CN105176939B - 一种含有非天然氨基酸的漆酶、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有非天然氨基酸的漆酶，及该漆酶的制备方法和漆酶的应用。制备方法具体为先使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点插入到大肠杆菌漆酶中，再利用大肠杆菌表达含非天然氨基酸的漆酶。该漆酶提高了对铜离子的亲和力，增加了漆酶内部Cu离子的占有率，并进而提高了漆酶酶活，改善了漆酶的外源铜离子依赖性。本发明还涉及含有非天然氨基酸的漆酶用于降解环境污染物苯并芘的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种含有非天然氨基酸的漆酶、制备方法及应用。
背景技术
漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，在自然界中广泛存在。漆酶能够催化多达250种不同的底物的氧化，包括酚类物质、多酚类物质、苯硫酚、多胺、生物色素、木质素、染料大分子芳香化合物等。伴随着底物的氧化，漆酶可以将分子氧还原为水，不会产生过氧化氢和活性氧等有害的中间产物。漆酶较宽松的底物特异性以及绿色环保的催化性能，使其在纺织、造纸、环保、家具制造和食品生产等行业具有广阔的应用前景。
目前我国市场上成熟的漆酶均为真菌来源的漆酶。由于真菌漆酶需要进行翻译后修饰，只能依靠筛选高产菌株自身表达或者使用真核表达系统进行重组表达，存在着生产周期长、产量低、成本高等缺点，严重限制了漆酶的大规模产业化应用。
相比现有的真菌漆酶，大肠杆菌漆酶CueO具有无需翻译后修饰、热稳定性好、可大规模重组表达、生产周期短、产量高、成本低等优势，因此成为真菌漆酶的良好替代者。但是CueO也存在着多酚氧化酶酶活较低和酶活依赖外源铜离子等，如果能解决CueO的这些问题，将大大推动漆酶的大规模产业化应用。
基因密码子扩展技术是近年来发展起来的一项蛋白修饰技术，利用琥珀终止密码子来编码多种非天然氨基酸并在生物活体内将非天然氨基酸定点插入蛋白中。目前这一技术已经将超过50种的非天然氨基酸成功地定点表达在活体细胞的蛋白质当中，并赋予了这些蛋白质各种新颖的物理、化学和生理性质。
发明内容
本发明是针对现有技术和产品的不足，利用基因密码子扩展技术，将可以结合铜的非天然氨基酸定点插入到漆酶CueO中，从而提高漆酶CueO对铜离子的亲和力，并进而提高漆酶CueO的漆酶酶活，改善漆酶CueO的外源铜离子依赖性。
本发明采用如下技术方案：
一种含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体，所述漆酶CueO的氨基酸序列为SEQ IDNO:1；所述漆酶CueO突变体为漆酶CueO的第106位的谷氨酸、第132位的天冬氨酸、第144位的谷氨酰胺、第147位的赖氨酸、第354位的丝氨酸、第355位的甲硫氨酸、第408位的天冬酰胺和第412位的甘氨酸中至少一个位点突变为非天然氨基酸。
进一步的改进，所述非天然氨基酸为3‐吡唑酪氨酸(PyTyr)或8‐羟基喹啉丙氨酸(HqAla)。
其中，3‐吡唑酪氨酸的结构如下图所示：
其中，8‐羟基喹啉丙氨酸的结构如下图所示：
进一步的改进，所述漆酶CueO突变体于大肠杆菌中表达。
一种利用表达漆酶CueO突变体的方法，包括如下步骤：
1)根据漆酶CueO的氨基酸序列和蛋白空间结构，选择突变位点；
2)使用定点突变PCR技术，将选定的突变位点的密码子突变为终止密码子；
3)将突变的漆酶CueO基因序列构建到pET‐28c表达载体上；
4)将漆酶CueO突变体表达载体与可特异性引入3‐吡唑酪氨酸的辅助质粒pEVOL‐tRNA‐PyTyrRS或8‐羟基喹啉丙氨酸的辅助质粒pEVOL‐tRNA‐HqAlaRS共同转化大肠杆菌BL21(DE3)，在培养基中添加IPTG、阿拉伯糖和非天然氨基酸进行CueO突变体的诱导表达；
5)将表达有目的蛋白的大肠杆菌收集后，超声破碎，并亲和纯化得到含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体。
