CN111848685A - 一种两亲性pn=ps型含磷树冠大分子纳米胶束的制备方法及其药物载体应用 - Google Patents

一种两亲性pn=ps型含磷树冠大分子纳米胶束的制备方法及其药物载体应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子纳米胶束的制备方法及其药物载体应用，所述将得到的两亲性含磷树冠大分子可在水中自组装为纳米胶束，其内部的疏水空腔能够包埋疏水药物形成稳定的复合物。本发明的方法简单，反应可控性强，易于操作分离，成本低廉，终产物分子量均一，原料来源商品化，具有良好的发展前景。

Description

一种两亲性PN=PS型含磷树冠大分子纳米胶束的制备方法及 其药物载体应用
技术领域
本发明属于药物载体材料及其制备和应用领域，特别涉及一种两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子纳米胶束的制备方法及其药物载体应用。
背景技术
化疗是目前临床上用于癌症治疗的手段之一。化疗药物能有效抑制肿瘤细胞的生长和转移，可以显著提高癌症病患的存活率。同时，化疗药物的缺陷也是明显的，一方面其毒副作用对患者健康的器官和组织造成了很大的损伤；另一方面由于给药效率低使得药量摄入过高，加剧了药物的毒副作用。因此构建有效安全的化疗药物载体，越来越受到研究人员关注。在药物载体系统中，主要有物理包裹和化学键合两种方式负载化疗药物。其中，化学键合虽然使得纳米载体与药物复合材料稳定存在，但也使得药物的释放变得困难。而物理包裹包括吸附、静电作用和疏水作用，药物上载量大且易于响应肿瘤微环境，因此是更为合适的纳米载药平台选择。
对于化疗药物载体，传统聚酰胺型树状大分子(PAMAM)是目前研究最深入的树状大分子之一，它独特的高度支化三维立体结构令其成为一种新型的高分子载体被广泛应用于纳米载药平台。同时，有报道指出PAMAM型树冠大分子纳米胶束可用于负载疏水药物DOX且具有较高的包封率(65％)和上载率(42％)(Wei,T.Peng,L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U. S.A.2015,112,NO.10,2978-2983)。然而，PAMAM的缺枝结构及分子量不均一的缺陷限制了其在纳米医药方面的临床应用。作为树状大分子家族成员的含磷树状大分子(Phosphorous dendrimers)由于其分子量分布均一，骨架结构精准和表面易功能化的特点而受到了研究者的广泛关注。随着纳米技术和纳米医学的不断发展，含磷树状大分子已广泛的应用于催化、材料、生物等领域。但由于含磷树状大分子的刚性分子结构，很难作为药物载体构建纳米载药体系。然而，作为含磷树状大分子家族重要成员的两亲性含磷树冠大分子却鲜为人知，其用作化疗药物载体的研究就更未见报道。两亲性含磷树冠大分子是一种具有疏水部分和亲水端基部分的树冠大分子，其在水溶液中能够形成尺寸均一的纳米胶束。该纳米胶束内部具有疏水空腔可用于负载疏水性药物，其包封率和上载率(详见具体实施部分内容)高于PAMAM 型树冠大分子。
检索国内外文献尚没有发现关于两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子纳米胶束的制备及其作为化疗药物载体用于药物传递的研究。
现有(专利申请号：CN 110294777 A)公开的一种含磷树冠大分子基杂化纳米材料及其制备方法和应用，该两亲性含磷树冠大分子的CMC值为151μM。众所周知，临界胶束浓度(CMC)是胶束的重要指标之一，低CMC值的胶束更容易成型且具有更高的应用价值。因此，我们重新设计构建了PN＝PS型两亲性含磷树冠大分子。该PN＝PS型含磷树冠大分子表面具有更多的亲水基团(单个分子表面多达40个)以及更多的刚性结构(PN＝PS结构)。经荧光探针法检测，该含磷树冠大分子的CMC值仅为27μM。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子纳米胶束的制备方法及其药物载体应用，该设计思路制备的PN＝PS型两亲性含磷树冠大分子的CMC值仅为27μM。
本发明的一种如结构式所示的两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子，
Figure BDA0002536810330000021
本发明的一种两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子材料的制备方法，包括：
(1)将酰胺溶于溶剂中，加入无水碳酸铯，冰浴，逐滴加入修饰有五个对羟基苯甲醛的环三磷腈AB5的溶液，反应，纯化，真空干燥，得到第0.5代的含磷树冠大分子C17G0.5；
(2)将C17G0.5溶于溶剂中，加入无水硫酸钠，冰浴，逐滴加入修饰有一个甲基肼的硫代磷酰氯MMHPSCl2溶液，反应，纯化，真空干燥，得到第1代含磷树冠大分子C17G1；
(3)首先将苯基磷衍生物PN＝PS溶于溶剂中，然后加入无水碳酸铯，冰浴，随后逐滴加入步骤(2)制得的C17G1的溶液，反应，纯化，真空干燥，得到第2代的含磷树冠大分子C17G2；
(4)将C17G2溶于溶剂中，加入无水硫酸钠，冰浴，逐滴加入修饰有一个甲基肼的硫代磷酰氯MMHPSCl2溶液，反应，纯化，真空干燥，得到第3代的含磷树冠大分子C17G3；
(5)将第3代的含磷树冠大分子C17G3溶于溶剂中，逐滴加入N,N-二异丙基乙胺，冰浴，再逐滴加入1-(2-氨基乙基)吡咯烷，搅拌反应，旋转蒸发，洗涤，真空干燥，得到吡咯烷修饰的磷树冠大分子C17G3NC4；
(6)将C17G3NC4溶于溶剂中，冰浴，逐滴加入氯化氢的乙醚溶液，搅拌反应过夜，旋转蒸发，真空干燥，得到两亲性磷树冠大分子纳米材料。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中酰胺为硬脂酸酰胺；溶剂为无水四氢呋喃；酰胺、AB5和无水碳酸铯的摩尔比为1.5:1:3；酰胺的四氢呋喃溶液浓度为0.030-0.090mmol/mL；AB5的四氢呋喃溶液浓度为0.020-0.060mmol/mL；冰浴的时间为10-60分钟；反应为：室温反应6-24h；纯化的工艺条件为：采用溶剂为体积比为1:1的乙酸乙酯和正己烷的柱层析进行纯化。
所述步骤(1)中酰胺是通过将硬脂酸溶于无水二氯甲烷中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐EDC*HCl活化，然后加入溶有酪胺的甲醇溶液，室温反应，纯化，真空干燥制得；AB5是通过将六氯环三磷腈溶于无水四氢呋喃中，加入无水碳酸钾，冰浴，逐滴加入溶有对羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液，室温反应，纯化，真空干燥制得。
