JP2020500891A

JP2020500891A - 新規プロセス

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Publication number: JP2020500891A
Application number: JP2019530148A
Authority: JP
Inventors: カラ，フィリップ; ヘンドリックス，ヴェロニク，モニーク，ロベルテ; クペレ，ビンシアン，マーサドゥ; ケセル，カリーヌ，ベーゼ，ジスレインドゥ
Original assignee: グラクソスミスクラインバイオロジカルズソシエテアノニム
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2020-01-16
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: MX2019006728A; CN110035770B; JP7136777B2; CA3045952A1; US20200061186A1; US10695424B2; BE1025160B1; CN110035770A; BR112019011286A2; BE1025160A1; EP3551222A1; WO2018104313A1

Abstract

本発明は、脂質、ステロール及びサポニンを含むサブミクロンリポソーム組成物の成熟化のための組成物、方法及びプロセスを提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、サポニン含有リポソーム組成物の生産のための改善されたプロセス、特に、そのような組成物の濾過に関する。

過去数十年の間、リポソーム(二分子層脂質小胞(二重層脂質小胞、bilayer lipid vesicle)としても公知)は、医薬化合物を被包及び送達するためにますます使用されている。リポソームは、1種以上の脂質(例えば、リン脂質)の二分子層を含み、その構造中に、タンパク質又は炭水化物などの他の分子を含み得る。リポソーム上の脂質層は、リポソームがその目的地に到達し、標的化される細胞の外膜に接着するまで、封入された医薬化合物を閉じ込め、保護する。このプロセスによって、健康な細胞に対する薬物毒性が最小化され、治療有効性が増加され得る。その構造中の脂質相及び水性相の両方の存在に起因して、リポソームは、両親媒性化合物に加えて、水溶性材料及び脂溶性材料の被包又は捕捉に利用することができる。

リポソームは、アジュバント組成物の製剤化において、ワクチン/免疫原性組成物中で使用され得る。これらのアジュバント組成物は、ヒトに非経口投与される場合が多いので、これらは無菌であることが所望される。アジュバントとして使用されるリポソームは一般に、サブミクロンリポソームであり、0.2μmフィルターを介して無菌濾過されるのに十分に小さい。サブミクロンリポソームの改善された濾過のためのプロセスを提供することが、本発明の目的である。

本発明者らは、サブミクロンリポソーム製剤を成熟させるステップを含む方法を使用して、サポニン含有サブミクロンリポソームの濾過を改善した。従って、本発明は、サブミクロンリポソーム製剤中にサポニンを含む組成物を作製する方法であって、
a.第1のサブミクロンリポソーム製剤を調製するステップであって、リポソームは、脂質及びステロールを含む、ステップ、
b.サポニンを第1のサブミクロンリポソーム製剤に添加するステップ、
c.サポニン含有サブミクロンリポソーム製剤を、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15又は少なくとも16時間にわたって成熟させるステップ、並びに
d.ステップc.の成熟したサポニン含有サブミクロンリポソーム製剤を、無菌グレードのフィルターを介して濾過するステップ
を含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、リポソームが脂質及びステロールを含むサブミクロンリポソーム製剤中にサポニンを含むリポソーム組成物を作製する方法であって、
a)リポソームが脂質及びステロールを含むサポニン含有サブミクロンリポソーム製剤を、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15又は少なくとも16時間にわたって成熟させるステップ、並びに
b)ステップa)の成熟したサポニン含有サブミクロンリポソーム製剤を、無菌グレードのフィルターを介して濾過するステップ
を含む方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、本方法のステップd.の濾過するステップの前又は後のいずれかに、リポソーム組成物が抗原と組み合わされる、本明細書に記載される方法にしたがうリポソーム組成物を調製するステップを含む、ワクチン組成物を調製する方法を提供する。

本明細書に記載される方法に従ってリポソーム組成物を調製するステップ、及び抗原キット構成要素に加えて、キット構成要素としてリポソーム組成物をキット中に包装するステップを含む、ワクチンキットを調製する方法。

実施例2及び3のサポニン含有リポソーム製剤の製剤化を示すフローシートを示す図である。以下の異なるフィルターを使用する濾過前の時間の関数としてのVmaxを示す図である: Sartopore2 0.45/02;
Sartopore2 0.35/0.2;
Sartopore2 0.8/0.2;
Pall EKV;
Pall EDF。
実施例3についての異なる成熟化時間におけるサポニン含有リポソーム製剤ロット1(A)及びロット2(B)の粒子サイズ(nm)の進化(evolution)を示す図である。実施例3についての異なる成熟化時間におけるサポニン含有リポソーム製剤ロット1(A)及びロット2(B)の粒子サイズ(nm)の進化(evolution)を示す図である。実施例3についての異なる成熟化時間におけるサポニン含有リポソーム製剤ロット1(A)及びロット2(B)のPDIの進化を示す図である。実施例3についての異なる成熟化時間におけるサポニン含有リポソーム製剤ロット1(A)及びロット2(B)のPDIの進化を示す図である。実施例3についての異なる成熟化時間におけるサポニン含有リポソーム製剤ロット1(A)及びロット2(B)の、3つの異なるロットのフィルター上でのVmaxを示す図である。実施例3についての異なる成熟化時間におけるサポニン含有リポソーム製剤ロット1(A)及びロット2(B)の、3つの異なるロットのフィルター上での濾過の前及び後のコレステロール含量(μg/ml)を示す図である。

リポソーム、特にサブミクロンリポソームは、免疫学的アジュバントの製剤化において使用され得る。1種以上の抗原と組み合わせてこのリポソームを含むワクチン組成物は、通常非経口投与され、従って、リポソーム組成物は無菌であることが所望される。本発明者らは、驚くべきことに、成熟化ステップ(次のセクションで定義される)が、フィルターの詰まりなどの、リポソームの濾過における問題を解決/回避することを、示した。

従って、本発明は、リポソームが脂質及びステロールを含むサブミクロンリポソーム製剤中にサポニンを含む組成物を作製する方法であって、
a.第1のサブミクロンリポソーム製剤を調製するステップであって、リポソームは、脂質及びステロールを含む、ステップ、
b.サポニンを第1のサブミクロンリポソーム製剤に添加するステップ、
c.サポニン含有サブミクロンリポソーム製剤を、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又は少なくとも16時間にわたって成熟させるステップ、並びに
d.ステップc.の成熟したサポニン含有サブミクロンリポソーム製剤を、無菌グレードのフィルターを介して濾過するステップ
を含む方法を提供する。

成熟化
「成熟化」又は「成熟させる」は、サポニン含有サブミクロンリポソーム組成物が、第1のサブミクロンリポソーム組成物へのサポニンの添加後に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又は少なくとも16時間にわたって貯蔵されることを意味する。一実施形態では、成熟化は、少なくとも4時間、少なくとも6時間又は少なくとも8時間にわたって持続する。一実施形態では、成熟化は、36時間以下、48時間以下又は24時間以下にわたって適用又は実施される。さらなる実施形態では、成熟化は、4〜24時間の間の時間にわたって適用される。さらなる実施形態では、成熟化は、16〜24時間にわたって適用又は実施される。成熟化は、任意の適切な容器中で実施することができる。ある実施形態では、成熟化は、製剤を撹拌することなく実施される。製剤が1回以上の成熟化又は成熟させるステップを受けた後、これは「成熟した」と記載することができる。

