KR100419592B1

KR100419592B1 - 클루이베로마이세스 마르시아누스의 퀴논옥시도리덕테이즈 유전자 및 이로부터 발현되는 단백질

Info

Publication number: KR100419592B1
Application number: KR10-2001-0074837A
Authority: KR
Inventors: 한예선; 고훈영; 임혜원; 차주환; 김욱현; 백정호
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2001-11-29
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2004-02-19
Also published as: JP2003189889A; US20030175886A1; KR20030044179A; US6955904B2; JP3639576B2

Abstract

본 발명은 클루이베로마이세스 마르시아누스로부터 유래된 퀴논 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자 및 이로부터 발현되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 서열 1에 나타낸 염기 서열을 갖는 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈 유전자 및 이로부터 발현된 아미노산 서열을 갖는 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈에 관한 것이다.

본 발명의 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈는 우수한 퀴논 환원 활성을 갖기 때문에 퀴논 화합물의 환원 반응 및 생물학적으로 활성이 있는 화합물의 중간체 합성에 이용할 수 있다.

Description

클루이베로마이세스 마르시아누스의 퀴논 옥시도리덕테이즈 유전자 및 이로부터 발현되는 단백질 {Gene Coding for Quinone Oxidoreductase of Kluyveromyces Marxianus and Protein Expressed Therefrom}

본 발명은 클루이베로마이세스 마르시아누스로부터 유래된 퀴논 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자 및 이로부터 발현되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 본 발명은 서열 1에 나타낸 염기 서열을 갖는 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈 유전자 및 이로부터 발현된 아미노산 서열을 갖는 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈에 관한 것이다.

몇 가지의 환원 효소에 의한 퀴논 화합물의 환원 생성물은 반응성 산소 라디칼(reactive oxygen radical)을 생성하게 된다. 반응성 산소 라디칼들은 산화적 스트레스(oxidative stress), DNA와 멤브레인(membrane) 손상, 그리고 암 발생을 유발한다고 알려져 있다. 그러나 퀴논 옥시도리덕테이즈와 같은 환원 효소는 이러한 자유 라디칼의 형성을 막아준다 [참조: Anil K. Kaisuwal et al., Biochemical Pharmacology, 60 (2000), 207-214].

따라서, 본 발명의 목적은 미생물로부터 생산되는 퀴논 옥시도리덕테이즈의유전자 서열을 밝히고, 이를 숙주 세포에서 대량 발현시켜 퀴논 옥시도리덕테이즈를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에서 사용한 유전자 클로닝을 위한 계통도.

도 2는 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈(kmQOR)의 유전자 및 아미노산 서열.

도 3은 자외선 분광 광도계를 이용하여 활성을 측정한 스펙트럼.

도 4는 환원 효소의 정제를 확인하기 위한 SDS-폴리아크릴아미드 겔(12%) 전기영동 결과를 보여주는 사진.

도 5a는 클루이베로마이세스 마르시아누스에서 정제한 전체 RNA를 보여주는 사진.

도 5b는 cDNA를 중합 효소 연쇄 반응시켜서 얻은 결과를 보여주는 사진.

도 6은 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈의 대량발현을 위한 pQOR22b의 제조 계통도.

도 7a는 이. 콜라이에서 퀴논 옥시도리덕테이즈가 대량 발현되는지를 확인하기 위한 SDS-폴리아크릴아미드 겔(12%) 전기영동 결과의 사진.

도 7b는 이. 콜라이에서 대량 발현된 퀴논 옥시도리덕테이즈를 정제한 것을확인하기 위한 SDS-폴리아크릴아미드 겔(12%) 전기영동 결과의 사진.