进一步，所述硬脂酸、酪胺和EDC*HCl的摩尔比为1:1.5:2；硬脂酸的二氯甲烷溶液浓度为0.20-0.60mmol/mL；酪胺的甲醇溶液浓度为0.30-0.90mmol/mL；六氯环三磷腈、对羟基苯甲醛和无水碳酸钾的摩尔比为1:5:20；六氯环三磷腈的四氢呋喃溶液浓度为0.20-0.60 mmol/mL；对羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液浓度为2-20mmol/mL；活化时间为10-40分钟；室温反应时间均为6-24小时；冰浴时间为10-60分钟；酰胺的纯化工艺条件为：采用溶剂为体积比为1:19的甲醇和二氯甲烷的柱层析进行纯化；AB5的纯化工艺条件为：采用溶剂为体积比为1:3的乙酸乙酯和正己烷的柱层析进行纯化。
所述步骤(2)中MMHPSCl2溶液是通过将硫代磷酰氯溶于无水三氯甲烷中，-61℃条件下逐滴加入溶有甲基肼的三氯甲烷溶液，室温搅拌过夜，过滤制得。
所述步骤(2)中C17G0.5、MMHPSCl2和无水硫酸钠的摩尔比为1:6:12；溶剂为无水二氯甲烷；C17G0.5的二氯甲烷溶液浓度为0.001-0.10mmol/mL；冰浴的时间为10-60分钟；反应的工艺参数为：室温搅拌反应6-24h。
进一步，所述步骤(2)中C17G0.5的无水二氯甲烷溶液浓度为0.04-0.080mmol/mL；MMHPSCl2的氯仿溶液浓度为0.02-0.060mmol/mL。
所述步骤(2)中的纯化步骤为：过滤，旋转蒸发，添加无水四氢呋喃重新溶解产物，逐滴加入至戊烷中，搅拌，移除上清后真空干燥。
所述步骤(3)中苯基磷衍生物PN＝PS是通过将硫化磷的叠氮衍生物(PS)溶于无水无氧的二甲基甲酰胺中，然后加入(4-羟基苯基)二苯基磷(PN)的二甲基甲酰胺无水无氧溶液，室温反应，纯化，真空干燥制得；
进一步，所述PN和PS摩尔比为1:1；PN的二甲基甲酰胺无水无氧溶液浓度为0.20-0.60 mmol/mL；PS的二甲基甲酰胺无水无氧溶液浓度为0.20-0.60mmol/mL；冰浴的时间为10-60 分钟；反应的工艺参数为：室温反应6-24小时；纯化的工艺条件为：采用溶剂为体积比为1:1.5 的乙酸乙酯和正己烷的柱层析进行纯化。
其中硫化磷的叠氮衍生物(PS)是通过将硫代磷酰氯溶于无水四氢呋喃中，加入无水碳酸钾，冰浴，逐滴加入溶有对羟基苯甲醛的无水四氢呋喃溶液，室温反应，纯化，真空干燥制得PS前体，随后将PS前体溶于无水四氢呋喃中，冰浴，逐滴加入混有叠氮化钠的无水四氢呋喃溶液，室温反应，纯化，真空干燥制得PS。
进一步，所述硫代磷酰氯、羟基苯甲醛和无水碳酸钾摩尔比为1:2:4；硫代磷酰氯的无水四氢呋喃溶液浓度为0.20-0.60mmol/mL；羟基苯甲醛的无水四氢呋喃溶液浓度为0.40-1.20 mmol/mL；冰浴的时间为10-60分钟；反应的工艺参数为：室温反应6-24小时；纯化的工艺条件为：采用溶剂为体积比为3:7的乙酸乙酯和正己烷的柱层析进行纯化；
所述PS前体和叠氮化钠摩尔比为1:1.1；PS前体无水四氢呋喃溶液浓度为0.20-0.60 mmol/mL；冰浴的时间为10-60分钟；反应的工艺参数为：室温反应6-24小时；
其中(4-羟基苯基)二苯基磷(PN)是通过将二苯基膦溶于无水无氧二甲基乙酰胺中，冰浴，逐滴加入溶有对碘苯酚的二甲基乙酰胺无水无氧溶液，高温反应，纯化，真空干燥制得PN。
进一步，所述二苯基膦和对碘苯酚摩尔比为1:1；二苯基膦的二甲基乙酰胺无水无氧溶液浓度为0.20-0.60mmol/mL；对碘苯酚的二甲基乙酰胺无水无氧溶液浓度为0.20-0.60 mmol/mL；冰浴的时间为10-60分钟；反应的工艺参数为：130℃反应1-12小时；纯化的工艺条件为：真空干燥。
所述步骤(3)中C17G1、PN＝PS和无水碳酸铯的摩尔比为1:12:30；溶剂为无水二氯甲烷；C17G1的二氯甲烷溶液浓度为0.010-0.050mmol/mL；PN＝PS的二氯甲烷溶液0.10-0.50 mmol/mL；冰浴的时间为10-60min；反应为：室温反应6-24h；纯化的工艺条件为：采用体积比为1:1的戊烷和乙醚混合溶液进行沉淀纯化。
所述步骤(4)中C17G2、无水硫酸钠和MMHPSCl2的摩尔比为1:20:30；溶剂为无水二氯甲烷；C17G2的二氯甲烷溶液浓度为0.002-0.20mmol/mL；冰浴的时间为10-60min；反应为：室温搅拌反应6-24h；纯化的工艺条件为：反应混合液逐滴加入至10倍体积的戊烷溶液中，搅拌，移除上清后真空干燥。
所述步骤(5)中C17G3、N,N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比为1:40:40；C17G3的二氯甲烷溶液浓度为0.01-0.10mmol/mL；冰浴的时间为10-60min；反应为：室温搅拌反应6-24h；纯化的工艺条件为：反应混合液逐滴加入至10倍体积的戊烷溶液中，搅拌，移除上清后真空干燥。
本发明提供一种基于所述两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子的纳米胶束。
本发明提供一种载药含磷树冠大分子的纳米胶束，所述纳米胶束原料组分包括：药物和所述两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子。
本发明提供一种所述载药两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子的纳米胶束的应用。
本发明还提供了一种两亲性含磷树冠大分子纳米胶束的药物载体应用，包括如下步骤：
(1)对1-C17G3进行梯度稀释，制备不同浓度梯度的1-C17G3溶液。然后分别加入芘的丙酮溶液，超声震荡30分钟，静止过夜。通过稳态荧光仪测定混合液在335nm激发波长下的荧光光谱，以I372/I393荧光强度比作为对数函数分析1-C17G3的临界胶束浓度(CMC)；
(2)首先制备固定摩尔浓度的1-C17G3的水溶液，按照不同的1-C17G3与阿霉素(DOX) 的摩尔比，分别加入不同摩尔量的DOX甲醇溶液，避光敞口搅拌过夜，制备得到 1-C17G3@DOX。对未上载的DOX通过紫外分光光度计进行定量。计算最终的上载效率及负载率；
(3)通过纳米粒度分析仪分别对1-C17G3和1-C17G3@DOX水合粒径与表面电势进行表征；
(4)将装有1-C17G3@DOX溶液的透析袋分别置于pH＝7.4和6.8的磷酸缓冲液环境中，放入恒温摇床中，分别测定不同时间点下溶液中DOX的含量。以盐酸阿霉素组为对照，评价载体@DOX在不同pH下的缓释性能。
