CN110527655B - 一种鸭源大肠杆菌益生菌菌株及其筛选制备方法与用途 - Google Patents

一种鸭源大肠杆菌益生菌菌株及其筛选制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种鸭源大肠杆菌益生菌菌株，保藏号为GDMCC NO：60693。本发明还提供了该菌株的筛选制备方法，包括(1)鸭源大肠杆菌的分离：(2)药敏感性的筛选；(3)耐酸性筛选；(4)胆盐耐受筛选；(5)胆汁耐受筛选；(6)安全性筛选；(7)改造筛选出来的菌株基因组。本发明还公开了该菌株的用途，能够应用于制备预防和控制鸭源大肠杆菌感染、沙门氏菌感染的药物。本发明的优点在于，能够提高鸭机体抗体水平，综合评估其安全性高，是在预防和控制鸭重要细菌性肠道感染疾病领域中的一种新药，为该领域的发展提出了新的研究方向，也为该领域的发展奠定了十分积极、价值极高的基础。

Description

一种鸭源大肠杆菌益生菌菌株及其筛选制备方法与用途
技术领域
本发明属于菌株筛选重组的技术领域，具体为一种鸭源大肠杆菌益生菌菌株及其筛选制备方法与用途。
背景技术
禽病原性大肠杆菌血清型众多，抗原结构复杂，选择优势血清型菌株制成疫苗控制禽源大肠杆菌病，常因大肠杆菌血清型众多，不能得到推广使用，而且菌苗还可能由于内毒素引起不良反应。国内外目前仍未出现血清交叉保护效率性好，保护效率高，广谱的疫苗产品出现。在生产条件较好的厂区，会结合综合生产管理进行细菌性病原菌感染的防控，减少大肠杆菌病发生和致病性大肠杆菌的带菌污染，但国内家禽生产中大肠杆菌病的防治仍主要靠抗生素的大量使用，这种状态导致一系列严重后果，如大量耐药菌株的出现等。沙门氏菌污染对生产效益，以及食品安全同样有很大的影响。随着人民生活质量提高，国际家禽生产要求提高，地球环境压力的大前提下，减抗无抗(抗生素)生产要求越来越高，越来越紧迫，对家禽如鸭生产中，致病性大肠杆菌、沙门氏菌等极大影响生产的细菌性病原菌的感染迫切需要寻求抗生素防控之外的解决措施。
大肠杆菌作为人及动物肠道正常菌群的重要成员，近年来在疫苗载体的研究中日益受到重视，尤其是在研制基因工程黏膜疫苗方面显现出独特的优越性，如对肠道组织和细胞的生态小境亲嗜性，存活和增殖能力强，适于口服免疫接种，特别是超前口服免疫，能将展呈外源抗原表位和粘附素的载体菌有效地定植在机体内肠道黏膜表面，抢先占居病原菌定居和复制的靶位，并尽可能早地刺激肠道黏膜产生基础免疫。所以，研制出一种新颖性、高效、安全的新型口服用优势益生菌重组载体菌产品研发和市场应用有极强的国际竟争力。
发明内容
为了解决现有技术中仍然大量使用抗生素控制禽源大肠杆菌病、沙门氏菌等疾病的缺陷，本发明提供了一种鸭源大肠杆菌益生菌菌株及其筛选制备方法与用途，实现的目的为，可以减少抗生素药物的使用，避免细菌耐药菌株的产生，减少药物残留，保证畜产品安全，促进人类的健康具有重要的意义。
为了实现上述目的，本发明提供的一种鸭源大肠杆菌益生菌菌株，所述菌株的染色体基因组缺失asd基因，所述缺失的asd基因序列如SEQUENCE NO.1所示，外源转入重组质粒pYA-fimA，该菌株的保藏号为GDMCC NO：60693, 分类名称为：Escherichia coli，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期：2019年6月13日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59 号楼5楼。
本发明还提供了所述鸭源大肠杆菌益生菌菌株的筛选制备方法，包括如下步骤：
(1)鸭源大肠杆菌的分离：无菌采集鸭新鲜粪便/肛拭子样本后，24 小时内划线麦康凯平板，经培养形态辨别和生理生化指标确认，分离得到大肠杆菌；
(2)将步骤(1)分离得到的大肠杆菌采用纸片扩散法进行药敏感性的筛选：所采用的药敏片为：
四环素含量为30μg的药敏片，氨苄青霉素含量为10μg的药敏片，头孢他啶含量为30μg的药敏片，链霉素含量为10μg的药敏片，甲氧氨苄嘧啶含量为25μg的药敏片，头孢唑林含量为30μg的药敏片，壮观霉素含量为 100μg的药敏片，强力霉素/多西环素含量为30μg的药敏片，恩氟沙星含量为5μg的药敏片，多粘菌素B含量为300μg的药敏片，环丙沙星含量为5μg 的药敏片，头孢曲松含量为30μg的药敏片，阿米卡星/丁胺卡那霉素含量为30μg的药敏片，氨曲南含量为30μg的药敏片，卡那霉素含量为30μg 的药敏片，诺氟沙星含量为10μg的药敏片，头孢噻污含量为30μg的药敏片，氟苯尼考含量为30μg的药敏片，庆大霉素含量为10μg的药敏片；
将经步骤(1)分离出的各株大肠杆菌接种于上述含药敏片的培养基上，筛选出5株对药敏片敏感的大肠杆菌分离株，为了区分，将它们记为YZ，GY，GY-1，DY，CZ；
(3)将经步骤(2)筛选出的菌株进行耐酸性筛选：将LB培养液pH分别调至3.0、4.0、5.0，然后将过夜培养后的YZ，GY，GY-1，DY，CZ菌株分别接种于上述不同pH的培养液中，得到处理组的每个处理，以pH为7的 LB培养液为对照，处理完毕后，每个处理组和对照组的菌液10倍稀释，分别取处理组和对照组稀释后的菌液涂布于LB固体培养基，37℃过夜培养后分别得到每个处理组和对照组的活菌菌落数，采用处理前后活菌的菌落数分别计算出处理组和对照组中各个菌株的存活率，最终筛选出耐酸性的菌株为 YZ、GY-1和CZ；
(4)将经步骤(3)筛选出的菌株进行胆盐耐受筛选：将步骤(3)筛选出的YZ、GY-1和CZ菌株经LB复苏后，接入肠道菌增菌肉汤培养基，增菌后再接入紫红胆盐葡萄糖琼脂上培养，根据肠道菌增菌肉汤培养基的变色情况和紫红色胆汁葡萄糖琼脂上菌落的生长情况判断出YZ、GY-1和CZ菌株均具有胆盐耐受力；
(5)将经步骤(3)筛选出的菌株进行胆盐耐受筛选后再进行胆汁耐受筛选：分别在接有YZ、GY-1和CZ菌株的LB培养液中加入不同浓度的胆汁，设为处理组，以不加胆汁的接有YZ、GY-1和CZ菌株的LB培养液为对照，处理完毕后，分别将每个处理组和对照组的菌液涂布于LB固体培养基培养，采用处理前和处理后的活菌菌落数分别计算出对照组和处理组各个菌株的存活率，根据存活率结果判定YZ、GY-1和CZ菌株均具有胆汁耐受力；
(6)将经步骤(3)筛选出的菌株进行耐胆盐、耐胆汁的筛选后，进行安全性筛选：
