGGACGTGAA-3'; 서열번호 7) 및 NotI 제한효소 자리를 삽입하여 만든 역방향(5'-CATGCGGCCGCTTAATTGCAAGAGGTGATA-3'; 서열번호 8, 밑줄; NotI 제한효소 자리) 프라이머 조합을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)을 실시하였다. PCR결과 형성된 산물을 주형으로 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시하여 페튜니아 당전이효소 유전자를 분리하였다.

PCR은 Taq DNA 폴리머라제(Taq DNA polymerase)를 위의 역전사체와 프라이머들을 혼합하여 94℃ 60초, 55℃ 60초, 72℃ 90초의 사이클을 40회 반복하여 수행하였고, PCR 결과 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 약 1.3kbp 에 해당되는 유전자를 증폭하였다. 증폭된 DNA는 대장균 클로닝 벡터인 pGEMT-easy에 옮겨 염기서열을 결정하였다.

PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키기 위한 벡터 제작

클로닝한 페튜니아 당전이효소 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키기 위하여, 상기 EcoRI과 NotI 제한효소 부위를 삽입하여 분리한 당전이효소 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자를 EcoRI과 NotI으로 절단한 대장균 발현벡터인 pGEX 5X-3에 삽입하여 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키기 위한 벡터를 제작하였다.

실시예 2. PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 및 생물전환방법을 이용한 새로운 물질 생산

대장균 DH5a에 상기 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질전환하였다. PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 형질전환 대장균을 50㎍/㎖ 엠피실린을 첨가한 LB 배지에 종균배양 하였다. 밤샘 배양한 종균배양 대장균 균주를 새로운 LB 배지에 접종하고, 600nm에서 흡광도 값 0.8까지 배양하였다. 배양된 대장균에 IPTG를 최종농도 1mM로 첨가해 주고, 18℃에서 18시간 동안 단백질을 발현시켰다. 배양된 대장균은 원심분리를 하여 상등액은 버리고, 회수된 대장균은 50㎍/㎖ 엠피실린과 2% 글루코즈가 첨가된 M9 배지에 흡광도 600nm에서 3.0로 되게 맞추었다. 여기에 최종 농도가 100μM이 되게 기질인 퀘세틴을 첨가해주고 25℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 상등액은 에칠아세테이트를 이용하여 추출하였다. 추출된 반응물은 진공농축 건조기를 이용하여 건조시킨 후 반응물을 다시 DMSO에 녹여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 이용하였다.

그 결과, 퀘세틴으로부터 새로운 화합물의 생성이 확인되었고(도 2), 이 물질의 분자량을 질량분석으로 확인해 본 결과 464-Da 크기의 물질임이 확인되었다. 또한 NMR 분석 결과 생성물의 구조는 예측하였던 퀘세틴-3-O-galactose 로 밝혀졌다.

실시예 3. 대사조절 대장균별 퀘세틴-3-O-갈락토사이드의 생산량 비교

퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside)의 생산량을 높이기 위하여 대장균의 대사과정을 조절하였다. 대장균 BL21(DE3)는 UDP-글루코오즈(UDP-glucose)에서 UDP-갈락토오즈(UDP-galactose)로 전환해주는 galE 유전자가 결손되어 있기 때문에 UDP-갈락토오즈가 존재하지 않는다. 이에 본 발명에서는 UDP-글루코오즈를 기질로 이용하여 UDP-갈락토오즈를 합성하는 대장균의 galE 유전자 또는 벼에서 클로닝한 OsUGE 유전자를 pCDF 벡터에 도입하여 대장균 BL21(DE3)에서 PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자와 동시에 발현시켰다. 그 결과, OsUGE가 도입된 대장균 BL21(DE3) 형질전환체가 galE 유전자가 도입된 대장균보다 퀘세틴-3-O-갈락토사이드가 약 1.85배가 증가함을 알 수 있었다(도 4).

