CN103169664B - 一种rgd肽修饰的双层载药纳米粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术和纳米医学技术领域,涉及一种RGD肽修饰的双层载药阳离子纳米粒。本发明的纳米粒内核为聚乳酸-羟基乙酸PLGA载药层,外层为载有药物增敏剂的RGD修饰的阳离子聚合物层。该纳米粒可通过受体介导和静电吸附作用穿过血脑屏障,入脑后能富集于脑肿瘤组织,在RGD介导下穿透深入肿瘤实质,与肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞特异结合,并通过内吞入胞。分散于外层的增敏剂首先释放,发挥逆转肿瘤耐药性的作用,分散于内层的药物随后缓慢释出,发挥药物高效、持久和安全的抗肿瘤疗效。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和纳米医学技术领域,涉及一种多肽修饰的双层载药阳离子纳米粒及其制备方法。
技术背景
研究报道,恶性脑胶质瘤是原发性脑肿瘤中发病率最高、治疗最棘手的一类肿瘤,其具有高复发率和高死亡率的特点,长期以来一直是临床治疗的难点。目前国内外公认的针对此病的治疗原则是以手术切除为基础,结合放化疗等辅助手段的综合治疗。其中术后化疗的成败对患者的生活质量和预后影响重大,目前被临床广泛应用的化疗药物主要有抗肿瘤烷化剂(AL)替莫唑胺和卡莫司汀。临床实践已明确术后口服替莫唑胺,或者瘤内放置卡莫司汀缓释小片(以对羧基苯氧丙烷-癸二酸共聚物(PCPP-SA)为载体的卡莫司汀缓释小片,Gliadel)能一定程度上延长胶质瘤患者的生存期,但因胶质瘤细胞呈现浸润性生长,药物很难扩散到整个肿瘤组织,加之易产生耐药性问题导致目前临床化疗效果极其有限。随着纳米技术的广泛应用,制备生物可降解的聚合物纳米粒作为传递和输送药物到脑组织的载体显示了其靶向递药和控制释药的独特优势。所述药物通过静脉注射,载药纳米粒可长时间滞留于循环系统中,同时避免药物的快速清除和降解。研究显示了纳米粒跨BBB所涉及的主要机制包括:纳米粒可吸附于血管内壁上,产生高浓度梯度,通过被动扩散入脑;纳米粒可使内皮细胞紧密连接开放进而渗透入脑;表面修饰特异配体的阳离子纳米粒可通过受体介导和静电吸附介导的胞吞转运作用入脑。然而,目前针对克服BBB的脑靶向 纳米粒大多还处于体外实验和动物实验阶段,不能用于临床治疗。其主要原因是:虽然纳米粒可在一定程度上提高脑内药物浓度,但进入脑内的药物量仍有限,且很难解决脑内药物在整个脑组织无选择性分布的难题,以及同样存在的肿瘤耐药性问题。
O6-苄基鸟嘌呤(O6-Benzylguanine,O6-BG)能有效逆转肿瘤细胞对BCNU和TMZ等烷化剂的耐药性。有关采用O6-BG的全身给药与Gliadel、TMZ等烷化剂联合用药的手段治疗脑肿瘤的临床试验正在进行中,初步试验结果表明O6-BG可增强烷化剂的疗效。
RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽序列是αvβ3整合素的特异性配体,整合素是与癌细胞侵袭转移密切相关的粘附分子,其中,整合素αvβ3在正常血管内皮和上皮细胞很少表达,但在新生血管内皮细胞、肿瘤细胞(包括脑胶质瘤细胞)表面高度表达。有研究证实环形RGD肽与靶细胞表面结合的亲和性比线性RGD更大,表面修饰了RGD环肽的纳米递药系统可获得更有效的肿瘤靶向和针对克服血脑屏障(BBB)的脑靶向效果。但近来许多研究也发现,被普遍研究的RGD环肽(RGDyC,RGDyK,RGDfC,RGDfK等)主要富集在肿瘤血管内部及周围,而进入肿瘤实质和肿瘤细胞内的量极有限;Sugahara等在“Cancer Cell”2009,16,510-520中报道发现一种新型结构的RGD环肽——CRGDK/RGPD/EC,与表达αv整合素的血管内皮细胞和肿瘤细胞的结合亲和力与通常RGD环肽近似,不同的是,此类RGD肽能通过特异性机制进一步穿透深入肿瘤实质并内化进入肿瘤细胞。
