CN113388591B - 漆酶及其突变体和应用 - Google Patents

漆酶及其突变体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了漆酶及其突变体和应用。本发明提供了从土壤中分离得到的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的野生型漆酶。为了提高野生型漆酶酶活，将其进行了单位点或多位点突变，其中，L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E、N196D、H439Y、L77I、G405V、D372K、K296E、V519T、T166K、A46G、R187E、W502F、R236K、N367D、M158A、V366A或V241I单位点突变所获得的突变体，其酶活力显著提高；在单位点突变的基础上，本发明进行了多位点组合突变，分别得到了酶活力显著提高的三位点、五位点以及七位点组合突变体。

Description

漆酶及其突变体和应用
技术领域
本发明涉及漆酶及其突变体，尤其涉及从土壤中筛选获得的酶比活力较高且偏中性的漆酶以及酶活力显著提高的酶突变体，属于漆酶及其突变体领域。
背景技术
漆酶（Laccase，EC1.1.3.2）属于多铜氧化酶，其能利用铜离子的氧化作用催化广泛的底物，从而将氧气还原为水。漆酶具有对有毒异种生物化合物进行氧化生物修复的巨大潜力，其应用被认为对环境无害。因此广泛用于食品工业、染料脱色、制浆、漂白及造纸废水处理和生物修复等领域。
现有的漆酶多存在酶活力较低、在原核或真核表达中可溶性表达量低等缺陷，亟待改进。
发明内容
本发明的目的之一提供一种酶活力较高的漆酶；
本发明的目的之二将所述的漆酶进行定点突变得到酶活力明显提高的单位点或多位点漆酶突变体；
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：
一种从土壤中分离得到的漆酶，其氨基酸序列为（a）或（b）所示:
(a)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或者
(b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有漆酶功能或活性的突变体。
本发明进一步提供了该漆酶的编码基因，该编码基因的多核苷酸序列为(a)：编码SEQ ID No.1所示氨基酸的多核苷酸；或者(b)：在(a)所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有漆酶的功能或活性。
本发明发现，SEQ ID No.1所示氨基酸序列的漆酶也难以在酵母表达系统中外泌表达且在大肠杆菌中可溶性表达量极低，导致其酶活较低，严重影响了其应用。本发明在前期尝试优化表达条件，在该蛋白质 N 端增加了标签蛋白等，但其可溶性表达量仍然很低。
为了提高漆酶的可溶性表达量，本发明对SEQ ID No.1所示氨基酸序列的漆酶进行了单位点或者多位点突变，最终筛选得到了酶活力显著提高的单位点突变体以及多位点突变体。
作为本发明一种具体的实施方式，本发明提供了一种酶活力显著提高的漆酶单位点突变体，该突变体通过将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E、N196D、H439Y、L77I、 G405V、D372K、K296E、V519T、T166K、A46G、R187E、W502F、R236K、N367D、M158A、V366A或V241I 中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体；优选的，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E、N196D、H439Y或者L77I中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体；更优选的，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E或者N196D中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体；特别优选的，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行L508F氨基酸单位点突变所获得的突变体。
本发明单位点突变体“L508F”表示将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的漆酶的第508位氨基酸由亮氨酸（L）突变成苯丙氨酸（F）；本发明其余的单位点突变的表述依此类推。
作为本发明一种具体的实施方式，本发明提供了一种热稳定性提高的漆酶多位点突变体，所述多位点突变体选自以下(a）-(c)中的任何一种：
(a)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行L508F/L507M/H436E三个位点突变得到的三位点组合突变体（L508F/L507M/H436E）；