(61)对YZ、GY-1和CZ菌株中毒力基因进行PCR检测：所述毒力基因为fimA、fimC、tsh、iucA、iucD、iutA、fyuA、irp2、colV；
(62)对YZ、GY-1和CZ菌株进行饮水安全性检测；
(7)改造筛选出来的菌株基因组：综合步骤(1)-(6)筛选结果，最终筛选出所述鸭源大肠杆菌益生菌菌株为CZ菌株，对CZ菌株的基因进行改造：
(71)采用同源重组系统缺失修饰CZ菌株基因组asd基因；
(72)插入重组质粒pYA-fimA。
本发明在进行菌株筛选时，综合了耐酸、耐胆碱、耐胆盐、毒力基因及饮水安全性的检测，使得到的益生菌菌株安全性高，为后续商品化利用提供的良好的基础。
进一步的，所述步骤(2)中进行药敏感性筛选时，首先将步骤(1)得到的大肠杆菌菌株经LB复苏后，分别将大肠杆菌菌株溶于生理盐水中制成细菌混悬液，所述细菌混悬液的浓度为0.5个麦氏标准，再用灭菌细菌涂布棒将得到的细菌混悬液分别均匀致密涂布于LB培养基表面；
然后在培养基表面上布置药敏片，筛选出5株对药敏片敏感的大肠杆菌分离株。
进一步的，所述步骤(3)的具体操作步骤为：将LB培养液用1mol/L 的HCl和1mol/L的NaOH将pH分别调至3.0、4.0、5.0，然后将过夜培养后的YZ，GY，GY-1，DY，CZ株按1％的接种量分别接种于不同pH的培养液中， 37℃处理3h，以pH为7的LB培养液为对照，处理完毕后，每个处理组和对照组的菌液10倍稀释，分别取处理组和对照组菌液100μL涂布于LB固体培养基，37℃过夜培养后计数对照组和处理组各个菌株的活菌菌落数，采用处理前后活菌菌落数的平均计数结果计算对照组和处理组中各个菌株的存活率，存活率的计算采用下述公式计算：
存活率(％)＝(不同pH的菌液平均活菌菌落数/对照组菌液平均活菌菌落数)×100。
所述步骤(4)中接入肠道菌增菌肉汤培养基增菌培养的温度为30-35℃，增菌培养时间为24-48h，然后在紫红胆盐葡萄糖琼脂上培养的温度为 30-35℃，培养时间为18-24h。
进一步的，所述步骤(4)中所使用的肠道菌增菌肉汤培养基由如下方法制得：
所述肠道菌增菌肉汤培养基成分包括：
Figure RE-GDA0002241297330000041
Figure RE-GDA0002241297330000051
将上述成分组成的肠道菌增菌肉汤培养基在25℃下调节pH为 7.2±0.2，加热到100℃，30分钟时立即冷却，即可得到肠道菌增菌肉汤培养基；
所使用的紫红色胆汁葡萄糖琼脂由如下方法制得：
所述紫红色胆汁葡萄糖琼脂包括如下成分：
Figure RE-GDA0002241297330000052
将上述成分组成的紫红色胆汁葡萄糖琼脂在25℃下调节pH为 7.4±0.2，后在常压条件下加热至沸腾即可。
进一步的，所述步骤(5)的操作步骤包括：分别在LB培养液中加入 0.1％、0.2％、0.3％(v/v)浓度的胆汁进行大肠杆菌分离株的耐胆汁试验，在37℃条件下培养2-3h，以不加胆汁的接有YZ、GY-1和CZ菌株的LB培养液为对照，处理完毕后，每个处理组和对照组的菌液10倍稀释，分别取处理组和对照组稀释后的菌液100μL涂布于LB固体培养基，37℃过夜培养后计数活菌菌落数，采用不同胆汁浓度下YZ、GY-1和CZ菌液平均活菌数和对照组菌液平均活菌数计算各个菌株和对照的存活率，存活率采用如下公式计算：
存活率(％)＝(不同胆汁浓度的菌液平均活菌菌落数/不加胆汁的菌液平均活菌菌落数)X100。
进一步的，所述步骤(61)中具体操作步骤包括：
以大肠杆菌分离株YZ、GY-1和CZ株基因组为模板；PCR扩增各毒力因子基因；所获PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪观察和分析结果；
以下为PCR检测各毒力因子所采用的上游引物、下游引物、扩增的特异性片段大小、以及退火温度：
fimA的上游引物如SEQUENCE NO.2所示，下游引物如SEQUENCE NO.3 所示，扩增的特异性片段大小为449bp，退火温度为54℃；
fimC的上游引物如SEQUENCE NO.4所示，下游引物如SEQUENCE NO.5 所示，扩增的特异性片段大小为337bp，退火温度为52℃；
tsh的上游引物如SEQUENCE NO.6所示，下游引物如SEQUENCE NO.7所示，扩增的特异性片段大小为381bp，退火温度为53℃；
iucA的上游引物如SEQUENCE NO.8所示，下游引物如SEQUENCE NO.9 所示，扩增的特异性片段大小为737bp，退火温度为56℃；
iucD的上游引物如SEQUENCE NO.10所示，下游引物如SEQUENCE NO.11 所示，扩增的特异性片段大小为127bp，退火温度为50℃；
iutA的上游引物如SEQUENCE NO.12所示，下游引物如SEQUENCE NO.13 所示，扩增的特异性片段大小为254bp，退火温度为55℃；
fyuA的上游引物如SEQUENCE NO.14所示，下游引物如SEQUENCE NO.15 所示，扩增的特异性片段大小为1443bp，退火温度为56℃；
irp2的上游引物如SEQUENCE NO.16所示，下游引物如SEQUENCE NO.17 所示，扩增的特异性片段大小为287bp，退火温度为59℃；
colV的上游引物如SEQUENCE NO.18所示，下游引物如SEQUENCE NO.19 所示，扩增的特异性片段大小为307bp，退火温度为46℃；
根据PCR检测结果判定出CZ菌株所含毒力因子最少。
所述步骤(71)具体操作方法为：
(711)质粒PKD46转化CZ株，获得CZ(PKD46)株：
取Red重组系统的质粒pKD46与200μL CZ株感受态混合，经化学Cacl2 法转化后获得CZ(PKD46)株；
(712)CZ(PKD46)株Red重组蛋白的诱导和感受态制备：
将CZ(PKD46)株挑取单个菌落接种于5mL新鲜含有浓度为150ng/mL 氨苄青霉素LB培养基中，30℃振荡培养过夜，次日按1:50接种于50mL LB 培养基，30℃培养至OD600达到0.2-0.3时，加入L-阿拉伯糖至30mmol/L，诱导1h，冰上预冷10min，4000rpm，4℃离心10min，弃培养基，用预冷的 10％甘油离心洗涤3次，浓缩100倍制成500μL的感受态细胞，40μL分装/ 管，存放于-70℃冰箱待用；
