JP7305213B2 - 変異体酵素を介するステビオール配糖体レバウシオシドｉの生合成的産生 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１９年７月９日に出願された「ＢＩＯＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＳＴＥＶＩＯＬ ＧＬＹＣＯＳＩＤＥ ＲＥＢＡＵＤＩＯＳＩＤＥ Ｉ ＶＩＡ ＶＡＲＩＡＮＴ ＥＮＺＹＭＥＳ」と題する米国特許出願第１６／５０６，８９２号、および２０１９年１１月８日に出願された「ＢＩＯＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＳＴＥＶＩＯＬ ＧＬＹＣＯＳＩＤＥＳ ＲＥＢＡＵＤＩＯＳＩＤＥ Ｊ ＡＮＤ ＲＥＢＡＵＤＩＯＳＩＤＥ Ｎ」と題する米国特許出願第１６／６７９，０３２号に基づく優先権を主張し、その内容全体は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

本発明の分野は、少なくとも部分的に、選択された微生物中に操作された生合成経路を介した特定のステビオール配糖体の産生に有用な方法およびプロセスに関する。より具体的には、本開示は、以前に未知の酵素および／または酵素変異体を使用する、レバウジオシドＩ（「Ｒｅｂ Ｉ」）の産生を提供する。

本発明は、少なくとも部分的に、修飾酵素の使用を通じたＲｅｂ ＡからのＲｅｂ Ｉの産生および／またはＲｅｂ Ｉの産生に焦点を当てる。

（Ｃ－１９－Ｏ－グルコースでの）レバウジオシドＡの特異的で方向性のあるグリコシル化は、レバウジオシドＲｅｂ Ｉを産生できる。Ｒｅｂ ＡからＲｅｂＩを酵素的に産生するための合成工程は、本明細書において代替酵素を用いて達成されている。以下でより詳細に説明するように、ＵＧＴ７６Ｇ１におけるドメインでの変異が、グルコシル化活性の特定の変更を引き起こすことができることが分かった。

加えて、高い力価でおよび／または費用を削減してステビオシドからレバウジオシドＡを介してレバウジオシドＩを産生する方法が、提供される。

本発明は、Ｒｅｂ ＡからＲｅｂ Ｉを産生する方法を包含する。特に、本発明は、（１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－酸－［（３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）エステル］として同定されるステビオール配糖体レバウジオシドＩ「Ｒｅｂ Ｉ」の産生を提供する。

本明細書において、とりわけ、レバウジオシドＩを合成する方法が提供され、方法は、（ａ）レバウジオシドＡを含むステビオール配糖体組成物；（ｂ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される基質；ならびに（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素、を含む反応混合物を調製すること；ならびにレバウジオシドＩを産生するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートすることを含む。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、本明細書に記載の方法において使用されるＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

一態様において、本明細書に記載の酵素のいずれか１つが提供される。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、ステビオール配糖体組成物は、ステビア抽出物である。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、本明細書に記載の方法はさらに、スクロースシンターゼを反応混合物に添加することを含む。提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、スクロースシンターゼは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）スクロースシンターゼ１（ＡｔＳＵＳ１）である。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、本明細書に記載の方法において使用されるスクロースシンターゼは、配列番号１１に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、使用されるＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２００Ａ変異体（ＬＡ）－ＡｔＳＵＳ１融合酵素である。いくらかの実施形態において、本明細書に記載の方法において使用されるＬＡ－ＡｔＳＵＳ１融合酵素は、配列番号１３に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。いくらかの実施形態において、本明細書に記載の方法において使用されるＬＡ－ＡｔＳＵＳ１融合酵素は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、反応混合物は、インビトロである、すなわち、本明細書に記載の方法は、インビトロで実行される。インビトロ反応のため、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはスクロースシンターゼは、インビトロ反応混合物に添加され得る。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、反応混合物は、細胞ベースの反応混合物である、すなわち、反応は、細胞中で実行される。細胞ベースの反応のため、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはスクロースシンターゼは、宿主細胞中で発現され得る。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはスクロースシンターゼは、それぞれ、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはスクロースシンターゼをコードするヌクレオチド配列から発現される。したがって、提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、宿主細胞は、配列番号２に対し少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、宿主細胞はさらに、配列番号１２に対し少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、宿主細胞はさらに、配列番号１４に対し少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

１つの態様において、本明細書に記載の配列のいずれか１つを含む核酸が提供される。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、宿主細胞は、酵母、非ステビオール配糖体産生植物、藻類、真菌、および細菌からなる群より選択される。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、宿主細胞は、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）；アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）；ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；メチロサイナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）；メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）；ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）；シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）；サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；ジゴサッカロミケス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）；ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）；ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）；トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）；アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）；アルツロボトリス属（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ）；ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）；マイコバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）；シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）；クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）；パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）；およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）からなる群より選択される。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、宿主細胞は、大豆；菜種；ひまわり；綿；とうもろこし；タバコ；アルファルファ；コムギ；オオムギ；オーツ麦；モロコシ；コメ；ブロッコリー；カリフラワー；キャベツ；パースニップ；メロン；ニンジン；セロリ；パセリ；トマト；バレイショ；イチゴ；ラッカセイ；ブドウ；グラスシード作物；テンサイ；サトウキビ；マメ；エンドウ豆；ライムギ；アマ；ケヤキ；針葉樹；イネ科牧草；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）；コメ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）；オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｙｕｌｇａｒｅ）；スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｇｒａｔｕｍ）；ミナトカモジグサ属（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）類；アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）類；およびアビシニアハマナ（Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）からなる群より選択される植物から単離された細胞である。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）である。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞（例えば、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞）である。

一態様において、本明細書に記載の宿主細胞のいずれか１つが提供される。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、基質は、ＵＤＰ－グルコースである。提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、ＵＤＰ－グルコースは、その場で生成される（例えば、スクロースシンターゼを使用してＵＤＰおよびスクロースから）。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、レバウジオシドＡは、反応混合物中、１５～５０ｇ／Ｌ（例えば、１５～５０、２０～５０、３０～５０、４０～５０、１５～４０、２０～４０、３０～４０、３０～５０、３０～４０、または４０～５０ｇ／Ｌ）の濃度を有する。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、反応混合物は、３５℃～４５℃（例えば、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃）の温度で、６．５～９．５（例えば、６．５、７、７．５、８、８．５、９、または９．５）のｐＨ範囲を有する。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、方法はさらに、粗レバウジオシドＩを単離することを含む（例えば、微小孔性吸着樹脂を使用して）。

一態様において、本明細書に記載のレバウジオシドＩ組成物のいずれか１つを含む組成物が提供される。

提供された方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、本明細書に記載の方法はさらに、粗レバウジオシドＩを結晶化して、９８％を超える（例えば、９８％、９９％、または９９．９％）純度を有するレバウジオシドＩを得ることを含む。

本開示の態様は、Ｌ２００Ａ変異（本明細書において「ＬＡ変異体」と呼ばれる）を含むＵＧＴ７６Ｇ１酵素の変異体を提供する。Ｌ２００Ａ変異は、配列番号９に関連する。提供された組成物または方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、ＬＡ変異体は、配列番号１に対し少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｌ２００Ａ変異を含む。提供された組成物または方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、ＬＡ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

本開示の態様は、ＡｔＳＵＳ１に融合されたＬＡ変異体の融合タンパク質を提供する。提供された組成物または方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、ＬＡ－ＡｔＳＵＳ１融合タンパク質は、配列番号１３に対し少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。提供された組成物または方法のいずれか１つのいくらかの実施形態において、ＬＡ－ＡｔＳＵＳ１融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

一態様において、本明細書に記載の変異体または融合タンパク質のいずれか１つを含む組成物が提供される。

製品／商用ユーティリティの観点において、ステビオール配糖体を含む数十の製品が米国で市場に出回っており、鎮痛剤から害虫駆除剤までのすべてのものにおいて、ならびに食品においておよび栄養補助食品として使用され得る。ステビオール配糖体を含む製品は、エアロゾル、液体、ゲルまたは顆粒製剤であり得、そのような製品が、いくらかの実施形態において提供される。

本開示は、種々の修飾および代替形状の影響を受けやすい一方で、その特定の実施形態が、例として図面に示され、本明細書で詳細に説明されるであろう。しかし、本明細書において提示される図面および詳細な説明が開示された特定の実施形態に本開示を限定することを意図するものではなく、逆に、その意図は、添付の特許請求の範囲により定義される本開示の精神および範囲内にあるすべての修飾、同等物、および代替物を網羅することが理解されなければならない。

本発明の別の特徴および利点は、本発明の実施形態の以下の詳細な説明において明らかになるであろう。

図１は、レバウジオシドＩ（「Ｒｅｂ Ｉ」）、（Ｃ_５０Ｈ_８０Ｏ_２８）、１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル）－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］－ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９酸－（３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル）－β－Ｄ－グルコピラノシル）、エステルの化学構造を示す。 図２は、Ｒｅｂ ＡからのＲｅｂ Ｉの生合成経路を示す。 図３は、インキュベーションの６時間後の選択されたＵＧＴにより触媒されたＲｅｂ ＡからのＲｅｂ Ｉのインビトロ産生を示す。パネルＡは、レバウジオシドＡ（Ｒｅｂ Ａ）およびレバウジオシドＩ（Ｒｅｂ Ｉ）の標準を示す。パネルＢ～Ｆは、それぞれ、ＵＧＴ７６Ｇ１（Ｂ）、ＣＰ１（Ｃ）、ＣＰ２（Ｄ）、ＬＡ（Ｅ）およびＵＧＴ７６Ｇ１－ＡｔＳＵＳ１融合酵素（ＧＳ）（Ｆ）によりＲｅｂ Ａから酵素的に産生されたＲｅｂ Ｉの量を示す。 図４は、およびスクロースの添加を用いて、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＡｔＳＵＳ１の両方が存在するカップリング系、ならびにＵＤＰＵＧＴ７６Ｇ１－ＡｔＳＵＳ１融合酵素（「ＧＳ」）により触媒されるＲｅｂ ＡからのＲｅｂ Ｉのインビトロ産生を示す。パネルＡは、レバウジオシドＩ（Ｒｅｂ Ｉ）およびレバウジオシドＡ（Ｒｅｂ Ａ）の標準を示す。パネルＢ～Ｄは、それぞれ、ＵＧＴ７６Ｇ１（Ｂ）、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＡｔＳＵＳ１の両方が存在するカップリング系（Ｃ）、ならびにＵＧＴ７６Ｇ１－ＡｔＳＵＳ１融合酵素（ＧＳ）（Ｄ）により触媒される酵素反応におけるＲｅｂ Ａから変換されたＲｅｂ Ｉの量を示す。 図５は、レバウジオシドＩの主要なＴＯＣＳＹおよびＨＭＢＣの相関を示す。

特定の実施形態の詳細な説明
ステビオール配糖体は、南米の植物ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）（キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ））の葉の甘味の原因である化合物の一種であり、食品、飼料および飲料の甘味料として使用できる。

定義：
細胞系は、異所性タンパク質の発現を提供する、任意の細胞を含む。それは、細菌、酵母、植物細胞および動物細胞または選択された遺伝子を用いる遺伝的形質転換を可能にし、その後、ステビオールからの所望のステビオール配糖体の生合成的産生を可能にする、任意の細胞系を含む。それは、原核細胞および真核細胞の両方を含む。それはまた、リボソームなどの、細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本明細書において提供される方法のいずれか１つの実施形態における好ましい微生物系である。

コーディング配列は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものであり、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指すために限定されずに使用される。

細胞系の増殖。増殖は、細胞が増殖および分裂することを可能にする適切な培地を提供することを含む。それはまた、細胞または細胞成分が組換えタンパク質を翻訳および作成することができるようにリソースを提供することも含む。

タンパク質発現。タンパク質産生は、遺伝子発現後に生じ得る。それは、ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後の段階からなる。ｍＲＮＡはその後、ポリペプチド鎖に翻訳され、それは最終的に、タンパク質へと折りたたまれる。ＤＮＡは、トランスフェクション－計画的に核酸を細胞に導入するプロセス、を通じて細胞に存在する。この用語は多くの場合、真核細胞における非ウイルス性の方法に対し使用される。他の用語が好ましいが、それは、他の方法および細胞の種類を指すこともあり得る：「形質転換」は、細菌、植物細胞を含む非動物真核細胞における非ウイルス性ＤＮＡ転移を説明するためにより頻繁に使用される。動物細胞において、形質転換がこれらの細胞における癌状態への進行（発癌）を指すためにも使用されるため、トランスフェクションは、好ましい用語である。形質導入は多くの場合、ウイルス媒介ＤＮＡ転移を説明するために使用される。形質転換、形質導入、およびウイルス感染は、本出願のトランスフェクションの定義下に含まれる。