成熟化は、任意の適切な温度で実施される。典型的には、成熟化は、室温で、15〜30℃の間の温度で、又は15〜25℃の間の温度で実施される。或いは、成熟化は、約18、19、20、21、22、23、24、25、26又は27℃で実施される。

一実施形態では、成熟化は、8〜24時間の期間にわたって、15〜25℃の間の温度で実施される。

無菌化
「無菌グレードのフィルター」は、有効濾過面積1cm²当たり1×10⁷以上の負荷レベル(challenge level)で微生物を負荷した後に無菌流出物を生成するフィルターを意味する。無菌グレードのフィルターは、本発明の分野の当業者に周知であり、典型的には、約0.2μmの孔サイズを有し、従って、約0.22μmの孔サイズを有するフィルターを含む。本発明の目的のために、無菌グレードのフィルターは、0.1〜0.25μmの間、例えば、0.18〜0.22μmの間の孔サイズを有する。

無菌グレードのフィルターのメンブレンは、例えば、酢酸セルロース、ポリエーテルスルホン(PES)、フッ化ポリビニリデン(PVDF)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)などであるがこれらに限定されない当業者に公知の任意の適切な材料から作製され得る。本発明の特定の実施形態では、本発明のフィルターメンブレンの1つ以上又は全ては、ポリエーテルスルホン(PES)、特に、親水性ポリエーテルスルホンを含む。本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載されるプロセスにおいて使用されるフィルターは、二重層フィルター、特に、エンドフィルターの孔サイズよりも大きい孔サイズを有する作り付けのプレフィルターを備える無菌フィルターである。一実施形態では、無菌化フィルターは、プレフィルターメンブレン層が、0.3〜0.5μmの間、例えば、0.35又は0.45μmの孔サイズを有する二重層フィルターである。さらなる実施形態によれば、フィルターは、非対称フィルターメンブレン(複数可)、例えば、非対称親水性PESフィルターメンブレン(複数可)を含む。或いは、無菌化フィルター層は、例えば非対称親水性PESプレフィルターメンブレン層と組み合わせたPVDFで作製されてもよい。

リポソーム
用語「リポソーム」は、当該分野で周知であり、水性空間を取り囲む1つ以上の脂質二分子層を含む小胞の一般的なカテゴリーを定義する。従って、リポソームは、リン脂質などの1種以上の脂質の二分子層からなり、その構造中に、タンパク質又は炭水化物などの他の分子を含み得る。脂質相及び水性相の両方が存在するので、リポソームは、水溶性材料、脂溶性材料及び/又は両親媒性化合物を被包又は捕捉できる。本発明のために意図されるリポソームは、かなりの量の(リポソーム形成性)脂質を含む。リポソーム形成性脂質は、当該分野で入手可能であり、アニオン性、カチオン性又は中性の脂質であり得る。一実施形態では、リポソーム形成性脂質部分は、中性脂質から本質的になる。「中性脂質」により、脂質の全体的な正味の電荷が(およそ)ゼロであることが理解される。従って、脂質は、全体的に非イオン性であってもよく、又は双性イオン性であってもよい。一実施形態では、リポソームは、双性イオン性脂質を含む。適切な脂質の例は、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン種である。一実施形態では、リポソームは、室温で適切には非結晶性であるリポソーム形成性脂質として、ホスファチジルコリンを含む。そのような非結晶性ホスファチジルコリン脂質の例には、卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)又はジラウリルホスファチジルコリン(DLPC)が含まれる。特定の実施形態では、本発明のリポソームは、DOPCを含み、又はDOPCから本質的になる。

リポソームは、飽和脂質から構成されるリポソーム、例えば、DLPCから構成されるリポソームについて、リポソーム-サポニン構造の安定性を増加させる、限定量の荷電脂質を含むこともできる。これらの場合には、荷電脂質の量は、適切には、リポソーム組成物の1〜20%w/w、好ましくは5〜10%w/wである。そのような荷電脂質の適切な例には、ラウリン酸などの脂肪酸、或いは、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジルセリンが含まれる。適切には、中性リポソームは、5%w/w未満、例えば、3%w/w未満又は1%w/w未満の荷電脂質を含む。特定の実施形態では、リポソームは、例えば、3.5:1〜4.5:1の間、例えば約4:1のDLPC:ラウリン酸比で、DLPC及びラウリン酸から構成される。

本発明のために意図されるリポソームは、ステロールをさらに含む。適切なステロールには、β-シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びコレステロールが含まれる。特定の一実施形態では、リポソームは、ステロールとしてコレステロールを含む。これらのステロールは、当該分野で周知であり、例えば、コレステロールは、動物脂肪中で見出される天然に存在するステロールとして、Merck Index、第11版、341頁に開示されている。ステロールと脂質との比は、典型的には、1:100〜1:2(mol/mol)、適切には1:5〜1:4、又は約1:4である。

具体的な実施形態では、本発明のリポソームは、1:4の比(コレステロール:DOPC)で、DOPC及びコレステロールを含む。

Z-平均直径(ZAD)及び多分散指数(PDI)は、動的光散乱(DLS)によって得られたデータに基づいて決定される。単色のコヒーレントレーザー光ビームが、適切な濃度で液体中に分散された粒子サイズ分析のための代表的サンプルを照射する。所与の角度で粒子によって散乱された光は、検出器(アバランシェフォトダイオード)(このアウトプットは相関器に供給される)によって記録される。分散された粒子は、連続的にブラウン運動しているので、観察された散乱強度は、時間軸に沿って変動する。従って、時間の関数としてのこれらの強度変動の分析は、分散された粒子の運動についての情報を提供する。DLS実験では、時間分析は、散乱強度の時間自己相関関数を構築する相関器を用いて実施される。減衰率は、粒子の並進拡散係数Dと関連付けられる。この減衰は、いわゆるキュムラント法によって、平均粒子サイズ及び多分散指数の観点から解釈される。

粘度ηの媒体中に分散された非相互作用性の球状粒子について、拡散係数Dは、ストークス・アインシュタインの式:

(式中、
kはボルツマン定数であり、
Tは絶対温度であり、
ηは媒体の粘度である)
によって、粒子流体力学的直径dHと関連付けられる。

キュムラント法は、DLS実験によって生成された自己相関関数を分析する単純な方法である。計算は、ISO 13321及びISO 22412で定義されている。このモーメント展開の最初の2つの項は、実際に使用され、サイズについての平均値(z-平均サイズ又はz-平均又はz-平均直径)、及び多分散指数(PDI)として公知の幅パラメーターである。

