JP2002508333A

JP2002508333A - ワクチン

Info

Publication number: JP2002508333A
Application number: JP2000538712A
Authority: JP
Inventors: エル．ジ．ダルマン，ウィルフリート; メシュラン，マルセルポーレットバン; ブルック，クロディーヌ; フリード，マルタン
Original assignee: スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2002-03-19
Also published as: NZ504936A; US20030072768A1; US6500432B1; ZA9811501B; GB9726555D0; AU740729B2; WO1999030733A1; HUP0100197A2; NO20003087D0; EP1037662A1; BR9814285A; PL341212A1; AR017866A1; TR200001737T2; KR20010024731A; IL136345A0; AU1967899A; CN1284883A; NO20003087L; CA2313005A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリヌクレオチドと着目のポリペプチドの同時投与により、核酸ワクチン接種の免疫応答を増強する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、着目のポリヌクレオチドとポリペプチドの同時投与による核酸ワク
チン接種の免疫応答を増強する方法に関する。

【０００２】発明の背景 1990年に、Wolff および共同研究者ら〔Wolff 他, Science 247:1465-1468 (1
990)〕は、何らトランスフェクション媒介物を使用しなくても非複製プラスミド
ＤＮＡコードレポーター分子が筋細胞により取り込まれ、そしてコードされるタ
ンパク質がプラスミドＤＮＡの注入後に発現されることを報告した。「裸の（na
ked)」（即ち、トランスフェクションを促進する剤を欠いた）プラスミドＤＮＡ
から発現されたタンパク質が筋肉内接種した時に免疫原性であったというその後
の発見は、相当な臨床的衝撃を伴って新しい研究分野を開拓した。

【０００３】そのようなものとして、核酸によるワクチン接種（NAVAC ）は、多数の病気に
対してワクチン接種するための比較的新しいアプローチである。それは最初に試
験管内で生産された（または培養された）ポリペプチド（または弱毒化微生物も
しくは死微生物）を投与する従来の方法ではなくて宿主細胞内での生体内でのポ
リペプチド生産を伴う。NAVAC は、投与する化合物が１または複数の特定抗原を
コードする核酸、即ちＤＮＡまたはＲＮＡから成るという点で、従来のワクチン
とも異なる。それらの核酸を注射すると、それらは哺乳類宿主の受容細胞により
取り込まれ、続いてそのような核酸によってコードされる抗原が発現される。そ
の後、宿主内の外来抗原の存在が、その抗原に対して向けられた特異的免疫応答
を惹起することができる。NAVAC は、体液性免疫、即ち抗体免疫、並びに細胞性
免疫、即ちＴヘルパー細胞応答および細胞障害性リンパ球を誘導することが示さ
れた〔例えば、Corr他, J. Exp. Med. 184:1555-1560 (1996); Doe他, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 93:8578-8583 (1996)を参照のこと〕。

【０００４】誘導された免疫応答は、数個の動物モデルにおいて、抗原が最初に得られた感
染生物によるその後のチャレンジに対して保護することが示された〔例えば、Ul
mer 他, Science 59:1745-1749 (1993); Sedegah他, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 91:9866-9870 (1994); Manichan他, J. Immunol. 155:259-265 (1995)〕。

【０００５】 NAVAC は大型動物種ではあまり有効でないことが示され（アジュバント付加タ
ンパク質の投与に比べて）、そして小動物種（例えばマウス）において観察され
るものに匹敵する免疫レベルを達成するには多量のＤＮＡを投与しなければなら
ない〔Gramzinski他, Vaccine Research 5:173-183 (1996); Lu 他, J. Virol.
70:3978-3991 (1996); Shiver 他, Journal of Pharmaceutical Science 85:131
7-1324 (1996) 〕。よって、例えば、新規デリバリーおよびターゲッティング方
法、新規アジュバント化技術、別の投与経路などを開発することによって、NAVA
C の効力を高める必要がある。本発明の目的は、ＤＮＡワクチン接種の効力に対
する別の改善を提供することである。

【０００６】発明の要約ある面では、本発明は、(i) あるポリペプチドをコードする、着目の遺伝子を
コードするポリヌクレオチドを投与し、そして(ii)同時に、即ち進行中の同一免
疫応答中に、前記ポリペプチドも投与することにより、核酸ワクチン接種の免疫
応答を増強する方法を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドとポリペプチド
の投与が互いに０〜10日以内に行われる。１つの好ましい態様は、ポリヌクレオ
チドの投与の３〜７日前にポリペプチドを投与することである。ポリペプチドは
、さらに、遅延型放出を提供するような形で（例えばカプセル化して）免疫系に
提供されるように、投与前に調製されてもよい。そのような場合、ポリペプチド
は好ましくはポリヌクレオチドと同時に投与される。

【０００７】別の面では、本発明は、着目のポリペプチドをコードする、着目の遺伝子をコ
ードするヌクレオチドを投与し、そして同時に、即ち、進行中の同一免疫応答中
に前記ポリペプチドを投与することによる、ポリペプチドワクチン接種の免疫応
答を増強する方法を提供する。

【０００８】更に関連する面では、本発明は、着目の遺伝子をコードするポリヌクレオチド
と対応する着目のポリペプチドとを含んで成り、前記ポリヌクレオチオ対ポリペ
プチドの比が1000:1〜1:1 (w/w) である、医薬組成物、ワクチン、並びにそのよ
うな組成物およびワクチンの調製方法に関する。所望により、ポリペプチドは、
遅延型放出を提供するような形で免疫系に提供されるように投与前に調製される
。

【０００９】発明の具体的説明本発明は、同時投与前に２つの異なる化合物を混合することによりＤＮＡワク
チンに対する哺乳類（例えばマウス、ウサギ、霊長類、人間）の免疫応答を増強
する方法に関する。第一の化合物は、防御免疫を刺激することができる特定のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド（核酸）、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ
を含んで成る。第二の化合物は、好ましくは、本発明の核酸によりコードされる
同じポリペプチド（または、実質的に同じ、即ち同じ免疫優性エピトープを有す
る）である、ポリペプチドを含んで成る。この増強は、体液性免疫応答と細胞性
免疫応答の両方により決定されるような全免疫応答の増加に関連する。即ち、下
記のものの１つまたは複数の測定可能な増加が観察される：全抗体価（特定のポ
リペプチドに対する）；リンパ増幅；およびＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）レ
ベル。更に、着目の遺伝子をコードするＤＮＡのような核酸を対応するポリペプ
チドと混合しそして哺乳類に（同時に）投与すると、相乗効果が観察される。即
ち、ＤＮＡワクチンがタンパク質（ポリペプチド）の存在下で免疫応答を誘導で
きるだけでなく、そのようなタンパク質（ポリペプチド）の存在がＤＮＡワクチ
ンの効力も実際に増強することが観察された。よって、本発明の一面は、免疫応
答を増強するためのポリヌクレオチドとポリペプチドを含んで成る組成物である
。所望により、ポリペプチドはアジュバント付加されてもよい。

【００１０】逆に、ポリペプチドワクチンへの特定の核酸（例えば、ポリペプチドの全部ま
たは実質的部分をコードするＤＮＡ）の存在も、同様にその免疫応答を増強する
ことがわかった。即ち、ＤＮＡ／ポリペプチド混合物の相互作用が、それらの個
々の成分の効力を増強する。特定のポリペプチドをコードしない類似のポリヌク
レオチドは免疫応答を増強できなかったので、この増強は、添加されるポリヌク
レオチドに特異的である。本発明の１つの驚くべき面は、ＤＮＡ成分とポリペプ
チド成分が免疫応答を惹起する上で互いに競合しなかったことと、逆に、ＤＮＡ
とタンパク質を同時に投与すると相乗効果が観察されたことである。

【００１１】本発明は、２つの異なるワクチン製剤（１つはＤＮＡ製剤、もう１つはタンパ
ク質製剤）を調製し、そして異なる時点で且つ特定の順序で、別々に投与すると
いう「プライムブースト」アプローチ〔Barnett 他, Vaccine 15:869-873 (1997
) 〕とは異なる。即ち、プライムブーストアプローチでは、免疫応答を「開始」
させるためにＤＮＡ分子が投与され、そして一次免疫応答が確立された後のその
後のある時間に（数週間後または数カ月後）、先在する免疫応答を上昇させるた
めにタンパク質が投与される。

【００１２】本発明の別の利点は、強い免疫応答への素因（例えば、最初のワクチン接種に
対する高比率の応答者、高レベルの抗体価、ＣＴＬ応答など）があるような場合
に、両化合物の組合せ（ＤＮＡ＋タンパク質）は免疫刺激物質の必要性を除去す
ることができる。