酵母。本発明によれば、本明細書において特許請求される酵母は、真界のメンバーとして分類される真核生物の単細胞微生物である。酵母は、多細胞の祖先から進化した単細胞生物であるが、本発明に有用ないくらかの種は、仮性菌糸または偽菌糸として既知である接続された出芽細胞のストリングを形成することにより多細胞特徴を発達させる能力を有するものである。

本開示において使用されるＵＧＴ酵素の名前は、ファミリー番号、サブファミリーを示す文字、および個々の遺伝子の番号の組み合わせによりＵＧＴ遺伝子が分類される、ＵＧＴ命名委員会により採用された命名システムと一致する（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ＵＤＰ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｓｕｐｅｒ ｆａｍｉｌｙ：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｕｐｄａｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ」，ＰＨＡＲＭＡＣＯＧＥＮＥＴＩＣＳ，１９９７，ｖｏｌ．７，ｐｐ．２５５－２６９）。例えば、名前「ＵＧＴ７６Ｇ１」は、ＵＧＴファミリー番号７６（植物起源である）、サブファミリーＧ、および遺伝子番号１に属する遺伝子によりコードされるＵＧＴ酵素を指す。

構造用語：
本明細書において使用されるように、単数形の「ａ、ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含む。

「含む」、「有する」などの用語が説明または特許請求の範囲において使用される範囲で、そのような用語は、特許請求の範囲内の暫定的な単語として使用される場合に「含む」が解釈されるように、用語「含む」と類似の様式で包括的であると意図される。

単語「代表的な」は、本明細書において、「例、実例、または例示として扱う」ことを意味するために使用される。「代表的な」ものとして本明細書に記載の任意の実施形態は、他の実施形態よりも好ましいまたは好都合であると、必ずしも解釈されるわけではない。

用語「相補的」は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものであり、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために限定されずに使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、対象の技術はまた、添付の配列リストに報告される完全な配列に相補的である単離された核酸フラグメントおよびそれらの実質的に類似の核酸配列を含む。

用語「核酸」および「ヌクレオチド」は、当業者にそれぞれの通常の慣習的な意味を与えるものであり、一本鎖または二本鎖のいずれかの形状のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指すために限定されずに使用される。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ自然発生のヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類縁体を含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾または縮重された変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。

用語「単離された」は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものであり、単離された核酸または単離されたポリペプチドの文脈において使用される場合、人の手により固有の環境から離れて存在し、そのため天然の産物ではない、核酸またはポリペプチドを指すために限定されずに使用される。単離された核酸またはポリペプチドは、精製された形状で存在してよく、または非天然の環境、例えば、トランスジェニック宿主細胞中などに存在してよい。

本明細書において使用されるような用語「インキュベートする」および「インキュベーション」は、２つまたはそれ以上の化学的実体または生物学的実体（化合物および酵素など）を混合しかつステビオール配糖体組成物を産生するのに好都合な条件下でそれらが相互作用することを可能にする、プロセスを意味する。

用語「縮重変異体」は、１つまたは複数の縮重コドン置換により参照核酸配列とは異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することにより達成できる。核酸配列およびそのすべての縮重変異体は、同じアミノ酸またはポリペプチドを発現する。

用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、それぞれ当業者にそれらの通常の慣習的な意味を与えるものである；３つの用語は、交換可能に使用される場合があり、サイズまたは機能に関係なく、アミノ酸のポリマー、またはアミノ酸類縁体を指すために限定されずに使用される。「タンパク質」は多くの場合、比較的大きいポリペプチドに関連して使用されるが、「ペプチド」は多くの場合、小さいポリペプチドに関連して使用され、当技術分野におけるこれらの用語の使用は、重複し、変化する。本明細書において使用されるような用語「ポリペプチド」は、別段の注意がない限り、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を指す。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、ポリヌクレオチド生成物を指す場合、本明細書において交換可能に使用される。したがって、代表的なポリペプチドは、ポリヌクレオチド生成物、自然発生のタンパク質、前述の相同体、相同分子種、パラログ、フラグメントおよび他の同等物、変異体、および類縁体を含む。

用語「ポリペプチドフラグメント」および「フラグメント」は、参照ポリペプチドに関して使用される場合、当業者にそれらの通常の慣習的な意味を与えるものであり、アミノ酸残基が参照ポリペプチド自体と比較して削除されているが、残りのアミノ酸配列が通常、参照ポリペプチドにおける対応する位置と同一である、ポリペプチドを指すために限定されずに使用される。そのような削除は、参照ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端、あるいはその両方で生じる可能性がある。

用語、ポリペプチドまたはタンパク質の「機能的フラグメント」は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質の一部であり、かつ実質的に同じ生物学的活性を有するか、または完全長ポリペプチドもしくはタンパク質と同じ機能を実質的に実行する（例えば、同じ酵素反応を実行する）、ペプチドフラグメントを指す。

用語「変異体ポリペプチド」、「修飾アミノ酸配列」または「修飾ポリペプチド」は、交換可能に使用され、１つまたは複数のアミノ酸により、例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換、削除、および／または追加により、参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を指す。一態様において、変異体は、参照ポリペプチドの能力の一部またはすべてを保持する「機能的変異体」である。

用語「機能的変異体」はさらに、保存的に置換された変異体を含む。用語「保存的に置換された変異体」は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換により参照ペプチドとは異なり、かつ参照ペプチドの活性の一部またはすべてを維持するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換」は、機能的類似の残基を用いるアミノ酸残基の置換である。保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基の別の残基への置換；アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、スレオニンとセリンの間などの１つの電荷または極性（親水性）残基の別の残基への置換；リジンもしくはアルギニンなどの１つの塩基性残基の別の残基への置換；アスパラギン酸またはグルタミン酸などの１つの酸性残基の別の残基への置換；またはフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンなどの１つの芳香族残基の別の残基への置換を含む。そのような置換は、タンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量または等電点にほとんどまたはまったく影響しないと予想される。句「保存的に置換された変異体」はまた、得られるペプチドが本明細書において記載されるような参照ペプチドの活性の一部またはすべてを維持するという条件で、残基が化学的に誘導体化された残基で置換されるペプチドを含む。

対象の技術のポリペプチドに関連する、用語「変異体」は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらには１００％同一であるアミノ酸配列を有する機能的に活性なポリペプチドをさらに含む。

すべての文法形式およびスペルの変動における用語「相同」は、スーパーファミリーからのポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび異なる種の相同ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む、「共通の進化的起源」を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，ＣＥＬＬ ５０：６６７，１９８７）。そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それらの配列の類似性により反映されるように、パーセント同一性または保存された位置での特定のアミノ酸またはモチーフの存在に関して、配列相同性を有する。例えば、２つの相同ポリペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９００、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらには１００％同一である、アミノ酸配列を有し得る。

「適切な制御配列」は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものであり、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指すために限定されずに使用される。制御配列は、プロモータ、翻訳リーダ配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含む可能性がある。

「プロモータ」は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものであり、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指すために限定されずに使用される。一般に、コード配列は、プロモータ配列の３’に位置している。プロモータは、その全体が固有の遺伝子に由来する場合もあれば、自然に見られる異なるプロモータに由来する異なる要素で構成される場合もあり、さらには合成ＤＮＡセグメントを含む場合もある。異なるプロモータが、異なる組織または細胞の種類において、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指示する可能性があることが、当業者により理解される。ほとんどの場合ほとんどの細胞種で遺伝子が発現されることを引き起こすプロモータは一般に、「構成的プロモータ」と呼ばれる。ほとんどの場合調節配列の正確な境界は完全に定義されていないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモータ活性を有する可能性があることが、さらに認識される。

用語「動作可能に結合する」は、一方の機能が他方により影響されるような、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモータは、それがそのコード配列の発現に影響を与え得る場合、コード配列と動作可能に連結されている（すなわち、コード配列は、プロモータの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に動作可能に連結され得る。

本明細書において使用されるような用語「発現」は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものであり、対象の技術の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指すために限定されずに使用される。「過剰発現」は、正常または非形質転換生物における産生のレベルを超える、トランスジェニックまたは組換え生物における遺伝子産物の産生を指す。

「形質転換」は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものであり、標的細胞中へのポリヌクレオチドの移動を指すために限定されずに使用される。移動されたポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡに組み込まれ、遺伝的に安定な遺伝をもたらすか、またはそれは、宿主の染色体とは無関係に複製できる。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「形質転換」と呼ばれる。

用語「形質転換」、「トランスジェニック」、および「組換え」は、本明細書において宿主細胞に関連して使用される場合、当業者にそれらのそれぞれの通常の慣習的な意味を与えるものであり、その中に異種核酸分子が導入されている、植物または微生物細胞などの宿主生物の細胞を指すために限定されずに使用される。核酸分子は、宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれ得るか、または核酸分子は、染色体外分子として存在できる。そのような染色体外分子は、自動複製できる。形質転換された細胞、組織、または対象は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含すると理解される。

用語「組換え」、「異種」、および「外因性」は、本明細書においてポリヌクレオチドに関連して使用される場合、当業者にそれらの通常の慣習的な意味を与えるものであり、特定の宿主細胞にとって外来の供給源に由来するか、または同じ供給源に由来する場合、その元の形状から改変された、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列または遺伝子）を指すために限定されずに使用される。したがって、宿主細胞中の外因性遺伝子は、特定の宿主細胞に対し内因性であるが、例えば、部位特異的変異誘発または他の組換え技術の使用を通じて修飾されている遺伝子を含む。この用語はまた、自然発生のＤＮＡ配列の自然発生ではない複数のコピーも含む。したがって、この用語は、細胞に対して外来または異種であるか、または細胞に対し相同であるが、要素が通常は見られない宿主細胞内の位置または形状にある、ＤＮＡセグメントを指す。

同様に、用語「組換え」、「異種」、および「外因性」は、本明細書においてポリペプチドまたはアミノ酸配列に関連して使用される場合、特定の宿主細胞の外部の源に由来するか、同じ源からの場合、その元の形状から修飾される、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を意味する。したがって、組換えＤＮＡセグメントを宿主細胞中で発現させて組換えポリペプチドを産生できる。

用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、当業者にそれらのそれぞれの通常の慣習的な意味を与えるものであり、細胞の中枢代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形状で遺伝子を多くの場合運搬する染色体外要素を指すために限定されずに使用される。そのような要素は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、自動複製する配列、ゲノム統合配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線形または環状であり得、任意の供給源に由来し、多数のヌクレオチド配列が、細胞中に適切な３’非翻訳配列とともに選択された遺伝子産物のためのプロモータフラグメントおよびＤＮＡ配列を導入できる独特の構築物へと結合または再結合されている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、かつ特定の宿主細胞の形質転換を促進する外来遺伝子に加えて要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、かつ外来宿主におけるその遺伝子の増大された発現を可能にする外来遺伝子に加えて要素を有する、特定のベクターを指す。

本発明は、その変換を可能にするためにＵＧＴ酵素を使用することからの目的のステビオール配糖体、Ｒｅｂ Ｉの産生に関する。対象の技術は、ステビオール配糖体を合成するための１，３－１９－Ｏ－グルコースグリコシル化活性および１，３－１３－Ｏ－グルコースグリコシル化活性などの、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する組換えポリペプチドを提供する。対象の技術の組換えポリペプチドは、ステビオール配糖体化合物の生合成に有用である。本開示において、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）は、活性化された供与体分子（典型的にはＵＤＰ－グルコース）からアクセプタ分子に糖残基を転移する酵素を指す。１，３－１９－Ｏ－グルコースのグリコシル化活性は、糖部分をレバウジオシドＡの１９－Ｏグルコース部分のＣ－３’に転移してレバウジオシドＩ（Ｒｅｂ Ｉ）を産生する酵素活性を指す（図１）。

合成生物学
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．ＦおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．によるＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（この後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．によるＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＳ ＷＩＴＨ ＧＥＮＥ ＦＵＳＩＯＮＳ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８４；およびＧｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７により出版されたＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，によるＩＮ ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ；（それぞれの全体は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。

別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実行または試験において使用できるが、好ましい材料および方法は、以下で説明される。