또한, PeF3GalGT 단백질을 코딩하는 유전자와 OsUGE 유전자가 도입된 대장균 BL21(DE3)를 이용하여 퀘세틴으로부터 퀘세틴-3-O-갈락토사이드의 합성을 조사하였다. 18℃에서 20시간 동안 유도한 후 대장균을 모아 흡광도 600nm에서 값을 3으로 2%의 글루코오즈, 50㎍/㎖의 엠피실린과 스펙티노마이신이 함유된 M9을 이용하여 퀘세틴을 넣고 30℃에서 배양하였다. 퀘세틴은 0, 3, 6, 9, 12, 24, 36 시간마다 100μM씩 첨가하여 최종적으로 700μM을 첨가하였다. 그 결과, 72시간 후에 277.9㎎/ℓ의 퀘세틴-3-O-갈락토사이드가 생산되는 것을 확인하였다(도 5).

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Method for mass production of quercetin-3-O-galactose using PeF3GalGT gene in Escherichia coli <130> PN13383 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1356 <212> DNA <213> Petunia hybrida <400> 1 atgtccaatt accatgttgc tgttctagca tttccttttg caacacatgc tggcctttta 60 cttggacttg tacaaaggct agcaaatgca ttacctaacg tgacatttac attctttaac 120 acgtccaaat caaattcttc attattcact actcctcatg acaacaacat taaaccgttt 180 aatatctccg atggcgtccc ggagggttac gtggtcggaa aaggaggtat tgaagcgctt 240 atagggttgt tctttaagtc tgctaaagag aatattcaaa atgctatggc agctgctgtg 300 gaggaatcgg gaaagaagat tacttgtgtt atggcagatg catttatgtg gttttctggt 360 gagattgctg aggaattgag cgttggttgg atccctttat ggacttctgc tgctggatca 420 ctctctgttc atgtttacac tgatctcatt agagaaaatg ttgaggctca aggaattgct 480 ggacgtgaag atgaaattct aacattcatt ccaggatttg ccgaattacg gctaggtagt 540 ttgcctagtg gagttgtctc tggagacttg gaatcaccat tttccgtaat gcttcacaaa 600 atgggcaaaa caataggaaa agccactgcc ttgccagtaa actcctttga agaactagac 660 cctccaattg ttgaagatct caagtccaaa ttcaataact tcctcaatgt tggtcccttt 720 aacttaacta ccccaccacc ctcagcaaac attacagatg aatatgggtg cattgcatgg 780 ctagacaaac aagaaccagg ctcagtggct tacataggat ttggcacggt ggctacacca 840 ccacctaatg agctaaaagc tatggctgaa gcacttgaag aaagtaaaac tccttttctt 900 tggtcactta aagacctttt caaatcattt tttccagaag ggttcttgaa aagaactagt 960 gagtatggta aaattgtgtc atgggcacca caagtacaag ttcttagtca tggttcagtt 1020 ggtgttttta taaatcattg tggatggaac tctgttttgg agagtatagc tgctggtgtg 1080 cctgtgattt gcaggccatt ttttggagat catcaattga atgcttggat ggttgagaaa 1140 gtatggaaaa ttggagtgaa aattgaagga ggagttttta ctaaagatgg aacaatgctt 1200 gcacttgact tggttttatc aaaaaccaaa aggaatacag aattgaaaca acaaattggg 1260 atgtataaag agcttgctct aaatgctgtt ggaccaagtg ggagctctac tgaaaatttc 1320 aagaaattgg ttgatattat cacctcttgc aattaa 1356 <210> 2 <211> 451 <212> PRT <213> Petunia hybrida <400> 2 Met Ser Asn Tyr His Val Ala Val Leu Ala Phe Pro Phe Ala Thr His 1 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Leu Gly Leu Val Gln Arg Leu Ala Asn Ala Leu Pro 20 25 30 Asn Val Thr Phe Thr Phe Phe Asn Thr Ser Lys Ser Asn Ser Ser Leu 35 40 45 Phe Thr Thr Pro His Asp Asn Asn Ile Lys Pro Phe Asn Ile Ser Asp 50 55 60 Gly Val Pro Glu Gly Tyr Val Val Gly Lys Gly Gly Ile Glu Ala Leu 65 70 75 80 Ile Gly Leu Phe Phe Lys Ser Ala Lys Glu Asn Ile Gln Asn Ala Met 85 90 95 Ala Ala Ala Val Glu Glu Ser Gly Lys Lys Ile Thr Cys Val Met Ala 100 105 110 Asp Ala Phe Met Trp Phe Ser Gly Glu Ile Ala Glu Glu Leu Ser Val 115 120 125 Gly Trp Ile Pro Leu Trp Thr Ser Ala Ala Gly Ser Leu Ser Val His 130 135 140 Val Tyr Thr Asp Leu Ile Arg Glu Asn Val Glu Ala Gln Gly Ile Ala 145 150 155 160 Gly Arg Glu Asp Glu Ile Leu Thr Phe Ile Pro Gly Phe Ala Glu Leu 165 170 175 Arg Leu Gly Ser Leu Pro Ser Gly Val Val Ser Gly Asp Leu Glu Ser 180 185 190 Pro Phe Ser Val Met Leu His Lys Met Gly Lys Thr Ile Gly Lys Ala 195 200 205 Thr Ala Leu Pro Val Asn Ser Phe Glu Glu Leu Asp Pro Pro Ile Val 210 215 220 Glu Asp Leu Lys Ser Lys Phe Asn Asn Phe Leu Asn Val Gly Pro Phe 225 230 235 240 Asn Leu Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ala Asn Ile Thr Asp Glu Tyr Gly 245 250 255 Cys Ile Ala Trp Leu Asp Lys Gln Glu Pro Gly Ser Val Ala Tyr Ile 260 265 270 Gly Phe Gly Thr Val Ala Thr Pro Pro Pro Asn Glu Leu Lys Ala Met 275 280 285 Ala Glu Ala Leu Glu Glu Ser Lys Thr Pro Phe