Z-平均サイズ
z-平均サイズは、強度に基づいて計算された値であり、他の方法によって生成された質量又は数の平均値と混同すべきではなく、又はそれらと直接比較すべきでもない。計算はISO標準で定義されており、従って、推奨されるようにこの計算を使用する全てのシステムは、同じ散乱角度が使用される場合に比較可能な結果を生じるはずである。

動的光散乱において使用されるz-平均サイズ又はz-平均又はz-平均直径は、キュムラント平均としても公知のパラメーターである。これは、この技術によって生成される主要かつ最も安定なパラメーターである。z-平均は、この平均を「調和強度平均粒子直径(harmonic intensity averaged particle diameter)」として定義するISO 13321及びより最近ではISO 22412で定義されるように、品質制御設定として一般に使用される。

z-平均サイズは、サンプル中の小さい変化、例えば、小さい割合の凝集物の存在に対しても敏感であり得るので、z-平均サイズは、サンプルが単峰性(即ち、ピーク1つだけ)、球状又はほぼ球状の形状、単分散(即ち、非常に狭い幅の分布)である場合、及びサンプルが適切な分散剤中で調製される場合にのみ、他の技術によって測定されたサイズと比較可能である。z-平均は流体力学的パラメーターであり、従って、分散物中の粒子又は溶液中の分子にのみ適用可能であることに留意すべきである。

サブミクロンリポソームは、1μm未満の平均直径を有する。リポソーム直径を測定する方法、例えば、動的光散乱は、当業者に周知である。本発明の説明を目的として、リポソームの平均直径は、Z-平均直径(ZAD)として表される。

本発明のリポソームは、約30〜300nmの間、50〜225nmの間、50〜200nmの間、80〜200nmの間、80〜150nmの間又は80〜120nmの間の平均直径を有し得る。或いは、リポソームの平均直径は、約30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275及び300nmであり得る。一実施形態では、本発明の方法によって生産されたリポソームは、50〜150nmの間の平均直径を有する。リポソームの平均直径は、例えば、既知の孔サイズを有する篩又はメッシュを介したリポソーム組成物の押出によって影響され得る。リポソームのサイズを制御するこの方法及びさらなる方法は、当該分野で周知であり、例えば、Mayhewら(1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169-174又はOlsonら(1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9-23に記載されている。本発明の特定の実施形態では、リポソームは、約220nm未満、200nm未満、特に、約50nm〜約150nmの間、特に、約80nm〜120nmの間の平均直径(ZAD)を有する。

多分散指数
この指数は、相関データへの単純な2パラメーターフィットから計算される数である(キュムラント分析)。多分散指数は無次元であり、0〜1のスケールである。非常に小さい値(例えば、0.05)は、高度に単分散の標準に対応する。値が1に近づくほど、粒子のサイズ分布は広くなる。

リポソーム製剤の多分散指数(PDI)は、製剤中のリポソーム粒子の不均一性の尺度である。ある実施形態では、ステップc.の成熟化後のリポソーム製剤のPDIは、0.225未満である。さらなる実施形態では、PDIは、0.200未満である。

サポニン
本発明の方法では、サブミクロンリポソームの調製の後、成熟化ステップの前に、サポニンをリポソーム製剤に添加するステップが提供される。

本発明における使用に特に適切なサポニンは、Quil A及びその誘導体である。Quil Aは、南アメリカの樹木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)から単離されたサポニン調製物であり、Dalsgaardら(「Saponin adjuvants」、Archiv. fuer die gesamte Virusforschung、第44巻、Springer Verlag、Berlin、243-254頁)によって1974年に、アジュバント活性を有することが最初に記載された。Quil Aと関連する毒性を有しないアジュバント活性を保持するQuil Aの精製された断片が、HPLCによって単離されており(EP 0 362 279)、例えば、QS7及びQS21(QA7及びQA21としても公知)である。QS21は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する天然のサポニンであり、CD8+細胞傷害性T細胞(CTL)、Th1細胞及び優勢なIgG2a抗体応答を誘導し、本発明に関連する特定のサポニンである。

特に、本発明における使用のためのサポニンは、Quil Aの免疫学的に活性な画分、例えば、QS-7又はQS21、適切にはQS21である。具体的な実施形態では、QS21は、そのあまり反応発生的でない(less reactogenic)組成物中で提供され、このとき、QS21は、コレステロールなどの外因性ステロール、例えば、リポソーム製剤中に取り込まれるコレステロールなどのステロールでクエンチされる。QS21:ステロールの比は、典型的には、1:100〜1:1(w/w)のオーダー、適切には1:10〜1:1(w/w)の間、及び好ましくは1:5〜1:1(w/w)の間である。適切には、過剰なステロールが存在し、QS21:ステロールの比は、少なくとも1:2(w/w)である。一実施形態では、QS21:ステロールの比は、1:5(w/w)である。ステロールは、適切にはコレステロールである。

緩衝剤(buffer)
リポソーム製剤は、緩衝剤を含み得る。また、本発明の方法は、緩衝剤を第1のリポソーム製剤に添加するさらなるステップを含んでもよい。本発明において使用される緩衝剤には、リン酸緩衝剤(Na/Na₂PO₄、Na/K₂PO₄又はK/K₂PO₄)、トリス緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤又はクエン酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤は、典型的には、5〜20mMの間の量で含まれる。特定の実施形態では、緩衝剤は、リン酸緩衝食塩水(PBS)である。液体混合物のpHは、組成物の治療的構成要素を考慮して調整される。適切には、液体混合物のpHは、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも5.5、少なくとも5.8、少なくとも6である。代替的に述べると、液体混合物のpHは、9未満、8未満、7.5未満又は7未満であり得る。他の実施形態では、液体混合物のpHは、4〜9の間、5〜8の間、5.5〜7.5の間又は5.8〜6.4の間である。具体的な実施形態では、pHは約6.1である。

浸透圧
溶液は、細胞のゆがみ又は溶解を回避するために、医薬的に許容される重量オスモル濃度(osmolality)を有するべきである。医薬的に許容される重量オスモル濃度は一般に、溶液が、およそ等張又は軽度に高張である重量オスモル濃度を有することを意味する。適切には、本発明の免疫原性組成物は、250〜750mOsm/kgの範囲の重量オスモル濃度を有し、例えば、重量オスモル濃度は、250〜550mOsm/kgの範囲、例えば、280〜500mOsm/kgの範囲であり得る。重量オスモル濃度は、市販の浸透圧計、例えば、Advanced Instruments Inc.(USA)から入手可能なAdvanced(登録商標)Model 2020の使用などによって、当該分野で公知の技術に従って測定することができる。

組成物の浸透圧は、例えば、適切な量の等張化剤(isotonifying agent)を提供することによって、当業者に公知の方法を使用して調整することができる。「等張剤(isotonicity agent)」又は「等張化剤」は、生理学的に許容され、製剤と接触している細胞膜を横切る水の正味の流れを防止するために、製剤(例えば、本発明の免疫原性組成物)に適切な浸透圧を付与する化合物である。100mM以上の塩化ナトリウムを含む水性アジュバント組成物、例えば、WO2005/112991及びWO2008/142133中のアジュバントシステムA(ASA)、又はWO2007/068907に開示されたリポソームアジュバントが公知である。