도 8은 정제한 퀴논 옥시도리덕테이즈의 활성 측정 결과를 보여주는 그래프.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하고자 심도있게 연구한 결과, 클루이베로마이세스 마르시아누스에서 퀴논 옥시도리덕테이즈가 발현된다는 사실을 발견하여 클루이베로마이세스 마르시아누스로부터 퀴논 옥시도리덕테이즈를 분리 및 정제하여 그 유전자 서열을 분석함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 클루이베로마이세스 마르시아누스로부터 유래된 퀴논 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자 및 이로부터 발현되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자 및 이로부터 발현된 아미노산 서열을 갖는 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈에 관한 것이다.

이와 같이, 본 발명은 퀴논 옥시도리덕테이즈를 얻기 위한 것으로, 클루이베로마이세스 마르시아누스로부터 퀴논 옥시도리덕테이즈 유전자를 클로닝하여 그 염기서열을 결정한 후, 이로부터 단백질을 발현시켜 열안정성이 매우 우수한 퀴논 옥시도리덕테이즈를 얻기 위한 것이다.

퀴논 옥시도리덕테이즈를 생산하는 유전자를 얻기 위하여 도 1에 도시된 바와 같은 유전자 클로닝 계통도를 설계하였다.

먼저, 대웅제약에서 스크리닝한 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주를 배양한 후, 원심분리하여 수거하고, 수득한 세포를 파쇄시킨 후, 얻어진 세포 추출물을 원심분리하고, 얻어진 상층액을 크로마토그래피로 분리한 후, 각각의 용리액에 대하여 자외선 분광 광도계로 기질에 대한 활성을 측정한다. 활성을 보인 용액을 모아서 분리하고, 정제된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시켜 단백질 밴드를 확인한다.

확인된 단백질을 PVDF 멤브레인에 옮겨 아미노산 말단의 서열을 확인하고, 그 아미노산 서열로부터 cDNA 합성을 위한 5' 프라이머를 합성한다.

다음으로, 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주를 배양하여 원심 분리에 의해 수거하고, 전체 RNA를 추출한다. cDNA의 합성을 용이하게 하기 위하여 전체 RNA로부터 mRNA를 정제한 후, 정제한 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 상기 합성한 5' 프라이머를 사용하여 역전사 효소-중합연쇄반응을 실시한다. 합성된 cDNA에 대해 중합 효소 연쇄 반응을 수행하고, DNA 서열 분석을 위하여, 얻어진 합성물을 클로닝 벡터에 클로닝한다. 클론의 유전자 서열을 사슬 종결법으로 결정한 후, BLAST 프로그램(Basic Local Alignment Search Tool Program)을 이용하여 분석함으로써, 종래의 환원 효소와 서열 유사성을 보이는 퀴논 옥시도리덕테이즈를 확인할 수 있다 [Foster, C. E., Bianchet, M. A., Talalay, P., Zhao, Q., and Amzel, M. L., Biochemistry, 38 (1999), 9881-9886 참조].

퀴논 옥시도리덕테이즈를 생산하는 유전자를 얻기 위하여, 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주로부터 플라스미드 라이브러리를 다음과 같이 제조한다.

클루이베로마이세스 마르시아누스의 게놈 DNA를 정제하여 상이한 제한효소로 절단하여 써던 블롯팅(Southern Blot) 혼성화 분석을 실시하고, 대략적인 제한효소 지도를 작성한다. 이를 기초로 하여, 게놈 DNA를 적당한 크기로 절단하는 제한효소(EcoRI, XhoI)를 사용하여 플라스미드 라이브러리를 제조한다.

제조한 라이브러리는 동위원소(³²P)로 처리된 프로브(QORp)를 사용하여 콜로니 혼성화(colony hybridization)을 통한 스크리닝 (screening)을 실시한다. 양성 신호를 나타내는 클론에 대해 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법을 사용하여 유전자의 염기서열을 결정한다.

퀴논 옥시도리덕테이즈 단백질을 얻기 위해, 퀴논 옥시도리덕테이즈 유전자를 함유하는 클론을 2개의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응시킨 후 아가로스 겔 상에서 분리하여 1143개 염기의 유전자 절편을 수득하고, 이 절편을 제한효소 NdeI과 XhoI으로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pET 22b(Novagen, Inc.)에 결합시켜 플라스미드 pQOR22b를 제조한다.