(713)CZ△asd：：cat获得：
以质粒pKD3做为DNA模版，P1、P2为引物，P1、P2的基因序列分别由 SEQUENCENO.20、SEQUENCE NO.21所示，按长引物条件进行PCR扩增，扩增出两端与asd基因上下游序列同源，中间为氯霉素抗性基因的DNA片段；
取100ng左右经纯化的PCR产物，与40μL的CZ(PKD46)株感受态细胞混合，电转化后涂布氯霉素和氨苄青霉素的LB平板，30℃条件培养过夜，所述LB平板中氯霉素浓度为34ng/ml，氨苄青霉素的浓度为150ng/mL；
所述涂布后LB平板上生长菌落，每个单菌落接种LB培养液，42℃培养 2h后(高温培养条件丢失抗性质粒PKD46，去除抗性选择标记)，在37℃条件培养过夜，分别取菌液划线氯霉素和氨苄青霉素的LB平板，筛选氨苄青霉素敏感而对氯霉素具有抗性的克隆，获得CZ△asd：：cat株；
(714)CZ△asd的获得：
质粒pCP20(编码FLP位点专一性重组酶)电转化CZ△asd：：cat感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素和氯霉素双抗性LB平板上，30℃培养获得阳性菌落，然后将获得的阳性菌落转接无抗性的LB中，42℃培养(高温培养条件丢失抗性质粒pCP20，去除抗性选择标记)，继而获得37℃条件下对两种抗生素均敏感的菌落，该菌株命名为CZ△asd；
所述(72)具体操作步骤为：
将鸭源沙门氏菌I型菌毛主要亚单位蛋白编码基因fimA序列插入含asd 基因的表达质粒载体pYA3493中，重组质粒系统中共表达fimA基因和asd 基因，Cacl2法将所述重组质粒转化入CZ△asd菌株,获得CZ-5株，经验证所述CZ-5菌株基因组缺失asd基因，同时含有pYA-fimA质粒。
以上所述本发明所述鸭源大肠杆菌益生菌菌株的筛选制备方法各个步骤中具体所使用的试剂、培养温度、培养时间、所采用的毒力基因检测引物、 PCR程序条件等等操作都是为了最大程度消除干扰，保证筛选结果的准确。
本发明还发现了上述鸭源大肠杆菌益生菌菌株的用途，将该菌株应用于制备预防和控制鸭类大肠杆菌感染、沙门氏菌感染的药物。
优选的，所述药物的类型为疫苗或免疫佐剂。本发明发现包含所述菌株的药物，经口服途径给喂鸭群，能诱导机体产生抗沙门氏菌菌毛主要亚单位蛋白FIMA抗体，提高血清中IgG和IgA抗体水平，能有效保护鸭群半数致死量致病性大肠杆菌和致病性沙门氏菌感染。
本发明采用上述技术方案，有益效果包括：本发明发现的这种鸭源大肠杆菌益生菌菌株，能够提高机体抗体水平，综合评估其安全性高，能够用于制备预防和控制鸭类大肠杆菌感染、沙门氏菌感染的药物，由此也降低了鸭群的死淘率，是在预防和控制鸭类肠道感染疾病领域中的一种新药，为该领域的发展提出了新的研究方向，也为该领域的发展奠定了十分积极、价值极高的基础。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作出进一步的说明。本发明中没有特殊说明的操作方法都是现有技术，没有特殊说明的操作条件也都是常温常压下，试剂均为市售自购。
实施例一：本发明提供的一种鸭源大肠杆菌益生菌菌株，所述菌株的染色体基因组缺失asd基因，所述缺失的asd基因序列如SEQUENCE NO.1所示，外源转入重组质粒pYA-fimA，该菌株的保藏号为GDMCC NO：60693。
本发明还提供了该菌株筛选制备的方法，包括如下步骤：
1、候选鸭源大肠杆菌益生株筛选
粪便/肛拭子采集
江苏省周边地区规模鸭养殖场粪便/肛拭子采集，10个养殖场，每个养殖场采集样本数30个，共300份粪便/肛拭子。
分离与培养
无菌采集新鲜粪便/肛拭子样本，采集后，24小时内划线麦康凯平板，共计分离到大肠杆菌菌株258株(培养形态学和生理生化试验确认)
2、体外药物敏感性评估(纸片扩散法)
上述258株分离株LB复苏后，挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液(0.5个麦氏标准)，用灭菌细菌涂布棒将待检细菌混悬液均匀致密涂布于LB培养基表面。
将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面，并用镊子轻按几下药敏片，在平皿中央贴一片，外周可等距离贴七片。
本项目所选择的药敏片如下：
TE30(四环素30μg)，AMP10(氨苄青霉素10μg)，CAZ30(头孢他啶30 μg)，S10(链霉素10μg)，SXT25(甲氧氨苄嘧啶25μg)，KZ30(头孢唑林 30μg)，SH100(壮观霉素100μg)，DO30(强力霉素/多西环素30μg)，ENR5 (恩氟沙星5μg)，PB300(多粘菌素B 300μg)，CIP5(环丙沙星5μg)，CRO30 (头孢曲松30μg)，AK30(阿米卡星/丁胺卡那霉素30μg)，ATM30(氨曲南 30μg)，K30(卡那霉素30μg)，NOR10(诺氟沙星10μg)，CTX30(头孢噻污 30μg)，FFC30(氟苯尼考30μg)，CN10(庆大霉素10μg)
结果，5株大肠杆菌分离株对上述19种药物有不同程度的敏感，上述5 株大肠杆菌分离株，分别命名为YZ，GY，GY-1，DY，CZ。
3、耐酸性试验
上述5株大肠杆菌分离株，将配制好的LB培养液用1mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH将pH分别调至3.0、4.0、5.0，然后将过夜培养后的YZ，GY， GY-1，DY，CZ株按1％的接种量分别接种于不同pH的培养基中，37℃分别处理3h，每个处理设3个重复，以对照组LB培养液(pH＝7.0)为对照。处理完毕后，每个处理组和对照组的菌液10倍稀释至合适的稀释度，取3个合适稀释度菌液100μL分别涂布于LB固体培养基，37℃过夜培养后计数平皿的菌落数，记录结果，每个处理计算平均菌落数。通过处理前后活菌数的平均计数结果计算大肠杆菌分离株的存活率。这里合适的稀释度的标准，是“取3个合适稀释度菌液100μL分别涂布于LB固体培养基，37℃过夜培养后计数平皿的菌落数，记录结果”，这个数据结果在20-300范围之间，保证平板上细菌过夜培养后，分散，均匀分布于平板，保证计数结果的准确性。