Leu Trp Ser Leu Lys 290 295 300 Asp Leu Phe Lys Ser Phe Phe Pro Glu Gly Phe Leu Lys Arg Thr Ser 305 310 315 320 Glu Tyr Gly Lys Ile Val Ser Trp Ala Pro Gln Val Gln Val Leu Ser 325 330 335 His Gly Ser Val Gly Val Phe Ile Asn His Cys Gly Trp Asn Ser Val 340 345 350 Leu Glu Ser Ile Ala Ala Gly Val Pro Val Ile Cys Arg Pro Phe Phe 355 360 365 Gly Asp His Gln Leu Asn Ala Trp Met Val Glu Lys Val Trp Lys Ile 370 375 380 Gly Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Phe Thr Lys Asp Gly Thr Met Leu 385 390 395 400 Ala Leu Asp Leu Val Leu Ser Lys Thr Lys Arg Asn Thr Glu Leu Lys 405 410 415 Gln Gln Ile Gly Met Tyr Lys Glu Leu Ala Leu Asn Ala Val Gly Pro 420 425 430 Ser Gly Ser Ser Thr Glu Asn Phe Lys Lys Leu Val Asp Ile Ile Thr 435 440 445 Ser Cys Asn 450 <210> 3 <211> 1065 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 3 atggtttcgg ccttgttgcg gacgatcctg gtgacgggcg gcgccggcta catcggcagc 60 cacaccgtcc tccagcttct ccaactcggc ttccgcgttg tcgtcctcga caacctcgac 120 aacgcctccg agctcgccat cctccgcgtc agggaactcg ccggacacaa cgccaacaac 180 ctcgacttcc gcaaggttga cctccgcgac aagcaagcgt tggaccaaat cttctcctct 240 caaaggtttg aggctgtcat ccattttgcc gggctgaaag ctgttggcga gagcgtgcag 300 aagcccctgc tttactacga caacaacctc atcggcacca tcactctcct gcaggtcatg 360 gccgcacatg gctgcaccaa gctggtgttc tcatcatccg caactgtcta cgggtggccc 420 aaggaggtgc cctgcactga agaatcccca ctttgtgcaa tgaaccccta cggcagaaca 480 aagctggtaa tcgaagacat gtgccgggat ctgcatgcct cagacccaaa ctggaagatc 540 atactgctcc gatacttcaa ccctgttgga gctcacccaa gcgggtacat tggtgaggac 600 ccctgcggca tcccaaacaa cctcatgccc ttcgtccagc aggtcgctgt tggcaggagg 660 ccggccctta ccgtctatgg aaccgactac aacaccaagg atggaactgg ggttcgtgac 720 tatatccatg ttgttgatct agcggatggt catatcgccg cgttaaggaa gctctatgaa 780 gattctgata gaataggatg tgaggtgtac aatctgggca ctggaaaggg gacatctgtg 840 ctggaaatgg ttgcagcatt cgagaaagct tctggaaaga aaatcccgct tgtatttgct 900 ggacgaaggc ctggagatgc cgagatcgtt tacgctcaaa ctgccaaagc tgagaaggaa 960 ctgaaatgga aggcaaaata cggggtagag gagatgtgca gggacctgtg gaattgggcg 1020 agcaagaacc cctacgggta tggatcgccg gacagtagca actga 1065 <210> 4 <211> 1017 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 atgagagttc tggttaccgg tggtagcggt tacattggaa gtcatacctg tgtgcaatta 60 ctgcaaaacg gtcatgatgt catcattctt gataacctct gtaacagtaa gcgcagcgta 120 ctgcctgtta tcgagcgttt aggcggcaaa catccaacgt ttgttgaagg cgatattcgt 180 aacgaagcgt tgatgaccga gatcctgcac gatcacgcta tcgacaccgt gatccacttc 240 gccgggctga aagccgtggg cgaatcggta caaaaaccgc tggaatatta cgacaacaat 300 gtcaacggca ctctgcgcct gattagcgcc atgcgcgccg ctaacgtcaa aaactttatt 360 tttagctcct ccgccaccgt ttatggcgat cagcccaaaa ttccatacgt tgaaagcttc 420 ccgaccggca caccgcaaag cccttacggc aaaagcaagc tgatggtgga acagatcctc 480 accgatctgc aaaaagccca gccggactgg agcattgccc tgctgcgcta cttcaacccg 540 gttggcgcgc atccgtcggg cgatatgggc gaagatccgc aaggcattcc gaataacctg 600 atgccataca tcgcccaggt tgctgtaggc cgtcgcgact cgctggcgat ttttggtaac 660 gattatccga ccgaagatgg tactggcgta cgcgattaca tccacgtaat ggatctggcg 720 gacggtcacg tcgtggcgat ggaaaaactg gcgaacaagc caggcgtaca catctacaac 780 ctcggcgctg gcgtaggcaa cagcgtgctg gacgtggtta atgccttcag caaagcctgc 840 ggcaaaccgg ttaattatca ttttgcaccg cgtcgcgagg gcgaccttcc ggcctactgg 900 gcggacgcca gcaaagccga ccgtgaactg aactggcgcg taacgcgcac actcgatgaa 960 atggcgcagg acacctggca ctggcagtca cgccatccac agggatatcc cgattaa 1017 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atggaattcg atgtccaatt accatgttgc 30 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttcacgtcca gcaattcctt gagcctcaac at 32 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 catgcggccg cttaattgca agaggtgata 30 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 atgttgaggc tcaaggaatt gctggacgtg aa 32