以下の非限定的な実施例を検討することで、本開示は、より完全に理解されるであろう。これらの実施例は、対象の技術の好ましい実施形態を示唆しているが、例証としてのみ与えられることが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、対象の技術の本質的な特徴を確認でき、その精神および範囲から逸脱することなく、対象の技術を種々の用途および条件に適合させるために種々の変更および修飾を行うことができる。

グリコシル化は、多くの場合、植物の天然物の生物活性および貯蔵を制御する広範囲の反応と見なされる。小分子のグリコシル化は、これまでに研究されてきたほとんどの植物種においてトランスフェラーゼのスーパーファミリーにより触媒される。これらのグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）は、６０を超えるファミリーに分類されている。これらのうち、ファミリー１のＧＴ酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）としても既知であり、ＵＤＰ活性化糖部分を特定のアクセプタ分子に移動させる。これらは、ステビオール配糖体中のそのような糖部分を移動させて種々のレバウジオシドを生成する分子である。これらの各ＵＧＴは、それら自体の活性プロファイルおよびそれらの活性化糖部分を移動させる好ましい構造位置を有する。

産生システム
原核生物におけるタンパク質の発現はほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導性プロモータを含むベクターを用いて細菌宿主細胞で実行される。融合ベクターは、そこにコードされているタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に、いくらかのアミノ酸を追加する。そのような融合ベクターは典型的に、３つの目的：１）組換えタンパク質の発現を増加させること；２）組換えタンパク質の溶解性を増加させること；ならびに３）アフィニティ精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を支援すること、に役立つ。多くの場合、タンパク質分解性開裂部位は、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入されて、融合タンパク質の精製に続いて融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。そのようなベクターは、本開示の範囲内にある。

一実施形態において、発現ベクターは、細菌細胞における組換えポリペプチドの発現のためのそれらの遺伝的要素を含む。細菌細胞における転写および翻訳のための要素は、プロモータ、タンパク質複合体のコード領域、および転写ターミネータを含み得る。

当業者は、発現ベクターの調製に利用可能な分子生物学技術に理解があるであろう。対象の技術の発現ベクターに組み込むために使用されるポリヌクレオチドは、上述したように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの日常的な技術により調製できる。

いくらかの分子生物学的技術が、相補的な凝集末端を介してＤＮＡをベクターに動作可能に連結するために開発されている。一実施形態において、相補的ホモポリマートラクトを、ベクターＤＮＡ中に挿入される核酸分子に追加できる。ベクターおよび核酸分子はその後、相補的ホモポリマーテール間の水素結合により結合されて、組換えＤＮＡ分子を形成する。

代替の実施形態において、提供される１つまたは複数の制限部位を含む合成リンカーは、対象の技術のポリヌクレオチドを発現ベクターに動作可能に連結するために使用される。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ消化により生成される。一実施形態において、核酸分子は、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩで処理され、これらの酵素は、それらの３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性により突出した３’－一本鎖末端を除去し、それらの重合活性によりくぼんだ３’末端を埋め、それによって平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する。平滑末端セグメントはその後、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼなどの、平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒できる酵素の存在下で、大モル過剰のリンカー分子とインキュベートされる。したがって、反応の生成物は、その末端に高分子リンカー配列を保持するポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドはその後、適切な制限酵素で切断され、ポリヌクレオチドの末端と互換性のある末端を産生する酵素で切断された発現ベクターにライゲートされる。

あるいは、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）部位を有するベクターを使用できる。必要とされるＰＣＲ増幅ポリヌクレオチドをその後、制限消化またはライゲーションなしでＬＩＣベクター中にクローニングできる（Ａｓｌａｎｉｄｉｓおよびｄｅ Ｊｏｎｇ，ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤ．ＲＥＳ．１８ ６０６９－７４，（１９９０）、Ｈａｕｎ，ｅｔ ａｌ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ １３，５１５－１８（１９９２）、本明細書と一致する範囲で参照により本明細書に組み込まれる）。

一実施形態において、選択されたプラスミドへの挿入のために目的のポリヌクレオチドを単離および／または修飾するため、ＰＣＲを使用することが適している。配列のＰＣＲ調製において使用するための適切なプライマは、核酸分子の必要なコード領域を単離し、制限エンドヌクレアーゼまたはＬＩＣ部位を追加し、コード領域を所望のリーディングフレームに配置するように設計できる。

一実施形態において、対象の技術の発現ベクターへの組み込みのためのポリヌクレオチドは、適切なオリゴヌクレオチドプライマを使用するＰＣＲを使用して調製される。コード領域を増幅し、一方でプライマ自体は、増幅された配列産物に組み込まれるようになる。一実施形態において、増幅プライマは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、それは、増幅された配列産物が適切なベクター中にクローン化されることを可能にする。

発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術により、植物または微生物の宿主細胞中に導入できる。対象の技術の発現ベクターを用いる適切な細胞の形質転換は、当技術分野において既知である方法により達成され、典型的には、ベクターの種類および細胞の両方に依存する。適切な技術は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥ－デキストランを介したトランスフェクション、リポフェクション、ケモポレーションまたはエレクトロポレーションを含む。

うまく形質転換された細胞、すなわち、発現ベクターを含むそれらの細胞は、当技術分野において周知である技術により同定できる。例えば、対象の技術の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を培養して、本明細書に記載のポリペプチドを産生できる。細胞を、当技術分野において周知である技術により発現ベクターＤＮＡの存在について調べることができる。

宿主細胞は、前述の発現ベクターの単一のコピー、あるいは、発現ベクターの複数のコピーを含み得る。

いくらかの実施形態において、形質転換された細胞は、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、または酵母細胞である。いくらかの実施形態において、細胞は、キャノーラ植物細胞、菜種植物細胞、ヤシ植物細胞、ヒマワリ植物細胞、綿植物細胞、とうもろこし植物細胞、ラッカセイ植物細胞、アマ植物細胞、ゴマ植物細胞、大豆植物細胞、およびペチュニア植物細胞からなる群より選択される植物細胞である。

微生物宿主細胞発現系および外来タンパク質の高レベルの発現を指示する制御配列を含む発現ベクターは、当業者に周知である。これらのいずれも、微生物宿主細胞における対象の技術の組換えポリペプチドの発現のためのベクターを構築するために使用できる。これらのベクターをその後、形質転換を介して適切な微生物に導入して、対象の技術の組換えポリペプチドの高レベルの発現を可能にできる。

適切な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当技術分野において周知である。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連するポリヌクレオチドの転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体統合を可能にする配列を含む。適切なベクターは、転写開始制御を有する領域５’のポリヌクレオチドおよび転写終結を制御する領域３’のＤＮＡフラグメントを含む。そのような制御領域は、宿主として選択された特定の種に固有の遺伝子に由来する必要がないことが理解されるが、両方の制御領域が、形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子に由来することが好ましい。

所望の微生物宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモータは、多数であり、当業者によく知られている。これらの遺伝子を駆動できる事実上すべてのプロモータは、ＣＹＣＩ、ＨＩＳ３、ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯ、ＡＤＨＩ、ＰＧＫ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣＩ、ＴＲＰＩ、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用である）；ＡＯＸＩ（ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用である）；およびｌａｃ、ｔｒｐ、ＪＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現に有用である）を含むが、これらに限定されない対象の技術に適している。

終結制御領域はまた、微生物宿主に固有の種々の遺伝子に由来してよい。終結部位は、本明細書に記載の微生物宿主のために任意で含まれる可能性がある。

植物細胞において、対象の技術の発現ベクターは、開発の所望の段階で、所望の組織における対象の技術の組換えポリペプチドの発現を指示できるプロモータに動作可能に連結されたコード領域を含み得る。便宜上の理由のため、発現されるポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに由来するプロモータ配列および翻訳リーダ配列を含んでよい。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列も存在する必要がある。発現ベクターはまた、ポリヌクレオチド発現を促進するために１つまたは複数のイントロンを含んでよい。

植物宿主細胞について、コード領域の発現を誘導できる任意のプロモータおよび任意のターミネータの任意の組み合わせを、対象の技術のベクター配列において使用できる。プロモータおよびターミネータのいくらかの適切な例は、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子からのものを含む。使用できる効率的な植物プロモータの１つの種類は、高レベルの植物プロモータである。そのようなプロモータは、対象の技術の発現ベクターと動作可能に連結して、ベクターの発現を促進できる必要がある。対象の技術において使用できる高レベルの植物プロモータは、例えば、大豆由来のリブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼの小さいサブユニット（ｓｓ）のプロモータを含む。これらの２つのプロモータは、植物細胞中で光誘導されることが知られている（Ｂｅｒｒｙ－Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＡＰＰ．ＧＥＮ．，１：４８３ ４９８（１９８２）、その全体は、それが本明細書と一致する範囲で本明細書に組み込まれる）、およびクロロフィルａｌｂ結合タンパク質のプロモータ（例えば、ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＰＬＡＮＴＳ，ＡＮ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＰＥＲＳＰＥＣＴＩＶＥ，Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．（１９８３），２９～３８ページ；Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２５８：１３９９（１９８３）、およびＤｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＥＤ ＧＥＮＥＴＩＣＳ，２：２８５（１９８３）を参照、それぞれは、それらが本明細書と一致する範囲で参照により本明細書に組み込まれる）。

Ｒｅｂ Ｉの前駆体合成
以前に述べられたように、ステビオール配糖体は、南アメリカの植物ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）（キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ））および植物ゴショイチゴ（Ｒｕｂｕｓ ｃｈｉｎｇｉｉ）（バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ））の葉の甘味の原因である化合物である。これらの化合物は、グリコシル化されたジテルペンである。特に、それらの分子は、ヒドロキシル水素原子がグルコース分子により置き換えられてエステルを形成し、かつヒドロキシル水素がグルコースとラムノースとの組み合わせでアセタールを形成する、ステビオール分子と見なすことができる。

本発明における目的の化合物を製造する１つの方法は、化学的に誘導された、または細菌および／または酵母などの操作された微生物における生合成を介して産生されたステビオールまたはルボソシド（rubososide）などの一般的なまたは安価な前駆体を利用することであり、かつＲｅｂ Ｉなどの標的のステビオール配糖体を、既知であるか安価な方法を通じて合成することである。

本発明の態様は、ステビオールを産生できる微生物系において酵素を組換え発現することを含む方法に関する。一般に、そのような酵素は、コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＰＳ）、カウレンシンターゼ（ＫＳ）およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）酵素を含んでよい。これは、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路またはメバロン酸経路（ＭＶＡ）などの、内因性イソプレノイド合成経路を発現する微生物株で生じる必要がある。いくらかの実施形態において、細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む、細菌細胞、またはサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞、またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞などの酵母細胞である。いくらかの実施形態において、細胞は、藻類細胞または植物細胞である。

その後、前駆体は、化学合成における使用のために発酵培養物から回収される。典型的に、これはステビオールであるが、それは細胞培養物からのカウレン、またはステビオール配糖体であり得る。いくらかの実施形態において、ステビオール、カウレンおよび／またはステビオール配糖体は、気相から回収されるが、他の実施形態においては、有機相または高分子樹脂が細胞培養物に添加され、カウレン、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体が、有機相または高分子樹脂から回収される。いくらかの実施形態において、ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＩまたはズルコシドＡから選択される。いくらかの実施形態において、産生されるテルペノイドは、ステビオビオシド（steviobioside）またはステビオシドである。いくらかの実施形態において、１つまたは複数のグリコシル化工程などの少なくとも１つの酵素工程がエクスビボで実行されることも、認識される必要がある。

本発明の一部は、その後さらにＲｅｂ Ｉへの酵素的変換に供される、ステビオール配糖体の産生である。本発明によれば、微生物的に産生されたステビオールの所望のステビオール配糖体（ここでは、Ｒｅｂ Ｉ）への変換のための生合成は、ジテルペノイドステビオールが糖部分のステビオール骨格への多段階化学集合を使用してルブソサイドおよびステビオシドから変換される場合に生じる。いくらかの実施形態において、Ｒｅｂ ＡのＲｅｂ Ｉへの変換のための生合成は、グルコシルトランスフェラーゼ（glucosyltranserase）活性を有する組換えポリペプチドの存在下でＲｅｂ Ａをグルコース供与体部分と反応させることにより生じる。いくらかの実施形態において、グルコース供与体部分は、その場で生成される。いくらかの実施形態において、グルコース供与体部分は、反応に添加される。例えば、いくらかの実施形態において、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号１０）と同定される酵素は、Ｒｅｂ ＡをＲｅｂＩに変換できる。いくらかの実施形態において、配列番号９に対し変異Ｌ２００Ａを含むＵＧＴ７６Ｇ１変異体（本明細書においては、「ＬＡ変異体」と呼ばれる、配列番号１のアミノ酸配列を有する変異体））は、Ｒｅｂ ＡをＲｅｂ Ｉに変換できる。本明細書において、ＬＡ変異体が、Ｒｅｂ ＡをＲｅｂ Ｉに変換する、増加した活性を有することが実証された。