存活率(％)＝(不同pH的菌液平均活菌数/对照组菌液平均活菌数)×100 结果：上述5株大肠杆菌在pH为3.0、4.0、5.0的条件下均能生长，但不同的生长环境表现出不一样的耐受程度。随着pH的降低，菌株的存活率都在下降。GY，DY株的耐酸能力较弱，YZ、GY-1和CZ的生长情况大致相同，表现为较强的耐酸能力，其中CZ株耐酸能力最强，培养基pH为3.0、4.0、5.0的存活率分别为79.8％、82.2％、94.5％。表1为各株大肠杆菌分离株的耐酸水平。
表1大肠杆菌分离株耐酸水平
YZ GY GY-1 DY CZ
pH 3.0 66.11％ 48.45％ 71.45％ 41.45％ 79.8％
pH 4.0 84.33％ 52.69％ 80.35％ 64.96％ 82.2％
pH 5.0 89.74％ 63.94％ 93.76％ 65.47％ 94.5％
4、胆盐耐受试验
肠道菌增菌肉汤培养基、紫红色胆汁葡萄糖琼脂购自于美国BD Difco 公司。
经药敏评估后无耐药性且耐酸能力较强的大肠杆菌分离YZ、GY-1和CZ 株，进行以下试验：
上述3个菌株，普通LB复苏后，接入肠道菌增菌肉汤培养基，30-35℃培养24-48h增菌，然后取增菌后的菌株接入紫红胆盐葡萄糖琼脂上30-35℃培养18-24h。
结果：YZ、GY-1和CZ株在肠道菌增菌肉汤培养基，培养液由绿色变为黄色，在紫红色胆汁葡萄糖琼脂上长成紫红色菌落，说明上述大肠杆菌分离株能在含胆盐培养基中生存，有胆盐耐受力。
本发明在具体使用肠道菌增菌肉汤培养基、紫罗兰红胆汁葡萄糖琼脂时，为了能够清楚干扰，适用于本发明的菌株，从而得到更为准确的结果，所述的两种培养基由下述制备方法制得：
肠道菌增菌肉汤培养基成分包括：
Figure RE-GDA0002241297330000111
调节pH值，使加热后在25℃下pH为7.2±0.2，加热到100℃30分钟并立即冷却。
紫罗兰红胆汁葡萄糖琼脂成分包括：
Figure RE-GDA0002241297330000112
调节pH值使加热后在25℃下pH为7.4±0.2。加热至沸腾，不要在高压锅中加热。
5、耐胆汁试验
为分析大肠杆菌分离株对肠道环境的适应性，更加真实地反映大肠杆菌分离株YZ、GY-1和CZ株对肠道胆汁的耐受能力。无菌操作取出鸭胆囊放入无菌平皿中，用注射器抽取胆汁放入无菌EP管中。在LB液体培养基中加入 0.1％、0.2％、0.3％(v/v)浓度胆汁进行大肠杆菌分离株的耐胆汁试验，37％培养2-3h，每个处理设3个重复，以不加胆汁的LB培养液为对照。处理完毕后，每个处理组和对照组的菌液10倍稀释至合适的稀释度，取3个合适稀释度菌液100μL分别涂布于LB固体培养基，37℃过夜培养后计数菌落数，记录结果，
存活率(％)＝(不同胆汁浓度的菌液平均活菌数/不加胆汁的菌液平均活菌数)X100
结果：
YZ、GY-1和CZ株大肠杆菌分离株用不同浓度的鸭胆汁处理后均能很好生长。在0.1％、0.2％、0.3％浓度的胆汁培养基中YZ、GY-1和CZ株的存活率分别为93.8％、90.5％、87.1％；95.6％、88.7％、85.8％；95.9％、 90.8％、86.8％，说明YZ、GY-1和CZ株对鸭胆汁均具有较好的耐受性。表 2为各菌株耐胆汁的水平。
表2大肠杆菌分离株耐鸡胆汁水平
YZ GY-1 CZ
0.10％ 93.8 95.6 95.9
0.20％ 90.5 88.7 90.8
0.30％ 87.1 85.8 86.8
6、安全性评估
①毒力因子PCR检测
将大肠杆菌分离株YZ、GY-1和CZ株划线接种LB琼脂培养基平板，37℃培养24h，挑取3-4个菌落溶于100uL无菌纯水，涡旋震荡混匀，100℃煮沸10-15min，8 000r/min离心15min，取上清作为模板，并保存于-20℃备用。根据现有技术可知，禽类重要毒力基因包括fimA、fimC、tsh、iucA、 iucD、iutA、fyuA、irp2、colV；
PCR扩增反应体系为：2xPCR Master Mix 12.5uL，10pmol/uL上下游引物各0.5uL，ddH20 7.5uL，模板为4uL，95℃预变性5min，95℃变性 30s，按不同引物需要退火温度退火30s，72℃延伸45s，共进行25-30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后，取5-6uL产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测分离，用凝胶成像仪观察和分析结果。
以下为PCR检测各毒力因子所采用的上游引物、下游引物、扩增的特异性片段大小、以及退火温度：
fimA的上游引物如SEQUENCE NO.2所示，下游引物如SEQUENCE NO.3 所示，扩增的特异性片段大小为449bp，退火温度为54℃；
fimC的上游引物如SEQUENCE NO.4所示，下游引物如SEQUENCE NO.5 所示，扩增的特异性片段大小为337bp，退火温度为52℃；
tsh的上游引物如SEQUENCE NO.6所示，下游引物如SEQUENCE NO.7所示，扩增的特异性片段大小为381bp，退火温度为53℃；
iucA的上游引物如SEQUENCE NO.8所示，下游引物如SEQUENCE NO.9 所示，扩增的特异性片段大小为737bp，退火温度为56℃；
iucD的上游引物如SEQUENCE NO.10所示，下游引物如SEQUENCE NO.11 所示，扩增的特异性片段大小为127bp，退火温度为50℃；
iutA的上游引物如SEQUENCE NO.12所示，下游引物如SEQUENCE NO.13 所示，扩增的特异性片段大小为254bp，退火温度为55℃；
fyuA的上游引物如SEQUENCE NO.14所示，下游引物如SEQUENCE NO.15 所示，扩增的特异性片段大小为1443bp，退火温度为56℃；
irp2的上游引物如SEQUENCE NO.16所示，下游引物如SEQUENCE NO.17 所示，扩增的特异性片段大小为287bp，退火温度为59℃；
colV的上游引物如SEQUENCE NO.18所示，下游引物如SEQUENCE NO.19 所示，扩增的特异性片段大小为307bp，退火温度为46℃；
结果见表3：
表3大肠杆菌分离株毒力因子基因表达分析