【００１３】本発明の更なる態様には、核酸とタンパク質抗原が共同投与（好ましくは同時
に）されるが、タンパク質抗原を投与後数日間放出する遅延型放出ビヒクル中に
タンパク質抗原が封入されているという製剤も含まれる。そのような製剤は、免
疫応答を偏らせることなく、核酸のみに比べて誘導される免疫応答の大きさを増
強する。

【００１４】核酸本発明に従って使用されるポリヌクレオチド物質は、有用な治療的用途（例え
ば予防または治療ワクチン）を有するポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲ
ＮＡ配列を含んで成る。本発明の方法によれば、発現可能なＤＮＡとＲＮＡの両
方を細胞へと輸送して、その中でポリペプチド翻訳生成物を形成させることがで
きる。核酸が適当な調節配列を含む場合、それらはコードされるタンパク質の比
較的多量の合成を指令するだろう。好ましくは、それらはウイルス〔非限定的に
肝炎ウイルス（全ての型），ＨＳＶ，ＨＩＶ，ＣＭＶ，ＥＢＶ，ＲＳＶ，ＶＺＶ
，ＨＰＶ，ポリオウイルス，インフルエンザウイルスが挙げられる〕、寄生生物
〔例えばプラスモジウム（Plasmodium）属から〕、および病原菌〔非限定的にＭ
．ツベルクロシス（M. tuberculosis）、Ｍ．レプレ（M. leprae）、クラミジ
ア（Chlamydia ）、シゲラ（Shigella）、Ｂ．ブルグドルフェリ（B. burgdorfe ri ）、毒素原性大腸菌（E. coli）、Ｓ．ティホザ（S. typhosa）、Ｈ．ピロリ
（H. pylori）、Ｖ．コレレ（V. cholerae）、Ｂ．パーツッシズ（B. pertuss is ）など〕により引き起こされる感染症に関係のある生物の抗原をコードする。
別の抗原、例えば癌細胞上に見つかるもの（腫瘍に対する免疫応答の既知標的の
例は、ＨＰＶ誘導頸部癌についてはＥＰ７、乳癌および他の癌についてはHer-2/
neu 、メラノーマおよび他の癌についてはMAGE-3、チロシナーゼ、melanA/MART
またはメラニン細胞特異的分化抗原であるgp100 ）も本発明の範囲内に含まれる
。

【００１５】本発明のポリヌクレオチドは、直鎖状断片の形であってもよく、またはプラス
ミドもしくはウイルスＤＮＡ中に組み込まれた非直鎖状断片の形であってもよい
。ポリヌクレオチド（または核酸）は、トランスフェクションを促進する他の物
資、例えばリポソーム製剤、荷電脂質（カチオンまたはアニオン性コキレート、
例えばLipofectin（商標）、Transfectam （商標）、DOTAP （商標））、ポリカ
チオン（例えばポリリジン、ポリエチレンイミンなど）、ウイルスタンパク質（
例えばヒストン）、核酸に結合するペプチド（例えば縮合剤）、デンドリマー、
PLPG微粒子などと組み合わせてもよい。

【００１６】核酸がＤＮＡである場合、様々な哺乳動物系での使用に適するプロモーターは
周知である。例えば、適当なプロモーターとしては、CMV IE, RSV LTR, SV40, A
deno MLP, メタロチオネインなどが挙げられる。

【００１７】 NAVAC による免疫応答の誘導の基礎となる正確な細胞機構および免疫学的機構
はまだ完全には解明されていない。NAVAC が優良とされる証拠は、タンパク質（
ワクチン接種）アプローチによって誘導するのは困難である免疫応答の一部であ
る、細胞障害応答の誘導である、ＣＴＬ応答を誘導するために、抗原は細胞内に
存在するNHC-I 分子の環境中に提示されなければならない。NAVAC ではタンパク
質が細胞内に発現されるので、そのようなMHC-I 提示は容易に達成できる。よっ
て、核酸ワクチン接種は、細胞性免疫、特に着目の抗原に対する細胞障害性Ｔ細
胞応答を刺激するのに非常に適する。

【００１８】タンパク質タンパク質は、有用な治療用途（例えば予防または治療ワクチンとして）を有
する任意のポリペプチドであることができる。上述したように、本発明は特定の
ポリペプチドに限定されないが、強力な細胞性免疫応答を本質的には刺激しない
かもしれないタンパク質、例えば細胞内病原体（例えば．非限定的にＭ．ツベル
クロシス、Ｍ．レプレ、クラミジア）中に見つかるポリペプチド、ある種の腫瘍
特異的抗原（例えば乳癌または結腸癌上に見つかるもの）、および弱免疫原性ウ
イルスタンパク質（例えばヘルペスウイルス，ＥＢＶ，ＣＭＶ，ＨＰＶなど由来
）を標的とすることが望ましいだろう。

【００１９】注目すべきことは、組換えタンパク質およびサブユニットワクチンの潜在的欠
点は、免疫防御応答を惹起せしめるために糖タンパク質抗原が特定のコンホメー
ション（即ち、生来のタンパク質と同様なコンホメーション）で提示されなけれ
ばならないかもしれないという事実である。組換え発現系から精製する際、抗原
のコンホメーションが正しいことを保証するのはしばしば困難である。しかしな
がら、生体内での抗原をコードする遺伝子の誘導およびその後のそれの細胞内発
現は、タンパク質生成物が生来の病原体タンパク質とごく類似して合成され、修
飾され、そしてプロセシングされることを保証するだろう。よって、例えば、ヒ
トウイルス糖タンパク質のための遺伝子の発現は、おそらく正しい抗原コンホメ
ーションをもたらすだろう。結果として、生来の抗原エピトープが免疫系に提示
され、そして例えば生来のウイルス糖タンパク質に特異的な中和抗体の産生を引
き起こすことができる。

【００２０】ＤＮＡ＋タンパク質通常、ＤＮＡワクチン接種は優先的にＴｈ１ヘルパー型応答を惹起させる。逆
に、大部分の可溶性非粒状抗原（即ち、タンパク質ベースのもの）ワクチンは優
先的にＴｈ２応答を惹起させる。一旦「開始 (prime)」されれば、免疫系応答は
最初のワクチン接種に使用した組成物（即ち、核酸またはポリペプチド）によっ
て優先的にＴｈ１またはＴｈ２を存続させる。全く意外なことに、ＤＮＡ＋タン
パク質の組合せは、同時投与すると、よりバランスのとれたＴｈ１＋Ｔｈ２応答
を示す。即ち、両方の応答が惹起され、そしてポリヌクレオチド／ポリペプチド
の組合せが相乗的に作用するように見える。更に、細胞外タンパク質の存在によ
りＣＴＬの誘導が妨害されない。

【００２１】ポリヌクレオチド／ポリペプチド免疫応答に基づく本発明の別の利点は、この
アプローチが潜伏性ウイルス感染を治療する方法を提供することである。数種類
のウイルス（例えばヘルペスウイルス群の構成員など）は、ウイルスが不活性形
または部分活性形で細胞内に保有される潜伏性感染を樹立し得る。そのような感
染を治療する方法はほとんどない。しかしながら、潜伏性ウイルスタンパク質に
対する細胞溶解免疫を誘導することにより、最終的に潜在的に感染した細胞をタ
ーゲッティングしそして排除することができる。こうして、ポリヌクレオチド／
ポリペプチド組成物を投与することにより、より強力な免疫応答（細胞溶解活性
を含む）を樹立できるので、この効果は純粋なNAVAC （即ちヌクレオチドのみ）
よりも増強されるであろう。

【００２２】このアプローチの関連用途は、慢性病原体感染の治療である。ゆっくりと複製
しそして細胞から細胞へと伝播する病原体の例は多数ある。これらの感染は慢性
であり、数年または数十年持続する場合もある。この例は、スローウイルス（例
えばビスナ）、Ｂ型肝炎ウイルス、スクラピー物質およびＨＩＶである。病原体
の別の例としては、プラスモジウム（Plasmodium）、ミコバクテリウム（Mycoba cterium ）、ヘリコバクター（Helicobacter）、ボレリア（Borrekia）およびト
キソプラスム（Toxoplasm ）属の生物並びに上述した他の生物が挙げられる。

【００２３】最後に、このアプローチは悪性疾患の治療にも適用できる。例えば、腫瘍細胞
により発現されるタンパク質に対する、Ｔ細胞媒介成分を含む強力な免疫応答を
惹起させるワクチン接種は、潜在的にそれらの細胞の除去をもたらすだろう。