ステビオール配糖体の生合成
本明細書において説明されるように、本技術の組換えポリペプチドは、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有し、それぞれレバウジオシドＩおよびレバウジオシドＭなどの、天然には存在しないか、典型的には天然源での存在量が少ないステビオール配糖体を調製するための生合成方法を開発するために有用である。本技術の組換えポリペプチドは、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有し、レバウジオシドＩなどの、新規ステビオール配糖体を調製しレバウジオシドＭの合成的生産に到達するための生合成方法を開発するために有用である。

基質は、１つまたは複数のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼにより触媒される反応においてステビオール配糖体化合物に変換できる任意の天然または合成化合物であり得る。例えば、基質は、天然のステビア抽出物、ステビオール、ステビオール－１３－Ｏ－グルコシド、ステビオール－１９－Ｏ－グルコシド、ステビオール－１，２－ビオシド、ルブソサイド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＧまたはレバウジオシドＥであり得る。基質は、純粋な化合物または異なる化合物の混合物であり得る。好ましくは、基質は、ルブソサイド、ステビオシド、ステビオール、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＥおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む。

本明細書に記載の方法はまた、本明細書に記載の組換えペプチドが１つまたは複数の追加の酵素と組み合わせて機能して、ステビオール配糖体化合物の全体的な生合成の効率を改善するか結果を改変できる、カップリング反応系を提供する。例えば、追加の酵素は、グリコシル化反応から生産されたＵＤＰを（例えば、グリコース残基の供与体としてスクロースを使用して）ＵＤＰ－グルコースに戻すように変換し、したがってグリコシル化反応の効率を改善することにより、グリコシル化反応に必要とされるＵＤＰ－グルコースを再生できる。

別の実施形態において、対象の技術の方法はさらに、組換えＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼを組換えスクロースシンターゼ、基質、および本明細書に記載の組換えポリペプチドとインキュベートすることを含む。組換えＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼは、対象の技術の組換えポリペプチドにより触媒されるものよりも、異なるグリコシル化反応を触媒できる。

適切なＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、またはそれらの機能的相同体などの、ステビオール配糖体化合物の生合成における１つまたは複数の反応を触媒できる当技術分野において既知である任意のＵＧＴを含む。

典型的に、対象の技術のインビトロ法では、ＵＤＰまたはＵＤＰ－グルコースは、約０．２ｍＭ～約５ｍＭ、好ましくは約０．５ｍＭ～約２ｍＭ、より好ましくは約０．７ｍＭ～約１．５ｍＭの濃度で緩衝液に含まれる。一実施形態において、組換えスクロースシンターゼが反応に含まれる場合、スクロースはまた、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、好ましくは約２００ｍＭ～約４００ｍＭ、より好ましくは約２５０ｍＭ～約３５０ｍＭの濃度で緩衝液に含まれる。いくらかの実施形態において、対象の技術のインビトロ法では、乾燥重量ベースで組換えポリペプチドの基質に対する重量比は、約１：１００～約１：５、好ましくは約１：５０～約１：１０、より好ましくは約１：２５～約１：１５である。

いくらかの実施形態において、インビトロ法の反応温度は、約２０℃～約４０℃、適切には２５℃～約３７℃、より適切には２８℃～約３２℃である。

当業者は、本明細書に記載の方法により生産されたステビオール配糖体組成物が更に精製され他のステビオール配糖体、香料、または甘味料と混合されて所望の香味または甘味組成物を得ることができることを認識するであろう。例えば、本明細書に記載されるように生産されたレバウジオシドＭまたはＲｅｂ Ｉを多く含む組成物は、主要なステビオール配糖体としてレバウジオシドＡを含む天然のステビア抽出物と、または他の合成もしくは天然のステビオール配糖体生成物と混合されて、所望の甘味組成物を製造できる。あるいは、本明細書に記載のステビオール配糖体組成物から得られた実質的に精製されたステビオール配糖体（例えば、レバウジオシドＩ）は、スクロース、マルトデキストリン、アスパルテーム、スクラロース、ネオテーム、アセスルファムカリウム、およびサッカリンなどの、他の甘味料と組み合わされてよい。他の甘味料と比較してステビオール配糖体の量は、当技術分野において既知であるように、所望の味を得るように調節できる。本明細書に記載のステビオール配糖体組成物（レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＭまたはそれらの組み合わせを含む）は、食品（飲料、ソフトドリンク、アイスクリーム、乳製品、菓子類、シリアル、チューインガム、焼成品など）、栄養補助食品、メディカルニュートリション、ならびに医薬製品に含まれてよい。

当業者は、本明細書に記載の方法により生産されたステビオール配糖体組成物が更に精製され他のステビオール配糖体、香料、または甘味料と混合されて所望の香味または甘味組成物を得ることができることを認識するであろう。例えば、本明細書に記載されるように生産されたレバウジオシドＩを多く含む組成物は、主要なステビオール配糖体としてレバウジオシドＡを含む天然のステビア抽出物と、または他の合成もしくは天然のステビオール配糖体生成物と混合されて、所望の甘味組成物を製造できる。あるいは、本明細書に記載のステビオール配糖体組成物から得られた実質的に精製されたステビオール配糖体（例えば、レバウジオシドＩ）は、スクロース、マルトデキストリン、アスパルテーム、スクラロース、ネオテーム、アセスルファムカリウム、およびサッカリンなどの他の甘味料と組み合わされてよい。他の甘味料と比較してステビオール配糖体の量は、当業者に既知であるように、所望の味を得るように調節できる。本明細書に記載のステビオール配糖体組成物（レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＭまたはそれらの組み合わせを含む）は、食品（飲料、ソフトドリンク、アイスクリーム、乳製品、菓子類、シリアル、チューインガム、焼成品など）、栄養補助食品、メディカルニュートリション、ならびに医薬製品に含まれてよい。

同一性スコアリングを使用する配列類似性の分析
本明細書において使用されるように、「配列同一性」は、２つの最適にアラインメントされたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、成分、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸のアラインメントのウインドウ全体にわたって不変である程度を指す。試験配列と参照配列のアラインメントされたセグメントについての「同一性割合」は、参照配列セグメントにおける成分の総数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな定義された部分により除した、２つのアラインメントされた配列により共有される同一成分の数である。

本明細書において使用されるように、用語「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」は、２つの配列が最適にアラインメントされる（適切なヌクレオチドの挿入、削除、またはギャップが、比較のウインドウ全体で参照配列の合計２０％未満である）場合に試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した参照（「クエリ」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の線形ポリヌクレオチド配列における同一のヌクレオチドの割合を指す。比較ウインドウをアラインメントさせるための配列の最適なアラインメントは、当業者に周知であり、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性の方法の検索などのツールにより、かつ好ましくはＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（アクセルリス社、バーリントン、ＭＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピューター化された遂行により、実行できる。試験配列と参照配列のアラインメントされたセグメントについての「同一性割合」は、参照配列セグメントにおける成分の総数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな定義された部分により除した、２つのアラインメントされた配列により共有される同一成分の数である。パーセント配列同一性は、同一性割合に１００を掛けたものとして表される。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の比較は、完全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部に対するもの、またはより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本発明の目的のため、「パーセント同一性」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用して、ポリヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定できる。

配列同一性の割合は好ましくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（商標）の「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラム（バージョン１０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社、マジソン、ＷＩ）を使用して決定される。「Ｇａｐ」は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ４８：４４３－４５３，１９７０）を利用して、一致の数を最大化しギャップの数を最小化する２つの配列のアラインメントを発見する。「ＢｅｓｔＦｉｔ」は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，ＡＤＶＡＮＣＥＳ ＩＮ ＡＰＰＬＩＥＤ ＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＳ，２：４８２－４８９，１９８１，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １１：２２０５－２２２０，１９８３）を使用して２つの配列間の類似性の最良のセグメントの最適なアラインメントを実行しギャップを挿入して一致する数を最大化する。パーセント同一性は、「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」プログラムを使用して決定することが最も好ましい。配列同一性を決定するために有用な方法はまた、アメリカ国立衛生研究所、ベセスダ、Ｍｄ．２０８９４のアメリカ国立医学図書館にあるアメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から公開されているＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムにおいて開示される；ＢＬＡＳＴマニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ，ＮＬＭ，ＮＩＨ参照；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２１５：４０３－４１０（１９９０）；バージョン２．０以降のＢＬＡＳＴプログラムは、アラインメントにギャップ（削除および挿入）を導入することを許す；ペプチド配列に対しＢＬＡＳＴＸを使用して配列の同一性を決定できる；ならびにポリヌクレオチド配列に対しＢＬＡＳＴＮを使用して配列同一性を決定できる。

本明細書において使用されるように、用語「実質的なパーセント配列同一性」は、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、または約９８％もしくは約９９％の配列同一性などの、さらに大きい配列同一性のパーセント配列同一性を指す。したがって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、または約９８％もしくは約９９％の配列同一性などの、さらに大きい配列同一性を有するポリヌクレオチド分子である。

同一性および類似性
同一性は、配列のアラインメント後の配列のペア間で同じであるアミノ酸の割合であり（これは配列情報または構造情報またはいくらかの他の情報のみを使用して行うことができるが、通常それは、配列情報単独に基づく）、類似性は、いくらかの類似性マトリックスを使用するアラインメントに基づいて割り当てられたスコアである。類似性指数は、以下のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、もしくはＧＯＮＮＥＴのいずれか１つ、またはタンパク質の配列アラインメントのための当業者により使用される任意のマトリックスであり得る。

同一性は、２つのサブシーケンス間の対応の程度である（配列間にギャップはない）。２５％またはそれより高い同一性は、機能の類似性を意味し、一方で１８～２５％は、構造または機能の類似性を意味する。２つの完全に無関係またはランダムな配列（１００残基を超える）が、２０％を超える同一性を有する可能性があることに注意されたい。類似性は、２つの配列を比較した場合のその間の類似度である。これは、それらの同一性に依存する。

前述の明細書から明らかなように、本開示の特定の態様は、本明細書において説明される実施例の特定の詳細により限定されず、そのため、他の修飾および適用、またはそれらの同等物が当業者に対して生じることが企図される。したがって、特許請求の範囲は、本開示の精神および範囲から逸脱しない、そのようなすべての修飾および適用をカバーすることが意図される。

さらに、別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施または試験に使用できるが、好ましい方法および材料は、上で説明される。

前述の発明は、理解の目的のために、説明および実施例により、いくらか詳細に説明されてきたが、特定の変更および修飾を実行できることは、当業者には明らかであろう。そのため、説明および実施例は、添付の特許請求の範囲により叙述される本発明の範囲を限定するものと解釈される必要がない。

変異体酵素
ＵＧＴ７６Ｇ１の結晶構造に基づき、一連の循環順列および一連の変異が、設計され、それらの機能について試験された。活性スクリーニングの後、ＵＧＴ７６Ｇ１循環順列変異体の１つのバージョンであるＣＰ１は、有意に活性であることが分かった。大まかに言えば、ＣＰ１は、ドメインが切り替えられ変異部位が同定されている、ＵＧＴ７６Ｇ１の変異体である。ＣＰ１は、ステビオールコアのグルコシル化に関して有意な活性を示した。リンカーが第２の変異体ＣＰ２を生成するためにＣＰ１変異体に挿入された場合、ＣＰ２は、ＣＰ１変異体と類似の活性を示すことが分かった。

ＵＧＴ７６Ｇ１のモデリング分析に基づき、ＵＧＴ７６Ｇ１酵素のための変異部位が、選択され、Ｒｅｂ ＡのＲｅｂ Ｉへの生物変換におけるそれらの活性について試験された。一連のそのような変異の後、一握りの変異体が、グリコシル化活性およびステビオールコアの装飾に関して所望の酵素的機能を有すると同定された。その後、Ｒｅｂ ＡをＲｅｂ Ｉに変換できる、遺伝子組換え微生物が開発された。例えば、１つのＵＧＴ７６Ｇ１変異体（Ｌ２００Ａ、本明細書においてＬＡ変異体と呼ばれる）は、Ｒｅｂ ＡのＲｅｂ Ｉへの生物変換について極めて高い酵素的活性を有することが分かった。ＬＡ変異体は、ＵＧＴ７６Ｇ１配列からの１つの変異部位（Ｌ２００Ａ）を含む。いくらかの実施形態において、ＬＡ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