本发明还提供了一种两亲性含磷树冠大分子纳米药物的传递效率评价方法，包括如下步骤：
(1)将MCF-7细胞和3T3细胞分别种于96孔板，在37℃、5％CO2环境中培养24小时，更换新鲜培养基，加入1-C17G3@DOX与细胞共孵育24小时，后用CCK-8法评价材料的细胞毒性。
(2)将MCF-7细胞种于激光共聚焦显微镜培养皿中，37℃、5％CO2培养24小时，加入1-C17G3@DOX与细胞共孵育4小时，PBS洗涤三次后，Dio染色细胞膜，而后戊二醛固定，最后DAPI染色，洗去残余染色剂后，通过激光共聚焦显微镜观察DOX吞噬情况。
(3)将MCF-7细胞种于12孔板，在37℃、5％CO2环境中培养24小时，更换新鲜培养基，加入1-C17G3@DOX与细胞共孵育4小时，PBS洗涤三次后，胰酶消化后离心收集细胞，PBS重悬，通过流式细胞仪定量分析材料对DOX吞噬效率。
(4)将MCF-7细胞种于6孔板，在37℃、5％CO2环境中培养24小时，更换新鲜培养基，加入1-C17G3@DOX与细胞共孵育4小时，PBS洗涤三次后，更换新鲜培养基，培养 24小时，胰酶消化后离心收集细胞，凋亡试剂盒处理后，利用流式细胞仪对细胞凋亡进行定量分析。
(5)将MCF-7细胞种于12孔板上，于37℃、5％CO2培养24小时，更换新鲜培养基，加入1-C17G3@DOX与细胞共孵育4小时，PBS洗涤三次后，更换新鲜培养基，培养24小时，利用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达，评测治疗效果。
所述培养MCF-7细胞所用有血清培养基为含10％FBS和1％双抗的RPMI 1640培养基，培养3T3细胞所用有血清培养基为含10％FBS和1％双抗的DMEM培养基。共孵育时间为4小时，共孵育后培养时间为24小时。
本发明使用核磁共振(1H NMR,31P NMR和13C NMR)、Zeta电势及水合粒径表征制备的纳米材料。然后利用CCK-8法、细胞吞噬、细胞凋亡和Western blot对1-C17G3的药物传递效率进行评价。
有益效果
(1)本发明的方法简单，反应可控性强，易于操作分离，成本低廉，终产物分子量均一，原料来源商品化，具有良好的发展前景；
(2)本发明制备得到的两亲性含磷树冠大分子可在水中自组装为纳米胶束，其内部的疏水空腔能够包埋疏水药物形成稳定的复合物。细胞实验结果显示，两亲性含磷树冠大分子在一定浓度条件下未表现明显细胞毒性。同时，与纯DOX相比，1-C17G3@DOX对正常细胞表现出了较低的毒性，而对癌细胞则表现较高的毒性。因此，此类两亲性含磷树冠大分子具有用于药物传递的优良前景。
(3)本发明构建了一种两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子，获得理想型胶束单体(低CMC 值型)，与经典型含磷树冠大分子不同，PN＝PS型含磷树冠大分子表面具有更多的亲水基团 (单个分子表面多达40个)以及更多的刚性结构(PN＝PS结构)。经荧光探针法检测，该含磷树冠大分子的CMC值仅为27μM，远远小于现有经典型两亲性含磷树冠大分子(CMC值为151μM，一种含磷树冠大分子杂化纳米材料及其制备和应用(专利CN 110294777A)。同时，TEM结果显示该含磷树冠大分子形貌均一且均为规则的球型，这主要是由于PN＝PS结构的引入增加了其内部双键和苯环的含量，增强了该树状大分子的整体刚性。因此，以PN＝PS型含磷树冠大分子纳米胶束作为载体通过负载疏水性化疗药物，有望制备出一种新型杂化纳米材料用于肿瘤细胞的化疗。
(4)本发明以六氯环三磷腈为核，通过层层修饰的方法合成新型含磷树冠大分子，该树冠大分子具有疏水的烷基长链和亲水的表面官能集团，可在水溶液中自组装形成具有疏水空腔的纳米胶束用于包裹疏水化疗药物，用于肿瘤治疗。本发明原料为商品化来源，制备的两亲性磷树冠大分子的分子量均一，制备方法简单，反应过程可控性高，易于操作；本发明制备的纳米材料可用做疏水性抗肿瘤药物的载体，与已报道的PAMAM型树冠大分子纳米胶束相比具有更高包封率和上载率(PAMAM型最高仅为88％和30％；PNAS,2015,112(10),2978-2983.)，能够有效的提高疏水性药物的治疗效果，拥有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的两亲性磷树冠大分子纳米材料的合成示意图；
图2为实施例1制备的硬脂酸酰胺的核磁共振氢谱图(A)和碳谱图(B)；
图3为实施例1制备的AB5的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C)；
图4为实施例1制备的C17G0.5的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C)；
图5为实施例1制备的C17G1的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C)；
图6为实施例1制备的PN＝PS的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C)；
图7为实施例1制备的C17G2的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C)；
图8为实施例1制备的C17G3的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C)；
图9为实施例1制备的C17G3NC4的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C)；
图10为实施例2中用荧光染料芘测定了两亲性树突状分子1-C17G3的临界胶束浓度；
图11为实施例4中纳米复合物的表面电势图与水动力学粒径图；
图12为实施例4中材料纳米胶束的TEM图与粒径分布直方图(插图)；
图13为实施例5中的在pH 6.8和pH 7.4条件下，1-C17G3@DOX的药物缓释图；
图14为实施例6中纳米胶束和载体@DOX对MCF-7细胞活性的抑制曲线；
图15为实施例6中纳米胶束和载体@DOX对NIH-3T3细胞活性的抑制曲线；
图16为实施例7中MCF-7细胞吞噬阿霉素的荧光显微镜照片；
图17为实施例8中MCF-7细胞DOX吞噬流式细胞术结果图(a)和分析直方图(b)；
图18为实施例9中流式细胞仪检测细胞凋亡分布图；
图19为实施例10中纳米复合物处理MCF-7细胞后的实时荧光定量PCR表达量定量图；