进一步的改进，所述终止密码子为琥珀密码子TAG。
进一步的改进，突变的漆酶CueO基因序列由SEQ ID NO:2中第316～318位的GAA，第394～396位GAT，第430～432位的CAG，第439～441位的AAA，第1060～1062位的TCT，第1063～1065位的ATG，第1222～1224位的AAC，第1234～1236位的GGT中的至少一个替换为TAG形成。
一种含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体于降解苯并芘的应用。
与现有的技术相比，本发明中的漆酶CueO有如下优点：
大肠杆菌漆酶CueO虽有无需翻译后修饰、热稳定性好、可大规模重组表达、生产周期短、产量高、成本低等优势，但也存在着多酚氧化酶酶活较低和酶活依赖外源铜离子等影响CueO大规模应用的缺点。大量的研究表明，CueO酶活低可能与其蛋白结构内Cu离子占有率不高有关。因此，目前对CueO的定向改造主要是通过分析CueO的空间结构，对Cu离子附近的氨基酸进行突变，筛选出高酶活的CueO突变体。但由于天然氨基酸对Cu离子的结合能力一般，目前CueO的酶活提高都不能令人满意。本发明通过基因密码子扩展技术将结合铜的非天然氨基酸定点插入到漆酶CueO中，提高了CueO对铜离子的亲和力，增加了CueO内部Cu离子的占有率，并进而提高了CueO的漆酶酶活，改善了CueO的外源铜离子依赖性。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为CueO的晶体结构示意图，T1/T2/T3/T4分别表示CueO中发挥不同功能的四个Cu离子；
图2为根据实施例3得到的CueO‐M355‐HqAla及CueO‐WT的重组表达SDS‐PAGE电泳图，其中：1为蛋白marker，2为CueO‐M355‐HqAla，3为CueO‐WT，箭头所示即为大肠杆菌漆酶M355突变体及野生型；
图3为根据实施例4得到的CueO各突变体的酶活检测结果；
图4为根据实施例5得到的CueO突变体降解苯并芘的结果。
具体实施方式
如下采用具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步详细说明，但应当理解本发明技术方案不限于以下所列举具体实施方式，任何根据本发明的原理所做的改变或替代都应当落入本发明的范围之内。
本发明的说明书，尤其是实施例中所使用的材料、试剂、装置等，如没有特别地指出，均是从商业可购得的或本领域常规使用的。
实施例1 CueO突变体的构建
根据PDB数据库中CueO的晶体结构信息(PDB ID：1N68，见图1)，分析可能与T1/T2/T4铜离子发生相互作用的氨基酸残基，选定漆酶CueO突变体由漆酶CueO的第106位的谷氨酸、第132位的天冬氨酸、第144位的谷氨酰胺、第147位的赖氨酸、第354位的丝氨酸、第355位的甲硫氨酸、第408位的天冬酰胺和第412位的甘氨酸，这几个突变位点。
根据CueO的DNA序列(SEQ ID NO:2)，分别设计能够使上述突变位点密码子突变为琥珀密码子的引物，具体引物序列如下表所示。
表1：突变引物列表
| 突变位点 | 序列(5'—3') |
| E106‐F | GACTTCACCCGGTACCTACAGCCCGTGCCAGTG |
| E106‐R | CACTGGCACGGGCTGTAGGTACCGGGTGAAGTC |
| D132‐F | CAGGTAGCGGCAGGTTGCTAAACGTTCAACGTCACCG |
| D132‐R | CGGTGACGTTGAACGTTTAGCAACCTGCCGCTACCTG |
| Q144‐F | GTTTTGCCGTGCTAATGCGGATGGAACCAGCAG |
| Q144‐R | CTGCTGGTTCCATCCGCATTAGCACGGCAAAAC |
| K147‐F | GCATCAGCACGGCTAGACCGGGCGACAGG |
| K147‐R | CCTGTCGCCCGGTCTAGCCGTGCTGATGC |