fimA fimC tsh iucA iucD iutA fyuA irp2 colV
YZ + - - + + + - - +
GY-1 + + + - - - + + -
CZ + - - - - - - - -
上述结果表明：YZ株有colV质粒，表现出colV质粒中重要毒力因子tsh,iucA,iucD和iutA检测阳性结果。GY-1株fimA，fimC检测结果阳性，而CZ株虽然检测出I型菌毛的主要亚单位基因fimA，但是fimC检测结果阴性，分fimC是I型菌毛装配和转运重要亚单位，其不表达或者缺失，不能完成组装功能性I型菌毛，且CZ株fyuA和irp2检测阴性，推测其可能其不含有HPI毒力岛。
综上结果，CZ株含毒力基因最少。
②饮水安全评估
1日龄的健康雏鸭20只，随机分为4组，每组5只，试验组分别饮用 YZ、GY-1和CZ株的菌液，雏鸭平均每日饮活菌1×1010个，持续饮活菌21d，对照组正常饮水，观察雏鸭的精神状态及采食、排便等情况。
结果：
在21d的雏鸭饲喂试验过程中GY-1和CZ株菌的试验组效果较好，雏鸡采食、排便均正常，精神状态良好，生长发育正常，所有试验雏鸭没有死亡现象；YZ株菌的试验组在饲喂前3天个别雏鸭有拉稀现象，但从第4天开始所有情况都正常，与GY-1和CZ组没有明显差异。说明YZ、GY-1和CZ株乳酸菌具有良好的生物安全性。
综上评估，CZ株菌具有良好的利用前景，后续将围绕CZ株进行基因组改造。
7、鸭源大肠杆菌益生株基因组改造：以下具体步骤中所用到的引物P1、 P2的基因序列分别由SEQUENCE NO.20、SEQUENCE NO.21所示、P3和P4的基因序列如SEQUENCE NO.22、SEQUENCE NO.23所示、Up-fimA(Hind 3)和Down –fimA(Bgl 2)基因序列分别如SEQUENCENO.24、SEQUENCE NO.25所示。本发明对菌株改造方法包括如下步骤：
①缺失asd基因：
采用分子生物学手段对CZ株ASD编码基因进行缺失修饰。
1.质粒PKD46转化CZ株，获得CZ(PKD46)株。
具体操作如下：挑取CZ株单个菌落接种于3mlLB液体培养基中37℃振摇培养过夜，取50μL培养物加入到4mLLB液体培养基中37℃振摇培养 1.5-2h使培养物OD600达到0.4-0.6,将培养物冰浴15min，4000rpm离心 10min，弃上清，将沉淀悬于2mL预冷的0.1mol/LCaCl2内，冰浴30min， 4000rpm离心10min，弃上清，沉淀用400μL预冷的0.1mol/LCaCl2重悬， 200μL/管分装，4℃保存短期使用，也可添加10-15％灭菌甘油置-70℃备用，使用时冰上缓慢溶解。
质粒pKD46与200μL感受态细菌混合，42℃水浴处理90s，转化培养液 30℃150rpm振摇复苏45min后，取200μL涂布氨苄青霉素(150ng/mL)抗性的LB平板，30℃培养过夜。
2.CZ(PKD46)株重组蛋白的诱导和感受态制备
挑取CZ(PKD46)株单个菌落接种于5mL新鲜LB培养基(含有150ng/mL 氨苄青霉素)中，30℃振荡培养过夜，次日按1:50接种于50mLLB培养基， 30℃培养至OD600达到0.2-0.3时，加入L-阿拉伯糖至30mmol/L，诱导1h，使pKD46上的Exo、Bet和Gam三个蛋白充分表达。冰上预冷10min，4000rpm， 4℃离心10min，弃培养基，用预冷的10％甘油离心洗涤3次，浓缩100倍制成500μL的感受态细胞，每管分装40μL，存放于-70℃冰箱待用。
3.CZ△asd：：cat获得
首先，质粒pKD3为模版，P1、P2为引物，按长引物条件进行PCR扩增。 PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃1min，52℃1min，72℃1min，10 个循环；94℃1min，63℃1min，72℃1min，25个循环；72℃延伸10min。
第一次PCR产物经DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后以1:200的比例稀释，取5μL作为模板加入到新的反应体系中，进行第二次PCR反应，以消除模板中质粒pKD3对后续重组过程中转化结果的影响。为保证PCR产物的量，相同条件下PCR同时扩增250μL，PCR产物取5μL电泳检测扩增效果，余下产物用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化，最后溶于50μL 洗脱液中，然后测定DNA浓度。
取100ng左右经纯化后PCR产物，与40μL的CZ(PKD46)感受态细胞混合，将混合物加入到0.1cm的Bio-Rad电极杯中，在电压1.8KV，脉冲25μF，电阻200欧姆的参数下进行电击，电击后迅速加入1ml预冷的SOC培养基， 150r/min,30℃培养1-1.5h，取200μL涂布氯霉素和氨苄青霉素的LB平板(氯霉素浓度为34ng/ml，氨苄青霉素的浓度为150ng/mL)上筛选asd基因缺失突变株。
质粒pKD46具有氨苄青霉素抗性基因，其复制子具有温度敏感性，在高温条件下无法复制，将上一步电转化得到的具有氨苄青霉素和氯霉素抗性的重组子，接种于LB培养基中，42℃培养2h后，在37℃条件下划线分离培养，对每个单菌落进行氨苄青霉素和氯霉素的抗性检测，挑选对氨苄青霉素敏感而对氯霉素具有抗性的单菌落。
以上述单菌落基因组为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增鉴定，对照野生型扩增片段为1104bp，重组体为1093bp大小，鉴于PCR产物大小较为接近，琼脂糖凝胶电泳并不能区分，将重组子PCR产物送测序鉴定得到消除质粒pKD46的重组菌株，将该重组菌命名为CZ△asd::Cat。
4.CZ△asd的获得
将CZ△asd::Cat按照上述方法制成电转化感受态细胞，转化入编码FLP 位点专一性重组酶的质粒pCP20(氯霉素抗性基因两端带有FRT位点)，涂布于含氨苄青霉素和氯霉素双抗性LB平板上，30℃培养筛选阳性转化子，然后将获得的阳性转化子转接无任何抗性的LB中，42℃培养数小时，再在37℃条件下划线培养分离单菌落，对各个单菌落进行氨苄青霉素和氯霉素抗性检测，获得对两种抗生素均敏感的突变株，并将该突变菌株命名为CZ△asd。