【００２４】上記で用いる「同時」投与とは進行中の同一免疫応答に対して言う。好ましく
は両成分が同時点に投与される（ＤＮＡ＋タンパク質の同時投与）が、しかしな
がら、一化合物を他方の（最初の）投与から数週間（好ましくは１〜10日間）以
内に投与することができ、それらは共に進行中の同一免疫応答の間に作用するこ
とから、この場合も「同時」と見なすことができる。一般に、ポリペプチドを投
与すると、抗原が免疫系に暴露されるやいなや免疫応答が開始するという点で、
免疫応答は即時型であると考えられる。対照的に、核酸を投与すると、ピーク抗
原発現（生体内）は投与３〜７日後に観察され、よって免疫系への抗原暴露はタ
ンパク質ワクチン接種の速度論に比べて「遅延型」であると考えられる。この速
度論の相違にもかかわらず、核酸とポリペプチドの同時投与は、それらが両方と
も進行中の免疫応答の過程の間に機能的に存在するという理解により、「同時」
であると見なすことができる。両方の抗原性形態（即ち、ポリペプチドそれ自体
と、投与されたポリヌクレオチドにより発現されるポリペプチド）を事実上同時
に免疫系に提示するために、製剤からのポリペプチドの放出が投与後遅延される
ような形でポリペプチドが含まれる製剤を想像することができる。これにより、
ポリヌクレオチドからのポリペプチドの発現が最初に起こり、次いでその後に製
剤から遅延放出されたポリペプチドによって前者が補足されることが可能になる
。

【００２５】よって、本発明の別の面は、免疫系から抗原を短期間だけ隠蔽しておくことを
目的とした遅延型放出粒子の形でタンパク質（ポリペプチド）が存在するかまた
は投与される、ＤＮＡ＋タンパク質の両者の同時投与である。好ましくは、その
期間は１〜10日間である。

【００２６】上述した「同時」投与の形態または可能性が異なることにもかかわらず、両方
の抗原性物質が進行中の免疫応答の誘導期の間存在することが本発明にとって重
要である。これに比較して、プライムブースト投与という概念は、(i) ポリヌク
レオチドによる免疫系の一次プライミングに続いて、(ii)一次免疫応答が樹立さ
れてから何週間または何箇月間か後にポリペプチドによる免疫応答の二次的なま
たはブースト処置を行うという２つの別個の免疫応答を言う。

【００２７】よって、ＤＮＡ＋タンパク質複合体は２つの別々の現象として投与することが
でき、または１回投与を可能にするために組み合わせて（混合して）投与するこ
とができる。好ましくは、ＤＮＡとタンパク質が混合される。混合は使用直前に
行うことができ、または２成分を製造（そして製剤化）する時、または、その間
の任意の時にできる。

【００２８】本発明の組成物およびワクチンは、1000：１（即ち１mgＤＮＡ／１μg タンパ
ク質）〜１：１〜１：100 (w/w) の比でＤＮＡ＋タンパク質を含んで成る。好ま
しくは、それは100 ：１〜１：１の範囲である。より好ましくは20：１〜：１の
範囲である。１つの好ましい比は５：１である。

【００２９】アジュバント本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド＋ポリペプ
チド混合物（複合体）は、アジュバント添加する場合、本発明のワクチン製剤に
おいて好ましくはアジュバントが添加される。ワクチン製剤は一般に New Trend
s and Developments in Vaccines, Voller他編, University Park Press, Balti
more, Maryland, 1978に記載されている。Fullerton はリポソーム内のカプセル
化を記載している。米国特許第4,235,877 号明細書。適当なアジュバントとして
は、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）、リン酸ア
ルミニウムもしくはアルガムリンが挙げられるが、カルシウム、鉄もしくは亜鉛
の塩であってもよく、またはアシル化チロシン、アシル化糖類、カチオンもしく
はアニオン誘導体化された多糖類またはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であっ
てもよい。

【００３０】適当なアジュバント系としては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましく
は３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウ
ム塩との組合せである。増強系はモノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との
組合せ、特にWO 94/00153 に開示されたようなＱＳ21と３Ｄ−ＭＰＬの組合せを
含み、またはWO 96/33739 に開示されたようにＱＳ21がコレステロールによりク
エンチングされている低反応性組成物を包含する。水中油型乳剤中にＱＳ21 ３
Ｄ−ＭＰＬとトコフェロールを含む特に有力なアジュバント製剤はWO 95/17210
に記載されており、それは好ましい製剤である。更に、着目の遺伝子およびＣｐ
Ｇ配列をコードすることによりＤＮＡがアジュバントとしても働くことができる
。そのようなＣｐＧ配列またはモチーフは当該技術分野で既知である。

【００３１】製剤本明細書中に記載のポリヌクレオチドおよびタンパク質の医薬上許容される塩
の投与も本発明の範囲に含まれる。そのような塩は、有機塩基と無機塩基を含む
医薬上許容される非毒性塩基から調製することができる。無機塩基から誘導され
る塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、
マグネシウム塩などが挙げられる。医薬上許容される非毒性有機塩基から誘導さ
れる塩としては、第一、第二および第三アミン、塩基性アミノ酸などの塩が挙げ
られる。有用な医薬用塩の記載はS.M. Berge他, J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977
) を参照されたい。この開示は参考として本明細書中に含められる。

【００３２】本発明の製剤のタンパク質成分は、抗原を免疫系から数日間だけ隠蔽しておき
、次いで抗原を放出させることを目的とした遅延型放出粒子の形態で投与するこ
とができる。それを行うことで、ＤＮＡが免疫応答のプライムを一旦開始したら
、タンパク質抗原が放出される。タンパク質抗原による免疫応答の開始とブース
トの両方を達成するための遅延型放出製剤の概念は文献に記載されており、例え
ばCoombes, A. 他〔Vaccine 14:1429-1438 (1996) 〕を参照されたい。タンパク
質抗原の遅延型放出製剤を達成するにあたって最も多く公表されている試みは、
タンパク質抗原が捕捉されているポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から構成さ
れた微粒子を使用している。別の製剤はポリアクリレート、ラテックス、デンプ
ン、セルロースおよびデキストランを使って調製されている。遅延型デリバリー
媒体として使用できる（即ち遅延型放出製剤のための）別の種類の担体は、超分
子バイオベクター（SMBV）である。SMBVは架橋多糖または架橋オリゴ糖のような
非液体親水性コアと、所望によりリン脂質のような両親媒性化合物を含む外層を
含んで成る。例えば、米国特許第5,151,264 号明細書、ＰＣＴ出願 WO 94/20078
, WO 94/23701 およびWO 96/06638 公報を参照のこと。

【００３３】本発明の好ましい態様では、タンパク質抗原をミョウバン上に吸着せしめ、次
いでミョウバン粒子を生分解性ポリマー、例えばポリ（カプロ−ラクトン）また
はポリ（ラクチド−コ−グリコリド）によりコーティングする。公表されたタン
パク質抗原のカプセル化方法とは異なり、そのような製剤は抗原の周りにポリマ
ーの密封層を提供するので、１日から数週間までの範囲の期間にわたり抗原の放
出を防止する。

【００３４】好ましい投与経路である注射のためのポリヌクレオチドおよびタンパク質は、
アンプル中の単位投与形態としてまたは多用量容器中に調製することができる。
ポリヌクレオチドとタンパク質は油中のまたは好ましくは水性媒体中の懸濁液、
溶液または乳剤のような形で存在してもよい。あるいは、ポリヌクレオチド塩を
凍結乾燥形にすることができ、投与の時点でそれを適当な賦形剤、例えば無菌の
発熱物質不含有水により再構成することができる。液状形も再構成できる凍結乾
燥形も両方とも、注射液のｐＨを適当に調整するのに必要な量で、剤、例えば緩
衝剤を含むだろう。どんな用途でも、特に製剤を静脈内投与すべきである場合に
は、溶質の全濃度は該製剤を等張、低張または弱高張にするように制御されるべ
きである。張力の調整には非イオン性物質、例えば糖類が好ましく、特にショ糖
が好ましい。それらの剤形のいずれも、適当な処方剤、例えばデンプン、糖、グ
リセロールまたは食塩溶液を更に含んでもよい。液体または固体のいずれにせよ
、単位用量あたりの組成物は0.1 ％〜99％のポリヌクレオチドとタンパク質様物
質を含んで成ることができる。

【００３５】使用前にポリヌクレオチドとポリペプチドが包装されている単位用量アンプル
または多用量容器は、ポリヌクレオチド（および／またはポリペプチド）の一定
量を収容する気密容器、または医薬上有効な用量、または有効量の倍数に適当な
ポリヌクレオチド（および／またはポリペプチド）を含む溶液を含んで成ること
ができる。ポリヌクレオチドとポリペプチドは無菌製剤として包装され、そして
気密容器は使用まで製剤の無菌性を保持するようにデザインされる。