| S354‐F | CGAGCATCGGGTCCATCTAGAGTTGCAGCTTGCGT |
| S354‐R | ACGCAAGCTGCAACTCTAGATGGACCCGATGCTCG |
| M355‐F | ATATCGAGCATCGGGTCCTAAGAGAGTTGCAGCTTGC |
| M355‐R | GCAAGCTGCAACTCTCTTAGGACCCGATGCTCGATAT |
| N408‐F | CGCCTGACCGTTGATTTTCTAGGCATGGTGGAAATCGAA |
| N408‐R | TTCGATTTCCACCATGCCTAGAAAATCAACGGTCAGGCG |
| G412‐F | GCTTGTTCATATCAAACGCCTGCTAGTTGATTTTGTTGGCATGGTGG |
| G412‐R | CCACCATGCCAACAAAATCAACTAGCAGGCGTTTGATATGAACAAGC |
利用定点突变PCR技术，以野生型CueO的DNA序列为模板，将E106、D132、Q144、K147、S354、M355、N408和G412这几个位点的密码子突变为琥珀密码子TAG。
将PCR得到的CueO突变体DNA分别插入pET‐28c质粒(Novagen，购自MerckMillipore)，得到突变体表达载体，测序验证突变成功。
实施例2 特异性引入非天然氨基酸辅助质粒的获得
根据发明人之前提交的发明专利“3‐吡唑基酪氨酸翻译系统及其应用”(公开号CN103571804A)和“8‐羟基喹啉丙氨酸翻译系统及其应用”(公开号CN104059891A)，获得可特异性引入3‐吡唑酪氨酸的辅助质粒pEVOL‐tRNA‐PyTyrRS和可特异性引入8‐羟基喹啉丙氨酸的辅助质粒pEVOL‐tRNA‐HqAlaRS。
实施例3 CueO‐M355‐HqAla突变体的表达和纯化
将实施例1得到的M355突变体质粒pET28c‐M355(卡那霉素抗性)和实施例2得到的8‐羟基喹啉丙氨酸辅助质粒pEVOL‐tRNA‐HqAlaRS(氯霉素抗性)共同转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经卡那霉素和氯霉素双抗平板筛选，获得两种质粒共转的阳性菌株。
将筛选出的阳性菌株接种于LB培养基(含有卡那霉素和氯霉素)中，37℃过夜培养后转入1L LB培养基(含有卡那霉素和氯霉素)中，37℃培养至OD600约为0.8，然后加入HqAla至终浓度1mM，IPTG至终浓度0.5mM，阿拉伯糖至终浓度0.2％，20℃诱导12h。
对诱导表达后菌液进行SDS‐PAGE电泳鉴定，电泳结果如图2所示，表明获得了大小约50kD的大肠杆菌漆酶，并且位置与大肠杆菌漆酶野生型一致。
将收集的菌体用Lysis buffer重悬，超声破碎，破碎液离心上清与Ni‐NTA beads在4℃结合1h，经过不同浓度的咪唑洗脱液洗脱，获得较纯的CueO‐M355‐HqAla，纯度约为90％。
在以上实施例中将8‐羟基喹啉丙氨酸辅助质粒pEVOL‐tRNA‐HqAlaRS(氯霉素抗性)替换为3‐吡唑酪氨酸的辅助质粒pEVOL‐tRNA‐PyTyrRS(氯霉素抗性)即可制得CueO‐M355‐PyTyr。
实施例4 CueO各突变体的酶活检测
根据实施例3所述表达纯化方法，表达CueO的突变体。
以ABTS作为底物，检测CueO‐WT、CueO‐E106‐PyTyr、CueO‐K147‐PyTyr、CueO‐M355‐PyTyr和CueO‐N408‐PyTyr的酶活。
酶活反应体系为100mM NaAc pH4.8，1mM ABTS，0.3uM CueO，10mM CuCl2，反应温度25℃，420nm吸光度检测，根据酶活反应曲线来计算CueO突变体的酶活。
酶活测定结果显示，CueO‐E106‐PyTyr、CueO‐K147‐PyTyr、CueO‐M355‐PyTyr和CueO‐N408‐PyTyr与野生型CueO‐WT相比，酶活均有了显著提升，其中CueO‐K147‐PyTyr的酶活提高了约5倍，见图3所示。
实施例5 CueO突变体促进降解苯并芘
根据实施例3所述表达纯化方法，表达CueO的突变体。