5.将鸭源沙门氏菌I型菌毛主要亚单位蛋白编码基因fimA插入到含有 asd基因的质粒载体pYA3493中。
以禽源沙门氏菌基因组为模板，Up-fimA和Down–fimA为引物，高保真酶系统扩增沙门氏菌1型菌毛主要编码基因fimA，PCR扩增产物送上海生物工程公司进行测序验证。
Hind 3和Bgl 2酶切处理fimA基因PCR产物和pYA3493载体质粒，处理时间为：45min-1h，酶切后经琼脂糖切胶回收，T4 DNA连接酶处理，获得重组质粒pYA-fimA。
重组质粒化学转化法转化入CZ△asd获得CZ-5株，该菌株基因组缺失 asd基因，必须在重组质粒存在并表达的前提下才能正常生长，经PCR扩增鉴定以及细菌生长试验验证CZ-5株基因组缺失asd基因，并含有重组质粒 pYA-fimA。
以下为对本发明筛选制备出来的菌株对于其用途的试验，本发明的菌株具有很好的预防和控制鸭类大肠杆菌感染、沙门氏菌感染的效果。基于本发明菌株具有此效果，可以采用现有技术将本发明菌株制备成预防和控制大肠杆菌感染、沙门氏菌感染疫苗或免疫佐剂。
(1)本发明筛选并重组构建后的菌株CZ-5口服饮水处理雏鸭群后提高抗FIMA抗体、IgG、IgA抗体水平
1.1益生菌CZ-5前处理
-80℃保种的CZ-5株划线普通LB平板16-18h复苏培养，有明显单菌落长成时，转接LB液体培养基，160rpm，18-24h摇床培养，制备种子液。根据需要进行大体积LB液体的扩大培养，5000rpm离心收集扩培养菌体，无菌生理盐水洗涤2次，充分去除培养基杂质和可能的内毒素，调整菌体浓度为108CFU/mL，109CFU/mL，1010CFU/mL。
1.2试验鸭处理
健康7日龄高邮雏鸭200只，随机分为4组，分为对照组(未处理)，组1(108CFU/mL)，组2(109CFU/mL)，组3(1010CFU/mL)，正常育雏育成饲养，满足试验群体的营养和管理需要。不同组别给喂不同量益生菌，对照组不做处理，连续给喂3天，分群小间饲养，饲养观察周期3个月。
1.3样本采集和数据处理
不同组别每周测量体重，统计采食量；分别在1周龄，1月龄，2月龄， 3月龄时采血，每个组别随机取10个样本收集其全血标本，上述全血样本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000rpm离心20分钟，取上清，每个样本分成3份，分别用于测定抗FIMA抗体、IgG、IgA抗体。
结果：
1.体重发育正常
所有组别鸭饮水，采食正常，CZ-5株的给喂未对处理鸭造成生长和行为的影响，体重增长符合本品种生长规律，且CZ-5株处理组体重有增加趋势，但组间差异不显著，其中组1，组2，组3不同浓度组之间对体重影响差异不显著，且育雏育成的死淘率有明显提高。
表1不同处理组试验鸭体重发育(g)
1周 1月 2月 3月
对照组 163.1±15.5 1300±110.1 2222±146.3 2645±195
组1 166.4±14.7 1324±128.2 2480±201.1 2750±187
组2 159.0±16.3 1312±119.2 2351±173.7 2697±191
组3 161.4±17.2 1318±123.7 2415±187.4 2723±176
表2不同处理组试验鸭育雏育成期死淘率(％)
死淘率
对照组 92％(46/50)
组1 98％(49/50)
组2 94％(47/50)
组3 98％(49/50)
2.抗体水平分析
2.1特异性抗沙门氏菌FIMA重组蛋白抗体水平变化
间接ELISA试验测定抗FIMA抗体水平，A450值统计如下。下表结果说明，在本发明CZ-5株口服处理3周后，持续整个观测周期有较高水平的抗FIMA 抗体，不同剂量处理组之间无显著差异。
表3处理不同时间不同组别中血清抗FIMA抗体的变化(A450)
处理前 1月 2月 3月
对照组 0.241±0.104 0.304±0.012 0.321±0.056 0.342±0.045
组1 0.209±0.021 0.884±0.081 1.009±0.103 0.981±0.012
组2 0.198±0.011 0.909±0.106 0.947±0.076 1.108±0.041
组3 0.223±0.009 0.976±0.025 0.978±0.027 0.973±0.023
2.2 IgG抗体
在处理前，抗体水平有波动，但基本水平A450小于0.2，随后每个月抗体检测发现，对照组抗体水平维持在0.2左右，而CZ-5株不同处理组，IgG 抗体水平都有逐步上升，其中较其他组，组1抗体水平在1月龄时稍高，但差异不显著，组3在2月龄和3月龄时抗体水平都表现较高。
表4处理不同时间不同组别中血清抗体IgG的变化(A450)
处理前 1月 2月 3月
对照组 0.194±0.024 0.225±0.012 0.248±0.058 0.204±0.037
组1 0.170±0.01 0.502±0.118 0.529±0.115 0.781±0.021
组2 0.176±0.01 0.361±0.056 0.447±0.067 0.758±0.033
组3 0.135±0.019 0.472±0.052 0.578±0.051 0.873±0.030
2.3 IgA抗体
1周龄时IgA抗体A450值在0.7左右，3月龄内对照组抗体水平都小于 0.12，不同剂量CZ-5株处理在1月龄时都未有明显的抗体水平变化，但在2 月龄和3月龄时抗体水平有显著水平升高。不同剂量处理组比较发现，2月龄和3月龄时，组3的抗体水平稍高于组1和组2，但未有显著的剂量依赖效应。
表5处理不同时间不同组别中血清抗体IgA的变化(A450)
处理前 1月 2月 3月
对照组 0.072±0.008 0.081±0.005 0.119±0.005 0.120±0.005
组1 0.068±0.006 0.075±0.006 0.102±0.006 0.154±0.005
组2 0.069±0.004 0.072±0.008 0.098±0.005 0.130±0.018
组3 0.071±0.004 0.076±0.009 0.132±0.008 0.280±0.014
由上述结果可见，本发明的CZ-5株可以提高鸭机体免疫力，具有良好的预防鸭大肠杆菌、沙门氏菌感染的效果。