一部の実施形態では、組成物のために使用される等張剤は、塩、例えば塩化ナトリウムである。しかし、他の実施形態では、組成物は、非イオン性等張剤を含み、組成物中の塩化ナトリウムの濃度又はイオン強度は、100mM未満、例えば、80mM未満、例えば、30mM未満、例えば、10mM未満又は5mM未満である。組成物は、非イオン性等張剤を含んでもよく、組成物の伝導率は、5mS/cm未満、例えば4mS/cm未満である。好ましい実施形態では、非イオン性等張剤は、ポリオール、例えばソルビトールである。ソルビトールの濃度は、例えば、約3%〜約15%(w/v)の間、例えば、約4%〜約10%(w/v)の間であり得る。等張剤が塩又はポリオールである、免疫学的に活性なサポニン画分及びTLR4アゴニストを含むアジュバントは、参照によって本明細書に組み込まれるWO2012/080369及びWO2012/080370に記載されている。

サブミクロンリポソーム組成物の調製
ステップa.の第1のサブミクロンリポソーム製剤を調製するプロセスは、WO2013/041572(US20140234403としても公開されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)において入手可能であり、特に、実施例3及び4は、コレステロール及び任意選択で3D-MPLをさらに含むDOPCリポソームのリポソーム調製物を作製する方法を記載している。その中で記載されるリポソーム調製物は、QS21とさらに混合される。

一実施形態では、ステップa.において得られるリポソームは、ホモジナイズ化に供されたものである、又は代替的に述べると、ステップa.は、リポソーム製剤のホモジナイズ化、特に、高剪断及び/又は高圧ホモジナイズ化を含む。

別の実施形態では、ステップa.は、以下のステップを含む、脂質フィルムを形成する方法を使用して実施される:(i)溶媒中に脂質ミックスを溶解させて、均一なミックスを形成するステップ、(ii)溶媒を除去して(例えば、蒸発によって)、脂質フィルムを形成するステップ、(iii)脂質フィルムを水和溶液で水和させて、リポソーム組成物を形成するステップ、及び(iv)リポソームのサイズを低減させて、サブミクロンリポソーム組成物を形成するステップ(特に、高剪断及び/又は高圧ホモジナイズ化を使用することによる)。

ホモジナイズ化
本発明の一実施形態では、リポソームは、高剪断ミキサーで最初に事前ホモジナイズされる。このステップは、粗いリポソームのサイズを低減させることを意図する。ローター又はインペラーは、固定子として公知の静置構成要素、又はローター及び固定子のアレイと一緒に、混合される溶液を含むタンク中で、又は溶液が通過するパイプ中のいずれかで、剪断を生み出すために使用される。高剪断ミキサーは、乳濁物、懸濁物、リオゾル(lyosol)(液体中に分散された気体)及び顆粒状産物を生み出すために使用することができる。

一実施形態では、事前ホモジナイズされたリポソームは、高圧ホモジナイザーでさらにホモジナイズされる。このプロセスは、当該分野で周知であり、通常、標準的なホモジナイザーを含む。溶液は、第1の反応容器においてホモジナイズされてもよく、又は溶液は、ホモジナイズする前に第2の反応容器に移されてもよい。第2の反応容器としての使用に適切な反応容器は、液体の体積を保持でき、これには、ステンレス鋼タンクなどのタンク、フラスコ又はビーカーが含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、リポソーム懸濁物は、ホモジナイズ化の間加圧される。

一実施形態では、リポソームは、高圧ホモジナイザーとインラインの高剪断ホモジナイザーを使用してホモジナイズされる。そのような技術は、当該分野で周知であり、ホモジナイズ化は通常、5000〜30000psiの間の圧力の範囲、即ち、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000又は30000psiで起こる。

TLR-4アゴニスト
さらなる実施形態では、リポソーム製剤は、TLR-4アゴニストをさらに含む。例えば、これは、解毒されたリポポリサッカリドであり得る。リポポリサッカリドは、本発明の方法を使用して生成されたリポソームにおいて免疫賦活薬として機能することを意図する。一実施形態では、リポポリサッカリドは、リピドAの非毒性誘導体、例えば、モノホスホリルリピドA又はより詳細には3-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)である。3D-MPLは、GlaxoSmithKline Biologicals S.A.によって名称MPLとして販売されており、本文書を通じてMPL又は3D-MPLと呼ばれる。例えば、米国特許第4,436,727号、同第4,877,611号、同第4,866,034号及び同第4,912,094号を参照のこと。3D-MPLは主に、IFN-7(Th1)表現型を有するCD4+T細胞応答を促進する。

3D-MPLは、GB2220211 Aに開示される方法に従って産生できる。化学的には、これは、3、4、5又は6つのアシル化鎖を有する3-脱アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。6つのアシル化鎖を20%よりも多く含む混合物が好ましい。本発明の組成物では、小粒子3D-MPLが使用され得る。小粒子3D-MPLは、本発明の目的のために記載される無菌化フィルターのうちの1つなどの無菌化フィルターを介して無菌濾過され得るような粒子サイズを有する。そのような調製物は、WO94/21292に記載されている。

使用され得る他のTLR-4アゴニストは、アルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、例えば、WO98/50399又は米国特許第6,303,347号(AGPの調製のためのプロセスも開示されている)に開示されるもの、適切にはRC527若しくはRC529、又は米国特許第6,764,840号に開示されるAGPの医薬的に許容される塩である。一部のAGPはTLR-4アゴニストであり、一部はTLR-4アンタゴニストである。両方ともアジュバントとして有用であると考えられる。

他の適切なTLR-4リガンドは、WO2003/011223及びWO2003/099195に記載されるとおりであり、例えば、WO2003/011223の4〜5頁又はWO2003/099195の3〜4頁に記載される化合物I、化合物II及び化合物III、並びに特に、ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680及びER804764のような、WO2003/011223に記載されるそれらの化合物である。例えば、1つの適切なTLR-4リガンドは、ER804057である。

本発明において使用され得る他のTLR-4リガンドには、例えば、WO2008/153541若しくはWO2009/143457又は文献Coler RNら(2011) Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant. PLoS ONE 6(1): e16333. doi:10.1371/journal.pone.0016333及びArias MAら(2012) Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4 Agonist, Promotes Potent Systemic and Mucosal Responses to Intranasal Immunization with HIVgp140. PLoS ONE 7(7): e41144. doi:10.1371/journal.pone.0041144に記載される、グルコピラノシル脂質アジュバント(GLA)が含まれる。WO2008/153541又はWO2009/143457は、本発明において使用され得るTLR-4リガンドを定義することを目的として、参照によって本明細書に組み込まれる。