【００３６】ＤＮＡ／タンパク質複合体の用量および投与経路ポリヌクレオチドは、例えば筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓をはじめとする
動物の体の様々な細胞、または血液細胞に投与することができる。ポリヌクレオ
チド／タンパク質複合体の投与は特定の経路または部位に限定されない。例えば
、経路は筋肉内、皮下、表皮（例えば遺伝子銃を使って）、耳介、経口、膣内、
経鼻などであることができる。好ましい経路は筋肉内、皮下または表皮である。

【００３７】標的指向するのに好ましい組織は筋肉、皮膚および粘膜である。皮膚と粘膜は
、一般的に大部分の感染性物質と遭遇する生理学的部位である。リンパ系組織に
付随する皮膚は、角質細胞、ランゲルハンス細胞および免疫応答の開始と更なる
調節に関与する他の樹状細胞といった特殊細胞を含む。

【００３８】投与すべき用量は、処置する被検体の状態と大きさ並びに処置の頻度と投与経
路に大きく依存する。用量と頻度を含む継続療法のための養生法は、初期応答と
臨床判断により進めることができる。組織の間質内腔への非経口注射経路が好ま
しい経路であるけれども、特殊な投与においては、鼻、喉、気管組織または肺の
粘膜への経路の例として、エーロゾル製剤の吸入といった別の非経口経路が必要
であるかもしれない。更に、鼻、肺および洞のような粘膜表面の感染性疾患に対
するワクチン接種には、経口投与を使うことができる。好ましいプロトコルでは
、水性担体中にポリヌクレオチド／ポリペプチドを含んで成る製剤を、一部位あ
たり10μL から一部位あたり約５mLの量で組織に注入する。製剤中のポリヌクレ
オチド／ポリペプチド複合体の濃度は、約0.1 μg/mLから約20 mg/mLであり、好
ましくは100 〜1000μg/mLの範囲内である。

【００３９】

【実施例】

下記の例は、詳細に別のように記載したところ以外は当業者に周知で、かつ、
日常的である、標準的な技術を用いて行なわれている。実施例は説明のためのも
のであって、本発明を限定するものではない。

【００４０】実施例１．ワクチンの調製Ａ．プラスミドＤＮＡ RSV-F タンパク質のコード配列（Collins 他，Proc. Natl. Acad. Sci. 81:76
83-7687 (1984)) (574アミノ酸）を当業者に周知のクローン化技術を用いて、真
核発現ベクターJA4304（Lu他，J. Virol 70:3978-3991 (1996)) 中にクローン化
した。簡単に言えば、RSV-F 挿入物をHindIII-EcoRV フラグメントとして、Hind
III 及びブラント末端BgIII 制限部位で直線化JA4304中にクローン化した。組換
えプラスミドを制限消化により分析し、挿入部位で配列決定した。注射のための
プラスミドＤＮＡをQiagenカラム（Max-Prep）により精製し、続いてフェノール
／クロロホルムで２回抽出し、エーテル抽出し、エタノール沈澱した。プラスミ
ドＤＮＡを無菌水中に再懸濁し、−20℃で貯蔵した。同様に、HSVgD タンパク質
（McGeoch 他，J. Gen. Virol 68:13-38 (1987))を発現させるのに用いたコード
配列は、HindIII-BamHI-BgIII 二重制限フラグメントに含有されており、JA4304
HindIII-BgIII 中にクローン化された。

【００４１】Ｂ．タンパク質 RSV F タンパク質及びRSV G タンパク質（Huang 他，Virus Res. 2:157-173 (
1985))のコード配列をクローン化し、キメラＦ／Ｇタンパク質を作成した。非常
に簡単に言えば、アミノ酸配列Ｆ（１〜526 ）及びＧ（69〜298 ）の間の融合を
含んで成るキメラ構成体を含有するプラスミドpEE14-FGをA. BOLLEN (ULB/CRI、
ベルギー）との共同研究から受け取った。FG融合タンパク質は全部で755 アミノ
酸を含有する。それはＦのＮ−末端シグナル配列から開始し、Ｆ糖タンパク質の
Ｃ−末端トランスメンブランドメイン（ 526〜576 ）を欠く。次いで、Ｇ糖タン
パク質の細胞外領域はコード領域の３′末端に融合され、アミノ末端領域及びカ
ルボキシ末端領域を欠く。Asp7181 （ブラント）５′−HindIII （ブラント）３
′制限フラグメント（2188塩基対）として、pNIV2857 (A. Bollen, ULB/CRI、ベ
ルギー）からのFGコード配列のpEE14 (Celltech ）のSmaI部位への挿入により、
pEE14-FG発現プラスミドを産生した。用いることができることが当業界で知られ
ている、多くの発現プラスミドがあることに気がつくだろう。

【００４２】由来したCHO K1細胞をリン酸Ca／グリセロールトランスフェクション手順を用
いて２回CsCl精製した、20μｇのpEE14-FGプラスミドＤＮＡでトランスフェクト
した。細胞クローンをGS（グルタミンシンテターゼ）発現系の手順（Crocett 他
，BioTechniques, 8:662 (1990))に従って選択し、グルタミンを含有せず、かつ
、10％の透析FBS （ウシ胎児血清）を補足したGMEM培地中で25μモルのメチオニ
ンスルホキシミン（ＭＳＸ）の存在下に増幅した。トランスフェクト後、39ＭＳ
Ｘ耐性クローンを24−ウェルのプレートでスクリーンし、それらの上清をFG融合
タンパク質の分泌について試験した。すべてのトランスフェクト体は、特異的「
サンドイッチ」ELISA アッセイ（即ち、ウサギポリクローナル抗FG血清／FG抗原
／mAb19 ）を用いて、Ｆ抗原発現について陽性であることが立証された。

【００４３】３つの最も良いFG−プロデューサークローン（ｎ°７、13及び37）を96−ウェ
ルのプレート中で、１ウェルあたり0.07細胞を用いて限界希釈アッセイにおいて
、単細胞サブクローン化した。合計59の陽性サブクローンが得られ、16の最も良
いFGプロデューサークローンをさらにウェスタンブロットとELISA で特徴づけた
。再び、８つの最も良いサブクローンをさらに増幅し、それらのFG発現を酪酸ナ
トリウム（２mM）またはDMSO（１または２％）の存在及び不存在下に評価した。
６つのサブクローンを増幅し、細胞バイアルを作り、−80℃で、または液体窒素
中に貯蔵した。最後に、３つの最も良いFGサブクローンを選択した。これらはCH
OK1 FG °7.18、°13.1及び°37.2である。

【００４４】モノクローナルmAb19 を用いたウェスタンブロット分析（非−還元条件）は約
135kDaにFGの主要バンドを示した。 CHO-FG細胞培地中への酪酸ナトリウムの添加は、サブクローン及び細胞培養増
殖条件に依存して、FGの発現レベルを３〜12倍に増加させた。特に、サブクロー
ンCHO-FG13.1は酪酸塩の存在下にFGタンパク質を８〜10倍多く発現した。

【００４５】凍結細胞培養上清を冷室（４℃〜７℃）で融解した。プロテアーゼ阻害剤（た
とえば、１／1000のアプロチニン、 0.5mg／Ｌのロイペプチン、0.5mM のペファ
ブロック（Pefabloc))を加える。融解した上清をPharmacia SP Sepharose HP （
商標）または速流動樹脂を充てんしたカラム上に載置する。SP Sepharose HP （
商標）または速流動樹脂を20mMのＭＥＳ、pH6.5 、１％のゼシット（thesit）（
緩衝液Ｄ）で平衡化する。載置後、カラムを280nm での吸収が基線に戻るまで緩
衝液Ｄで洗浄する。カラムを連続的に150mM のNaCl、次いで、300mM のNaCl、最
後に１ＭのNaClを含有する緩衝液Ｄで溶出する。

【００４６】 FGを300mM のNaClを含有する緩衝液Ｄで溶出する。必要なら、溶出液をFiltro
n 0 MEGA 30 または50kDa 膜上で濃縮することができるだろう。溶出液は、濃縮
されているかいないかにかかわらず、平衡化されたPharmacia Superdex 200（商
品名）16／60上に載置し、ＰＢＳ、１％のTween 80で溶出する。合計１〜３mgの
タンパク質（Lowry ）を１回の実験に注入する。

【００４７】言及するように、組換え糖タンパク質であるヘルペスシンプレックスウイル
ス（ＨＳＶ）タイプ２（rgD₂t ）の端を切り取った変型も調製した。このような
タンパク質及びＤＮＡコード配列は当業界で既知である（たとえば：EP 139417B
, US 5,656,457及びWO 92/16231 を参照のこと）。

【００４８】組換えヒト免疫欠損ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）エンベロープ糖タンパク
質gp120 を調製した。gp120 発現及びそのＤＮＡコード配列も当業界に既知であ
る（例えば、US 5,653,985, US 5,614,612及びEP 290261Bを参照のこと）。