图20为实施例11中纳米复合物处理MCF-7细胞后的蛋白免疫印迹试验蛋白条带的灰度定量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取硬脂酸(1.82mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，加入EDC*HCl(1.82mmol) 活化；然后逐滴加入10mL溶有酪胺(1.82mmol)的甲醇溶液，室温反应12小时，薄层色谱分析(TLC)检测反应进程，通过柱层析进行纯化(二氯甲烷和甲醇，v:v＝1:19)，最后真空干燥得到硬脂酸酰胺。
(2)取六氯环三磷腈(17.25mmol)溶于50mL无水四氢呋喃中，加入无水碳酸钾(172.5 mmol)，冰浴20分钟，逐滴加入5mL溶有对羟基苯甲醛(86.25mmol)的四氢呋喃溶液，室温反应12小时，核磁(31P NMR)检测反应进程，然后通过柱层析进行纯化(正己烷和乙酸乙酯，v:v＝1:3)，最后真空干燥得到修饰有五个对羟基苯甲醛的环三磷腈AB5。
(3)取硫代磷酰氯(30.7mmol)溶于100mL无水三氯甲烷中，-61℃条件下逐滴加入10mL溶有甲基肼(61.4mmol)的三氯甲烷溶液，滴加完毕后室温搅拌过夜，核磁(31P NMR) 检测反应，然后过滤得到修饰有一个甲基肼的硫代磷酰氯MMHPSCl2的三氯甲烷溶液，该溶液的浓度通过核磁氢谱特征质子峰积分计算。
(4)将(1)中的硬脂酸酰胺(0.495mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中，加入无水碳酸铯(0.99mmol)，冰浴20分钟，逐滴加入10mL溶有AB5(0.33mmol)的四氢呋喃溶液，室温反应12小时，核磁(31P NMR)检测反应进程，然后通过柱层析进行纯化(正己烷和乙酸乙酯，v:v＝4:6)，真空干燥得到第0.5代的含磷树冠大分子C17G0.5。
(5)将0.35mmol的C17G0.5溶于50mL无水二氯甲烷中，加入无水硫酸钠(4.2mmol)，冰浴20分钟，逐滴加入2.1mmol的MMHPSCl2溶液，室温反应6小时，核磁(31P NMR和1H NMR)检测反应进程，过滤除去沉淀，旋转蒸发除去有机溶剂，添加10mL无水四氢呋喃重新溶解产物，逐滴加至100mL戊烷中，搅拌0.5小时，移除上清后真空干燥，得到第一代含磷树冠大分子C17G1。
(6)将硫代磷酰氯(3.5mmol)溶于10mL的无水四氢呋喃中，加入无水碳酸钾，冰浴20分钟，逐滴加入5mL溶有对羟基苯甲醛(7mmol)的无水四氢呋喃溶液，室温反应，纯化，真空干燥制得硫化磷的叠氮衍生物前体，随后将PS前体溶于10mL的无水四氢呋喃中，冰浴，逐滴加入2mL含有3.5mmol叠氮化钠的无水四氢呋喃溶液，室温反应12小时，过滤纯化，真空干燥制得硫化磷的叠氮衍生物(PS)。
(7)将二苯基膦(1mmol)溶于5mL的无水无氧二甲基乙酰胺中，冰浴20分钟，逐滴加入2mL溶有对碘苯酚(1mmol)的二甲基乙酰胺无水无氧溶液，130℃反应3小时，真空干燥制得(4-羟基苯基)二苯基磷(PN)。
(8)将(6)中的PS(2mmol)溶于10mL的无水无氧二甲基乙酰胺中，冰浴20分钟，逐滴加入5mL溶有PN的二甲基乙酰胺无水无氧溶液，室温反应12小时，核磁(31P NMR 和1H NMR)检测反应进程。通过柱层析进行纯化(乙酸乙酯和正己烷，v:v＝1:1.5)，真空干燥得到苯基磷衍生物(PN＝PS)。
(9)将(5)中的PN＝PS(0.1mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，加入无水碳酸铯，冰浴20分钟，逐滴加入5mL溶有C17G1(0.5mmol)的二氯甲烷溶液，室温反应12小时，核磁(31P NMR和1H NMR)检测反应进程。过滤除去沉淀，旋转蒸发除去有机溶剂，添加10mL无水四氢呋喃重新溶解产物，逐滴加至100mL戊烷与乙醚的混合液中，搅拌0.5小时，移除上清后真空干燥，得到C17G2。
(10)将(9)中的C17G2(0.05mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入无水硫酸钠，冰浴20分钟，逐滴加入1mmol的MMHPSCl2溶液，室温反应6小时，核磁(31P NMR和1H NMR) 检测反应进程，过滤除去沉淀，旋转蒸发除去有机溶剂，添加10mL无水四氢呋喃重新溶解产物，逐滴加至100mL戊烷中，搅拌0.5小时，移除上清后真空干燥，得到C17G3。
(11)取C17G3(0.4mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙胺(16mmol)，冰浴，而后逐滴加入吡咯烷(16mmol)，室温反应12小时，核磁(31P NMR)检测反应进程，旋转蒸发除去有机溶剂，添加10mL无水四氢呋喃重新溶解产物，逐滴加至100mL 戊烷中，搅拌0.5小时，移除上清后真空干燥，得到C17G3NC4。
(12)取C17G3NC4(0.4mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中，冰浴，而后逐滴加入氯化氢的乙醚溶液(16mmol)，搅拌反应过夜，旋转蒸发，真空干燥，得到两亲性磷树冠大分子纳米材料(1-C17G3)。
本发明使用400MHz核磁共振仪进行氢谱(1H NMR)、磷谱(31P NMR)、碳谱(13C NMR)测试，结果如下：
硬脂酸酰胺：
Figure BDA0002536810330000091
1H NMR(400MHz,MeOD)δ＝0.92(t,3J(H-H)＝8Hz,3H,Ci‘0-H),1.31(m,28H,Ch‘0-H,Cg‘0-H and Cf‘0-H),1.59(m,2H,Ce‘0-H),2.15(t,3J(H-H)＝8Hz,2H,Cd‘0-H),2.70(t,3J(H-H)＝8Hz,2H,Ca‘0-H),3.36(m,2H,Cb‘0-H),6.72(d,3J(H-H)＝8Hz,2H,C2‘0-H),7.04(d,3J(H-H)＝8Hz,2H,C3‘0-H)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,MeOD)δ＝13.02(s,Ci‘0),22.32(s,Ch‘0),25.67(s,Ch‘0),29.21(m,Cf‘0)31.66(s,Cg‘0),34.31(s,Ca‘0),35.74(s,Cd‘0),40.79(s,Cb‘0),49.00(MeOD), 114.78(s,C2‘0),129.29(s,C3‘0),129.81(s,C4‘0),155.50(s,C1‘0),174.83(s,Cc‘0)ppm.