发明内容
本发明的目的是鉴于脑部的特殊结构,提供一种RGD肽修饰的双层载 药纳米粒及其制备方法。该双层载药纳米粒既能克服BBB入脑,又能富集于脑肿瘤组织,深入肿瘤实质,并特异性与肿瘤细胞结合,入胞后逆转肿瘤耐药性,进而提高抗肿瘤药物的细胞毒性。
本发明的多肽介导的双层载药阳离子纳米粒,由三个部分组成(如图1所示):(1)最外层含有RGD序列的主动靶向头基;(2)次外层为载O6-BG的阳离子聚合物层;(3)内层为载有抗肿瘤烷化剂BCNU或TMZ的无毒可生物降解的PLGA层。
具体而言,本发明的多肽介导的双层载药阳离子纳米粒,其特征在于,所述纳米粒为双层载药结构,内核为聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)载药层,外层为载有药物增敏剂的RGD修饰的阳离子聚合物(CP)层,其组成通式为:
RGD-CP(O6-BG)/PLGA(AL)纳米粒
其中,RGD为含有RGD序列的环状多肽,通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-SMCC)或双功能的聚乙二醇与CP共价连接;
CP为含有游离氨基的壳聚糖(chitosan,CS)或聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine,PLL);
AL为抗肿瘤烷化剂卡莫司汀(BCNU)或替莫唑胺(TMZ);
O6-BG为抗肿瘤烷化剂的增敏剂O6-苄基鸟嘌呤。
本发明中,所述的环状多肽其结构中含有游离巯基,本发明的实施例中所述的含有RGD序列的环状多肽选自CRGDKGPDC,CRGDKGPEC,CRGDRGPEC,CRGDRGPDC或RGDyC
本发明中,所述的双功能聚乙二醇为分子量在1000-5000Da范围内的MAL-PEG-NHS,其一端含有马来酰亚胺基,另一端含有羟基琥珀酰亚胺活化 酯。
本发明提供了所述的多肽介导的双层载药阳离子纳米粒的制备方法,其包括步骤:
1)RGD环肽与CP的共价连接:
用双功能的MAL-PEG-NHS或Sulfo-SMCC为交联剂,通过共价键,交联剂一端的琥珀酰亚胺活化酯与CP表面氨基连接,另一端的马来酰亚胺基与RGD环肽上游离巯基反应,得RGD-CP;合成路线如下:
2)制备纳米粒:采用乳化溶剂挥发法制备RGD-CP(O6-BG)/PLGA(AL)含药纳米粒:
药物和PLGA溶于二氯甲烷,涡旋混匀作为油相,以加入乳化剂,置冰水浴中行探头超声得初乳后;将初乳加入含有O6-BG的RGD-CP与乳化剂的外水相中搅拌、固化,离心,冻干得RGD-CP/PLGA纳米粒。
本发明中,所述乳化剂选自0.5~5%的PVA水溶液或0.5~5%泊洛沙姆F68。
本发明中,所述油相与外水相的体积比为1∶10~50。
本发明中,采用调节体系pH值到5-8,或者加入0.1%多聚磷酸钠水溶液0.5~5ml进行固化。
经体外释放试验测定,结果显示,本发明的多肽介导的双层载药阳离子纳米粒在pH7.4PBS条件下,释放缓慢,能延长药物作用时间。该纳米粒可通过受体介导和静电吸附作用穿过血脑屏障,入脑后能富集于脑肿瘤组织,在RGD介导下穿透深入肿瘤实质,与肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞特异结合,并通过内吞入胞,分散于外层的增敏剂首先释放,内层的药物缓慢释出,抗肿瘤高效、持久和安全。