【００４９】実施例２．マウスの免疫化Ａ．プラスミドＤＮＡワクチン化プラスミドＤＮＡ（RSV-F タンパク質「ＤＮＡＦ」をコードしている）を注
射直前に50μｌの無菌ＰＢＳあたり10μｇの濃度で再懸濁した。麻酔をかけたマ
ウスの前脛骨筋に50μｌのこのＤＮＡワクチンを２回注射した。第１回の注射４
週間後にブースター注射を与えた。あるグループには、ＤＮＡワクチンを最初の
注射でのみ与えた。

【００５０】Ｂ．タンパク質ワクチン接種 FGタンパク質ワクチン。キメラＦ／Ｇタンパク質（「FG」）を精製FGを150mM
のNaCl, 10mM PO₄ (pH7.4 ）に再懸濁することにより、２μｇ／50μｌの１回用
量を調製した。フェノキシエタノールを保存料として 0.5％の濃度で加えた。タ
ンパク質ワクチンを最初の注射の７日前に調製し、４℃で貯蔵した。

【００５１】Ｃ．混合ＤＮＡ／タンパク質ワクチン接種最初の注射の７日前に１回用量あたり２μｇのFGを 26.95μｌのH₂O 及び4.25
μｌの 1.5ＭのNaCl, 100mM PO₄(pH7.4）と混合した。更に、0.25μｌのフェノ
キシエタノールを保存料として加えた。この調製物を４℃で貯蔵した。それぞれ
の注射（第１または第２の）の直前に、5.65μｌのＦをコードするＤＮＡ（10μ
ｇに対応する）をこのタンパク質調製物に加えた。

【００５２】免疫化スキームを下記に示す。

【表１】

【００５３】実施例３．混合ワクチン投与による血清学上の応答マウスを混合ＤＮＡ／タンパク質ワクチン組成物および関連した対照で２回免
疫化し、それらの血清学上の応答を次のプロトコルを用いて分析した。

【００５４】３．ａ．プロトコル：酵素結合免疫吸収剤アッセイ（ELISA ） Maxisorp Nunc 免疫プレートを４℃で１晩50μｌ／ウェルのＰＢＳ中で希釈し
た１μｇ／mlのFG抗原をコーティングするか（プレートのＢ列〜Ｈ列）、または
50μｌの５μｇ／mlのＰＢＳで希釈した、精製ヤギ抗−マウス免疫グロブリン抗
血清（ベーリンガー）をコーティングした（プレートのＡ〜IgG 標準曲線）。プ
レートの飽和を37℃で１時間、 100μｌ／ウェルのＰＢＳ，ＢＳＡ１％、Tween
20 0.1％、NBCS４％（飽和緩衝液）を用いて行った。次いで、１連のIgG （マウ
スポリクローナル抗血清、SIGMA ）の飽和緩衝液での２倍希釈液（１ウェルあた
り50μｌ）を 200ng／mlでの標準開始として列Ａに入れ、血清標本を１／50希釈
で開始する列ＢからＨに適用し、さらに連続的に２倍に希釈し、37℃で１時間半
インキュベートした。ＰＢＳ Tween 20 (0.1％）を用いて３回洗浄した。次いで
、飽和緩衝液で5000倍に希釈したビオチン化ヤギ抗−マウスIgG 抗血清（Amersh
am）を加え、37℃で１時間半インキュベートした。上記のような３回の洗浄及び
飽和緩衝液で1000倍に希釈されたストレプトアビジンビオチン化ホースラディッ
シュペルオキシダーゼ複合体（Amersham）の37℃で30分間の連続的な添加後（50
μｌ／ウェル）、プレートを５回洗浄し、50μｌ／ウェルの基質溶液（50mM pH4
.5クエン酸緩衝液中にOPDA 0.4mg／ml及びH₂O₂ 0.03％）を用いて室温（暗所）
で15分インキュベートした。反応をH₂SO₄2N（50μｌ／ウェル）を加えることに
より停止した。着色反応を波長 492／620mm で多走査ELISA リーダーで読み取っ
た。抗体価をSoftMaxProソフトウェアを用いる４パラメータ数学的方法により計
算した。

【００５５】標準としてマウスモノクローナル抗体（SIGMA ）及び標本についてイソタイプ
特異的ビチオン化ヤギ抗−マウスIgG1、IgG2a 及びIgG2b 抗血清（Amersham）を
用いて、同じプロトコルを用いて血清の特異的イソタイプ分布を決定した。イソ
タイプ分布を合計IgG 特異的免疫応答のパーセントとして表示した。

【００５６】３．ｂ．結果図１（Ig 14 post 2）は、ブースター注射２週間後の免疫化動物における血清
学的応答を示す。２つのワクチン基質の組み合わせは、それぞれの基質を別個に
用いて（（DNAFまたはFG）×２×）得られたものに比較して、RSV-FG特異的抗体
の量を強力に増強した。２つのワクチン化合物を混合すること（（ＤＮＡ＋FG）
２×）は、最初のＤＮＡを用いるプライム及び連続するそのタンパク質（DNAF／
FG）単独でのブースターによる２つの別々の注射でのそれらの投与と同様に有効
である。混合ＤＮＡ／タンパク質ワクチンの総IgG 力価は、別個の基質のそれぞ
れの力価の合計よりもはるかに高く、２つのワクチン基質を混合することによる
相乗効果を示している。

【００５７】図２（IgG イソタイプ14 post 2 ）は種々のワクチングループにおけるイソタ
イプ分布を示す。最初の注射でＤＮＡワクチンを受けたすべてのグループは、タ
イプ１（Ｔｈ１）のＴヘルパー応答を表示する多量のIgG2a を有しているのに対
し、タンパク質グループは全く反対の傾向を有し、Ｔｈ２タイプ応答について典
型的なIgG2イソタイプを有している。驚くべきことに、混合ＤＮＡ＋タンパク質
グループも高レベルのIgG2a イソタイプを有していた。そのタンパク質の直接の
存在がＴｈ２タイプ応答に向けて系を指令すると考えられ、したがって、それが
ＤＮＡワクチンに影響を与え、その後生体内で抗原が産生するから、これは予想
外である。増加した抗体レベルが得られたという事実（図１）は、(i) タンパク
質がこの製剤において免疫反応性でなかったことおよび(ii)認められた応答が単
にＤＮＡワクチンによるものであったという可能性を排除する。

【００５８】実施例４．混合ワクチン投与によるリンパ増殖応答Ｔヘルパー細胞活性の誘導及びＴヘルパー細胞のタイプの決定を次のように評
価した。４．ａ．プロトコル：マウスの脾臓細胞およびリンパ節細胞によるFG−特異的リ
ンパ増殖およびサイトカイン生産の生体内検出生体内刺激脾臓および腸骨のリンパ節を第２免疫化の15日後に採取した。同じグループに
属する動物の脾臓およびリンパ節をプールし、培地１（２mMのＬグルタミンで完
全にしたRPMI 1640 ＋５×10^-2mMの２−メルカプトエタノール＋１mMのピルビン
酸ナトリウム＋１×非必須ＭＥＭアミノ酸＋ 100IU／mlのペニシリン＋ 100μｇ
／mlのストレプトマイシン）（５ml／脾臓細胞、１ml／リンパ節細胞）中で静か
に粉砕し、室温で10分間、1200rpm で遠心分離した。次いで、細胞ペレットを培
地１（３ml／脾臓細胞、１ml／リンパ節）に再懸濁し、細胞懸濁液をマルチサイ
ザー（multisizer）カウンターで数え、培地２（培地１＋１％の熱不活性化正常
マウス血清）において、２×10⁶細胞／mlに調整した。

【００５９】Ｕ底の96ウェルのプレートに１ウェルあたり100ml のこれらの細胞懸濁液を加
えた。特異的再刺激のために、 100μｌの一連の２倍希釈の精製FG（ 1.5〜0.02
3 μｇ／ウェルの範囲に培地２で希釈）を用いた。対照は 100μｌの培地のみを
受け取った。総刺激を最終濃度５μｇ／mlで 100μｌのConA（ベーリンガー）に
より評価した。全刺激条件を三回実施した。次いで、プレートを５％のCO₂のイ
ンキュベーター中で37℃で、FG特異的再刺激のために、それぞれ、48時間（ConA
総刺激）または72時間インキュベートした。その後、 100μｌの上清を各ウェル
から取り出し、³Ｈ−チミジン、１μCi／ウェル（Amersham）を補足した新鮮な
培地１と取り換えた。収集する前に５％のCO₂のインキュベーター中で、37℃で
、プレートをさらに18〜24時間インキュベートした。ニトロセルロースフィルタ
ー上での細胞溶解後、チミジンの取り込みをベータカウンターで測定した。結果
を各再刺激条件についてcpm （３回の平均）で表わす。