(b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行L508F/L507M/H436E/R431D/R355K五个位点突变得到的五位点组合突变体(L508F/L507M/H436E/R431D/R355K)；
(c)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行L508F/L507M/H436E/R431D/R355K/T294E/N196D七个位点突变得到的七位点组合突变体(L508F/L507M/H436E/R431D/R355K/T294E/N196D)。
本发明多位点突变体“L508F/L507M/H436E”表示将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的漆酶的第508位的亮氨酸（L）突变成苯丙氨酸（F），第507位的亮氨酸（L）突变成甲硫氨酸（M）以及将第436位的组氨酸（H）突变成谷氨酸（E）；本发明其他所述氨基酸多位点突变的表述依此类推。
所述的漆酶单位点突变体或多位点突变体的编码基因也属于本发明的保护范畴之内。
本发明还公开了含有所述漆酶单位点突变体或多位点突变体的编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体可以为重组原核表达载体或重组真核载体。
本发明进一步提供了制备任何一项所述的漆酶突变体的方法，包括：
（1）将所述漆突变体的编码基因可操作的与表达调控元件连接构建得到重组表达载体；
（2）将重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，诱导表达重组蛋白，纯化，即得。
本发明技术方案详述
漆酶13B22的筛选及酶学性能检测
漆酶13B22从农药污染的土壤中筛选获得，首先提取土壤宏基因组后构建fosmid文库，然后利用漆酶基因的保守序列设计简并引物，使用Tail-PCR从宏基因组中得到了漆酶13B22的基因全长。将13B22的全长编码基因构建到大肠杆菌表达载体pET30a上，得到野生型质粒，热激转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将携带重组基因的大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞在添加50 μg/mL卡那霉素的50 mL LB 培养基中，在30℃下以120 rpm振荡培养至OD600为0.7～0.75。然后，将 0.1 mM 异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷和 0.25 mM CuCl2 添加到培养基中，并将温度降至25℃，继续孵育4 h，在此期间通过关闭摇动功能实现微需氧条件。在进一步生长 20 h后将菌液移至离心管中8000g 离心10 min收获细胞。将沉淀重新悬浮在含有 20 mM Tris/HCl (pH 8.0) 的5 mL缓冲液中。在冰上超声破碎细胞，在4℃下以12,000 g离心30 min后将破碎上清液转移到新的预冷10 mL EP管中，使用镍柱纯化目的蛋白后测定漆酶活性。同时取少量样品制备SDS-PAGE样品。将测定，漆酶13B22对漆酶底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（简称ABTS）的最适反应温度为37℃，最适反应pH值为6.0，是一个新发现的酶比活力相对较高且偏中性的漆酶。
由于其难以在酵母表达系统中外泌表达且在大肠杆菌中可溶性表达量极低，严重影响了其应用。本发明人在前期尝试优化表达条件，在蛋白质 N 端增加了标签蛋白等，但其可溶性表达量仍然很低。
漆酶13B22突变体的设计、筛选以及酶学性能检测
基于人工智能构建的预测基因在大肠杆菌表达量的模型，基于漆酶13B22的遗传进化信息，通过模型初步虚拟筛选出35个单点突变体，通过两步PCR构建单点突变型质粒，将测序正确的突变质粒热激转化到BL21（DE3）感受态细胞中。结果表明，相较于漆酶13B22的野生型，22个单点突变体粗酶液对漆酶底物 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（简称ABTS）的酶活力均明显提高。
35个单点突变体中，酶活力高于野生型漆酶的为L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E、N196D、H439Y、L77I、 G405V、D372K、K296E、V519T、T166K、A46G、R187E、W502F、R236K N367D、M158A、V366A及V241I共22个单位点突变体；其中，L508F的酶活力为841.728±33.246，不仅显著高于野生型漆酶的酶活力，也显著高于其它的34个单点突变体。