AB5:
Figure BDA0002536810330000101
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.24(m,10H,C2 0-H),7.82(m,10H,C3 0-H),9.98(t,4J(H-C-C13-H)＝4Hz,5H,CHO)ppm.
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ＝5.19(d,2J(p-p)＝84.24Hz,P01,P02),20.73(dd,2JP-P＝88.5 Hz,2JP-P＝84.6Hz)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3)δ＝121.40(m,C2 0),131.44(s,C3 0),133.77(m,C40), 154.29(m,C1 0),190.36(s,CHO),190.48(s,CHO).
PN＝PS：
Figure BDA0002536810330000102
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝6.46(s,1H,OH),6.90(m,2H,C2 1-H),7.31-7.36(m,4H,C2 2-H),7.48(m,6H,C3 1-H and C6 1-H),7.62(m,6H,C7 1-H and C8 1-H),7.81(m,4H,C3 2-H),9.94(s,2.00H,CHO)ppm.
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ＝14.60(d,2J(PN-PS2)＝29Hz,PN),49.52(d,2J(P2-PN)＝29Hz, P2)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3)δ＝115.87(s,C2 1),116.06(s,C2 1),122.07(s,C22), 122.14(s,C2 2),128.62(s,C6 1),128.79(s,C6 1),131.27(s,C3 1,C3 2),132.58(s,C4 2),132.68 (s,C7 1),132.66(s,C7 1),132.71(s,C8 1),134.90(s,C5 1),135.07(s,C5 1),156.91(s,C1 2), 156.98(s,C1 2),191.29(s,CHO)ppm.
C17G0.5:
Figure BDA0002536810330000103
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝0.86(t,3J(H-H)＝8Hz,3H,Ci‘0-H),1.26(m,28H,Ch‘0-H,Cg‘0-H and Cf‘0-H),1.58(m,2H,Ce‘0-H),2.12(t,3J(H-H)＝8Hz,2H,Cd‘0-H),2.78(t,3J(H-H)＝8Hz,2H,Ca‘0-H),3.46(m,2H,Cb‘0-H),5.72(t,3J(H-H)＝6Hz,1H,NH),6.92(d,3J(H-H)＝8 Hz,2H,C2‘0-H),7.04(d,3J(H-H)＝8Hz,2H,C3‘0-H),7.09(m,10H,C2 0-H),7.72(t,3J(H-H)＝8Hz,10H,C3 0-H),9.93(m,5H,CHO)ppm.
31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝7.40(m,P0)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3)δ＝14.11(s,Ci‘0),22.66(s,Ch‘0),25.71(s,Ce‘0),29.48 (m,Cf‘0),31.89(s Cg‘0),35.07(s,Ca‘0),36.73(s,Cd‘0),40.47(s,Cb‘0),120.66(br s,C2‘0), 121.24(s,C2 0),129.84(s,C4 0),131.33(s,C3 0),133.61(m,C3‘0),136.63(s,C4‘0),148.47(m, C1‘0),154.58(br s,C1 0),173.23(s,Cc‘0),190.41(s,CHO),190.45(s,CHO),190.55(s,CHO) ppm.
C17G1:
Figure BDA0002536810330000111
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝0.90(t,3J(H-H)＝8Hz,3H,Ci‘0-H),1.27(m,28H,Ch‘0-H,Cg‘0-H and Cf‘0-H),1.59(m,2H,Ce‘0-H),2.12(t,3J(H-H)＝8Hz,2H,Cd‘0-H),2.77(t,3J(H-H)＝8Hz,2H,Ca‘0-H),3.44(m,2H,Cb‘0-H),3.51(m,15H,CH3-N-P1),5.49(t,3J(H-H)＝8Hz,1H, NH),6.93(d,3J(H-H)＝8Hz,2H,C2‘0-H),7.03(m,10H,C2 0-H),7.62(m,15H,C3 0-Hand CH＝N),7.70(br s,2H,C3‘0-H)ppm.
31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝8.34(m,P0),62.40,62.43(s,P1)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3)δ＝14.15(s,Ci‘0),22.70(s,Ch‘0),25.72(s,Ce‘0),29.52 (m,Cf‘0),31.93(s,Cg‘0),32.03(s,CH3-N-P1),32.05(s,CH3-N-P1),35.19(s,Ca‘0),36.77(s,Cd ‘0),40.67(s,Cb‘0),121.06(br s,C2‘0),121.37(s,C2 0),128.60(s,C30),129.69(s,C4 0), 131.25(s,C3‘0),135.91(s,C4‘0),140.71(m,CH＝N),148.80(br s,C1‘0),151.69(br s,C1 0), 173.16(s,Cc‘0)ppm.
C17G2:
Figure BDA0002536810330000112
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝0.87(t,3J(H-H)＝8Hz,3H,Ci‘0-H),1.23(m,30H,CH2 Ch‘0-H,Cg‘0-H,Cf‘0-H and Ce‘0-H),2.01(t,3J(H-H)＝8Hz,2H,Cd‘0-H),2.59(t,3J(H-H)＝8Hz,2 H,Ca‘0-H),3.32(m,15H,CH3-N-P1),5.98(t,3J(H-H)＝8Hz,1H,NH),6.93(d,3J(H-H)＝8Hz,2 H,C2‘0-H),7.09(m,12H,C3‘0-H and C2 0),7.26(m,40H,C2 2-H),7.38(m,50H,C30-H,C2 1-H and C3 1-H),7.58(m,105H,C6 1-H,C7 1-H,C8 1-H and CH＝N),7.75(m,40H,C3 2-H), 9.86(m,20H,CHO)ppm.