実施例
例１：ＵＧＴ酵素の酵素的活性スクリーニング
ステビオール配糖体の大部分は、糖の供与体としてウリジン５’－ジホスホグルコース（ＵＤＰ－グルコース）を使用するＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）により典型的に触媒される、ステビオールのいくらかのグリコシル化反応により形成される。植物において、ＵＧＴは、ＵＤＰ－グルコースからステビオールにグルコース残基を移動させる非常に多様な酵素群である。例えば、ステビオシドのＣ－１３－Ｏ－グルコースのＣ－３’のグリコシル化は、レバウジオシドＡ（ＵＧＴ７６Ｇ１）を生じる。Ｒｅｂ ＡからレバウジオシドＩ（Ｒｅｂ Ｉ）を産生するために、ＵＧＴは、グルコース残基をＵＤＰ－グルコースからＲｅｂ Ａに移動させ、ＲｅｂＡのＣ－１９－Ｏ－グルコースのＣ－３’位をグリコシル化する必要がある（図２）。Ｒｅｂ ＡからのＲｅｂ Ｉ産生のための特異的ＵＧＴ酵素を同定するために、ＵＧＴ７６Ｇ１および関連変異体が、活性スクリーニングのためのタンパク質構造に基づいて選択された。

すべての候補ＵＧＴ遺伝子の完全長ＤＮＡフラグメントは、商業的に合成された。ｃＤＮＡのほぼすべてのコドンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に好ましいものに変更された（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＮＪ）。合成ＤＮＡは、細菌発現ベクターｐＥＴｉｔｅ Ｎ－Ｈｉｓ ＳＵＭＯ Ｋａｎベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中にクローニングされた。

各発現構築物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換され、それは続いて、ＯＤ６００が０．８～１．０に到達するまで、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地中、３７℃で増殖された。タンパク質発現を、１ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導し、培養物を１６℃で２２時間さらに増殖させた。細胞を、遠心分離（３，０００×ｇ；１０分間；４℃）により収集した。細胞ペレットを、回収し、直ちに使用するか、－８０℃で貯蔵した。

細胞ペレットを典型的には、溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２５ｕｇ／ｍｌリゾチーム、５ｕｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に再懸濁した。細胞を、４℃での超音波処理により破壊し、細胞片を、遠心分離（１８，０００×ｇ；３０分間）により清澄化した。上清を、平衡化した（平衡化緩衝液：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）Ｎｉ－ＮＴＡ（キアゲン）アフィニティカラムにロードした。タンパク質試料のロード後、カラムを、平衡化緩衝液で洗浄して、結合していない混入タンパク質を除去した。Ｈｉｓ－タグベータ－グルコシダーゼ組換えポリペプチドを、２５０ｍＭイミダゾールを含む平衡化緩衝液により溶出した。

精製した候補ＵＧＴ組換えポリペプチドを、基質として種々のステビオール配糖体を使用することにより、グリコシルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。典型的には、組換えポリペプチド（２０μｇ）を、２００μｌのインビトロ反応系中で試験した。反応系は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌステビオール配糖体および３ｍＭ ＵＤＰ－グルコースを含む。反応を、３０～３７℃で実行し、５０ｕｌの反応を、２００μＬの１－ブタノールを種々の時点で添加することにより終了した。試料を、２００μＬの１－ブタノールで３回抽出した。プールした画分を、乾燥させ、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析のために１００μＬの８０％メタノールに溶解した。

ＨＰＬＣ分析をその後、クォータナリポンプ、温度制御カラムコンパートメント、オートサンプラーおよびＵＶ吸光度検出器を含む、Ｄｉｏｎｅｘ ＵＰＬＣ ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００システム（サニーベール、ＣＡ）を使用して実行した。ガードカラムを有するＳｙｎｅｒｇｉ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を、プールした試料中のステビオール配糖体の特徴づけのために使用した。ＨＰＬＣ分析において使用した検出波長は、２１０ｎｍであった。

活性スクリーニングの後、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するいくらかの酵素を、Ｒｅｂ Ｉ産生のために同定した。

ＵＧＴ７６Ｇ１酵素は、Ｒｅｂ ＡをＲｅｂ Ｉに変換できる。種々の変異体および変異型をスクリーニングした後、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して１つの変異（Ｌ２００Ａ）のみを有する、特定の変異型であるＬＡは、実施例２においてより詳細に説明されるように、Ｒｅｂ ＡをＲｅｂ Ｉに変換する際に、予期せず有意に高い活性を示した。

実施例２：Ｒｅｂ ＩへのＲｅｂ Ａの酵素的生物変換
循環順列分析は、有用なまたは価値のある酵素を開発するための強力なツールである（ＰＬｏＳ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，８（３）ｅ１００２４４５；ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ，２０１５，（３））。ＵＧＴ７６Ｇ１の結晶構造に基づき、一連の循環順列が設計された。活性スクリーニングを実行した後、循環順列（「ＣＰ１」）の１つのバージョンが、ＷＴ ＵＧＴ７６Ｇ１と比較してＲｅｂ Ｉ産生のためのより高い活性を有していることが分かった。リンカー（YKDDSGYSSSYAAAAGM（配列番号１５））を、ＣＰ１のＣ－末端とＮ－末端の間に挿入して、またＲｅｂ Ｉ産生についてＷＴ ＵＧＴ７６Ｇ１よりも高い活性を有する、第２の変異体（「ＣＰ２」）を生成した。

ＵＧＴ７６Ｇ１のモデリング分析に基づき、変異部位が、酵素活性を強化するために選択された。生成された種々の変異体の酵素活性スクリーニングの後、１つの変異体であるＬＡ（ＵＧＴ７６Ｇ１のＬ２００Ａ変異体）が、特に野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較した場合、Ｒｅｂ ＡをＲｅｂ Ｉに変換する際の酵素活性の有意な増加を示したことが、予期せず分かった。

インビトロでのレバウジオシドＡのレバウジオシドＩへの変換を確認するため、選択されたＵＧＴ酵素を、ステビオール配糖体基質としてＲｅｂ Ａを使用してアッセイした。反応系は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ/ｍｌステビオシド、３ｍＭ ＵＤＰ－グルコース、および酵素（２０ｕｇ／２００ｕｌ反応）を含んだ。反応を、３７℃で実行し、１－ブタノールを添加することにより終了した。試料を、１－ブタノールで３回抽出した。プールした画分を、乾燥させ、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析のために８０％メタノールに溶解した。ＨＰＬＣ分析を、上の説明のように実行した。

図３に示すように、ＵＧＴ７６Ｇ１は、Ｒｅｂ ＡをＲｅｂ Ｉに変換できる（図３、パネルＢ）。ＣＰ１（図３、パネルＣ）およびＣＰ２（図３、パネルＤ）変異体は両方とも、ＵＧＴ７６Ｇ１よりもより高い酵素活性を有する。ＣＰ２は、ＣＰ１よりもより低い活性を有し、Ｎ－末端とＣ－末端の間の選択されたリンカーが、酵素活性に影響することを示唆する。高い酵素活性を有する変異体を同定するために、いくらかの部位変異を、ＵＧＴ７６Ｇ１結晶構造に基づき生成した。活性スクリーニングの後、ＵＧＴ７６Ｇ１よりもより高い活性を有する変異体が発見された。ＬＡ変異体（Ｌ２００Ａ）は、すべての試験された変異体の中で最も高い活性を有する。図３、パネルＥに示すように、それぞれＲｅｂ ＩおよびＲｅｂ Ａに対応するピークは、５０％よりも多くのＲｅｂ Ａが、ＬＡが使用された場合に消費されＲｅｂ Ｉに変換されたことを示す。比較により、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＣＰ１およびＣＰ２のいずれかが使用された場合、１５％未満のＲｅｂ Ａが、Ｒｅｂ Ｉに変換された（図３、パネルＢ～Ｄ）。ＵＧＴ７６Ｇ１－ＡｔＳＵＳ１融合酵素（ＧＳ）もまた、ＬＡ、ＣＰ１またはＣＰ２ほど顕著ではないが、ＵＧＴ７６Ｇ１と比較してＲｅｂ ＡのＲｅｂ Ｉへの生物変換についてより高い活性を示した（図３、パネルＦ）。

ＵＧＴ酵素およびスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）の両方が存在するカップリング系において、ＵＤＰ－グルコースが、ＵＤＰおよびスクロースから再生でき、これは反応混合物への余分なＵＤＰ－グルコースの添加を省略することを可能にする。適切なスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）は、例えば、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）スクロースシンターゼ１；シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）スクロースシンターゼ３、およびリョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔｅ）スクロースシンターゼであり得る。

別の態様において、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、その方法において使用できる。特に適切なＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、ＵＧＴ－ＳＵＳ融合酵素であり得る。ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼは、スクロースシンターゼドメインに結合されたＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素であり得る。特に、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、スクロースシンターゼドメインに結合されたＵＧＴ－グリコシルトランスフェラーゼドメインを含む。加えて、ＵＧＴ－ＳＵＳ融合酵素は、スクロースシンターゼ活性を有し、したがって、ＵＤＰおよびスクロースからＵＤＰ－グルコースを再生できる。特に適切なＵＧＴ－ＳＵＳ融合酵素は、例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１－ＡｔＳＵＳ１融合酵素（「ＧＳ」と名付けられている）であり得る。ＧＳ融合酵素は、ＵＤＰおよびスクロースの添加で、Ｒｅｂ ＡをＲｅｂ Ｉに変換できる（図４）。図４に示すように、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ＵＤＰ添加でＲｅｂ ＡをＲｅｂ Ｉに変換できない（図４、パネルＢ）。しかし、ＧＳ融合酵素（図４、パネルＤ）およびＵＧＴ７６Ｇ１およびＡｔＳＵＳ１酵素系の組み合わせ（図４Ｃ）の両方は、Ｒｅｂ ＡからＲｅｂ Ｉを産生でき、ＡｔＳＵＳ１スクロースシンターゼによるＵＤＰＧ再生を示唆する。ＧＳ融合酵素が、同じ反応系においてＵＧＴ７６Ｇ１およびＡｔＳＵＳ１酵素の組み合わせよりもより高い酵素活性を有していることもまた分かった。スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）は、スクロースの存在下でＵＤＰのＵＤＰ－グルコースへの変換を触媒する。したがって、ＵＤＰ－グルコースを利用するグリコシル化反応（ＵＧＴにより触媒されるものなど）のため、ＳＵＳを使用してＵＤＰからＵＤＰ－グルコースを再生でき、そのような反応の効率を高める。

例３：産生されたＲｅｂ Ｉの構造のＮＭＲ分析
産生されたＲｅｂ Ｉ化合物は、上述したように半分取クロマトグラフィにより精製された。

Ｒｅｂ Ｉの分子式は、それぞれｍ／ｚ１１４６．５２８１および１１５１．４８３９で［Ｍ＋ＮＨ_４］^＋および［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対応する付加イオンを示した、その正の高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）に基づいて、Ｃ_５０Ｈ_８０Ｏ_２８として推定され、この組成は、^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルデータにより支持された。Ｒｅｂ Ｉの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、δ１．２２、および１．２６で２つのメチルシングレット；δ０．７５～２．５９の間の９つのメチレンおよび２つのメチンプロトン；ならびにδ５．０１および５．６５で環外二重結合に対応する２つのシングレットの存在を示し、ステビア・レバウディアナ（Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）から以前単離されたｅｎｔ－カウランジテルペノイドと類似であった。ｅｎｔ－カウランジテルペノイドの基本骨格は、主要なＴＯＣＳＹ（Ｈ－１／Ｈ－２；Ｈ－２／Ｈ－３；Ｈ－５／Ｈ－６；Ｈ－６／Ｈ－７；Ｈ－９／Ｈ－１１；Ｈ－１１／Ｈ－１２）ならびにＨＭＢＣ（Ｈ－１／Ｃ－２、Ｃ－１０；Ｈ－３／Ｃ－１、Ｃ－２、Ｃ－４、Ｃ－５、Ｃ－１８、Ｃ－１９；Ｈ－５／Ｃ－４、Ｃ－６、Ｃ－７、Ｃ－９、Ｃ－１０、Ｃ－１８、Ｃ－１９、Ｃ－２０；Ｈ－９／Ｃ－８、Ｃ－１０、Ｃ－１１、Ｃ－１２、Ｃ－１４、Ｃ－１５；Ｈ－１４／Ｃ－８、Ｃ－９、Ｃ－１３、Ｃ－１５、Ｃ－１６およびＨ－１７／Ｃ－１３、Ｃ－１５、Ｃ－１６）の相関により支持された。