TLR-4リガンド、例えばリポポリサッカリド、例えば3D-MPLは、アジュバント組成物のヒト用量当たり、1〜100μgの間の量で使用され得る。3D-MPLは、約50μg、例えば、少なくとも40μg、少なくとも45μg若しくは少なくとも49μg、又は100μg未満、80μg未満、60μg未満、55μg未満若しくは51μg未満のレベルで使用され得る。適切な範囲の例は、40〜60μgの間、適切には45〜55μgの間又は49〜51μgの間、又は50μgである。さらなる実施形態では、アジュバント組成物のヒト用量は、約25μg、例えば、少なくとも20μg、少なくとも21μg、少なくとも22μg若しくは少なくとも24μg、又は30μg未満、29μg未満、28μg未満、27μg未満若しくは26μg未満のレベルで3D-MPLを含む。より低い範囲の例には、20〜30μgの間、適切には21〜29μgの間若しくは22〜28μgの間若しくは28〜27μgの間若しくは24〜26μgの間、又は25μgが含まれる。

包装
無菌濾過後、無菌サブミクロンリポソーム組成物は、適切な容器中に包装される。サブミクロンリポソーム組成物は、バイアル、特に、単回用量ガラスバイアル中に包装することができる。或いは、サブミクロンリポソーム組成物は、高密度ポリエチレン貯蔵バッグなどのバッグ中に包装することができる。

ワクチンを調製する方法
本発明は、本明細書に記載される本発明のプロセスによってサブミクロンリポソーム組成物を調製するステップ、及びリポソーム組成物と抗原とを組み合わせるステップを含む、ワクチンを調製する方法をさらに提供する。

用語「抗原」は、当業者に周知である。抗原は、ヒト又は動物において免疫応答を生じさせることが可能な、タンパク質、ポリサッカリド、ペプチド、核酸、タンパク質-ポリサッカリドコンジュゲート、分子又はハプテンであり得る。抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、原生動物又は菌類(真菌、fungus)由来の分子に由来し得、それと相同であり得、又はそれを模倣するように合成され得る。本発明の代替的な実施形態では、抗原は、腫瘍細胞又は新生物(neoplasia)由来の分子に由来し、それと相同であり、又はそれを模倣するように合成される。本発明のさらなる実施形態では、抗原は、アレルギー、アルツハイマー病、アテローム動脈硬化症、肥満及びニコチン依存症に関与する物質由来の分子に由来し、それと相同であり、又はそれを模倣するように合成される。

本発明の特定の実施形態では、抗原は、プラスモディウム種(Plasmodium spp)、例えば、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)又は三日熱マラリア原虫(P. vivax)に由来する。

本発明の特定の実施形態では、抗原は、マイコバクテリウム種(Mycobacterum spp)、例えば、結核菌(M. tuberculosis)に由来する。

熱帯熱マラリア原虫に由来する可能な抗原には、スポロゾイト周囲タンパク質(CSタンパク質)、RTS、PfEMP-I、Pfs 16抗原、MSP-I、MSP-3、LSA-I、LSA-3、AMA-I及びTRAPが含まれる。他の熱帯熱マラリア原虫抗原には、EBA、GLURP、RAPl、RAP2、セクエストリン(Sequestrin)、Pf332、STARP、SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230、及び他のプラスモディウム種におけるそれらのアナログが含まれる。抗原は、タンパク質全体又はその免疫原性断片であってもよい。

熱帯熱マラリア原虫CSタンパク質に由来する抗原は、ハイブリッド融合タンパク質の形態であってもよい。融合タンパク質は、別のタンパク質又はその断片に融合された熱帯熱マラリア原虫CSタンパク質に由来するタンパク質を含み得る。融合タンパク質は、熱帯熱マラリア原虫のCSタンパク質由来のN末端又はC末端の断片を含み得る。或いは、又はさらに、融合タンパク質は、熱帯熱マラリア原虫CSタンパク質の中心領域由来の1つ以上の反復単位(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又はそれよりも多い反復単位)を含み得る。一実施形態では、融合タンパク質は、B型肝炎由来の表面抗原(HBsAg)又はその免疫原性断片と一緒に、CSタンパク質に由来する抗原を含むハイブリッド融合タンパク質である。典型的には、B型肝炎由来の表面抗原は、S抗原、例えば、adw血清型に由来するS抗原として公知の主要表面タンパク質を含む。

特に、融合タンパク質は、実質的に全ての熱帯熱マラリア原虫のCSタンパク質のC末端部分、CSタンパク質免疫優性領域の4つ以上のタンデムリピート、及びB型肝炎由来の表面抗原(HBsAg)を含み得る。一態様では、融合タンパク質は、CSタンパク質のC末端部分に対して実質的に相同である少なくとも160のアミノ酸を含む配列を含む。特に、「実質的に全て」のCSタンパク質のC末端部分は、疎水性アンカー配列を欠くC末端を含む。CSタンパク質は、C末端から最後の12〜14(例えば12)のアミノ酸を欠いていてもよい。

一実施形態では、本発明における使用のための融合タンパク質は、直鎖状リンカーを介してHBsAgのN末端にインフレームで融合された、株NF54(Caspersら、上記)に由来する熱帯熱マラリア原虫3D7クローンのアミノ酸207〜395(207 395)に実質的に対応する熱帯熱マラリア原虫のCSタンパク質の一部分を含むタンパク質である。リンカーは、HBsAg由来のpreS2領域の一部又は全てを含み得る。

本発明における使用のための特定の融合タンパク質は、WO93/10152及びWO98/05355に記載される、RTSとして公知の融合タンパク質である。RTSは、RTS,S混合粒子(ここで、「S」は、融合されていないモノマーを示す)の形態で、又はRTSとして存在し得る。RTS,S粒子は、同時に合成され得、例えば精製の間に、複合粒状構造(RTS,S)を自発的に形成し得る2つのポリペプチドRTS及びSを含む。これらの粒子は、ウイルス様粒子(VLP)とも呼ばれ得る。そのような粒子は、いくつかの方法で、例えば、酵母又は細菌などの適切な宿主において融合タンパク質を発現させることによって調製することができる。

B型肝炎由来の表面抗原の存在及びRTS,S粒子の形成は、ハイブリッドタンパク質のCSタンパク質部分の免疫原性を引き上げ、安定性を助け、及び/又はタンパク質の再現性のある製造を補助すると考えられる。

CS抗原は、この寄生生物の生活環のスポロゾイト又はプレ赤血球(pre-erythrocytic)期で発現される任意の抗原、例えば、肝臓期、例えば、肝臓期抗原-1(LSA-1)、肝臓期抗原-3(LSA-3)、トロンボスポンジン関連匿名タンパク質(thrombospondin related anonymous protein)(TRAP)、メロゾイト表面タンパク質-1(MSP1)、主要メロゾイト表面タンパク質及び頂端メロゾイト(merezoite)抗原-1(AMA-1)から選択される別の抗原と併せて使用され得る。CS抗原と併せて使用するための他の適切な抗原には、PfEMP-I、Pfs 16抗原、MSP-3、LSA-3、AMA-I、TRAP、GLURP、RAPl、RAP2、セクエストリン(Sequestrin)、Pf332、STARP、SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230が含まれる。