本发明的多肽介导的双层载药阳离子纳米粒具有如下显著优点:
(1)阳离子聚合物具有良好的生物降解性,粘膜粘附性,脑组织相容性和肿瘤细胞亲和性;
(2)所采用的RGD序列环肽能介导纳米粒穿过血脑屏障、深入肿瘤实质、与肿瘤新生血管内皮细胞核肿瘤细胞特异结合并内化入胞。
(3)O6-苄基鸟嘌呤能在DNA修复蛋白O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)的半胱氨酸接受位点上形成苄基半胱氨酸,使得AGT失去转 移酶活性,从而有效逆转肿瘤细胞对BCNU和TMZ等烷化剂的耐药性。
附图说明
图1是双层载药纳米粒结构示意图。
图2.1为BCNU的HPLC色谱图;图2.2为TMZ的HPLC色谱图;图2.3为O6-BG的HPLC色谱图。
图3.1为RGD-PEG-CS/PLGA纳米粒的粒径分布图,粒径为150±3.2nm;图3.2为RGD-PEG-PLL/PLGA纳米粒的粒径分布图,粒径为200±2.7nm。
图4为纳米粒透射电镜图,显示明显的双层结构。
图5为多肽介导的双层载药阳离子纳米粒的体外释放曲线,图中显示制得的纳米粒在pH7.4PBS条件下,释放缓慢,能延长药物作用时间。
图6是双层载药阳离子纳米粒的制备流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明加以进一步的说明,但是不限制本发明的内容。
实施例1
1.合成RGD-CS
称取分子量为1μmol壳聚糖(CS),溶于5ml醋酸,称溶液A;称取16μmolRGD(CRGDKGPDC),溶于2.1ml醋酸钠缓冲液,称溶液B。称取16μmol NHS-PEG-MAL于室温下以固体形式加至溶液A中,涡旋30s后,将反应液全部加至溶液B中,继续于室温反应12h。然后转移至截留分子量为50kDa的超滤管,于4000rpm,30min超滤5-6次,去除未反应的PEG-RGD和RGD,收集上层液体冷冻干燥得到白色疏松状固体。
或者:称取分子量为1μmol壳聚糖(CS),溶于5ml醋酸,称溶液A;称取16μmol RGD(CRGDKGPDC),溶于2.1ml醋酸钠缓冲液,称溶液B。称取16μmol的Sulfo-SMCC于室温下加至溶液A中,涡旋30s后,将反应液全部加至溶液B中,继续于室温反应12h。然后转移至截留分子量为50kDa的超滤管,于4000rpm,30min超滤5-6次,去除未反应的小分子反应物,收集上层液体冷冻干燥得到白色疏松状固体。
2.制备RGD-CS(O6-BG)/PLGA(BCNU)纳米粒
称取100.0mgPLGA,溶于4.0ml二氯甲烷,作为油相;称取50.3mgRGD-CS,溶于50ml0.1%醋酸,作为外水相A;称取0.05gPVA,溶于50ml去离子水,作为外水相B;将外水相A和外水相B混合均匀,作为外水相。称取50.2mgBCNU,溶于油相中,涡旋30s,后将含药油相加至10ml 1%PVA中,超声120s,继续加入含O6-BG(40.2mg)的外水相,搅拌挥发有机溶剂。混悬液于14000rpm离心45min,倾去上清液,去离子水洗涤纳米粒两次,14000rpm离心后,即得。
实施例2
同实施例1的制备方法,将处方中的CRGDKGPDC改为相同摩尔数的CRGDKGPEC,固定处方中其它组分用量,制备得到CRGDKGPEC修饰的纳米粒。
实施例3
同实施例1的制备方法,将处方中的CRGDKGPDC改为相同摩尔数的CRGDRGPEC,固定处方中其它组分用量,制备得到CRGDRGPEC修饰的纳米粒。
实施例4
同实施例1的制备方法,将处方中的CRGDKGPDC改为相同摩尔数的CRGDRGPDC,固定处方中其它组分用量,制备得到CRGDRGPDC修饰的纳米粒。
实施例5