31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝7.67(m,P0),13.87(d,2J(PN-P2)＝31Hz,PN),49.81(td,2J (PN-P2)＝31Hz,P2),60.72,60.79(s,P1)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3)δ＝14.17(s,Ci‘0),22.86(s,Ch‘0),25.74(s,Ce‘0),29.52 (m,Cf‘0),31.90(s,Cg‘0),32.26(s,CH3-N-P1),32.30(s,CH3-N-P1),35.33(s,Ca‘0),36.11(s,Cd ‘0),40.29(s,Cb‘0),121.05(br s,C2‘0),121.66(m,C2 1),122.01(s,C22),124.47(br s,C2 0), 125.89(s,C4 1),127.31(s,C3 0),128.43(s,C4 0),128.79(s,C6 1),128.92(s,C6 1),131.19(s,C3 1 and C3 2),131.71(s,C3‘0),132.53(s,C4 2),132.64(s,C7 1),132.68(s,C7 1),132.99(br s,C8 1),134.68(s,C5 1),134.81(s,C51),140.04(m,CH＝N),153.43(br s,C1 0 and C1 1),156.69(s, C1 2),156.78(s,C1 2),173.53(s,Cc‘0),190.93(s,CHO)ppm.
C17G3:
Figure BDA0002536810330000121
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝0.88(t,3J(H-H)＝6Hz,3H,Ci‘0-H),1.23(m,30H,Ch‘0-H,Cg‘0-H,Cf‘0-H and Ce‘0-H),1.99(t,3J(H-H)＝8Hz,2H,Cd‘0-H),2.57(t,3J(H-H)＝8Hz,2H,Ca‘0-H),3.20(m,2H,Cb‘0-H),3.25(m,15H,CH3-N-P1),3.41(m,60H,CH3-N-P2),5.92(t,3J(H-H)＝4Hz,1H,NH),6.91(d,3J(H-H)＝8Hz,2H,C2‘0-H),7.08(m,12H,C3‘0-H and C2 0-H),7.16(m,40H,C2 2-H),7.31(m,10H,C3 0-H),7.40(m,40H,C3 2-H),7.57(m,165H,C2 1-H,C3 1-H,C6 1-H,C7 1-H,C8 1-H and CH＝N)ppm.
31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝7.76(m,P0),13.16(d,2J(PN-P2)＝30Hz,PN),50.95(td,2J (P2-PN)＝30Hz,P2),60.70,60.78(s,P1),62.95(s,P3)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3)δ＝14.16(s,Ci‘0),22.69(s,Ch‘0),25.71(s,Ce‘0),29.55 (m,Cf‘0 and Cg‘0),31.83(s,CH3-N-P2),31.96(s,CH3-N-P2),32.94(s,CH3-N-P1),33.07(s, CH3-N-P1),35.16(s,Ca‘0),36.63(s,Cd‘0),40.61(s,Cb‘0),120.10(br s,C2‘0),121.61(m,C2 1),121.96(s,C2 2),125.12(s,C2 0),126.18(s,C4 1),127.62(s,C30),128.45(s,C3 2),128.74(s, C6 1),128.87(s,C6 1),130.33(s,C3 1),131.67(s,C3‘0),132.56(s,C7 1),132.67(s,C8 1), 132.85(s,C4 2),134.74(s,C5 1),134.86(s,C51),141.34(m,CH＝N),153.41(s,C1 2),153.50(s, C1 2),153.86(br s,C1 0,C1 1),173.19(s,Cc‘0),173.19(s,Cc‘0)ppm.
C17G3NC4:
Figure BDA0002536810330000131
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝0.86(t,3J(H-H)＝8Hz,3H,Ci‘0-H),0.90(Pentane),1.21(m, 30H,Ch‘0-H,Cg‘0-H,Cf‘0-H and Ce‘0-H),1.70(br s,160H,C4 3-H),2.01(t,3J(H-H)＝8Hz,2 H,Cd‘0-H),2.48(br s,160H,C3 3-H),2.59(m,80H,Ca‘0-H and C2 3-H),3.02(m,80H,Cb ‘0-H and C1 3-H),3.14(m,60H,CH3-N-P3),3.35(m,15H,CH3-N-P1),4.05(t,3J(H-H)＝8Hz,40 H,NH-P3),6.17(t,3J(H-H)＝4Hz,1H,NH-C),6.91(d,3J(H-H)＝8Hz,2H,C2‘0-H),7.10(m,52 H,C3‘0-H,C2 0-H and C2 2-H),7.30(m,10H,C3 0-H),7.36(m,40H,C3 2-H),7.59(m,165H, C2 1-H,C3 1-H,C6 1-H,C7 1-H,C8 1-H and CH＝N)ppm.
31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝7.80(m,P0),12.76(d,2J(PN-P2)＝30Hz,PN),51.06(td,2J (PN-P2)＝30Hz,P2),60.84,60.90(s,P1),68.41(s,P3)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3)δ＝14.15(s,Ci‘0),22.68(s,Ch‘0),23.53(s,C4 3),25.75 (s,Ce‘0),29.55(m,Cf‘0and Cg‘0),30.58(s,CH3-N-P2),30.69(s,CH3-N-P3),33.00(s, CH3-N-P1),33.09(s,CH3-N-P1),34.11(Pentane),39.81(s,C2 3),53.78(s,C3 3),56.18(s,C1 3), 56.26(s,C2 3),120.80(br s,C2‘0),121.11(br s,C2 1),121.63(br s,C2 2),125.33(s,C2 0), 126.40(s,C4 1),127.21(s,C3 2),127.78(s,C3 0),128.41(s,C4 0),128.67(s,C6 1),128.80(s, C6 1),131.74(s,C3‘0),131.95(s,C3 1),132.54(s,C8 1),132.65(s,C8 1),132.76(s,C4 2), 134.75(s,C5 1),134.87(s,C5 1),135.95(m,CH＝N),152.24(s,C1 2),153.34(s,C1 2),153.79(br s,C1 0and C1 1),173.22(s,Cc‘0)ppm.