本明細書に記載される抗原のいずれかの免疫原性断片は、その抗原の少なくとも1つのエピトープを含み、マラリア抗原性を示し、適切な構築物中で提示される場合、例えば、他のマラリア抗原若しくは他の非マラリア抗原に融合される場合、又は担体上で提示される場合など、免疫応答を生じさせることが可能であり、この免疫応答は、ネイティブ抗原に対して向けられるものである。典型的には、免疫原性断片は、マラリア抗原由来の少なくとも20、又は少なくとも50、又は少なくとも100の連続するアミノ酸を含む。

三日熱マラリア原虫由来の可能な抗原には、スポロゾイト周囲タンパク質(CSタンパク質)ベースの抗原並びにDuffy抗原結合タンパク質及びその断片、例えばPvRII(例えば、WO02/12292を参照のこと)が含まれる。

可能なCSタンパク質ベースの抗原には、三日熱マラリア原虫のCSタンパク質に由来する配列を含む融合タンパク質が含まれ得る。一実施形態では、融合タンパク質はハイブリッド融合タンパク質である。本明細書のハイブリッドタンパク質は、三日熱マラリア原虫I型及びII型に由来するタンパク質を含み得る。特に、ハイブリッド融合タンパク質は、別のタンパク質又はその断片に融合された、三日熱マラリア原虫I型及びII型に由来するタンパク質を含み得る。

一態様では、ハイブリッド融合タンパク質は、三日熱マラリア原虫のCSタンパク質(CSV)及びB型肝炎由来の表面抗原、一般に、S抗原、例えば、adw血清型に由来するS抗原として公知の主要表面タンパク質に由来するハイブリッドタンパク質を含む。

好ましくは、融合タンパク質は、a)三日熱マラリア原虫のI型スポロゾイト周囲タンパク質の中心反復セクションに由来する少なくとも1つの反復単位、b)三日熱マラリア原虫のII型スポロゾイト周囲タンパク質の中心反復セクションに由来する少なくとも1つの反復単位、及びc. B型肝炎ウイルスに由来する表面抗原S、を含む免疫原性ハイブリッド融合タンパク質である。

本発明のCSV由来の抗原構成要素は一般に、Sタンパク質のアミノ末端に融合される。より具体的には、CSV断片のC末端は、このS抗原のN末端に融合される。例えば、適切な融合タンパク質は、WO2008/009652に記載される、CSV-Sである。

酵母細胞では、一旦発現されると、ハイブリッド融合タンパク質(S抗原を含む)は、このタンパク質の多数のモノマーから構成されるリポタンパク質構造/粒子(即ちVLP)へと自発的にアセンブルすることができる。そのような粒子は、酵母又は細菌などの適切な宿主において融合タンパク質を発現させることによって調製することができる。

選択されたレシピエント酵母株が、そのゲノム中にB型肝炎S発現カセットの1つ以上の組み込まれたコピーもまた保有する場合、得られた株は、ハイブリッドタンパク質を融合タンパク質として合成し、非融合S抗原もまた合成する。これらは、ハイブリッド融合タンパク質のモノマー及びS抗原のモノマーを含むリポタンパク質粒子へと自発的にアセンブルされ得る。

CSV-S及び/又はRTS単位を含むVLPもまた提供される。粒子は、CSV-S及びRTS単位から本質的になってもよい。或いは、産生される粒子は、CSV-S、RTS及びS単位を含む又はそれらから本質的になる。そのような混合粒子は、例えば、WO2008/009650に記載されている。

結核の分野における目的の抗原には、例えばWO2006/117240に開示されるMtb72f及びそのバリアントが含まれる。特に目的の抗原はM72であり、そのポリペプチド配列は、WO2006/117240の配列番号4に提供され、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号3に提供される。

結核の分野における目的のさらなる抗原は、例えばWO2010/010180に開示されるRv1753及びそのバリアント、例えば、WO2010/010180の配列番号1及び2〜7から選択されるRv1753配列、特に配列番号1である。結核の分野における目的の別の抗原は、例えばWO2010/010179に開示されるRv2386及びそのバリアント、例えば、WO2010/010179の配列番号1及び2〜7から選択されるRv2386配列、特に配列番号1である。結核の分野における目的の他の抗原には、例えばWO2011092253に開示されるRv3616及びそのバリアント、例えば、WO2011/092253の配列番号1及び2〜7から選択される天然のRv3616配列、又は改変されたRv3616配列、例えば、WO2011092253の配列番号161〜169、179及び180から選択されるもの、特に配列番号167が含まれる。目的のさらなる抗原は、例えば、WO97/044463、WO03/044048及びWO2010/149657に開示されるHBHAである。

結核抗原は、適切には、ポリペプチドの形態で利用されるが、或いは、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態で提供されてもよい。

特定の実施形態では、本発明の方法は、水痘帯状疱疹ウイルス(Varicella Zoster Virus、VZV)に由来する抗原を使用する。本発明における使用のためのVZV抗原は、任意の適切なVZV抗原又はその免疫原性誘導体であり得、適切には、精製されたVZV抗原である。用語「免疫原性誘導体」は、ヒトへの投与後にVZVに対する免疫応答を誘導する能力を保持する任意の分子を包含する。

誘導体の生成のための適切な方法は、当該分野で周知であり、これには、例えば、Sambrookら[Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、2000、Cold Spring Harbor Laboratory Press]に開示される標準的な分子生物学の技術、例えば、アミノ酸の付加、欠失、置換若しくは再編成、又はその化学的改変のための技術が含まれる。一態様では、誘導体には、例えば、トランケーション又は他の断片が含まれる。

一態様では、誘導体は、本発明に関して、エピトープ、即ち、ポリペプチドの免疫原性特性を実質的に担い、免疫応答を惹起することが可能な抗原決定基、一態様ではT細胞エピトープである、を含むアミノ酸配列である。

一態様では、免疫原性誘導体の免疫原性活性のレベルは、上記イムノアッセイ技術によって適切にはアッセイされるように、それが由来するポリペプチドについての免疫原性の、少なくとも約50%であり、一態様では少なくとも約70%であり、一態様では少なくとも約90%又は約90%よりも高い。本発明の一部の態様では、対応する全長ポリペプチドの免疫原性活性よりも高いレベルの免疫原性活性を有する、例えば、約100%よりも高い、又は150%以上の免疫原性活性を有する免疫原性部分が、同定され得る。一態様では、VZV抗原は糖タンパク質であり、一態様では、gE抗原(gp1としても公知)又はその免疫原性誘導体である。

gE抗原、そのアンカーなし誘導体(これも免疫原性誘導体である)及びその産生は、EP0405867及びその中の参考文献に記載されている[Vafai A. Antibody binding sites on truncated forms of varicella-zoster virus gpI (gE) glycoprotein Vaccine 1994 12:1265-9もまた参照のこと]。EP192902は、gE及びその産生も開示している。

一態様では、gEは、本明細書の配列番号1の配列、及び参照によって本明細書に完全に組み込まれるVirus research、40巻、1996 199頁以下に開示される配列を有する、トランケートされたgEである。本明細書で以後、gEに対する言及は、文脈から他が明らかでない限り、トランケートされたgEに対する言及を含む。

