CN113244172A - 一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents
一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113244172A CN113244172A CN202110332771.0A CN202110332771A CN113244172A CN 113244172 A CN113244172 A CN 113244172A CN 202110332771 A CN202110332771 A CN 202110332771A CN 113244172 A CN113244172 A CN 113244172A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nps
- sirna
- dox
- irgd
- targeted
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
- A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
- A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1273—Polymersomes; Liposomes with polymerisable or polymerised bilayer-forming substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G81/00—Macromolecular compounds obtained by interreacting polymers in the absence of monomers, e.g. block polymers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开了一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统及其制备方法,其采用肿瘤靶向穿膜肽iRGD对NPs进行靶向修饰,再负载化疗药物盐酸阿霉素、血管内皮生长因子的siRNA,构建肿瘤治疗体系DOX/siVEGF/iRGD‑NPs,该体系具有较低的细胞毒性,通过DOX、siVEGF、iRGD和NPs四者协同作用获得主动靶向抑制肿瘤细胞MCF‑7、新生血管及靶向穿透肿瘤球的能力,预计在肿瘤的靶向治疗上具有潜在应用前景。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤细胞靶向抑制技术领域,具体涉及一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤因其较高的发病率及致死率成为世界三大疾病之一,严重威胁着人类的生命健康。近年来,联合化学治疗与基因治疗用于肿瘤治疗成为了国内外的研究热点。化学治疗作为肿瘤治疗最主要的方法之一,可用于治疗多种类型的肿瘤,但由于安全剂量范围内的药物并不能完全根除肿瘤,过量非特异选择性的药物在体内累积,引起严重的毒副作用。治疗基因的加入可以减少化疗药物的剂量,从而降低药物引起的毒副作用,同时避免肿瘤细胞产生耐药性,而化疗药物的使用可以有效提高基因在细胞中的表达,增强治疗基因的治疗效果。
因此,联合化学治疗与基因治疗可以达到降低毒副作用,提高肿瘤治疗效果的目的。但联合化学治疗与基因治疗面临一个巨大的挑战,即合成安全高效且特异性强的纳米载体。聚合物形成的纳米囊泡因其独特的结构及理化性质,得到广泛的使用。通过在纳米载体表面进行靶向修饰的主动靶向作用,使其能特异性靶向至肿瘤部位,提高肿瘤细胞对纳米载体的摄取。相比于正常组织,肿瘤组织通常会过度表达某些受体或抗原,而纳米载体表面的靶向配体通过与肿瘤组织表面的受体/抗原特异性结合,实现靶向递送。
发明内容
本发明的目的在于提供一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统的制备方法,该方法工艺简单、易于控制。
本发明的目的还在于提供采用上述制备方法制备的siRNA和抗癌药靶向共递送系统。
本发明的最后一个目的在于提供上述siRNA和抗癌药靶向共递送系统在制备具有肿瘤细胞靶向抑制能力、靶向穿透能力和体内抑制血管生成能力功效的药物中的应用。
为了实现上述第一个目的,本发明采用如下技术方案:一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统的制备方法,包括以下步骤:
(1)脂多糖胺纳米囊泡(NPs)的制备
通过酰胺化反应将胆固醇氯甲酸酯(cholesteryl,Cho)引入聚乙烯亚胺(PEI),得到胆固醇封端的聚乙烯亚胺(PEI-Cho);
通过高碘酸钠氧化反应制备得到多醛基氧化海藻酸钠(Oxidized alginate,OA);
通过Schiff碱反应将多醛基氧化海藻酸钠(MASA)引入胆固醇封端的聚乙烯亚胺(PEI-Cho),并通过还原化合物中的亚胺键和醛基得到脂多糖胺(lipopolysaccharide-amine,LPSA)纳米囊泡(NPs);