实施例2
将6mg的1-C17G3溶于3mL超纯水中配制2mg/mL的母液，随后梯度稀释成1mL且浓度为0.001-2mg/mL的工作液。每份工作液中加入10μL浓度为4.0×10-4M芘(Py)的丙酮溶液，超声30分钟后室温保存过夜。设置稳态荧光仪入射狭缝宽度1.0mm，接收狭缝宽度1.2mm，在激发波长为333nm下，扫描每份溶液在350nm-435nm范围内的荧光曲线。取372nm与393nm处的荧光值比值I372/I393作纵坐标，工作液浓度lg值为横坐标，拟合曲线，曲线的拐点处横坐标即为1-C17G3临界胶束浓度的lg值(如图10所示)。结果显示，随着1-C17G3浓度的升高I372/I393的荧光强度比值在27μM处有一个明显的下降，这说明材料 1-C17G3能够形成胶束，且临界胶束浓度为27μM。
实施例3
取阿霉素(DOX)溶于甲醇中，然后按照不同的摩尔比(1-C17G3：DOX＝1:10,1:15,1:20 和1:25)将300μL不同浓度的DOX甲醇溶液加入到1-C17G3的水溶液中，室温敞口搅拌过夜。随后将混合溶液移入离心管，7000转/分钟、20分钟离心2次，每次离心结束后取出上清液，再用适量超纯水重悬沉淀后再进行下一次离心。将沉淀溶于1mL甲醇中，测定其在481nm处的紫外吸收值，通过与纯DOX甲醇溶液的标准曲线对比计算DOX的包封率和上载率(如表1所示)。结果显示，比例从1:10到1:20，DOX的上载率逐渐上升，当达到1:25时，包封率和上载率下降明显，可以得出两者最佳混合比例为1:20。
表1不同投药比的1-C17G3@DOX包封率和上载率
Figure BDA0002536810330000141
实施例4
分别配制材料浓度相同的1-C17G3和1-C17G3@DOX(此处采用的1-C17G3:DOX的摩尔比为1:20)水溶液(溶液中1-C17G3浓度为50μM)，通过马尔文激光粒度仪(Malvern,ΜK，633nm激光)对1-C17G3及1-C17G3@DOX的水动力学粒径及表面电势进行表征。结果显示，相较于1-C17G3，1-C17G3@DOX的水合粒径有所增大(如表2所示)，而Zeta电势有一定程度的降低。将50μM的1-C17G3溶液稀释10倍，制备低于CMC的1-C17G3溶液，通过动态光散射仪测量其粒径。结果显示，胶束形成后将溶液稀释至CMC以下，胶束形态不会被破坏，但此时的水合粒径会增大至约200nm(如图11所示)。配制2mg/mL的1-C17G3 溶液样品超声处理20min并稳定2h。将样品溶液滴在透射电子显微镜(TEM)专用铜网上，随后将铜网置于加热灯下直至铜网上液体完全蒸发，将样品置于TEM中进行观察和TEM图片拍摄。通过粒径分布分析，纳米胶束的粒径大约为26nm(如图12所示)。
表2 1-C17G3和1-C17G3@DOX胶束的水合粒径和Zeta电位
Figure BDA0002536810330000151
实施例5
分别称取一定质量(5mg)的1-C17G3@DOX(此处采用的1-C17G3:DOX的摩尔比为 1:20)粉末溶于pH＝7.4和pH＝6.8的PBS缓冲溶液，置于透析袋(分子截留量为10,000) 中，随后分别以上述两种缓冲液(20mL每组)为外液，置于37℃恒温摇窗中，90rpm振荡条件下进行缓释实验。在设定的时间点上取样3mL，并补充等体积的相应新鲜缓冲液。为研究纯药的释放动力学，称取含有等质量DOX的盐酸阿霉素溶于pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，置于pH 7.4的缓释外液中进行释放研究，采用和之前相同的取样方法。通过紫外分光光度计测量缓释实验样品在481nm处的吸光值，与标准曲线对比计算获得每个样品的DOX含量，绘制释放动力学曲线(如图13所示)。结果显示，盐酸阿霉素在9小时之内释放完毕，而 1-C17G3@DOX则以一种相对缓慢且持续的方式释放DOX，8小时内，最多不超过50％的 DOX药物从1-C17G1@DOX中释放到外液介质中。相比pH＝7.4，1-C17G3@DOX在pH＝6.8 条件下DOX的释放能力更强。
实施例6
本实施例利用CCK-8法评价1-C17G3@DOX(此处采用的1-C17G3:DOX的摩尔比为 1:20)对人乳腺癌细胞MCF-7和小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3的抑制效果：收集对数生长期MCF-7细胞和NIH-3T3细胞，分别按照10,000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下孵育过夜。弃掉培养基后，每孔更换90μL新鲜培养基，并添加 10μL含不同浓度的材料(最终材料的相对DOX浓度为0.1,0.2,0.5,1,2μM)或生理盐水(对照组)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基，加入含100μL含有10％CCK-8的新鲜培养基溶液，继续培养3h后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值，结果如图14和图15所示。结果显示，与生理盐水对照组相比，在试验浓度范围内1-C17G3处理过的MCF-7细胞和3T3细胞，细胞存活率均在80％以上，说明1-C17G3本身对MCF-7细胞和3T3细胞不具抑制性。与此同时，对于MCF-7细胞(如图14所示)来说，在相同浓度条件下1-C17G3@DOX比盐酸阿霉素拥有更强的细胞抑制效果。与之相反，对于3T3细胞(如图15所示)1-C17G3能够减弱DOX对细胞活性的抑制效果。
实施例7
以MCF-7细胞为模型细胞来检验纯DOX和1-C17G3@DOX(此处采用的1-C17G3:DOX的摩尔比为1:20)的细胞吞噬效率。收集对数生长期MCF-7细胞，按每孔10万个细胞种12 孔板，37℃、5％CO2环境中培养24小时。加入分别含有盐酸阿霉素、1-C17G3和 1-C17G3@DOX的新鲜培养基(最终相对DOX浓度为10μM，最终相对1-C17G3浓度为0.5 μM)孵育5小时，使用PBS缓冲溶液清洗细胞。Dio细胞膜染色液染色15分钟，PBS溶液洗净，2.5％戊二醛固定细胞15分钟，PBS溶液洗净，DAPI染5分钟，清洗后倒净液体。荧光显微镜观察材料在MCF-7细胞内的分布情况。结果显示(如图16所示)，将纯DOX和 1-C17G3@DOX与细胞培养3小时后，大量的红色荧光(DOX)分布在细胞胞浆中。那么可以说明1-C17G3@DOX能够成功的将DOX运输到细胞内。
实施例8
将MCF-7细胞离心收集后重悬稀释，按每孔10万个细胞种12孔板，37℃、5％CO2环境中培养24小时。加入分别含有盐酸阿霉素、1-C17G3和1-C17G3@DOX(此处采用的 1-C17G3:DOX的摩尔比为1:20)的新鲜培养基(最终相对DOX浓度为2,4,5,8μM，最终相对1-C17G3浓度为0.1,0.2,0.25,0.4μM)孵育4小时。孵育完成后每孔用300μL胰酶消化，离心收集后用200μLPBS重悬，通过流式细胞仪表征。得到MCF-7细胞吞噬DOX的定量数据。结果显示(如图17所示)，随着DOX浓度的增加，细胞内荧光数值随之增强，而由于DOX的荧光淬灭作用，使得1-C17G3@DOX组的荧光强度弱于纯DOX组。
实施例9