本发明将酶活力较高的前7个单位点突变体（L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E、N196D）依次叠加分别得到3位点组合突变体3MUT（L508F/L507M/H436E）、5位点组合突变体5MUT（L508F/L507M/H436E/R431D/R355K）和7位点组合突变体7MUT（L508F/L507M/H436E/R431D/R355K/T294E/N196D）。根据图2中的B图和图2中的C图的结果可见，随着叠加的位点增加，多位点突变体在大肠杆菌 BL21(DE3)中的可溶性蛋白表达量逐步显著增加，对底物ABTS的酶活力均显著提高，3位点组合突变体3MUT（L508F/L507M/H436E）、5位点组合突变体5MUT（L508F/L507M/H436E/R431D/R355K）和7位点组合突变体7MUT（L508F/L507M/H436E/R431D/R355K/T294E/N196D）的破碎上清的酶活性分别为1305.962±56.914 U/L、3084.777±216.618 U/L和3954.03±74.026U/L，较野生型漆酶的酶活力294.938±7.962U/L分别提高了大约4.428倍、10.459倍和13.406倍。这些结果初步表明通过构建蛋白序列对蛋白表达量的预测模型，可以筛选得到氨基酸突变体来提高外源蛋白质的表达量或酶活力。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka等人, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 和Cassol等人, (1992); Rossolini等人, Mol Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白（即抗原），其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
术语“转化”指将编码基因导入到宿主细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到宿主细胞中。
术语“表达”：内源性基因或转基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。
术语“编码基因”：转录成RNA的核酸序列。
附图说明
图1 漆酶13B22的最适反应温度和最适pH值。
图2 基于AI的高表达蛋白学习算法的理性设计提高漆酶13B22的蛋白表达量；A图为野生型漆酶13B22和模型预测的30个单位点突变体诱导表达后破碎上清中对漆酶底物ABTS的酶活性； B图为野生型13B22和多位点叠加突变体诱导表达后破碎上清中对漆酶底物ABTS的酶活性；C 图为评估野生型13B22和多位点叠加突变体诱导表达后破碎上清中蛋白表达量的western blot（C1）和SDS-PAGE胶图(C2)；M：maker；L1M：单位点突变体1MUT(L508F)；L3M：3位点组合突变体3MUT（L508F/L507M/H436E）；L5M：5位点组合突变体5MUT（L508F/L507M/H436E/R431D/R355K）； L7M：7位点组合突变体7MUT（L508F/L507M/H436E/R431D/R355K/T294E/N196D）。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
试验例1漆酶13B22的筛选及酶学性能检测
漆酶13B22从农药污染的土壤中筛选获得，首先提取土壤宏基因组后构建fosmid文库，然后利用漆酶基因的保守序列设计简并引物，使用Tail-PCR从宏基因组中得到了漆酶13B22的基因全长。
将13B22的全长编码基因构建到大肠杆菌表达载体pET30a上，得到野生型质粒，热激转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将携带重组基因的大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞在添加50μg/mL卡那霉素的50 mL LB 培养基中，在30℃下以120 rpm振荡培养至OD600为0.7～0.75。然后，将0.1 mM 异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷和 0.25 mM CuCl2 添加到培养基中，并将温度降至25℃，继续孵育4 h，在此期间通过关闭摇动功能实现微需氧条件。在进一步生长20 h后将菌液移至离心管中8000g 离心10 min收获细胞。将沉淀重新悬浮在含有 20 mMTris/HCl (pH 8.0) 的5 mL缓冲液中。在冰上超声破碎细胞，在4℃下以12,000 g离心30min后将破碎上清液转移到新的预冷10 mL EP管中，使用镍柱纯化目的蛋白后测定漆酶活性。同时取少量样品制备SDS-PAGE样品。
测定结果发现，漆酶13B22对漆酶底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（简称ABTS）的最适反应温度为37℃，最适反应pH值为6.0（图1），是一个新发现的酶比活力相对较高且偏中性的漆酶。
漆酶13B22难以在酵母表达系统中外泌表达且在大肠杆菌中可溶性表达量极低，严重影响了其应用。尽管在前期尝试优化表达条件，在蛋白质N端增加了标签蛋白等，但其可溶性表达量仍然很低。
试验例2漆酶13B22突变体的设计、筛选以及酶学性能检测
基于人工智能构建的预测基因在大肠杆菌表达量的模型，基于漆酶13B22的遗传进化信息，通过模型初步虚拟筛选出35个单位点突变体，通过两步PCR构建单位点突变型质粒，将测序正确的突变质粒热激转化到BL21（DE3）感受态细胞中。结果表明，相较于漆酶13B22的野生型，22个单位点突变体粗酶液对漆酶底物 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（简称ABTS）的酶活力均明显提高（表1）。