상기 사용된 합성 올리고뉴클레오티드는 상기 사용한 제한효소의 절단 부위를 포함하며, 단백질 번역 개시 부위에 정확히 결합될 수 있도록 설계하고, 그 서열은 다음과 같다.

kmQOR-F : 5'-TCATTGTACATATGTCATCATTCCTATCAAAG-3'

kmQOR-R : 5'-GGTCTCGAGCCATTTCAACACAACCATATT-3'

상기 플라스미드 pQOR22b를 발현 숙주인 이. 콜라이 BL21 (DE3) (hsdSgal (λcⅠts857ind1sam7nin5lacUV5-T7 gene1)) (Novagen Inc., Madison, Wisconsin, USA로부터 상업적으로 입수함)에 형질전환시킨 후, 배지에 접종하여 성장시키고, IPTG(β-D-isopropyl-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 퀴논 옥시도리덕테이즈 단백질의 발현을 유도한다. 진탕배양한 후 세포를 원심 분리하여 파쇄시킨다. 얻어진 세포 추출물을 크로마토그래피 등으로 분리하여 전기영동시켜 단백질 밴드를 확인할 수 있다.

pQOR22b를 포함하는 이. 콜라이 균주(E.coli BL21(DE3)/pET 22b)는 2001년 11월 12일자로 한구 생명공학 연구원 유전자 은행(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁되었으며, 기탁 기관에 의해 부여된 수탁 번호는 KCTC 10114BP이었다.

퀴논 옥시도리덕테이즈의 활성 측정은 자외선 분광 광도계(UV-1601PC, SHIMADZU)를 이용하여 측정한다. 활성 측정은 1,4-벤조퀴논의 농도를 변화시키면서 340 nm의 파장에서 NADPH(ε_340nm=6.23mM^-1)의 산화에 의한 흡광도의 변화를 측정하여 수행한다. 정확한 결과를 얻기 위하여, 실험을 다수회 실시한 후 그 평균값을 계산하여 반응 속도 상수를 구할 수 있다. 하기 실시예에 상세하게 기재된 바와 같이, 본 발명의 클루이베로마이세스 마르시아누스는 매우 우수한 퀴논 화합물 환원 활성을 갖는다는 것을 알 수 있다.

<실시예 1> 클루이베로마이세스 마르시아누스로부터 환원 효소의 분리 정제

대웅제약에서 스크리닝한 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주를 30℃에서72시간동안 8ℓ의 YM 배지에서 O.D₆₀₀이 7.0이 될 때까지 배양하였다. 배양한 세포를 3,000g에서 10분 동안 원심분리하여 수거하였다. 얻어진 세포를 희석액(50mM Na Phosphate, pH 6.5, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, PMSF) 200㎖에 용해시킨 후, 프렌치 프레스(French Press) 셀을 압력 11,000바에서 작동시켜 세포를 파쇄시킨 후, 초음파 발생기(Branson sonifier, Model 450)를 5분씩 5회 작동시켜 추가로 파쇄시켰다. 이 때 얻어진 세포 추출물을 25,000g에서 30분간 원심분리하고, 얻어진 상층액을 양이온 교환 크로마토그래피 (S 세파로스, Pharmacia)로 분리한 후, 각각의 용리액에 대하여 자외선 분광 광도계(UV-1601PC, SHIMADZU)로 기질에 대한 활성을 측정하였다(도 3 참조).

활성을 보인 용액을 모아서 황산암모늄(Ammonium Sulfate, AMS)의 농도가 1.2M이 되도록 황산 암모늄을 첨가한 다음 페닐 세파로스로 분리하였다. 활성을 보인 용리액은 친화성(affinity) 컬럼인 하이트랩-블루(HiTrap-Blue) 세파로스 크로마토그래피를 실시하여 분리하였고 겔 여과 크로마토그래피(슈퍼덱스-75, Pharmacia)를 이용하여 최종적으로 분리하였다. 정제된 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시켰을 때 분자량이 약 42kDa에 해당하는 단백질 밴드가 확인되었다(도 4 참조).