(2)提高鸭抗感染能力
1.1本发明CZ-5株前处理
-80℃保种的CZ-5株划线普通LB平板16-18h复苏培养，有明显单菌落长成时，转接LB液体培养基，160rpm，18-24h摇床培养，制备种子液。根据需要进行大体积LB液体的扩大培养，5000rpm离心收集扩培养菌体，无菌生理盐水洗涤2次，充分去除培养基杂质和可能的内毒素，调整菌体浓度为108CFU/mL备用。
禽源致病性大肠杆菌、禽源致病性沙门氏菌菌株由本课题分离和保存，已经测定半数致死量分别为2.1x108CFU和0.8x108CFU。
1.2试验鸭和处理
健康7日龄高邮雏鸭200只，随机分为4组，分为对照组1(大肠杆菌对照组)，对照组2(沙门氏菌对照组)，处理组1(大肠杆菌处理组)，处理组2(沙门氏菌处理组)；8日龄，对照组不做任何处理，处理组1和2每只给喂108CFU/mLCZ-5株，连续给喂3天后正常育雏育成饲养；1月龄时，攻毒处理，禽源致病性大肠杆菌攻毒对照组1和处理组1，攻毒剂量2.1x108CFU，攻毒方式，颈部皮下注射；禽源致病性沙门氏菌菌株攻毒对照组2和处理组2，攻毒剂量0.8x108CFU，攻毒方式，颈部皮下注射。观察周期1 个月。
结果：
表6对禽源致病性大肠杆菌、沙门氏菌攻毒保护作用
死亡只数(只) 死亡率(％)
对照组1 18/50 36
对照组2 13/50 26
处理组1 3/50 6
处理组2 2/50 4
由上述结果可见，本发明的CZ-5株，可以很好的控制住大肠杆菌感染、沙门氏菌感染，从而降低死亡率。
本发明筛选出的大肠杆菌益生菌株改造过程中不经过抗生素的筛选，不含有抗生素标签，不需要抗生素的压力维持菌株的生长。也就是讲本菌株的使用不会造成抗生素基因在生物体内的核酸污染。从而可以说明本发明的菌株可以有效避免耐药菌株的产生。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种鸭源大肠杆菌益生菌菌株及其筛选制备方法与用途
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 19
<211> 1104
<212> DNA
<213> 缺失的asd基因序列(Escherichia coli)
<400> 19
atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggtatggtcg gctccgttct catgcaacgc 60
atggttgaag agcgcgactt cgacgccatt cgccctgtct tcttttctac ttctcagctt 120
ggccaggctg cgccgtcttt tggcggaacc actggcacac ttcaggatgc ctttgatctg 180
gaggcgctaa aggccctcga tatcattgtg acctgtcagg gcggcgatta taccaacgaa 240
atctatccaa agcttcgtga aagcggatgg caaggttact ggattgacgc agcatcgtct 300
ctgcgcatga aagatgacgc catcatcatt cttgaccccg tcaatcagga cgtcattacc 360
gacggattaa ataatggcat caggactttt gttggcggta actgtaccgt aagcctgatg 420
ttgatgtcgt tgggtggttt attcgccaat gatcttgttg attgggtgtc cgttgcaacc 480
taccaggccg cttccggcgg tggtgcgcga catatgcgtg agttattaac ccagatgggc 540
catctgtatg gccatgtggc agatgaactc gcgaccccgt cctctgctat tctcgatatc 600
gaacgcaaag tcacaacctt aacccgtagc ggtgagctgc cggtggataa ctttggcgtg 660
ccgctggcgg gtagcctgat tccgtggatc gacaaacagc tcgataacgg tcagagccgc 720
gaagagtgga aagggcaggc ggaaaccaac aagatcctca acacatcttc cgtaattccg 780
gtagatggtt tatgtgtgcg tgtcggggca ttgcgctgcc acagccaggc attcactatt 840
aaattgaaaa aagatgtgtc tattccgacc gtggaagaac tgctggctgc gcacaatccg 900
tgggcgaaag tcgttccgaa cgatcgggaa atcactatgc gtgagctaac cccagctgcc 960
gttaccggca cgctgaccac gccggtaggc cgcctgcgta agctgaatat gggaccagag 1020
ttcctgtcag cctttaccgt gggcgaccag ctgctgtggg gggccgcgga gccgctgcgt 1080
cggatgcttc gtcaactggc gtaa 1104
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> fimA的上游引物(Escherichia coli)
<400> 1
ctctggcaat cgttgttct 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> fimA的下游引物(Escherichia coli)
<400> 2
aatggtgttg gttccgtta 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> fimC的上游引物(Escherichia coli)
<400> 3
gccgatggtg taaaggat 18
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> fimC的下游引物(Escherichia coli)
<400> 4