(2)纳米囊泡包裹盐酸阿霉素(DOX/NPs)的制备
配制盐酸阿霉素(DOX)/PBS溶液,随后加入步骤(1)中制备的脂多糖胺纳米囊泡(NPs),在磁力搅拌下先进行超声处理,再继续搅拌反应,反应结束后离心,制得纳米囊泡包裹盐酸阿霉素(DOX/NPs)溶液;
(3)siRNA/DOX-NPs的制备
将FAM-siRNA粉末溶于无核酶水制成FAM-siRNA溶液,与纳米囊泡包裹盐酸阿霉素(DOX/NPs)溶液混合,室温下静置后,离心,除去未被包裹的FAM-siRNA,获得siRNA/DOX-NPs;
(4)DOX/siRNA/iRGD-NPs的制备
将穿膜肽(iRGD)溶液与siRNA/DOX-NPs溶液混合,复合完成后过滤,获得DOX/siRNA/iRGD-NPs。
本发明制备方法利用靶向穿膜肽作为靶向配体对纳米载体进行修饰,使纳米载体具有主动靶向性,通过携带化疗药物和治疗基因共同治疗肿瘤,提高药物在肿瘤部位的浓度,改善肿瘤的治疗效果,减少毒副作用,为临床上提供安全高效低毒的新型肿瘤治疗体系。
具体而言,本发明将盐酸阿霉素(DOX)、血管内皮生长因子的siRNA(siVGEF),负载于纳米囊泡(NPs)上,然后采用穿膜肽(iRGD)对NPs进行靶向修饰,通过体外细胞摄取及细胞毒性实验,筛选出高效低毒且具备靶向性能的纳米载体DOX/siRNA/iRGD-NPs,并对其物理化学结构、缓冲能力、转染效率和细胞毒性进行表征。
因此,本发明在高效低毒纳米囊泡的基础上,采用穿膜肽iRGD对NPs进行靶向修饰,并同时负载化疗药物DOX、靶向血管内皮生长因子的siRNA(siVEGF),构建DOX/siRNA/iRGD-NPs靶向共递送系统。
在上述siRNA和抗癌药靶向共递送系统的制备方法中:
脂多糖胺(lipopolysaccharide-amine,LPSA)纳米囊泡(NPs)的制备参考申请人前期合成的脂多糖胺(lipopolysaccharide-amine,LPSA)(申请号200910193876.1、201210008056.2)。
优选的,步骤(1)中所述聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2k,其与胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为1:0.5~3。
优选的,步骤(1)中所述多醛基海藻酸钠OA中的醛基与所述胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho的摩尔比小于1:2,其中所述多醛基海藻酸钠的氧化程度为0.20~0.80。
优选的,步骤(4)中获得的DOX/siRNA/iRGD-NPs中,DOX/NPs的质量比为0.25:1,siRNA浓度为100nM,所述iRGD与所述NPs中N元素的摩尔质量比为2.5。
本发明的第二个目的可以通过以下技术方案来实现:一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统,采用上述方法制备获得。
本发明的第三个目的可以通过以下技术方案来实现:上述的siRNA和抗癌药靶向共递送系统在制备具有肿瘤细胞靶向抑制能力、靶向穿透能力和体内抑制血管生成能力功效的药物中的应用。
本发明采用前期采用接枝共聚方法,制备了一种以氧化藻酸盐为主链、胆固醇接枝的PEI为侧链的刷状共聚物脂多糖胺(lipopolysaccharide-amine,LPSA,见申请号为201210008056.2的专利申请)。该共聚物可在水中直接快速自组装形成纳米囊泡(Nanopolymersomes,NPs),NPs具有高效胞液递送能力,其能高效负载并介导基因进行体内外转染,但无主动靶向能力。
基于此,本发明采用肿瘤靶向穿膜肽iRGD(in ternalizing RGD,氨基酸序列:CRGDK/RGPD/EC)对NPs进行靶向修饰,再负载化疗药物盐酸阿霉素(Doxorubicin,DOX)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)的siRNA(siVEGF),构建肿瘤治疗体系,期望其能克服人体内系列生理屏障,特异性靶向及穿透肿瘤组织、高效入胞、突破内体释放至胞液后,再通过DOX和siVEGF的双重抗肿瘤作用,即一方面通过DOX直接杀死肿瘤细胞,同时通过siVEGF特异性沉默靶基因来抑制肿瘤新生血管生成,进而间接“饿”死肿瘤细胞来提高抗肿瘤效果,最终达到高效低毒特异性强的肿瘤治疗目的。
本发明在成功构建DOX/siRNA/iRGD-NPs体系后,着重探讨了该体系对肿瘤细胞、肿瘤球、血管的靶向、穿透及抑制作用。
实验结果表明:本发明成功构建了siRNA和抗癌药靶向共递送系统DOX/siVEGF/iRGD-NPs,证明该体系具有较低的细胞毒性,通过DOX、siVEGF、iRGD和NPs四者协同作用获得主动靶向抑制肿瘤细胞MCF-7、新生血管及靶向穿透肿瘤球的能力,预计在肿瘤的靶向治疗上具有潜在应用前景。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