도 4에서, 레인 1은 세포 파쇄 상층액, 레인 2는 S 세파로스 크로마토그래피 분리물, 레인 3은 페닐 세파로스 크로마토그래피 분리물, 레인 4는 하이트랩 블루 크로마토그패리 분리물, 레인 5는 수퍼덱스 75 크로마토그래피 분리물, M은 표준분자량 마커를 나타낸다.

상기 확인된 단백질을 PVDF 멤브레인에 옮겨 아미노산 말단의 서열을 확인하였고, 그 아미노산 서열로부터 cDNA 합성을 위한 5' 프라이머를 합성하였다.

프라이머 1 : 5'-ATGTCYTCNTTNCTNTCNAANAG-3'

프라이머 2 : 5'-ATGTCYTCYTTDCTDTCYAAYAG-3'

<실시예 2> 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈의 cDNA 합성 및 DNA 서열 분석

클루이베로마이세스 마르시아누스 균주를 30℃에서 72시간 동안 100ml YM 배지에서 배양하였다. 배양한 균주를 3,000g에서 원심 분리하여 수거하였다. TRIZOL(GIBCO BRL, Life Technologies) 용액을 사용하여 균주로부터 전체 RNA를 추출하였다(도 5a 참조). 도 5a는 클루이베로마이시스 마르시아누스에서 추출한 전체 RNA를 1.2% 포름 알데히드 아가로스 겔에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진으로, 레인 1과 2는 클루이베로마이시스 마르시아누스의 전체 RNA를 나타낸다.

cDNA의 합성을 용이하게 하기 위하여 전체 RNA로부터 mRNA를 정제하였다. 정제한 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 실시예 1에서 합성한 프라이머를 사용하여 역전사효소-중합 연쇄 반응(RT-PCR, 30℃ 10분, 42℃ 30분, 96℃ 5분, 1싸이클)을 실시하였다. 합성된 cDNA는 중합 효소 연쇄 반응(프라이머 1, 2, M13 프라이머 M4 (5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'), 94℃ 30초, 48℃ 30초, 72℃ 30초, 5싸이클, 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 30초, 30싸이클)을 수행하였다 (도 5b 참조). 도 5b에서, M은 HaeIII 마커, 레인 1은 프라이머 1과 M13 프라이머 M4의 반응 생성물을 나타낸다.

DNA 서열 분석을 위하여, 얻어진 합성물을 TA 클로닝 벡터에 클로닝하였다. 약 18개 클론의 유전자 서열을 사슬 종결법으로 결정한 후, BLAST 프로그램(Basic Local Alignment Search Tool Program)을 이용하여 분석한 결과, 종래의 환원 효소와 서열 유사성을 보이는 퀴논 옥시도리덕테이즈가 확인되었다 [Foster, C. E., Bianchet, M. A., Talalay, P., Zhao, Q., and Amzel, M. L., Biochemistry, 38 (1999), 9881-9886 참조].

퀴논 옥시도리덕테이즈와 유사성을 보이는 클론은 약 640bp의 크기이며 전체 유전자 서열을 찾기 위한 프로브(probe, 이하 QORp라 명명함)로서 사용되었다.

<실시예 3> 퀴논 옥시도리덕테이즈 유전자의 클로닝

퀴논 옥시도리덕테이즈를 생산하는 유전자를 얻기 위하여 도 1에 도시된 바와 같은 유전자 클로닝 계통도를 설계하였다. 먼저 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주로부터 플라스미드 라이브러리를 다음과 같이 제조하였다.

클루이베로마이세스 마르시아누스의 게놈 DNA를 정제하여 약 10가지의 제한효소로 자른 다음 써던 블롯팅(Southern Blot) 혼성화 분석을 실시하였다. 써던 블롯팅을 기초로 하여 대략적인 제한효소 지도를 만들었다. 게놈 DNA를 적당한 크기로 절단하는 제한효소(EcoRI, XhoI)를 사용하여 플라스미드 라이브러리를 제조하였다.