【００６０】サイトカイン検出脾臓細胞を培地３（培地１＋10％の熱不活性化FCS ）において５×10⁶細胞／
mlに調整した以外は上記と同様に処理した。24ウェルのプレートに１ウェルあた
り１mlのこれらの細胞懸濁液を加えた。細胞に５μｇ／ml（25μｌ／ウェル）の
精製したFG抗原を加えることにより再刺激を行った（培地を対照として用いた）
。プレートを５％のCO₂インキュベーター中で37℃で72時間インキュベートした
。上清を取り出し、Elisa によりサイトカイン(IFNγおよびIL−５）の存在につ
いて試験した。Maxisorp Nunc 免疫プレートを50μｌ／ウェルの、それぞれ 1.5
μｇ／mlのラットモノクローナル抗マウスINFg（Genzyme ）、または１μｇ／ml
の 0.1Ｍ重炭酸緩衝液（pH9.5 ）で希釈したラットモノクローナル抗−マウスＩ
Ｌ５（Phamingen ）を用いて４℃で１晩コーティングした。プレートの飽和を、
37℃で 100μｌ／ウェルのＰＢＳＢＳＡ１％、Tween 20（ 0.1％）、NBCS４％
（飽和緩衝液）を用いて１時間行なった。

【００６１】次いで、標準を、それぞれ、2430pg／mlまたは2000pg／mlで開始する、飽和緩
衝液中のIFNg（Genzyme ）またはＩＬ５（Pharmingen）のいずれかの一連の２倍
希釈液を入れることにより（１ウェルあたり50μｌ）列Ａに適用した。標本も連
続的に２倍に希釈し、プレートの他の列に加えた。プレートを37℃で１時間半イ
ンキュベートした。ＰＢＳ Tween 20 0.1％を用いて３回洗浄を行った。次いで
、飽和緩衝液で0.5 または 1.0μｇ／ml（それぞれ）に希釈したビオチン化ヤギ
抗−マウスINFgまたはＩＬ５抗血清（それぞれ、Genzyme およびPharmingen）を
37℃で１時間半インキュベート（50μｌ／ウェル）した。上記のような３回の洗
浄および飽和緩衝液で 10000倍に希釈したAMDEX （商標、Amersham）の連続的な
37℃での30分間の添加（50μｌ／ウェル）の後で、プレートを５回洗浄し、50μ
ｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Biorad）を用いて室温で（暗所で）10分間インキ
ュベートした。50μｌ／ウェルのH₂SO₄(0.4N)を加えることにより反応を停止し
た。着色強度を波長 450／630nm で多走査ELISA リーダーで読み取った。結果を
４パラメータ法を用いる対応検量線に関連して、pg／mlのIFNgまたはＩＬ５で表
わす。

【００６２】４．ｂ．結果図３（リンパ増殖）はFG抗原を用いる生体内再刺激による種々のワクチングル
ープからの脾臓細胞のリンパ増殖を示す。２つのワクチン化合物を１つの組成物に組み合わせると、１価（ＤＮＡまたは
タンパク質）のワクチンまたはＤＮＡプライム＋タンパク質ブースト免疫化に比
較して、この細胞応答を強力に増加する。表１（IFNgおよびＩＬ５）は、増殖す
る細胞からの、それぞれ、特異的サイトカイン、ＩＦＮガンマおよびＩＬ５の分
泌を示す。Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ５の分泌は、混合ワクチングループの
強力なリンパ増殖にもかかわらず低い。Ｔヘルパー細胞のＴｈＩタイプに対する
Ｔｈ２の相対的比の測定である、IFNg／ＩＬ−５比はこのグループのイソタイプ
分布と矛盾せず（図２参照）、さらにＴｈ１タイプの免疫応答の誘導についての
混合ワクチン組成物中のＤＮＡの影響を確証する。

【００６３】実施例５．混合ワクチン投与による細胞障害性Ｔ細胞応答細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導を次のように決定した。脾臓細胞を前の節に記載したように調製し、２×10⁷の脾臓細胞を10mlの培地
３（実施例４参照）を有する25cm²のフラスコ中で増殖させた。これらの細胞を
、10／１（Ｅ／Ｓ）の比でＲＳＶ感染させた未だ実験に使用されたことのない脾
臓細胞（刺激細胞）の添加により７日間（37℃、７％のCO₂）刺激した。これら
の後者の刺激細胞は２×10⁶個の溶血正常脾臓細胞をＲＳＶ（ＭＯＩ 0.5）で、
37℃で１時間半、感染させることにより得られた。細胞毒性アッセイの準備にお
いて、EMT6同系標的細胞（クノックスビルのB. Rouse博士により提供された、Ｈ
２ｄ哺乳類アデノカルシノーマ細胞）を次のように調製した。３×10⁶のEMT6を
遠心分離により収集し、培地１で１回洗浄し、 200μｌの培地１に再懸濁した。
細胞を対照のワクシニアウイルス（ＰＳＣ11、負の対照）または10のＭＯＩでRS
V-F を発現する組換えワクシニアウイルスで、37℃で１時間感染させた（ワクシ
ニアウイルスは、ブラッセルのA. Bollen 博士から得た）。次いで、感染細胞を
培地３で１mlに調整し、37℃および７％のCO₂で１晩インキュベートした。

【００６４】次いで、感染細胞を洗浄し、遠心分離により収集し、50μｌのＦＣＳに再懸濁
した。50mlの370MBq／mlの放射能標識したクロム酸ナトリウム（デュポン）を１
時間加えた。標的細胞を培地１で連続３回洗浄し、２×10⁴標的細胞／mlの最終
濃度に調整した。細胞毒性アッセイのために、種々の比率の再刺激したエフェク
ター細胞（ 100／１−30／１−10／１−３／１−１／１のＥ／Ｔ比率）の存在す
る96ウェルのミクロプレートのウェルに、Cr51負荷EMT6標的細胞を入れた。すべ
ての標本は 100μｌ／ウェルで二重に行った。次いで、エフェクターと標的細胞
を含有するミクロプレートを800rpmで５分間遠心分離し、37℃でCO₂を用いて４
時間インキュベートした。その後、50μｌの上清をルマプレート（lumaplate, P
ackard）に移し、１晩乾燥させて、数えた。溶解のパーセントを次のように計算
した：（標本のcpm-同時放出のcpm ）／（最高cpm （トリトン３％溶解）−同時
放出のcpm ）×100 。

【００６５】結果図４は種々のワクチングループにおけるＣＴＬの存在を示す。予想したように
、ＤＮＡのワクチン接種はＣＴＬを誘導するのに対し、アジュバントを加えない
FGタンパク質は、対照標的細胞に向うバックグラウンド溶解と同じであるＣＴＬ
価を有する。ＤＮＡワクチンの１回の投与は、ＣＴＬ誘導を開始し、さらに、タ
ンパク質（単独）またはＤＮＡ（単独）のいずれかを用いるブーストは実質的に
この応答を増加させなかった。２つのワクチン化合物（ＤＮＡ＋タンパク質）の
混合は、ＣＴＬ応答が検出できたので、ＤＮＡ成分によるＣＴＬ応答の誘導に影
響しなかった。アジュバントを加えないタンパク質ワクチンにＤＮＡワクチンを
混合することは、その免疫応答への特別な面、すなわち、ＣＴＬ応答の誘導を可
能とする。

【００６６】実施例６．混合ワクチン投与による増強された体液性応答は、着目のポリペプチ
ドをコードする特異的ポリヌクレオチドによるある場合には、プラスミドＤＮＡは、異種ポリペプチドと共投与するとアジュ
バント効果を作用させることができることが分かった（Sato他，Science 273:35
2-354 (1996)) 。実施例３に説明したような体液性応答の認められた増強がプラ
スミドＤＮＡの非特異的アジュバント効果によることを排除するために次の実験
を行った。次の調製物で実施例３に記載したようにマウスを免疫した：10μｇの
DNA-F 、10μｇのDNA-F ＋２μｇのFG（混合抗原）、２μｇのFgまたは10μｇの
pJA4304 ＋２μｇのFG。この後者のグループは、混合抗原グループに似ているが
、DNA-F と同じベクターバックボーンを有しているプラスミドDNA JA4304はＦポ
リペプチドを発現しないという差異がある。血清学上の応答は第２注射の13日後
に分析した。

【００６７】

【表２】

【００６８】これらの結果から、２つの特異的抗原組成物（すなわち、ポリペプチドFGおよ
びDNA-F ）を混合することは、強力に体液性応答を増強すること並びに相乗効果
が生じることが非常に明らかである。この増強は、同様の、非コードプラスミド
が免疫応答を増強できないから、抗原をコードするプラスミドの存在に依存して
いる。