以苯并芘作为底物，检测CueO‐WT、CueO‐K147‐PyTyr、CueO‐K147‐HqAla、CueO‐M355‐PyTyr和CueO‐M355‐HqAla对苯并芘的降解效率，实验方案如下：
1、培养基：富集培养的无机盐培养基(MSM)组成：Na2HPO4 2g,KH2PO4 1g MgSO4·7H20 0.5g,(NH4)2SO4 0.1g,微量元素溶液5mL,H201000mL，pH7.2‐7.5，及0.01mg/L苯并芘；
2、上述培养基中，接种对苯并芘有降解作用的分支杆菌，对比加入0.1mmol/L大肠杆菌重组漆酶和未加入重组漆酶组对苯并芘的降解效果；
3、溶液中苯并芘提取与分析：将菌液转移至125ml分液漏斗中，向分液漏斗中加入菌液体积1/2的二氯甲烷，震荡后静置15min，将下层有机相转至干净三角瓶中。重复以上步骤一次，向三角瓶中加入5g无水硫酸钠，静置30min后取液体用气相色谱—质谱联用仪测定多环芳烃含量。
4、苯并芘GC－MS检测条件：苯并芘含量检测采用GC‐MS(ThermoFisher ITQ‐1100)检测，具体测定条件如下：色谱柱：DB‐5ms 30mB‐5ms mm‐5ms um；载气：高纯He(99.9999％)1.0ml/min；进样口温度：300℃，不分流进样；色谱升温程序：60℃→25℃/min→250℃(1min)→5℃/min→280℃(4min)→5℃/min→290℃(5min)；传输线温度：280℃；离子源温度：250℃；电子激发能量：70eV；扫描模式：选择离子扫描SIM。
4、检测结果：
与分支杆菌对苯并芘约60％的降解效率相比，四种插入非天然氨基酸的CueO突变体降解效率均高于80％，其中CueO‐K147‐HqAla的降解效率更是达到了99％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体，其特征在于，所述漆酶CueO的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；漆酶CueO突变体为漆酶CueO的第147位的赖氨酸或第355位的甲硫氨酸替换为非天然氨基酸形成；
所述非天然氨基酸为3-吡唑酪氨酸或8-羟基喹啉丙氨酸；
所述漆酶CueO突变体于大肠杆菌中表达。
2.一种表达如权利要求1所述的漆酶CueO突变体的方法，包括如下步骤：
1）根据漆酶CueO的氨基酸序列和蛋白空间结构，选择突变位点；
2）使用定点突变PCR技术，将选定的突变位点的密码子突变为终止密码子；
3）将突变的漆酶CueO基因序列构建到pET-28c表达载体上；
4）将漆酶CueO突变体表达载体与可特异性引入3-吡唑酪氨酸的辅助质粒pEVOL-tRNA-PyTyrRS或8-羟基喹啉丙氨酸的辅助质粒pEVOL-tRNA-HqAlaRS共同转化大肠杆菌BL21(DE3)，在培养基中添加IPTG、阿拉伯糖和非天然氨基酸进行漆酶CueO突变体的诱导表达；
5）将表达有目的蛋白的大肠杆菌收集后，超声破碎，并亲和纯化得到含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体；
其中，步骤1）中所述的突变位点为第147位的赖氨酸或第355位的甲硫氨酸。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸为3-吡唑酪氨酸或8-羟基喹啉丙氨酸。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述终止密码子为琥珀密码子TAG。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述突变的漆酶CueO基因序列由SEQ ID NO:2中第439~441位的AAA，第1063~1065位的ATG中的任意一个替换为TAG形成。
6.一种权利要求1所述的含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体于降解苯并芘的应用。
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