キット
本発明は、本明細書に記載されるように本発明のサブミクロンリポソーム組成物を調製するステップ、及び抗原キット構成要素に加えて、キット構成要素としてリポソーム組成物をキット中に包装するステップを含む、ワクチンキットを調製する方法をさらに提供する。

抗原及び/又はリポソームは、送達の時に即座に調製することができる。従って、本発明は、混合の準備ができた抗原及びリポソーム組成物を含むワクチンキットを調製する方法を提供する。キットは、抗原及びリポソーム組成物が、使用の時まで別々に維持されることを可能にする。

構成要素は、キット内で互いに物理的に分離されており、この分離は、種々の方法で達成できる。例えば、2つの構成要素は、バイアルなどの2つの別々の容器中に存在し得る。次いで、2つのバイアルの内容物は、例えば、一方のバイアルの内容物を取り出し、それを他方のバイアルに添加すること、又は両方のバイアルの内容物を別々に取り出し、それらを第3の容器(例えば、バイアル)中で混合することによって、混合され得る。

特定の実施形態では、キット構成要素のうちの1つはシリンジ中にあり、他方はバイアルなどの容器中にある。シリンジは、(例えば、針を用いて)その内容物を混合のために第2の容器中に挿入するために使用され得、次いで、混合物がシリンジ中に引き出され得る。次いで、シリンジの混合された内容物は、典型的には新たな無菌針を介して、患者に投与され得る。1つの構成要素をシリンジ中に包装することにより、患者投与のために別々のシリンジを使用する必要性を排除する。別の好ましい配置では、2つのキット構成要素は、同じシリンジ、例えば、二重チャンバーシリンジ中に、別々にではあるが一緒に保持される。シリンジが(例えば、患者への投与の間に)作動されると、2つのチャンバーの内容物は混合される。この配置は、使用の時点での別々の混合ステップの必要性を回避する。

キット構成要素は、水性形態であり得る。一部の実施形態では、構成要素(例えば、抗原)は、乾燥形態(例えば、凍結乾燥形態)であり、他の構成要素(リポソーム組成物)は、水性形態である。2つの構成要素は、乾燥構成要素を再活性化し、患者への投与のための水性組成物を与えるために、混合され得る。凍結乾燥された構成要素は、典型的には、シリンジよりむしろバイアル内に置かれ得る。

乾燥された構成要素は、安定剤、例えば、ラクトース、スクロース又はマンニトール、並びにそれらの混合物、例えば、ラクトース/スクロース混合物、スクロース/マンニトール混合物などを含み得る。1つの可能な配置は、予め充填されたシリンジ中の水性アジュバント構成要素及びバイアル中の凍結乾燥された抗原構成要素を使用する。

本発明の「ワクチン組成物」に関連する本明細書の実施形態は、本発明の「免疫原性組成物」に関連する実施形態にも適用可能であり、逆もまた同様である。

単数形の用語「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「この(the)」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、単語「又は」は、文脈が明確に他を示さない限り、「及び」を含むことを意図する。用語「複数」は、2つ以上を指す。用語「含む(comprises)」は「含む(includes)」を意味する。従って、文脈が他を要求しない限り、単語「含む(comprises)」、並びに「含む(comprise)」及び「含む(comprising)」などのバリエーションは、述べられた化合物若しくは組成物(例えば、核酸、ポリペプチド又は抗原)又はステップ、或いは化合物又はステップの群を含むことを意味するが、任意の他の化合物、組成物、ステップ、又はそれらの群を排除することを意味しないことが理解される。略称「例えば(e.g.)」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、非限定的な例を示すために本明細書で使用される。従って、略称「例えば(e.g.)」は、用語「例えば(for example)」と同義である。本明細書のオープンな暫定的語句「含む(comprising)」、「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」は、全ての場合において、それぞれ、クローズな暫定的語句「〜からなる(consisting of)」、「〜からなる(consist of)」及び「〜からなる(consists of)」によって任意選択で置換可能であることが、本発明者らによって意図される。

さらに、温度、組成物などの物質の百分率、濃度又はレベルに関して与えられる数的限定は、およそであることを意図する。従って、温度が15℃〜25℃と示される場合、この温度は、およそ(又は「」若しくは「約」)15℃〜およそ(又は「」若しくは「約」)25℃であると理解されることを意図する。同様に、濃度は、少なくとも(例えば)200pgであると示される場合、この濃度は、少なくともおよそ(又は「」若しくは「約」)200pgであると理解されることを意図する。数値xに関して用語「約」は、x±5%又はx±10%を意味する。

本明細書に記載される方法及び材料と類似又は等価な方法及び材料が、本開示の実施又は試験において使用され得るが、適切な方法及び材料は、以下に記載される。以下の実施例が本発明を説明する。

[実施例1]
濃縮リポソームバルクの調製
濃縮リポソームバルクを、WO2013/041572(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)の実施例3に記載されるように調製した。簡潔に述べると、濃縮リポソームバルクを、2ステップで調製した。第1のステップは、脂質フィルム調製であった。DOPC(ジオレオイルホスファチジルコリン)、3D-MPL及びコレステロールを、イソプロパノール中に順次溶解させた。次いで、イソプロパノールを、撹拌しながら揮散させ、55℃の温浴中で圧力勾配を低減させて、フィルム残渣を得た。次いで、圧力を徐々に低減させ、最終的な乾燥を適用して、脂質フィルムを得た。第2のステップは、濃縮リポソームバルクの調製であった。その目的のために、脂質フィルムを、PBS中で再水和させ、リポソームの粗い懸濁物を形成した。次いで、リポソーム懸濁物を、高圧ホモジナイザーとインラインの高剪断ミキサーを用いてホモジナイズして、所望のナノサイズのリポソームを生成した。得られた濃縮リポソームバルク(これはQS21を含まない)を、0.22μm PESメンブレンを介して濾過する。実施例における使用のための濃縮リポソームバルクは、10mMリン酸緩衝液(pH6.1)及び150mM NaCl中に、40mg/mlのDOPC、10mg/mlのコレステロール、2mg/mlのMPLを含んでいた。

[実施例2]
サポニン含有リポソームの調製-濾過性
この試験の目的は、異なる成熟化時間(0時間、1/2時間、4時間及び24時間)後の、並びに異なるフィルター(Sartopore2 0.45-0.2μm、Sartopore 2 XLI 0.35-0.2μm、Sartopore XLG 0.8-0.2μm、Pall EKV及びPall EDF)上でのQS21含有リポソーム製剤の濾過性を評価することであった。リポソーム製剤を、図1のフローシートによって示されるプロトコールに従って調製する。要約すると、適切な緩衝液中の、実施例1において調製したような濃縮リポソームバルクへのQS21の添加は、QS21含有リポソーム製剤を生じ、上記のような濾過性評価に供される。本試験のために、濾過に使用したリポソーム製剤は以下の組成を有した。
MPL 100μg/ml
コレステロール 500μg/ml
DOPC 2000μg/ml
QS21 100μg/ml
NaCl 150mM
Na₂HPO₄ 2.1mM
KH₂PO₄ 7.9mM