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 페튜니아 유래 UDP-의존성 당전이효소(Petunia hybrida UDP-dependent glycosyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터, 서열번호 3의 염기서열을 가지는 벼 유래의 OsUGE 유전자를 포함하는 발현벡터 및 galE(UDP-galactose epimerase) 유전자가 결실된 대장균을 함유하는 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물 제조용 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 galE 유전자가 결실된 대장균은 대장균 BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물 제조용 조성물.
a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 페튜니아 유래 UDP-의존성 당전이효소(Petunia hybrida UDP-dependent glycosyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 galE(UDP-galactose epimerase) 유전자가 결실된 대장균을 형질전환시키는 단계;
b) 상기 형질전환된 대장균에 서열번호 3의 염기서열을 가지는 벼 유래의 OsUGE 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질전환하는 단계; 및
c) 상기 형질전환 대장균을 배양하면서 퀘세틴을 기질로 첨가하는 단계를 포함하는 대장균에서 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물의 제조방법.
삭제
삭제
서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 페튜니아 유래 UDP-의존성 당전이효소(Petunia hybrida UDP-dependent glycosyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 및 서열번호 3의 염기서열을 가지는 벼 유래의 OsUGE 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 퀘세틴-3-O-갈락토사이드(quercetin-3-O-galactoside) 화합물을 생산하는 galE(UDP-galactose epimerase) 유전자가 결실된 대장균.
삭제
삭제
삭제