さらに、Ｒｅｂ Ｉの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、δ５．０３、５．２４、５．３４、５．５３、および６．１２でのダブレットとして芳香族プロトンを示し、その構造中の５つの糖単位の存在を示唆した。５％Ｈ_２ＳＯ_４を用いるＲｅｂ Ｉの酸加水分解は、Ｄ－グルコースを与え、それはＴＬＣにより真正の試料と直接比較することにより同定され、その分子構造中の６つのグルコピラノシル部分の存在を示唆した。Ｄ－グルコースの立体配置を、Ｌ－システインメチルエステルおよびＯ－トリルイソチオシアネートを有するその対応するチオカルバモイル－チアゾリジンカルボキシレート誘導体を調製し、その保持時間を文献比較に記載されているような標準の糖と比較することにより、同定した。Ｒｅｂ Ｉの酵素的加水分解は、^１Ｈ ＮＭＲおよび標準化合物との共ＴＬＣの比較によりステビオールと同定されたアグリコンを提供した。化合物Ｒｅｂ Ｉの^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲの値は、ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣおよびＲＯＥＳＹデータに基づいて割り当てられた。

酵素および酸加水分解実験と共にＲｅｂ Ｉの^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲ値の綿密な研究は、化合物Ｒｅｂ Ｉはまた、２，３－分岐グルコトリオシル置換基としてＣ－１３ヒドロキシルで結合される３つのグルコシル部分残基および追加のグルコシル単位の同定を残すＣ－１９位でエステルの形状である別のグルコシル部分を有するステビオール配糖体であることを、示唆した。糖Ｉの３’位での^１Ｈおよび^１３Ｃ化学シフトの両方についての低磁場シフトは、この位置での追加のβ－Ｄ－グルコシル部分を示唆し、それは主要なＨＭＢＣ相関：Ｈ－１’／Ｃ－１９、Ｃ－２’；Ｈ－２’／Ｃ－１’、Ｃ－３’およびＨ－３’／Ｃ－１’、Ｃ－２’およびＣ－４’により支持された。δ５．０３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、５．２４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、５．３４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、５．５３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）および６．１２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）での５つの芳香族プロトンについて観察された大きい結合定数は、ステビオール配糖体について報告されているように、それらのβ－配向を示唆した。Ｒｅｂ Ｉの構造はさらに、図５に示すように、主要なＴＯＣＳＹ、およびＨＭＢＣの相関により支持された。

化学およびスペクトルの研究からの結果に基づき、Ｒｅｂ Ｉは、１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－酸－（３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）エステルとして割り当てられ、そのスペクトルデータは、文献で報告されたレバウジオシドＩの構造データと一致している。

ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中の産生されたＲｅｂ Ｉ（３ｍｇ）の溶液に、３ｍｌの５％Ｈ_２ＳＯ_４を加え、混合物を、１６時間還流した。反応混合物をその後、飽和炭酸ナトリウムで中和し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（２×２５ｍｌ）で抽出して糖を含む水性画分およびアグリコン部分を含むＥｔＯＡｃ画分を与えた。水相を、濃縮し、ＴＬＣ系ＥｔＯＡｃ／ｎ－ブタノール／水（２：７：１）およびＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／水（１０：６：１）［６－８］を使用して標準の糖と比較した；糖は、Ｄ－グルコースと同定された。

産生されたＲｅｂ Ｉ（５００μｇ）を、０．５Ｍ ＨＣｌ（０．５ｍＬ）で１．５時間加水分解した。冷却後、混合物を、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ４００カラムに通し、溶出物を、凍結乾燥した。残渣を、ピリジン（０．２５ｍＬ）に溶解し、Ｌ－システインメチルエステルＨＣｌ（２．５ｍｇ）とともに６０℃で１．５時間加熱し、その後Ｏ－トシルイソチオシアネート（１２．５ｕＬ）を、混合物に加え、６０℃でさらに１．５時間加熱した。反応混合物のＨＰＬＣ分析を、２５０ｎｍでのＵＶ検出下、移動相２５％アセトニトリル－０．２％ＴＦＡ水、１ｍＬ／分を使用するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａカラム［Ｃ１８、１５０×４．６ｍｍ（５ｕ）］により実行した。糖は、Ｄ－グルコースと同定された（ｔＲ，１２．６４）［真正試料、Ｄ－グルコース（ｔＲ，１２．５４）およびＬ－グルコース（ｔＲ，１１．４２分）］［９］。

産生されたＲｅｂ Ｉ（１ｍｇ）を、４．５でｐＨを維持することにより、２．５ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解し、５０μＬのクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）からの粗ペクチナーゼ（シグマ－アルドリッチ）を、加えた。混合物を、５０℃で４８時間撹拌し、反応中に沈殿した生成物を、濾過し、その後結晶化させた。得られた結果の生成物は、それらの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータおよび共ＴＬＣの比較によりステビオールとして同定された。

酵素的生物変換により産生された１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－酸－（３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）エステル（レバウジオシドＩ）についての完全^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルデータは、広範な１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲならびに高分解能質量スペクトルデータに基づいて割り当てられた。レバウジオシドＩの構造はさらに、酸および酵素的加水分解の研究により支持された。

目的の配列
ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２００Ａ変異体（ＬＡ）：アミノ酸配列（配列番号１）
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQIAKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL

ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２００Ａ変異体（ＬＡ）：ＤＮＡ配列（配列番号２）
ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGATTATCTTGTTCCCTGTACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCAATTAGCAAACGTCCTCTACTCCAAGGGATTTTCAATAACAATCTTCCATACTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAGTAATTATCCTCACTTTACATTCAGGTTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGCGTATCTCAAATTTACCTACGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATCAATGAGCATGGAGCCGATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAAGTGAGGAAGACGAGGAAGTTTCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACTTCGCCCAATCAGTCGCAGACTCACTGAATCTACGCCGTTTGGTCCTTATGACAAGTTCATTATTCAACTTTCACGCACATGTATCACTGCCGCAATTTGACGAGTTGGGTTACCTGGACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGAACAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAGAGCGCTTATAGTAATTGGCAAATTGCGAAAGAAATTCTCGGAAAAATGATAAAGCAAACCAAAGCGTCCTCTGGAGTAATCTGGAACTCCTTCAAGGAGTTAGAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAAATCCCCGCTCCCTCGTTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTCCCTCCTAGATCATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGTCGTCAGTTCTATATGTAAGCTTTGGGAGTACTTCGGAAGTGGATGAAAAGGACTTCTTAGAGATTGCGCGAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTTCCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGTTAAGGGCTCGACGTGGGTCGAGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGGAGAATCGTGAAATGGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGGCCTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGAAGGCGTTCCAATGATATTTTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAACGCTCGCTATATGTCTGATGTGTTGAAGGTTGGCGTGTACCTGGAGAATGGTTGGGAAAGGGGGGAAATTGCCAACGCCATACGCCGGGTAATGGTGGACGAGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAACGCTCGGGTTTTAAAACAAAAAGCGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCTATGAATCCCTAGAATCCTTGGTAAGCTATATATCTTCGTTATAA

ＵＧＴ７６Ｇ１ ＣＰ１変異体（ＣＰ１）：アミノ酸配列（配列番号３）
MNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYS

ＵＧＴ７６Ｇ１ ＣＰ１変異体（ＣＰ１）：ＤＮＡ配列（配列番号４）
ATGAACTGGCAAATCCTGAAAGAAATCCTGGGTAAAATGATCAAACAAACCAAAGCGTCGTCGGGCGTTATCTGGAACTCCTTCAAAGAACTGGAAGAATCAGAACTGGAAACCGTTATTCGCGAAATCCCGGCTCCGTCGTTCCTGATTCCGCTGCCGAAACATCTGACCGCGAGCAGCAGCAGCCTGCTGGATCACGACCGTACGGTCTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCGCCGTCATCGGTGCTGTATGTTTCATTCGGTAGCACCTCTGAAGTCGATGAAAAAGACTTTCTGGAAATCGCTCGCGGCCTGGTGGATAGTAAACAGTCCTTCCTGTGGGTGGTTCGTCCGGGTTTTGTGAAAGGCAGCACGTGGGTTGAACCGCTGCCGGATGGCTTCCTGGGTGAACGCGGCCGTATTGTCAAATGGGTGCCGCAGCAAGAAGTGCTGGCACATGGTGCTATCGGCGCGTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAACAGTACGCTGGAATCCGTTTGCGAAGGTGTCCCGATGATTTTCAGCGATTTTGGCCTGGACCAGCCGCTGAATGCCCGCTATATGTCTGATGTTCTGAAAGTCGGTGTGTACCTGGAAAACGGTTGGGAACGTGGCGAAATTGCGAATGCCATCCGTCGCGTTATGGTCGATGAAGAAGGCGAATACATTCGCCAGAACGCTCGTGTCCTGAAACAAAAAGCGGACGTGAGCCTGATGAAAGGCGGTAGCTCTTATGAATCACTGGAATCGCTGGTTAGCTACATCAGTTCCCTGGAAAATAAAACCGAAACCACGGTGCGTCGCCGTCGCCGTATTATCCTGTTCCCGGTTCCGTTTCAGGGTCATATTAACCCGATCCTGCAACTGGCGAATGTTCTGTATTCAAAAGGCTTTTCGATCACCATCTTCCATACGAACTTCAACAAACCGAAAACCAGTAACTACCCGCACTTTACGTTCCGCTTTATTCTGGATAACGACCCGCAGGATGAACGTATCTCCAATCTGCCGACCCACGGCCCGCTGGCCGGTATGCGCATTCCGATTATCAATGAACACGGTGCAGATGAACTGCGCCGTGAACTGGAACTGCTGATGCTGGCCAGTGAAGAAGATGAAGAAGTGTCCTGTCTGATCACCGACGCACTGTGGTATTTCGCCCAGAGCGTTGCAGATTCTCTGAACCTGCGCCGTCTGGTCCTGATGACGTCATCGCTGTTCAATTTTCATGCGCACGTTTCTCTGCCGCAATTTGATGAACTGGGCTACCTGGACCCGGATGACAAAACCCGTCTGGAAGAACAAGCCAGTGGTTTTCCGATGCTGAAAGTCAAAGACATTAAATCCGCCTATTCGTAA

ＵＧＴ７６Ｇ１ ＣＰ２変異体（ＣＰ２）：アミノ酸配列（配列番号５）
MNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLYKDDSGYSSSYAAAAGMENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYS

ＵＧＴ７６Ｇ１ ＣＰ２変異体（ＣＰ２）：ＤＮＡ配列（配列番号６）
ATGAACTGGCAAATCCTGAAAGAAATCCTGGGTAAAATGATCAAACAAACCAAAGCGTCGTCGGGCGTTATCTGGAACTCCTTCAAAGAACTGGAAGAATCAGAACTGGAAACCGTTATTCGCGAAATCCCGGCTCCGTCGTTCCTGATTCCGCTGCCGAAACATCTGACCGCGAGCAGCAGCAGCCTGCTGGATCACGACCGTACGGTCTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCGCCGTCATCGGTGCTGTATGTTTCATTCGGTAGCACCTCTGAAGTCGATGAAAAAGACTTTCTGGAAATCGCTCGCGGCCTGGTGGATAGTAAACAGTCCTTCCTGTGGGTGGTTCGTCCGGGTTTTGTGAAAGGCAGCACGTGGGTTGAACCGCTGCCGGATGGCTTCCTGGGTGAACGCGGCCGTATTGTCAAATGGGTGCCGCAGCAAGAAGTGCTGGCACATGGTGCTATCGGCGCGTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAACAGTACGCTGGAATCCGTTTGCGAAGGTGTCCCGATGATTTTCAGCGATTTTGGCCTGGACCAGCCGCTGAATGCCCGCTATATGTCTGATGTTCTGAAAGTCGGTGTGTACCTGGAAAACGGTTGGGAACGTGGCGAAATTGCGAATGCCATCCGTCGCGTTATGGTCGATGAAGAAGGCGAATACATTCGCCAGAACGCTCGTGTCCTGAAACAAAAAGCGGACGTGAGCCTGATGAAAGGCGGTAGCTCTTATGAATCACTGGAATCGCTGGTTAGCTACATCAGTTCCCTGTACAAAGATGACAGCGGTTATAGCAGCAGCTATGCGGCGGCGGCGGGTATGGAAAATAAAACCGAAACCACGGTGCGTCGCCGTCGCCGTATTATCCTGTTCCCGGTTCCGTTTCAGGGTCATATTAACCCGATCCTGCAACTGGCGAATGTTCTGTATTCAAAAGGCTTTTCGATCACCATCTTCCATACGAACTTCAACAAACCGAAAACCAGTAACTACCCGCACTTTACGTTCCGCTTTATTCTGGATAACGACCCGCAGGATGAACGTATCTCCAATCTGCCGACCCACGGCCCGCTGGCCGGTATGCGCATTCCGATTATCAATGAACACGGTGCAGATGAACTGCGCCGTGAACTGGAACTGCTGATGCTGGCCAGTGAAGAAGATGAAGAAGTGTCCTGTCTGATCACCGACGCACTGTGGTATTTCGCCCAGAGCGTTGCAGATTCTCTGAACCTGCGCCGTCTGGTCCTGATGACGTCATCGCTGTTCAATTTTCATGCGCACGTTTCTCTGCCGCAATTTGATGAACTGGGCTACCTGGACCCGGATGACAAAACCCGTCTGGAAGAACAAGCCAGTGGTTTTCCGATGCTGAAAGTCAAAGACATTAAATCCGCCTATTCGTAA