将MCF-7细胞离心收集后重悬稀释，按每孔20万个细胞种6孔板，37℃、5％CO2环境中培养24小时。加入分别含有盐酸阿霉素、1-C17G3和1-C17G3@DOX(此处采用的 1-C17G3:DOX的摩尔比为1:20)的新鲜培养基最终相对DOX浓度为5μM，最终相对1-C17G3 浓度为0.25μM)孵育4小时，孵育完成后，PBS溶液洗净，加入新鲜有血清培养基培养24 小时。培养结束后，收集孔内培养基，胰酶消化，与上清一起离心收集，PBS溶液洗两次。而后每孔用400μL结合液重悬细胞，转移至流式样品管中，每管加入5μL的FITC染色液染色15分钟；冰浴条件下，每管加入10μL的PI染色液染色5分钟。通过流式细胞仪表征。结果显示，与纯DOX组相比1-C17G3@DOX组凋亡细胞比例明显提高，证明1-C17G3作为药物载体能够显著地提高DOX的治疗效果(如图18所示)。
实施例10
按实施例9中相同的方法处理细胞，随后进行RT-qPCR实验，具体实验步骤如下：
(1)总RNA抽提：裂解细胞样本，低温离心提取总RNA，加入无RNA酶的水溶解RNA。55℃孵育5min。(2)反转录：取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。加入1μL oligo(dT)15。用无RMA酶的去离子水补足至12μL。于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。依次加入5×buffer，10mM dNTPs，RNA inhibitor和反转录酶，用枪抽吸混匀。于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。(3)定量PCR：取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管，2×qPCR Mix，7.5μM基因引物，反转录产物， ddH2O。(4)PCR扩增：在PCR仪中进行变性、退火和延伸的多次循环以扩增目的基因。结果显示(如图19所示)，与纯DOX组相比，1-C17G3@DOX组BAX、p53和PTEN蛋白基因的表达量更大，而Bcl-2蛋白基因表达量较小，这说明1-C17G3@DOX引起癌细胞凋亡的能力更强。
实施例11
按实施例9中相同的方法处理细胞，随后进行蛋白免疫印迹实验，具体实验步骤如下：
将细胞样本冰浴裂解，离心提取蛋白质，制作标准曲线对蛋白质含量进行检测。临时保存蛋白质样本，快速完成SDS-PAGE电泳清洗和灌胶等准备工作，上样后连接40V电压电泳 4-5h。转膜后，配制好一抗和二抗稀释液进行免疫反应，随后进行显影和定影工作，最后扫描胶片进行凝胶图像分析以及灰度分析。
其结果与qPCR结果相对应(如图20所示)，1-C17G3@DOX组中BAX、p53和PTEN 三个蛋白质含量为最高，而Bcl-2蛋白质则为最低。同样也说明1-C17G3@DOX对癌细胞凋亡的作用更强。

Claims (10)

1.一种如结构式所示的两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子，
Figure FDA0002536810320000011
2.一种两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子材料的制备方法，包括：
(1)将酰胺溶于溶剂中，加入无水碳酸铯，冰浴，逐滴加入修饰有五个对羟基苯甲醛的环三磷腈AB5的溶液，反应，纯化，真空干燥，得到第0.5代的含磷树冠大分子C17G0.5；
(2)将C17G0.5溶于溶剂中，加入无水硫酸钠，冰浴，逐滴加入修饰有一个甲基肼的硫代磷酰氯MMHPSCl2溶液，反应，纯化，真空干燥，得到第1代含磷树冠大分子C17G1；
(3)首先将苯基磷衍生物PN＝PS溶于溶剂中，然后加入无水碳酸铯，冰浴，随后逐滴加入步骤(2)制得的C17G1的溶液，反应，纯化，真空干燥，得到第2代的含磷树冠大分子C17G2；
(4)将C17G2溶于溶剂中，加入无水硫酸钠，冰浴，逐滴加入修饰有一个甲基肼的硫代磷酰氯MMHPSCl2溶液，反应，纯化，真空干燥，得到第3代的含磷树冠大分子C17G3；
(5)将第3代的含磷树冠大分子C17G3溶于溶剂中，逐滴加入N,N-二异丙基乙胺，冰浴，再逐滴加入1-(2-氨基乙基)吡咯烷，搅拌反应，旋转蒸发，洗涤，真空干燥，得到吡咯烷修饰的磷树冠大分子C17G3NC4；
(6)将C17G3NC4溶于溶剂中，冰浴，逐滴加入氯化氢的乙醚溶液，搅拌反应过夜，旋转蒸发，真空干燥，得到两亲性磷树冠大分子纳米材料。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中酰胺为硬脂酸酰胺；溶剂为无水四氢呋喃；酰胺、AB5和无水碳酸铯的摩尔比为1.5:1:3；酰胺的四氢呋喃溶液浓度为0.030-0.090mmol/mL；AB5的四氢呋喃溶液浓度为0.020-0.060mmol/mL；冰浴的时间为10-60分钟；反应为：室温反应6-24h。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中C17G0.5、MMHPSCl2和无水硫酸钠的摩尔比为1:6:20；溶剂为无水二氯甲烷；C17G0.5的二氯甲烷溶液浓度为0.001-0.10mmol/mL；冰浴的时间为10-60分钟；反应的工艺参数为：室温搅拌反应6-24h。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中C17G1、PN＝PS和无水碳酸铯的摩尔比为1:12:30；溶剂为无水二氯甲烷；C17G1的二氯甲烷溶液浓度为0.010-0.050mmol/mL；PN＝PS的二氯甲烷溶液0.10-0.50mmol/mL；冰浴的时间为10-60min；反应为：室温反应6-24h。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中C17G2、无水硫酸钠和MMHPSCl2的摩尔比为1:20:30；溶剂为无水二氯甲烷；C17G2的二氯甲烷溶液浓度为0.002-0.20mmol/mL；冰浴的时间为10-60min；反应为：室温搅拌反应6-24h。
7.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中C17G3、N,N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比为1:40:40；C17G3的二氯甲烷溶液浓度为0.01-0.10mmol/mL；冰浴的时间为10-60min；反应为：室温搅拌反应6-24h。
8.一种基于权利要求1所述两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子的纳米胶束。
9.一种载药两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子的纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束原料组分包括：药物和权利要求1所述两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子。
10.一种权利要求9所述载药两亲性PN＝PS型含磷树冠大分子的纳米胶束的应用。
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