제조한 라이브러리는 콜로니 혼성화(colony hybridization)을 통한 스크리닝(screening)을 실시하였다. 스크리닝은 동위원소(³²P)로 처리된 프로브(QORp)를 사용하여 실시하였다. 1차 스크리닝에서는 4개의 양성 신호를 얻었고 2차에서는 20여 개의 강한 양성 신호를 얻었다. 양성 신호를 나타내는 클론 20개중 10개를 선택하여 써던 블롯팅을 실시한 결과, 목적 유전자가 존재하는 것을 다시 확인할 수 있었다. 이 중 1개의 클론을 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법을 이용하여 유전자의 염기서열을 결정하였다 (도 2 참조).

<실시예 4> 퀴논 옥시도리덕테이즈(kmQOR)의 발현 및 분리 정제

퀴논 옥시도리덕테이즈 단백질을 얻기 위해 제한 효소 지도 및 염기 서열을 검토한 후, 현재 단백질 발현 장치가 가장 잘 확립되어 있는 이. 콜라이에서 발현시켰다. 우선 C 말단에 6개의 히스티딘(Histidine) 아미노산 잔기를 붙일 수 있는 발현 벡터인 pET 22b(Novagen, Inc.)를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단하여 선형화시켰다. 퀴논 옥시도리덕테이즈 유전자를 함유하는 클론을 2개의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응시킨 후 아가로스 겔 상에서 분리하여 1143개 염기의 유전자 절편을 수득하였다. 이 절편을 제한효소 NdeI과 XhoI으로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pET 22b에 결합시켜 플라스미드 pQOR22b를 제조하였다.

상기 사용된 합성 올리고뉴클레오티드는 상기 사용한 제한효소의 절단 부위를 포함하며, 단백질 번역 개시 부위에 정확히 결합될 수 있도록 설계되었으며, 그 서열은 다음과 같다.

kmQOR-F : 5'-TCATTGTACATATGTCATCATTCCTATCAAAG-3'

kmQOR-R : 5'-GGTCTCGAGCCATTTCAACACAACCATATT-3'

상기 플라스미드 pQOR22b를 발현 숙주인 이. 콜라이 BL21 (DE3) (hsdSgal (λcⅠts857ind1sam7nin5lacUV5-T7 gene1)) (Novagen Inc., Madison, Wisconsin, USA로부터 상업적으로 입수함) 내로 형질전환시켰다(도 6 참조).

상기 퀴논 옥시도리덕테이즈 유전자로 형질전환된 이. 콜라이 BL21 (DE3)을 앰피실린 (Ampicillin, 100㎍/㎕)이 첨가된 1 리터 LB 배지에 접종하고 37℃에서 OD₆₀₀가 0.6이 되도록 성장시킨 후 IPTG(β-D-isopropyl-D-thiogalactopyranoside)를 최종 농도 500μM이 되도록 첨가하여 퀴논 옥시도리덕테이즈 단백질의 발현을 유도하였다. 이후 4시간 동안 진탕배양한 후 세포를 3000 g에서 10분 동안 원심 분리하여 수거하였다. 얻어진 세포를 희석용액 (20mM Tris-HCl pH7.9, 500mM NaCl, 5mM imidazole, 1mM PMSF) 25㎖에 녹인 후 초음파발생기를 5분씩 3회 작동시켜 파쇄시켰다. 이 때 얻어진 세포 추출물을 25,000g에서 30분 동안 원심분리하고 얻어진 상층액을 하이트랩 킬레이팅 (HiTrap Chelating, Pharmacia) 컬럼을 이용하여 분리한 후, 겔 여과 크로마토그래피(슈퍼덱스 75, Phamacia)를 이용하여 최종 분리하였다. 정제된 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동시킨 결과, 분자량이 약 42kDa에 해당되는 하나의 단백질 밴드가 확인되었다 (도 7a 및 7b 참조).