表1漆酶13B22的35个单点突变体的酶活力
Figure DEST_PATH_IMAGE001
35个单位点突变体中，酶活力高于野生型漆酶的为L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E、N196D、H439Y、L77I、 G405V、D372K、K296E、V519T、T166K、A46G、R187E、W502F、R236K、N367D、M158A、V366A及V241I这22个单位点突变体；其中，酶活力显著高于野生型漆酶的单位点突变体有L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E、N196D、H439Y、L77I、G405V、D372K、K296E、V519T、T166K、A46G、R187E以及W502F；L508F的酶活力为841.728±33.246，不仅显著高于野生型漆酶的酶活力，也显著高于其它的34个单位点突变体的酶活力。
将酶活力较高的前7个单位点突变体（L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E、N196D）依次叠加分别得到3位点组合突变体3MUT（L508F/L507M/H436E）、5位点组合突变体5MUT（L508F/L507M/H436E/R431D/R355K）和7位点组合突变体7MUT（L508F/L507M/H436E/R431D/R355K/T294E/N196D）。
根据图2中的B图和C图的结果可见，随着叠加的位点增加，多位点突变体在大肠杆菌 BL21(DE3)中的可溶性蛋白表达量逐步显著增加，对底物ABTS的酶活力均显著提高，3位点组合突变体3MUT（L508F/L507M/H436E）、5位点组合突变体5MUT（L508F/L507M/H436E/R431D/R355K）和7位点组合突变体7MUT（L508F/L507M/H436E/R431D/R355K/T294E/N196D）的破碎上清的酶活力分别为1305.962±56.914 U/L、3084.777±216.618 U/L和3954.03±74.026U/L，较野生型漆酶的酶活力294.938±7.962U/L分别提高了大约4.428倍、10.459倍和13.406倍。这些结果初步表明通过构建蛋白序列对蛋白表达量的预测模型可以筛选得到氨基酸突变体来提高外源蛋白质的表达量或酶活力。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 漆酶及其突变体和应用
<130> BJ-2002-210602A-L
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 521
<212> PRT
<213> 土壤(Soil)
<400> 1
Ala Asp Ala Val Asp Thr Thr Thr Asp Gly Ala Pro Val Leu Ser Gly
1 5 10 15
Thr Glu Phe Asp Leu Thr Ile Ala Glu Thr Pro Val Asn Phe Thr Gly
20 25 30
Ala Pro Arg Met Ala Thr Thr Ile Asn Gly Ser Leu Pro Ala Pro Thr
35 40 45
Leu Arg Trp Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Ile Arg Val Thr Asn Arg
50 55 60
Leu Pro Val Asp Ser Ser Ile His Trp His Gly Ile Leu Leu Pro Phe
65 70 75 80
Gln Met Asp Gly Val Pro Gly Ile Ser Tyr Lys Gly Ile Ala Pro Gly
85 90 95
Glu Thr Phe Thr Tyr Arg Phe Lys Val Gln Gln Thr Gly Thr Tyr Trp
100 105 110
Tyr His Ser His Ser Gly Met Gln Glu Gln Thr Gly Met Tyr Gly Thr
115 120 125
Ile Val Ile Glu Pro Ala Gly Gly Glu Thr Ile Arg Ala Asp Arg Asp
130 135 140
Tyr Val Val Gln Leu Ser Asp Trp Thr Asp Glu Asp Pro Met Arg Val
145 150 155 160
Phe Ser Lys Leu Lys Thr Gln Ser Asp Tyr Tyr Asn Phe Asn Gln Pro
165 170 175
Thr Val Ala Asp Phe Phe Arg Asp Val Ser Arg Asn Gly Phe Lys Ala
180 185 190