【００６９】実施例７．ポリペプチド抗原の短遅延型投与は、それぞれのポリヌクレオチドワ
クチンの体液性応答を増強しているコードされたポリペプチドは細胞によるポリヌクレオチドの摂取後に初めて発
現するはずであるから、ポリペプチド抗原は、ポリヌクレオチドワクチンよりも
免疫系へのより迅速な提供を有する。ポリペプチド抗原の短遅延型デリバリーは
２つの免疫原性の組成物を（実質上）同時に免疫系に提供する。

【００７０】マウスに次の免疫原を２回注射した：30μｇのDNA-gp120 、10μｇのgp120 タ
ンパク質、30μｇのDNA-gp120 の４日後に10μｇのgp120 タンパク質（遅延型タ
ンパク質のデリバリー）。体液性応答およびイソタイプ分布を、抗−gp120 特異
的抗体を捕獲するためにgp120 タンパク質を用いて実施例３に記載したように本
質的に決定した。

【００７１】図５は第２注射の14日後の総抗−gp120 IgG 力価を示す。IgG 力価は、タンパ
ク質の投与が４日間遅延した、２つの抗原形（ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チド）を受けたグループにおいて強力に増加した。

【００７２】図６はイソタイプ分布を示す。見れば分かるように、遅延型タンパク質デリバ
リーはＤＮＡグループについて観察すると、多量のIgG2a を維持し、これは、タ
ンパク質だけのグループと大きな対照をなしている。

【００７３】実施例８．遅延型放出製剤 20μｇの抗原gD2tをH₂O （最終容積90μｌ）中の 500μｇのミョウバン（水酸
化アルミニウムに吸着させた。ポリ（カプロラクトン）ジオール（平均Mn 2000
、軟化温度50℃）のエタノール溶液（５ｍ／ml、70℃で）を10：１（ポリカプロ
ラクトン：ミョウバン）まで加え、温度を25℃に平衡化させた。これは、ミョウ
バンの粒子上にポリカプロラクトンの共堆積を生じる。得られたコーティング粒
子を遠心分離により収集し、水で洗浄した。

【００７４】生体内放出速度論のために、標本を放射性ヨウ素化したgD2tを用いて調製した
。gD2tを製造者の指示に従ってIodogen (Pierce ）を用いてヨウ素化した。生体
内速度論を250mM のリン酸ナトリウム中で実施した。この培地はミョウバンから
gD2tの即時の放出を引き起こした。ポリカプロラクトンをコーティングしたミョ
ウバンをこの培地において37℃で８日間インキュベートし、放射能活性測定によ
り培地への抗原の放出を分析した。コーティングされていないミョウバンについ
ては、gD2tは10分以内に培地に放出された。ポリカプロラクトンをコーティング
したミョウバンについては、24時間以内にわずかな（５〜25％）の放出があり、
続いて８日間にわたるゆっくりとした放出があった。生体内研究のために、前記ポリカプロラクトンをコーティングしたミョウバン
をgDをコードするＤＮＡと、10μｇのＤＮＡについて２μｇのタンパク質の比率
で混合した。

【００７５】実施例９．遅延型放出製剤により体液性応答の増加した誘導ＤＮＡおよび対応するタンパク質抗原の両方の同時投与を可能にするために、
上記のように調製した遅延型製剤を試験した。マウスに次の抗原組成物を注射し
た（ALOH-PLCはgD2tを含有するポリカプロラクトンをコーティングしたミョウバ
ンをいう）：

【表３】

【００７６】最初の注射から13日後の体液性応答を測定し、次の表に示す：

【表４】

【００７７】これらの結果から分かるように、組み合わせタンパク質およびＤＮＡ免疫化は
体液性の応答のより強力な誘導をもたらす。グループ２（ＤＮＡの４日後に投与
されたタンパク質）およびグループ４（ＤＮＡおよび製剤化されたタンパク質の
同時注射による遅延型製剤）が非常に類似しているという事実は、タンパク質の
遅延型放出が起こったことおよびポリヌクレオチドの時期でのタンパク質の同時
の存在は、ＤＮＡワクチンにより誘導された体液性応答の誘導を強力に増強する
ことを強く示している。両方のワクチン組成物からの免疫系へのペプチドの実質
上の同時の提供が、核酸ワクチン接種後短期間遅延したポリペプチドのデリバリ
ーにより達成できることが分かる。

【００７８】本明細書に引用した、特許及び特許出願を含むが、これらに限定されない、す
べての出版物は、あたかも各個別の出版物が本明細書における参照により組み込
まれると完全に発表したかのように、特別に及び個別的に示したように、参照に
より本明細書に組み込まれる。

【００７９】上記により本発明の好ましい態様を説明してきたが、本発明は本明細書に開示
されたまさにその指示に限定されるものではなく、請求の範囲内となるすべての
変更に対する権利を留保するものと解すべきである。

【００８０】

【表５】

【００８１】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】（Ig 14 post 2）はブースター注射後２週目の免疫処置動物における血清学的
応答を示す。２つのワクチン基質の組合せは、各々の基質を別々に使用する〔２
×（DNA-F またはFGタンパク質）〕ことによって得られものに比べて、RSV-FG特
異的抗体の量を大きく増加させた。

【図２】（IgG イソタイプ14 post 2 ）は様々なワクチングループにおけるイソタイプ
分布を示す。最初の注射でＤＮＡワクチンを接種しなかった全てのグループが、
タイプ１のＴヘルパー応答（Th１）の指標である高含量のIgＧ2aを有するのに対
し、タンパク質グループは、反対の、即ち、Th２タイプの応答に典型的なIgＧ1
イソタイプの完全な傾向を有する。

【図３】（リンパ増幅）、FG抗原による試験管内再感作による様々なワクチングループ
からの脾細胞のリンパ増幅を示す。

【図４】様々なワクチングループにおけるＣＴＬの存在を示す。

【図５】２回目の注射後14日目の全抗gp120 IgＧ力価を示す。IgＧ力価は、２つの抗原
形（ポリヌクレオチドとポリペプチド）を接種したグループにおいて大きく増加
する。ポリペプチド（タンパク質）投与は４日間遅らせた。