ＵＧＴ７６Ｇ１－ＡｔＳＵＳ１融合酵素（ＧＳ）：アミノ酸配列（配列番号７）
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLGSGANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD

ＵＧＴ７６Ｇ１－ＡｔＳＵＳ１融合酵素（ＧＳ）：ＤＮＡ配列（配列番号８）
ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGATTATCTTGTTCCCTGTACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCAATTAGCAAACGTCCTCTACTCCAAGGGATTTTCAATAACAATCTTCCATACTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAGTAATTATCCTCACTTTACATTCAGGTTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGCGTATCTCAAATTTACCTACGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATCAATGAGCATGGAGCCGATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAAGTGAGGAAGACGAGGAAGTTTCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACTTCGCCCAATCAGTCGCAGACTCACTGAATCTACGCCGTTTGGTCCTTATGACAAGTTCATTATTCAACTTTCACGCACATGTATCACTGCCGCAATTTGACGAGTTGGGTTACCTGGACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGAACAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAGAGCGCTTATAGTAATTGGCAAATTCTGAAAGAAATTCTCGGAAAAATGATAAAGCAAACCAAAGCGTCCTCTGGAGTAATCTGGAACTCCTTCAAGGAGTTAGAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAAATCCCCGCTCCCTCGTTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTCCCTCCTAGATCATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGTCGTCAGTTCTATATGTAAGCTTTGGGAGTACTTCGGAAGTGGATGAAAAGGACTTCTTAGAGATTGCGCGAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTTCCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGTTAAGGGCTCGACGTGGGTCGAGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGGAGAATCGTGAAATGGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGGCCTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGAAGGCGTTCCAATGATATTTTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAACGCTCGCTATATGTCTGATGTGTTGAAGGTTGGCGTGTACCTGGAGAATGGTTGGGAAAGGGGGGAAATTGCCAACGCCATACGCCGGGTAATGGTGGACGAGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAACGCTCGGGTTTTAAAACAAAAAGCGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCTATGAATCCCTAGAATCCTTGGTAAGCTATATATCTTCGTTAGGTTCTGGTGCAAACGCTGAACGTATGATAACGCGCGTCCACAGCCAACGTGAGCGTTTGAACGAAACGCTTGTTTCTGAGAGAAACGAAGTCCTTGCCTTGCTTTCCAGGGTTGAAGCCAAAGGTAAAGGTATTTTACAACAAAACCAGATCATTGCTGAATTCGAAGCTTTGCCTGAACAAACCCGGAAGAAACTTGAAGGTGGTCCTTTCTTTGACCTTCTCAAATCCACTCAGGAAGCAATTGTGTTGCCACCATGGGTTGCTCTAGCTGTGAGGCCAAGGCCTGGTGTTTGGGAATACTTACGAGTCAATCTCCATGCTCTTGTCGTTGAAGAACTCCAACCTGCTGAGTTTCTTCATTTCAAGGAAGAACTCGTTGATGGAGTTAAGAATGGTAATTTCACTCTTGAGCTTGATTTCGAGCCATTCAATGCGTCTATCCCTCGTCCAACACTCCACAAATACATTGGAAATGGTGTTGACTTCCTTAACCGTCATTTATCGGCTAAGCTCTTCCATGACAAGGAGAGTTTGCTTCCATTGCTTAAGTTCCTTCGTCTTCACAGCCACCAGGGCAAGAACCTGATGTTGAGCGAGAAGATTCAGAACCTCAACACTCTGCAACACACCTTGAGGAAAGCAGAAGAGTATCTAGCAGAGCTTAAGTCCGAAACACTGTATGAAGAGTTTGAGGCCAAGTTTGAGGAGATTGGTCTTGAGAGGGGATGGGGAGACAATGCAGAGCGTGTCCTTGACATGATACGTCTTCTTTTGGACCTTCTTGAGGCGCCTGATCCTTGCACTCTTGAGACTTTTCTTGGAAGAGTACCAATGGTGTTCAACGTTGTGATCCTCTCTCCACATGGTTACTTTGCTCAGGACAATGTTCTTGGTTACCCTGACACTGGTGGACAGGTTGTTTACATTCTTGATCAAGTTCGTGCTCTGGAGATAGAGATGCTTCAACGTATTAAGCAACAAGGACTCAACATTAAACCAAGGATTCTCATTCTAACTCGACTTCTACCTGATGCGGTAGGAACTACATGCGGTGAACGTCTCGAGAGAGTTTATGATTCTGAGTACTGTGATATTCTTCGTGTGCCCTTCAGAACAGAGAAGGGTATTGTTCGCAAATGGATCTCAAGGTTCGAAGTCTGGCCATATCTAGAGACTTACACCGAGGATGCTGCGGTTGAGCTATCGAAAGAATTGAATGGCAAGCCTGACCTTATCATTGGTAACTACAGTGATGGAAATCTTGTTGCTTCTTTATTGGCTCACAAACTTGGTGTCACTCAGTGTACCATTGCTCATGCTCTTGAGAAAACAAAGTACCCGGATTCTGATATCTACTGGAAGAAGCTTGACGACAAGTACCATTTCTCATGCCAGTTCACTGCGGATATTTTCGCAATGAACCACACTGATTTCATCATCACTAGTACTTTCCAAGAAATTGCTGGAAGCAAAGAAACTGTTGGGCAGTATGAAAGCCACACAGCCTTTACTCTTCCCGGATTGTATCGAGTTGTTCACGGGATTGATGTGTTTGATCCCAAGTTCAACATTGTCTCTCCTGGTGCTGATATGAGCATCTACTTCCCTTACACAGAGGAGAAGCGTAGATTGACTAAGTTCCACTCTGAGATCGAGGAGCTCCTCTACAGCGATGTTGAGAACAAAGAGCACTTATGTGTGCTCAAGGACAAGAAGAAGCCGATTCTCTTCACAATGGCTAGGCTTGATCGTGTCAAGAACTTGTCAGGTCTTGTTGAGTGGTACGGGAAGAACACCCGCTTGCGTGAGCTAGCTAACTTGGTTGTTGTTGGAGGAGACAGGAGGAAAGAGTCAAAGGACAATGAAGAGAAAGCAGAGATGAAGAAAATGTATGATCTCATTGAGGAATACAAGCTAAACGGTCAGTTCAGGTGGATCTCCTCTCAGATGGACCGGGTAAGGAACGGTGAGCTGTACCGGTACATCTGTGACACCAAGGGTGCTTTTGTCCAACCTGCATTATATGAAGCCTTTGGGTTAACTGTTGTGGAGGCTATGACTTGTGGTTTACCGACTTTCGCCACTTGCAAAGGTGGTCCAGCTGAGATCATTGTGCACGGTAAATCGGGTTTCCACATTGACCCTTACCATGGTGATCAGGCTGCTGATACTCTTGCTGATTTCTTCACCAAGTGTAAGGAGGATCCATCTCACTGGGATGAGATCTCAAAAGGAGGGCTTCAGAGGATTGAGGAGAAATACACTTGGCAAATCTATTCACAGAGGCTCTTGACATTGACTGGTGTGTATGGATTCTGGAAGCATGTCTCGAACCTTGACCGTCTTGAGGCTCGCCGTTACCTTGAAATGTTCTATGCATTGAAGTATCGCCCATTGGCTCAGGCTGTTCCTCTTGCACAAGATGATTGA

ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）からのＷＴ ＵＧＴ７６Ｇ１：アミノ酸配列（配列番号９）
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL

ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）からのＷＴ ＵＧＴ７６Ｇ１：ＤＮＡ配列（配列番号１０）
ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGATTATCTTGTTCCCTGTACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCAATTAGCAAACGTCCTCTACTCCAAGGGATTTTCAATAACAATCTTCCATACTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAGTAATTATCCTCACTTTACATTCAGGTTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGCGTATCTCAAATTTACCTACGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATCAATGAGCATGGAGCCGATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAAGTGAGGAAGACGAGGAAGTTTCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACTTCGCCCAATCAGTCGCAGACTCACTGAATCTACGCCGTTTGGTCCTTATGACAAGTTCATTATTCAACTTTCACGCACATGTATCACTGCCGCAATTTGACGAGTTGGGTTACCTGGACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGAACAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAGAGCGCTTATAGTAATTGGCAAATTCTGAAAGAAATTCTCGGAAAAATGATAAAGCAAACCAAAGCGTCCTCTGGAGTAATCTGGAACTCCTTCAAGGAGTTAGAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAAATCCCCGCTCCCTCGTTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTCCCTCCTAGATCATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGTCGTCAGTTCTATATGTAAGCTTTGGGAGTACTTCGGAAGTGGATGAAAAGGACTTCTTAGAGATTGCGCGAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTTCCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGTTAAGGGCTCGACGTGGGTCGAGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGGAGAATCGTGAAATGGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGGCCTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGAAGGCGTTCCAATGATATTTTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAACGCTCGCTATATGTCTGATGTGTTGAAGGTTGGCGTGTACCTGGAGAATGGTTGGGAAAGGGGGGAAATTGCCAACGCCATACGCCGGGTAATGGTGGACGAGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAACGCTCGGGTTTTAAAACAAAAAGCGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCTATGAATCCCTAGAATCCTTGGTAAGCTATATATCTTCGTTATAA

シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＷＴ ＡｔＳＵＳ１：アミノ酸配列（配列番号１１）
MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD

シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＷＴ ＡｔＳＵＳ１：ＤＮＡ酸配列（配列番号１２）
ATGGCAAACGCTGAACGTATGATTACCCGTGTCCACTCCCAACGCGAACGCCTGAACGAAACCCTGGTGTCGGAACGCAACGAAGTTCTGGCACTGCTGAGCCGTGTGGAAGCTAAGGGCAAAGGTATTCTGCAGCAAAACCAGATTATCGCGGAATTTGAAGCCCTGCCGGAACAAACCCGCAAAAAGCTGGAAGGCGGTCCGTTTTTCGATCTGCTGAAATCTACGCAGGAAGCGATCGTTCTGCCGCCGTGGGTCGCACTGGCAGTGCGTCCGCGTCCGGGCGTTTGGGAATATCTGCGTGTCAACCTGCATGCACTGGTGGTTGAAGAACTGCAGCCGGCTGAATTTCTGCACTTCAAGGAAGAACTGGTTGACGGCGTCAAAAACGGTAATTTTACCCTGGAACTGGATTTTGAACCGTTCAATGCCAGTATCCCGCGTCCGACGCTGCATAAATATATTGGCAACGGTGTGGACTTTCTGAATCGCCATCTGAGCGCAAAGCTGTTCCACGATAAAGAATCTCTGCTGCCGCTGCTGAAATTCCTGCGTCTGCATAGTCACCAGGGCAAGAACCTGATGCTGTCCGAAAAAATTCAGAACCTGAATACCCTGCAACACACGCTGCGCAAGGCGGAAGAATACCTGGCCGAACTGAAAAGTGAAACCCTGTACGAAGAATTCGAAGCAAAGTTCGAAGAAATTGGCCTGGAACGTGGCTGGGGTGACAATGCTGAACGTGTTCTGGATATGATCCGTCTGCTGCTGGACCTGCTGGAAGCACCGGACCCGTGCACCCTGGAAACGTTTCTGGGTCGCGTGCCGATGGTTTTCAACGTCGTGATTCTGTCCCCGCATGGCTATTTTGCACAGGACAATGTGCTGGGTTACCCGGATACCGGCGGTCAGGTTGTCTATATTCTGGATCAAGTTCGTGCGCTGGAAATTGAAATGCTGCAGCGCATCAAGCAGCAAGGCCTGAACATCAAACCGCGTATTCTGATCCTGACCCGTCTGCTGCCGGATGCAGTTGGTACCACGTGCGGTGAACGTCTGGAACGCGTCTATGACAGCGAATACTGTGATATTCTGCGTGTCCCGTTTCGCACCGAAAAGGGTATTGTGCGTAAATGGATCAGTCGCTTCGAAGTTTGGCCGTATCTGGAAACCTACACGGAAGATGCGGCCGTGGAACTGTCCAAGGAACTGAATGGCAAACCGGACCTGATTATCGGCAACTATAGCGATGGTAATCTGGTCGCATCTCTGCTGGCTCATAAACTGGGTGTGACCCAGTGCACGATTGCACACGCTCTGGAAAAGACCAAATATCCGGATTCAGACATCTACTGGAAAAAGCTGGATGACAAATATCATTTTTCGTGTCAGTTCACCGCGGACATTTTTGCCATGAACCACACGGATTTTATTATCACCAGTACGTTCCAGGAAATCGCGGGCTCCAAAGAAACCGTGGGTCAATACGAATCACATACCGCCTTCACGCTGCCGGGCCTGTATCGTGTGGTTCACGGTATCGATGTTTTTGACCCGAAATTCAATATTGTCAGTCCGGGCGCGGATATGTCCATCTATTTTCCGTACACCGAAGAAAAGCGTCGCCTGACGAAATTCCATTCAGAAATTGAAGAACTGCTGTACTCGGACGTGGAAAACAAGGAACACCTGTGTGTTCTGAAAGATAAAAAGAAACCGATCCTGTTTACCATGGCCCGTCTGGATCGCGTGAAGAATCTGTCAGGCCTGGTTGAATGGTATGGTAAAAACACGCGTCTGCGCGAACTGGCAAATCTGGTCGTGGTTGGCGGTGACCGTCGCAAGGAATCGAAAGATAACGAAGAAAAGGCTGAAATGAAGAAAATGTACGATCTGATCGAAGAATACAAGCTGAACGGCCAGTTTCGTTGGATCAGCTCTCAAATGGACCGTGTGCGCAATGGCGAACTGTATCGCTACATTTGCGATACCAAGGGTGCGTTTGTTCAGCCGGCACTGTACGAAGCTTTCGGCCTGACCGTCGTGGAAGCCATGACGTGCGGTCTGCCGACCTTTGCGACGTGTAAAGGCGGTCCGGCCGAAATTATCGTGCATGGCAAATCTGGTTTCCATATCGATCCGTATCACGGTGATCAGGCAGCTGACACCCTGGCGGATTTCTTTACGAAGTGTAAAGAAGACCCGTCACACTGGGATGAAATTTCGAAGGGCGGTCTGCAACGTATCGAAGAAAAATATACCTGGCAGATTTACAGCCAACGCCTGCTGACCCTGACGGGCGTCTACGGTTTTTGGAAACATGTGTCTAATCTGGATCGCCTGGAAGCCCGTCGCTATCTGGAAATGTTTTACGCACTGAAGTATCGCCCGCTGGCACAAGCCGTTCCGCTGGCACAGGACGACTAA

ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２００Ａ変異体（ＬＡ）－ＡｔＳＵＳ１融合酵素：アミノ酸配列（配列番号１３）
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQIAKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLGSGANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDDWT

ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２００Ａ変異体（ＬＡ）－ＡｔＳＵＳ１融合酵素：ＤＮＡ配列（配列番号１４）
ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGATTATCTTGTTCCCTGTACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCAATTAGCAAACGTCCTCTACTCCAAGGGATTTTCAATAACAATCTTCCATACTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAGTAATTATCCTCACTTTACATTCAGGTTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGCGTATCTCAAATTTACCTACGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATCAATGAGCATGGAGCCGATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAAGTGAGGAAGACGAGGAAGTTTCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACTTCGCCCAATCAGTCGCAGACTCACTGAATCTACGCCGTTTGGTCCTTATGACAAGTTCATTATTCAACTTTCACGCACATGTATCACTGCCGCAATTTGACGAGTTGGGTTACCTGGACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGAACAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAGAGCGCTTATAGTAATTGGCAAATTGCGAAAGAAATTCTCGGAAAAATGATAAAGCAAACCAAAGCGTCCTCTGGAGTAATCTGGAACTCCTTCAAGGAGTTAGAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAAATCCCCGCTCCCTCGTTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTCCCTCCTAGATCATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGTCGTCAGTTCTATATGTAAGCTTTGGGAGTACTTCGGAAGTGGATGAAAAGGACTTCTTAGAGATTGCGCGAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTTCCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGTTAAGGGCTCGACGTGGGTCGAGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGGAGAATCGTGAAATGGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGGCCTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGAAGGCGTTCCAATGATATTTTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAACGCTCGCTATATGTCTGATGTGTTGAAGGTTGGCGTGTACCTGGAGAATGGTTGGGAAAGGGGGGAAATTGCCAACGCCATACGCCGGGTAATGGTGGACGAGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAACGCTCGGGTTTTAAAACAAAAAGCGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCTATGAATCCCTAGAATCCTTGGTAAGCTATATATCTTCGTTAGGTTCTGGTGCAAACGCTGAACGTATGATAACGCGCGTCCACAGCCAACGTGAGCGTTTGAACGAAACGCTTGTTTCTGAGAGAAACGAAGTCCTTGCCTTGCTTTCCAGGGTTGAAGCCAAAGGTAAAGGTATTTTACAACAAAACCAGATCATTGCTGAATTCGAAGCTTTGCCTGAACAAACCCGGAAGAAACTTGAAGGTGGTCCTTTCTTTGACCTTCTCAAATCCACTCAGGAAGCAATTGTGTTGCCACCATGGGTTGCTCTAGCTGTGAGGCCAAGGCCTGGTGTTTGGGAATACTTACGAGTCAATCTCCATGCTCTTGTCGTTGAAGAACTCCAACCTGCTGAGTTTCTTCATTTCAAGGAAGAACTCGTTGATGGAGTTAAGAATGGTAATTTCACTCTTGAGCTTGATTTCGAGCCATTCAATGCGTCTATCCCTCGTCCAACACTCCACAAATACATTGGAAATGGTGTTGACTTCCTTAACCGTCATTTATCGGCTAAGCTCTTCCATGACAAGGAGAGTTTGCTTCCATTGCTTAAGTTCCTTCGTCTTCACAGCCACCAGGGCAAGAACCTGATGTTGAGCGAGAAGATTCAGAACCTCAACACTCTGCAACACACCTTGAGGAAAGCAGAAGAGTATCTAGCAGAGCTTAAGTCCGAAACACTGTATGAAGAGTTTGAGGCCAAGTTTGAGGAGATTGGTCTTGAGAGGGGATGGGGAGACAATGCAGAGCGTGTCCTTGACATGATACGTCTTCTTTTGGACCTTCTTGAGGCGCCTGATCCTTGCACTCTTGAGACTTTTCTTGGAAGAGTACCAATGGTGTTCAACGTTGTGATCCTCTCTCCACATGGTTACTTTGCTCAGGACAATGTTCTTGGTTACCCTGACACTGGTGGACAGGTTGTTTACATTCTTGATCAAGTTCGTGCTCTGGAGATAGAGATGCTTCAACGTATTAAGCAACAAGGACTCAACATTAAACCAAGGATTCTCATTCTAACTCGACTTCTACCTGATGCGGTAGGAACTACATGCGGTGAACGTCTCGAGAGAGTTTATGATTCTGAGTACTGTGATATTCTTCGTGTGCCCTTCAGAACAGAGAAGGGTATTGTTCGCAAATGGATCTCAAGGTTCGAAGTCTGGCCATATCTAGAGACTTACACCGAGGATGCTGCGGTTGAGCTATCGAAAGAATTGAATGGCAAGCCTGACCTTATCATTGGTAACTACAGTGATGGAAATCTTGTTGCTTCTTTATTGGCTCACAAACTTGGTGTCACTCAGTGTACCATTGCTCATGCTCTTGAGAAAACAAAGTACCCGGATTCTGATATCTACTGGAAGAAGCTTGACGACAAGTACCATTTCTCATGCCAGTTCACTGCGGATATTTTCGCAATGAACCACACTGATTTCATCATCACTAGTACTTTCCAAGAAATTGCTGGAAGCAAAGAAACTGTTGGGCAGTATGAAAGCCACACAGCCTTTACTCTTCCCGGATTGTATCGAGTTGTTCACGGGATTGATGTGTTTGATCCCAAGTTCAACATTGTCTCTCCTGGTGCTGATATGAGCATCTACTTCCCTTACACAGAGGAGAAGCGTAGATTGACTAAGTTCCACTCTGAGATCGAGGAGCTCCTCTACAGCGATGTTGAGAACAAAGAGCACTTATGTGTGCTCAAGGACAAGAAGAAGCCGATTCTCTTCACAATGGCTAGGCTTGATCGTGTCAAGAACTTGTCAGGTCTTGTTGAGTGGTACGGGAAGAACACCCGCTTGCGTGAGCTAGCTAACTTGGTTGTTGTTGGAGGAGACAGGAGGAAAGAGTCAAAGGACAATGAAGAGAAAGCAGAGATGAAGAAAATGTATGATCTCATTGAGGAATACAAGCTAAACGGTCAGTTCAGGTGGATCTCCTCTCAGATGGACCGGGTAAGGAACGGTGAGCTGTACCGGTACATCTGTGACACCAAGGGTGCTTTTGTCCAACCTGCATTATATGAAGCCTTTGGGTTAACTGTTGTGGAGGCTATGACTTGTGGTTTACCGACTTTCGCCACTTGCAAAGGTGGTCCAGCTGAGATCATTGTGCACGGTAAATCGGGTTTCCACATTGACCCTTACCATGGTGATCAGGCTGCTGATACTCTTGCTGATTTCTTCACCAAGTGTAAGGAGGATCCATCTCACTGGGATGAGATCTCAAAAGGAGGGCTTCAGAGGATTGAGGAGAAATACACTTGGCAAATCTATTCACAGAGGCTCTTGACATTGACTGGTGTGTATGGATTCTGGAAGCATGTCTCGAACCTTGACCGTCTTGAGGCTCGCCGTTACCTTGAAATGTTCTATGCATTGAAGTATCGCCCATTGGCTCAGGCTGTTCCTCTTGCACAAGATGATTGA

Claims (15)

1. レバウジオシドＩを合成するための方法であって、
   下記（ａ）～（ｃ）を含む反応混合物を調製すること：
   （ａ）レバウジオシドＡを含むステビオール配糖体組成物；
   （ｂ）基質として、スクロースとウリジン二リン酸（ＵＤＰ）；及び
   （ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素；
   ならびに
   レバウジオシドＩを産生するのに充分な時間反応混合物をインキュベートすること
   を含み、
   インキュベート前の反応混合物にスクロースシンターゼを添加することをさらに含む、方法。
2. ステビオール配糖体組成物が、ステビア抽出物である、請求項１に記載の方法。
3. 反応混合物が、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. スクロースシンターゼが、配列番号１１のアミノ酸配列を含むシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）スクロースシンターゼ１（ＡｔＳＵＳ１）である、請求項1に記載の方法。
5. 反応混合物が、インビトロである、請求項１に記載の方法。
6. 反応混合物が、細胞ベースの反応混合物である、請求項１に記載の方法。
7. ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素が、宿主細胞において発現される、請求項６に記載の方法。
8. 宿主細胞が、酵母、非ステビオール配糖体産生植物、藻類、真菌、および細菌からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
9. 宿主細胞が、細菌細胞である、請求項７に記載の方法。
10. 細菌細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項９に記載の方法。
11. 宿主細胞が、酵母細胞である、請求項７に記載の方法。
12. レバウジオシドＡが、反応混合物中で１５～５０ｇ／Ｌの濃度を有する、請求項１に記載の方法。
13. 反応混合物が、３５℃～４５℃の温度で６．５～９．６のｐＨ範囲を有する、請求項１に記載の方法。
14. 粗レバウジオシドＩを単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
15. ９８％を超える純度を有するレバウジオシドＩを得るために粗レバウジオシドＩを結晶化することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

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