Ala Leu Asp Asn Arg Lys Met Trp Asn Gln Met Arg Met Ser Pro Thr
195 200 205
Asp Leu Ala Asp Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Tyr Leu Val Asn Gly
210 215 220
Thr Thr Pro Ala Gly Asn Trp Thr Gly Leu Phe Arg Pro Gly Glu Lys
225 230 235 240
Val Arg Leu Arg Phe Val Asn Ser Gly Ala Met Thr Phe Phe Asp Val
245 250 255
Arg Ile Pro Gly Leu Lys Met Thr Val Val Gln Ala Asp Gly Gln Asp
260 265 270
Val Glu Pro Val Thr Val Asp Glu Ile Arg Ile Gly Val Ala Glu Thr
275 280 285
Tyr Asp Val Ile Val Thr Pro Lys Asp Gly Ala Tyr Thr Ile Phe Ala
290 295 300
Gln Ser Met Asp Arg Thr Gly Tyr Ala Arg Gly Thr Leu Ala Pro Arg
305 310 315 320
Ala Gly Met Thr Ala Ala Val Pro Thr Pro Asp Lys Pro Gln Pro Leu
325 330 335
Glu Met Glu Asp Met Met Gly Asp Met Thr Gly Met Ala Arg Ala His
340 345 350
His Ala Arg Thr Glu Tyr Gly Pro Ser Val Asp Met Arg Val Asn Thr
355 360 365
Pro Arg Thr Asp Leu Asp Asp Pro Gly Val Gly Leu Arg Asp Asn Gly
370 375 380
Arg Arg Val Leu Thr Tyr Ala Asp Leu His Thr Val Gly Gly Pro Leu
385 390 395 400
Asp Pro Arg Asp Gly Glu Arg Glu Ile Glu Leu His Leu Thr Gly Asn
405 410 415
Met Glu Arg Tyr Thr Trp Ser Ile Asp Gly Val Glu Phe Gly Arg Ser
420 425 430
Thr Pro Val His Phe Arg His Asn Glu Arg Leu Arg Val Val Phe Val
435 440 445
Asn Asp Thr Met Met Thr His Pro Met His Leu His Gly Met Trp Ser
450 455 460
Glu Leu Glu Ser Pro Asp Gly Gly Phe Gln Val Arg Lys His Thr Ile
465 470 475 480
Ala Val Gln Pro Ala Gln Arg Val Ser Phe Leu Val Thr Ala Asp Ala
485 490 495
Leu Gly Arg Trp Ala Trp His Cys His Leu Leu Leu His Met Asp Ala
500 505 510
Gly Met Phe Arg Glu Val Val Val Ala
515 520

Claims (7)

1.一种漆酶的突变体，其特征在于，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行L508F氨基酸单位点突变获得所述的突变体。
2.一种漆酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行L508F/L507M/H436E三个位点突变得到的三位点组合突变体。
3.一种漆酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行L508F/L507M/H436E/R431D/R355K五个位点突变得到的五位点组合突变体。
4.一种漆酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行L508F/L507M/H436E/R431D/R355K/T294E/N196D七个位点突变得到的七位点组合突变体。
5.编码权利要求1-4任何一项所述突变体的编码基因。
6.含有权利要求5所述编码基因的重组表达载体。
7.一种制备权利要求1-4任何一项所述突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将所述突变体的编码基因可操作的与表达调控元件连接构建得到重组表达载体；
（2）将重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，诱导表达重组蛋白，纯化，即得。
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