ccggcattca actctgttac cgtca 25
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> tsh的上游引物(Escherichia coli)
<400> 5
tgttacgacg cattgaga 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> tsh的下游引物(Escherichia coli)
<400> 6
acgaactggg aagtatgg 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> iucA的上游引物(Escherichia coli)
<400> 7
gactggcaac tggcggaata 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> iucA的下游引物(Escherichia coli)
<400> 8
cggctggtag cacagtagag g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> iucD的上游引物(Escherichia coli)
<400> 9
acaaccttat ttaccaccct 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> iucD的下游引物(Escherichia coli)
<400> 10
accactctgt cctccacc 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> iutA的上游引物(Escherichia coli)
<400> 11
tcaacccact gcttcttacc 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> iutA的下游引物(Escherichia coli)
<400> 12
gccacgcaca ttcatacc 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> fyuA的上游引物(Escherichia coli)
<400> 13
accgttatcg ccattctg 18
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> fyuA的下游引物(Escherichia coli)
<400> 14
tcgtcattgc tcttaccct 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> irp2的上游引物(Escherichia coli)
<400> 15
aaggattcgc tgttaccgga c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> irp2的下游引物(Escherichia coli)
<400> 16
tcgtcgggca gcgtttcttc t 21
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> colV的上游引物(Escherichia coli)
<400> 17
acggatgctc agtttct 17
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> colV的下游引物(Escherichia coli)
<400> 18
tgtgcttggc gtcatag 17
<210> 20
<211> 70
<212> DNA
<213> p1引物序列(Escherichia coli)
<400> 20
cggtatggtc ggctccgttc tcatgcaacg catggttgaa gagcgcgatg tgtaggctgg 60
agctgcttcg 70
<210> 21
<211> 68
<212> DNA
<213> p2引物序列(Escherichia coli)
<400> 21
cgacgcagcg gctccgcggc cccccacagc agctggtcgc ccacggtaca tatgaatatc 60
ctccttag 68
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> p3引物序列(Escherichia coli)
<400> 22
atgaaaaatg ttggttttat c 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> p4引物序列(Escherichia coli)
<400> 23
ttacgccagt tgacgaagca tc 22
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> Up-fimA(BamH1引物序列Escherichia coli)
<400> 24
ccaggatcca tgaaacataa attaatgac 29
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> Down - fimA(Xba1引物序列Escherichia coli)
<400> 25
actctagatt attcgtattt catgataaag g 31

Claims (3)

1.一种鸭源大肠杆菌益生菌菌株，其特征在于，所述菌株的染色体基因组缺失asd基因，所述缺失的asd基因序列如SEQUENCE NO.1所示，外源转入重组质粒pYA-fimA，该菌株的保藏号为GDMCC NO：60693。
2.一种权利要求1所述鸭源大肠杆菌益生菌菌株的用途，其特征在于，将该菌株应用于制备预防和控制鸭类大肠杆菌感染、沙门氏菌感染的药物。
3.根据权利要求2所述的鸭源大肠杆菌益生菌菌株的用途，其特征在于，所述药物的类型为疫苗或免疫佐剂。
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