도 7a에서, 레인 1은 IPTG 첨가전, 레인 2는 IPTG 첨가 후 4시간 배양시, 레인 3은 IPTG 첨가 후 4시간 배양한 세포 파쇄 상층액, 레인 4는 IPTG 첨가 후 4시간 배양한 세포 파쇄 침전물, M은 표준 분자량 마커를 나타낸다.

도 7b에서, M은 표준 분자량 마커, 레인 1은 세포 파쇄 상층액, 2는 하이드랩 킬레이팅 분리물, 3은 수퍼덱스 75 분리물을 나타낸다.

<실시예 5> 퀴논 옥시도리덕테이즈의 활성 측정

퀴논 옥시도리덕테이즈의 활성 측정은 자외선 분광 광도계(UV-1601PC, SHIMADZU)를 이용하여 측정하였다. 활성 측정 용액은 2μＭ 퀴논 옥시도리덕테이즈, 50mM Na 포스페이트 pH 6.5 완충 용액 및 1,4-벤조퀴논 (전체부피 1 ml)으로 구성되어 있으며, 환원 반응은 25℃에서 용액에 200 μＭ NADPH를 가한 즉시 시작되었다. 활성 측정은 1,4-벤조퀴논의 농도를 10 μＭ에서 200 μＭ까지 변화시키면서 340 nm의 파장에서 NADPH(ε_340nm=6.23mM^-1)의 산화에 의한 흡광도의 변화를 측정하여 수행하였다. 정확한 결과를 얻기 위하여, 실험을 3회씩 실시하였고 그 평균값을 계산하여 반응 속도 상수를 구하였다. 1,4-벤조퀴논에 대한 퀴논 옥시도리덕테이즈의 반응 속도 상수는 Km=1.8mM , kcat=9.5×10⁵m^-1이며 kcat/Km은 5.3×10⁷M^-1m^-1이었다 (도 8 참조).

다른 퀴논 옥시도리덕테이즈의 반응에 대한 예를 들면 다음과 같다. 파네로캐테 크리소스포륨 (Phanerochaete chrysosporium)의 퀴논 옥시도리덕테이즈 경우 1,4-벤조퀴논에 대한 환원 반응은 17.1 nmol˙m^-1이다 [Brock, B. J., and Gold, M. H., Arch. Biochem. Biophys. 331 (1996), 31-40 참조]. 인간의 퀴논 옥시도리덕테이즈 경우 α-토코페롤퀴논에 대한 반응 속도 상수kcat/Km은 1.5 x 10⁷M^-1m^-1이다 [Siegel, D., Bolton, E. M., Burr, J. A. Leibler, D. C., and Ross, D. Mol. Pharmacol. 37 (1997) 300-305 참조]. 또한, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)의 경우 기질인 두로퀴논(duroquinone)에 대한 반응 속도 상수는 3.2 x 10⁷M^-1m^-1이다 [Sparla, F., Tedeschi, G., Pupillo, P., Trost, P. FEBS Letters 463 (1999) 382-386 참조].

Claims

서열 2에 기재된 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈 (kmQOR) 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
서열 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 분자량이 42 kDa인 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈(kmQOR).
제1항 기재의 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제3항에 있어서, 재조합 벡터가 플라스미드 pQOR22b인 벡터.
제3항 기재의 재조합 벡터로 형질전환된 이. 콜라이.
제5항에 있어서, 수탁 번호 KCTC 10114BP의 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)/pET 22b인 이. 콜라이.
제5항 기재의 이. 콜라이를 배양하는 단계,

IPTG를 첨가하여 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈의발현을 유도하는 단계,

상기 발현된 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈를 회수하여 정제하는 단계

를 포함하는, 클루이베로마이세스 마르시아누스 퀴논 옥시도리덕테이즈의 제조 방법.
서열 3 또는 서열 4의 염기 서열을 갖는 프라이머.