同实施例1的制备方法,将CS改为相同剂量的PLL,固定处方中其它组分的用量,制得RGD-PLL(O6-BG)/PLGA(BCNU)纳米粒。
实施例6
同实施例5的试验方法,将BCNU改为相同剂量的TMZ,固定处方中其它试剂的用量,制得RGD-PLL(O6-BG)/PLGA(TMZ)纳米粒。
实施例7:纳米粒的体外释放测定
1)载BCNU纳米粒的体外释放:
称取含有一定量BCNU的纳米粒冻干粉末,溶于pH7.4PBS溶液中,并置于经过EDTA预处理的截留分子量为7000Da透析袋中,以相同pH的PBS缓冲液作为外液,置于37℃恒温振荡器(60rpm)。于固定时间点,取出相应透析袋中纳米粒混悬液,于4℃离心,10000rpm,40min。沉淀复溶于2ml去离子水,冻干。测量冻干品中残余的BCNU含量,计算释放百分数。
2)载TMZ纳米粒的体外释放:
称取含有一定量TMZ的纳米粒冻干粉末,溶于pH7.4PBS溶液中,并置于经过EDTA预处理的截留分子量为7000Da透析袋中,以相同pH的PBS缓冲液作为外液,置于37℃恒温振荡器(60rpm)。于固定时间点,定时从外液取样。HPLC测定TMZ的浓度,计算释放百分数。
Claims (7)
1.一种多肽介导的双层载药阳离子纳米粒,其特征在于,所述纳米粒为双层载药结构,内核为聚乳酸-羟基乙酸PLGA载药层,外层为载有药物增敏剂的RGD修饰的阳离子聚合物CP层,其组成通式为:
RGD-CP(O6-BG)/PLGA(AL)纳米粒
其中RGD为含有RGD序列的环状多肽,其结构中含有游离巯基,通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯或双功能的聚乙二醇与CP共价连接,所述的双功能聚乙二醇为分子量在1000-5000Da范围内的MAL-PEG-NHS,其一端含有马来酰亚胺基,另一端含有羟基琥珀酰亚胺活化酯;
CP为含有游离氨基的壳聚糖CS或聚左旋赖氨酸PLL;
AL为抗肿瘤烷化剂卡莫司汀BCNU或替莫唑胺TMZ;
O6-BG为抗肿瘤烷化剂的增敏剂O6-苄基鸟嘌呤。
2.按权利要求1所述的多肽介导的双层载药阳离子纳米粒,其特征在于,所述的含有RGD序列的环状多肽是CRGDKGPDC,CRGDKGPEC,CRGDRGPEC,或CRGDRGPDC。
3.按权利要求1所述的多肽介导的双层载药阳离子纳米粒的制备方法,其特征在于,其包括步骤:
1)RGD环肽与CP的共价连接:
用双功能的MAL-PEG-NHS或4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯为交联剂,通过共价键,交联剂一端的琥珀酰亚胺活化酯与CP表面氨基连接,另一端的马来酰亚胺基与RGD环肽上游离巯基反应,得RGD-CP;
2)制备纳米粒:采用乳化溶剂挥发法制备RGD-CP/PLGA含药纳米粒,药物和PLGA溶于二氯甲烷,涡旋混匀作为油相,以加入乳化剂,置冰水浴中行探头超声得初乳后;将初乳加入含有O6-BG的RGD-CP与乳化剂的外水相中搅拌、固化,离心,冻干得纳米粒。
4.按权利要求3所述的方法,其特征是,所述RGD环肽选自CRGDKGPDC,CRGDKGPEC,CRGDRGPEC,CRGDRGPDC,或RGDyC。
5.按权利要求3所述的方法,其特征是,所述乳化剂选自0.5~5%的PVA水溶液或0.5~5%泊洛沙姆F68。
6.按权利要求3所述的方法,其特征是,所述油相与外水相的体积比为1:10~50。
7.按权利要求3所述的方法,其特征是,所述固化方法是调节体系pH值到5-8,或者加入0.1%多聚磷酸钠水溶液0.5~5ml。
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