濾過性を、0.8バールの圧力で試験し、Vmax、即ち、フィルターの遮断前にフィルターを通過できる最大体積として測定した。得られた結果を表1に列挙し、図2に説明する。

結果
使用したフィルターの型にかかわらず、QS21含有リポソーム組成物の濾過性は、成熟化時間に従ったVmaxの増加によって示されるとおり、成熟化時間とともに増加する。リポソームが長く成熟されるほど、Vmaxは高くなる。

[実施例3]
サポニン含有リポソームの調製-粒子サイズ、PDI、Vmax、MPL/QS21/DOPC/コレステロール含量
実施例2について詳述した組成を有する2ロットのQS21含有リポソーム製剤もまた、図1のフローシートに従って生成した。3ロットのPall EKVフィルター(Pall 1、Pall 2及びPall 3)を、成熟化なし(T0)、及び2又は4時間の成熟化(T2H及びT4H)の後に試験した。以下のパラメーターを測定した:
・成熟化の前及び後の平均粒子サイズ(nm)(ZAD)
・成熟化の前及び後のPDI
・濾過の際のVmax(ml/m²)
・濾過の前及び後のMPL、QS21、DOPC及びコレステロール含量

ZAD及びPDIは、ISO 13321及びISO 22412標準に従って測定した。

表2は、異なるロットのPall EKVフィルター上での濾過後の、T0、T2H及びT4Hにおいて測定した示された含量を列挙する。サンプルを、濾過の前にも収集して、参照含量として使用した。

結果
フィルターロットにかかわらず、QS21含有リポソーム製剤の両方のロットで、濾過前に測定した含量と比較して、2時間又は4時間の成熟化時間後(及び濾過後)に測定した含量において、実質的な変動は存在しない。これは、MPL、QS21、DOPC及びコレステロールに関して、含量の喪失が成熟化後に起きなかったことを示している。

粒子サイズ(図3)、PDI(図4)、Vmax(図5)及びコレステロール含量(図6)に関する結果を、図3〜6に示す。図3(3A及び3B)は、リポソームサイズが成熟化時間とともに増加することを示す。図4(4A及び4B)は、並行して、より小さいサイズのリポソームが消失するために、多分散(PDI)が成熟化時間とともに減少することを示す。理論に束縛されることは望まないが、成熟化ステップが存在しない場合、より小さいリポソームの存在がフィルターの孔中に徐々に蓄積し、最終的にフィルターの詰まりを生じ得るので、QS21含有リポソームの成熟化後には、濾過性が改善される(図5A及び5Bにさらに示されるように、Vmaxは、成熟化時間とともに増加する)と考えられる。

配列番号1
1 MGTVNKPVVG VLMGFGIITG TLRITNPVRA SVLRYDDFHI DEDKLDTNSV YEPYYHSDHA
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Claims

リポソームが脂質及びステロールを含むサブミクロンリポソーム製剤中にサポニンを含むリポソーム組成物を作製する方法であって、
a)第1のサブミクロンリポソーム製剤を調製するステップであって、リポソームは、脂質及びステロールを含む、ステップ、
b)サポニンを第1のサブミクロンリポソーム製剤に添加するステップ、
c)サポニン含有サブミクロンリポソーム製剤を、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又は16時間にわたって成熟させるステップ、並びに
d)ステップc)の成熟したサポニン含有サブミクロンリポソーム製剤を、無菌グレードのフィルターを介して濾過するステップ
を含む、方法。
第1のサブミクロンリポソーム製剤が、TLR-4アゴニストをさらに含む、請求項1に記載の方法。
脂質が中性脂質である、請求項1又は2のいずれか一項に記載の方法。
中性脂質が、卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)又はジラウリルホスファチジルコリンから選択されるホスファチジルコリンである、請求項3に記載の方法。
中性脂質がDOPCである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
ステロールがコレステロールである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
脂質とステロールとの比が、3:1〜5:1の間、例えば、約4:1である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
サポニンがQS21である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
TLR-4アゴニストがリポポリサッカリドである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
TLR-4アゴニストが3D-MPLである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
リポソーム製剤が、5〜7の間、例えば、6.1のpHで緩衝化される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
ステップd)の濾過後のリポソームが、80〜120nmの間のZ-平均直径を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
ステップd)のサブミクロンリポソーム製剤を、さらなる無菌グレードのフィルターを介して濾過するステップe)をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
緩衝剤を、ステップa)のサブミクロンリポソーム製剤に添加するステップをさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
ステップd)の濾過するステップが、15〜25℃の間の温度で実施される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
ステップc)の成熟させるステップが、15℃未満、例えば、2〜8℃の間の温度で実施され、ステップd)の濾過するステップが、15〜25℃の間の温度で実施される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
ステップc)の成熟させるステップ及びステップd)の濾過するステップが、15〜25℃の間の温度で実施される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
成熟させるステップが、少なくとも6時間にわたって実施される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
成熟させるステップが、48時間以下、36時間以下又は24時間以下にわたって実施される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
成熟させるステップが、16〜24時間にわたって実施される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
成熟させるステップが、15〜25℃の間の温度で8〜24時間の間実施される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
濾過するステップが、1〜1.5バールの間の圧力で実施される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
ステップc)における成熟化後のサポニン含有サブミクロンリポソーム製剤の多分散指数(PDI)が、0.225未満又は0.200未満である、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
前記無菌グレードのフィルター又は少なくとも１つの無菌グレードのフィルターが、第1層が第2層のフィルターよりも大きい孔サイズを有する二重層フィルターである、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
濾過された組成物が、無菌ガラスバイアル又はバッグ中に包装される、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法を含み、濾過された組成物と抗原とを組み合わせるステップを含む、ワクチン組成物を調製する方法。
ワクチンが、マラリア、帯状疱疹、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、CMV感染、高齢者におけるRSV感染、HBV感染、HIV感染、結核(TB)、HSV感染、HPV感染、ブドウ球菌(Staph)、クロストリジウム・ディフィシル(C Difficile)、市中肺炎(CAP)の予防、減弱又は処置において使用される、請求項26に記載の方法。
請求項1〜25のいずれか一項に従ってリポソーム組成物を調製するステップ、及び抗原キット構成要素に加えて、キット構成要素としてリポソーム組成物をキット中に包装するステップを含む、ワクチンキットを調製する方法。
抗原がバイアル中で凍結乾燥され、リポソーム組成物がシリンジ中にある、請求項28に記載の方法。
リポソームが脂質及びステロールを含むサブミクロンリポソーム製剤中にサポニンを含むリポソーム組成物を作製する方法であって、
a)リポソームが脂質及びステロールを含むサポニン含有サブミクロンリポソーム製剤を、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15又は少なくとも16時間にわたって成熟させるステップ、並びに
b)ステップa)の成熟したサポニン含有サブミクロンリポソーム製剤を、無菌グレードのフィルターを介して濾過するステップ
を含む、方法。
ステップa)の成熟させるステップが、16〜24時間にわたって適用される、請求項30に記載の方法。