【図６】抗gp120 IgＧ力価のイソタイプ分布を示す。遅延型タンパク質デリバリーは、
ＤＮＡグループに観察されたようなかなりの量のIgＧ2a力価を維持し、これはタ
ンパク質のみのグループと対照的である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年８月２日（１９９９．８．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項１７】哺乳類の免疫応答を増強するために用いられる組成物の製
造における、一緒に混合されたＤＮＡ＋ポリペプチドの使用であって、前記ポリ
ペプチドが遅延型放出製剤中に提供されることを特徴とする使用。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月２５日（２０００．１２．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】 NAVAC による免疫応答の誘導の基礎となる正確な細胞機構および免疫学的機構
はまだ完全には解明されていない。NAVAC が優良とされる証拠は、タンパク質（
ワクチン接種）アプローチによって誘導するのは困難である免疫応答の一部であ
る、細胞障害応答の誘導である。ＣＴＬ応答を誘導するために、抗原は細胞内に
存在するNHC-I 分子の環境中に提示されなければならない。NAVAC ではタンパク
質が細胞内に発現されるので、そのようなMHC-I 提示は容易に達成できる。よっ
て、核酸ワクチン接種は、細胞性免疫、特に着目の抗原に対する細胞障害性Ｔ細
胞応答を刺激するのに非常に適する。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】上述した「同時」投与の形態または可能性が異なることにもかかわらず、両方
の抗原性基質が進行中の免疫応答の誘導期の間存在することが本発明にとって重
要である。これに比較して、プライムブースト投与という概念は、(i) ポリヌク
レオチドによる免疫系の一次プライミングに続いて、(ii)一次免疫応答が樹立さ
れてから何週間または何箇月間か後にポリペプチドによる免疫応答の二次的なま
たはブースト処置を行うという２つの別個の免疫応答を言う。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】本発明の組成物およびワクチンは、1000：１（即ち１mgＤＮＡ／１μg タンパ
ク質）〜１：１〜１：100 (w/w) の比でＤＮＡ＋タンパク質を含んで成る。好ま
しくは、それは100 ：１〜１：１の範囲である。より好ましくは20：１〜１：１
の範囲である。１つの好ましい比は５：１である。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４２】由来したCHO K1細胞をリン酸Ca／グリセロールトランスフェクション手順を用
いて２回CsCl精製した、20μｇのpEE14-FGプラスミドＤＮＡでトランスフェクト
した。細胞クローンをGS（グルタミンシンテターゼ）発現系の手順（Crocett 他
，BioTechniques, 8:662 (1990))に従って選択し、グルタミンを含有せず、かつ
、10％の透析FBS （ウシ胎児血清）を補足したGMEM培地中で25μモルのメチオニ
ンスルホキシミン（ＭＳＸ）の存在下に増幅した。トランスフェクト後、39ＭＳ
Ｘ耐性クローンを24−ウェルのプレートでスクリーンし、それらの上清をFG融合
タンパク質の分泌について試験した。すべてのトランスフェクト体は、特異的「
サンドイッチ」ELISA アッセイ（即ち、ウサギポリクローナル抗FG血清／FG抗原
／mAb19 ）を用いて、Ｆ抗原発現について陽性であることが立証された。モノクローナル抗体19は配座のF1エピトープを認識し、中和性である。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４９】実施例２．マウスの免疫化Ａ．プラスミドＤＮＡワクチン接種プラスミドＤＮＡ（RSV-F タンパク質「ＤＮＡＦ」をコードしている）を注
射直前に50μｌの無菌ＰＢＳあたり10μｇの濃度で再懸濁した。麻酔をかけたマ
ウスの前脛骨筋に50μｌのこのＤＮＡワクチンを２回注射した。第１回の注射４
週間後にブースター注射を与えた。あるグループには、ＤＮＡワクチンを最初の
注射でのみ与えた。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５６】３．ｂ．結果図１（Ig 14 post 2）は、ブースター注射２週間後の免疫化動物における血清
学的応答を示す。２つのワクチン基質の組み合わせは、それぞれの基質を別個に
用いて（（DNAFまたはFG）２×）得られたものに比較して、RSV-FG特異的抗体の
量を強力に増強した。２つのワクチン化合物を混合すること（（ＤＮＡ＋FG）２
×）は、最初のＤＮＡを用いるプライム及び連続するそのタンパク質（DNAF／FG
）単独でのブースターによる２つの別々の注射でのそれらの投与と同様に有効で
ある。混合ＤＮＡ／タンパク質ワクチンの総IgG 力価は、別個の基質のそれぞれ
の力価の合計よりもはるかに高く、２つのワクチン基質を混合することによる相
乗効果を示している。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５８】実施例４．混合ワクチン投与によるリンパ増殖応答Ｔヘルパー細胞活性の誘導及びＴヘルパー細胞のタイプの決定を次のように評
価した。４．ａ．プロトコル：マウスの脾臓細胞およびリンパ節細胞によるFG−特異的リ
ンパ増殖およびサイトカイン生産の試験管内検出試験管内刺激脾臓および腸骨のリンパ節を第２免疫化の15日後に採取した。同じグループに
属する動物の脾臓およびリンパ節をプールし、培地１（２mMのＬグルタミンで完
全にしたRPMI 1640 ＋５×10^-2mMの２−メルカプトエタノール＋１mMのピルビン
酸ナトリウム＋１×非必須ＭＥＭアミノ酸＋ 100IU／mlのペニシリン＋ 100μｇ
／mlのストレプトマイシン）（５ml／脾臓細胞、１ml／リンパ節細胞）中で静か
に粉砕し、室温で10分間、1200rpm で遠心分離した。次いで、細胞ペレットを培
地１（３ml／脾臓細胞、１ml／リンパ節）に再懸濁し、細胞懸濁液をマルチサイ
ザー（multisizer）カウンターで数え、培地２（培地１＋１％の熱不活性化正常
マウス血清）において、２×10⁶ 細胞／mlに調整した。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７３】実施例８．遅延型放出製剤 20μｇの抗原gD2tをH₂O （最終容積90μｌ）中の 500μｇのミョウバン（水酸
化アルミニウム）に吸着させた。ポリ（カプロラクトン）ジオール（平均Mn 200
0 、軟化温度50℃）のエタノール溶液（５ｍ／ml、70℃で）を10：１（ポリカプ
ロラクトン：ミョウバン）まで加え、温度を25℃に平衡化させた。これは、ミョ
ウバンの粒子上にポリカプロラクトンの共堆積を生じる。得られたコーティング
粒子を遠心分離により収集し、水で洗浄した。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７４】試験管内放出速度論のために、標本を放射性ヨウ素化したgD2tを用いて調製し
た。gD2tを製造者の指示に従ってIodogen (Pierce ）を用いてヨウ素化した。生
体内速度論を250mM のリン酸ナトリウム中で実施した。この培地はミョウバンか
らgD2tの即時の放出を引き起こした。ポリカプロラクトンをコーティングしたミ
ョウバンをこの培地において37℃で８日間インキュベートし、放射能活性測定に
より培地への抗原の放出を分析した。コーティングされていないミョウバンにつ
いては、gD2tは10分以内に培地に放出された。ポリカプロラクトンをコーティン
グしたミョウバンについては、24時間以内にわずかな（５〜25％）の放出があり
、続いて８日間にわたるゆっくりとした放出があった。生体内研究のために、前記ポリカプロラクトンをコーティングしたミョウバン
をgDをコードするＤＮＡと、10μｇのＤＮＡについて２μｇのタンパク質の比率
で混合した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者バンメシュラン，マルセルポーレットベルギー国，ベ−1330 リクサンサール，リュドゥランスティテュ 89，スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム (72)発明者ブルック，クロディーヌベルギー国，ベ−1330 リクサンサール，リュドゥランスティテュ 89，スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム (72)発明者フリード，マルタンベルギー国，ベ−1330 リクサンサール，リュドゥランスティテュ 89，スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニムＦターム(参考） 4C076 AA42 AA60 BB11 CC07 FF70 4C085 AA03 BB07 BB23 CC21 EE03 GG01 4C086 AA01 EA16 MA03 MA05 MA66 NA05 NA12 ZB09

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 (i) 着目のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと(i
i)前記着目のポリペプチドの同時投与による核酸ワクチン接種の免疫応答を増強
する方法。
【請求項２】前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記ＤＮＡとタンパク質が混合される、請求項２に記載の方
法。
【請求項５】前記ポリペプチドが前記ポリヌクレオチドの０〜10日後に投
与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記ポリペプチドが前記ポリヌクレオチド後の３〜７日以内
に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記ポリペプチドが遅延型放出製剤中に提供されそして前記
ポリヌクレオチドと同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】 (i) 着目のポリペプチドをコードする核酸と(ii)前記着目の
ポリペプチドの同時投与によるポリペプチドワクチン接種の免疫応答を増強する
方法。
【請求項９】前記核酸がＤＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記核酸がＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】前記ＤＮＡとタンパク質が混合される、請求項９に記載の
方法。
【請求項１２】前記ポリペプチドが遅延型放出製剤中に提供されそして前
記ポリヌクレオチドと同時に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】前記免疫応答がＴｈ１応答である、請求項８に記載の方法
。
【請求項１４】ＤＮＡとポリペプチドを含んで成る医薬組成物であって、
前記ＤＮＡが着目のポリペプチドをコードし、そして前記ＤＮＡ：前記ポリペプ
チドの比が1000：１〜１：１(w/w) である医薬組成物。
【請求項１５】前記ポリペプチドが遅延型放出製剤中に提供される、請求
項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】前記ポリペプチドがポリ（カプロ−ラクトン）またはポリ
（ラクチド−コ−グリコリド）を含んで成る生分解性ポリマーによりコーティン
グされる、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】請求項１４に記載の医薬製剤の調製方法であって、着目の
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを精製し；着目のポリペプチドを精
製し；そしてそれらの組合せを混合することを含んで成る方法。
【請求項１８】請求項１５に記載の医薬製剤の調製方法であって、着目の
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを精製し；着目のポリペプチドを精
製し；着目のポリペプチドを遅延型放出製剤中にカプセル化し、そしてそれらの
組合せを混合することを含んで成る方法。
【請求項１９】ＤＮＡ＋ポリペプチドを含んで成るワクチンであって、前
記ＤＮＡが着目のポリペプチドをコードし、そして前記ＤＮＡ：前記ポリペプチ
ドの比が1000：１〜１：１(w/w) であるワクチン。
【請求項２０】前記ポリペプチドが遅延型放出製剤中に提供される、請求
項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】ＤＮＡ＋ポリペプチドに加えて適当なアジュバントを含ん
で成る、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２２】遅延型製剤中に提供されたＤＮＡ＋ポリペプチドと適当な
アジュバントを含んで成る、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２３】哺乳類の免疫応答を増強するために用いられる組成物の製
造における、一緒に混合されたＤＮＡ＋ポリペプチドの使用。
【請求項２４】哺乳類の免疫応答を増強するために用いられる組成物の製
造における、一緒に混合されたＤＮＡ＋ポリペプチドの使用であって、前記ポリ
ペプチドが遅延型放出製剤中に提供されることを特徴とする使用。