(1)本发明提供的纳米囊泡(NPs)不仅结合了MASA、PEI、胆固醇三者的优点,即同时具有MASA的可降解性、优良的生物相容性,低分子量PEI的质子海绵特性、低毒性、强的细胞膜粘附及保护DNA不受酶解的特性,胆固醇的细胞摄取及脂质特性;而且赋予了脂多糖胺阳离子聚合物新的特性:本发明脂多糖胺阳离子聚合物是两亲接枝共聚两性电解质,即共聚物同时具有亲疏水性(两亲)及酸碱性(两性),可形成类似细胞膜双分子层的脂质体囊泡;上述优点能促进基因转染过程中的DNA压缩装载、聚合物/基因复合物在细胞表面的粘附摄取、复合物对细胞内体/溶酶体的突破、DNA从复合物的解离释放等过程,最终达到提高基因转染效率及降低细胞毒性的目的;
(2)盐酸阿霉素(DOX)是临床上用于多种癌症治疗的一线药物,如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、急性淋巴细胞白血病的治疗。然而,由于DOX为小分子化学药物,在体内代谢速度快,且无特异选择性,因而毒副作用大,使其应用受到限制。本发明利用两亲性纳米囊泡可以包载亲水性药物的特性,以NPs包载DOX,期望能解决前述DOX使用中的问题,降低毒性,提高其抗肿瘤效果;
(3)本发明通过特异性沉默胞浆中的信使RNA,从而介导基因沉默,裸siRNA在体内面临一系列的障碍,如siRNA易被核酸酶降解、肾脏清除、半衰期短等,且游离的siRNA为阴离子亲水性双链小RNA,不易被细胞吸收,为了能将siRNA靶向递送至特定靶细胞,并发挥其基因沉默作用,提高治疗效果,本发明利用脂多糖胺纳米囊泡中带正电的PEI与siRNA中带负电的磷酸基团之间的静电相互作用力,将siRNA负载于NPs上,期望siRNA能克服体内递送时的一系列生理屏障,靶向到达肿瘤部位,并发挥其特异性沉默功能;
(4)本发明为减少被动靶向过程中对正常组织造成的损伤、加强治疗药物在肿瘤部位的富集,通过在纳米载体表面进行靶向修饰改性,使纳米载体具备主动靶向的性能,选用能靶向αVβ3整合素(肿瘤新生血管内皮细胞、多种肿瘤细胞表面高表达,而成熟血管内皮细胞和正常细胞不/低表达)的穿膜肽iRGD对NPs进行靶向修饰,DOX/siRNA/iRGD-NPs较siRNA/DOX-NPs有更好的肿瘤球穿透性,说明iRGD赋予了NPs靶向穿透能力。
附图说明
图1是实施例1中LPSA的制备流程图;
图2是实施例1中DOX/NPs的实验结果图,其中A.DOX标准曲线;B.时间对DOX/NPs包封率、载药量的影响;
图3是实施例1中siRNA/DOX-NPs的实验结果图,其中A.不同浓度NPs对siRNA负载能力的测定;B.siRNA标准曲线;C、E.分别为NPs负载siRNA定性、定量测定结果;D、F.分别为DOX/NPs负载siRNA定性、定量测定结果;
图4是实施例1中DOX/siRNA/iRGD-NPs的实验结果图,其中A.iRGD标准曲线;B.时间对NPs负载iRGD的影响;C.NPs对不同浓度iRGD负载能力的测定;
图5是实施例1中不同投料质量比DOX/NPs细胞摄取分析,其中(A1.blank组明场照片;A2.DOX组明场、荧光照片;A3-A6.分别为DOX/NPs=0.125:1、0.25:1、0.5:1、1:1明场、荧光照片;
图6是实施例1中是不同投料质量比DOX/NPs细胞存活率;
图7是实施例1中DOX/iRGD-NPs细胞摄取分析,其中A1.blank组明场照片;A2.DOX/NPs组明场、荧光照片;A3-A6.分别为摩尔比[iRGD]/[N]=2.5、5、10、20明场、荧光照片;
图8是实施例1中iRGD-NPs透射电镜图(磷钨酸做负染色);
图9是实施例2中的靶细胞筛选:A.αVβ3、NRP-1Western Blot图;B.αVβ3、NRP-1相对蛋白表达量(from Western Blot);
图10是实施例2中的siRNA/iRGD-NPs细胞摄取动力学结果;
图11是实施例2中将复合物FAM-siRNA-NPs、FAM-siRNA/iRGD-NPs分别与细胞孵育4h后的结果图,A.FAM-siRNA/iRGD-NPs细胞摄取荧光照片;B、C.分别为流式细胞仪测定细胞摄取率、相对荧光强度;
图12是实施例2中DOX/iRGD-NPs细胞毒性测定,其中DOX、DOX/NPs、iRGD的终浓度分别为6.5μg/mL、0.67mg/mL、50μg/mL;
图13是实施例3中不同悬滴时间、不同培养时间对肿瘤球形成的影响:A-D.悬滴时间分别为1d、2d、3d、4d;E-H.悬滴2d后分别培养1d、2d、3d、4d;
图14是实施例3中不同细胞数对肿瘤球形成的影响:A-J的细胞数分别为5000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000;
图15是实施例3中FAM-siRNA/iRGD-NPs肿瘤球靶向穿透能力测定;
图16是实施例4中斑马鱼鱼卵荧光照片,A:未带荧光;B:带荧光;
图17是实施例4中NPs介导siVEGF抑制斑马鱼肠下血管丛生成情况,其中:A.不同浓度NPs介导siVEGF抑制斑马鱼血管生成(A1-A4.分别为blank、NPs=0.5、0.67、1mg/mL时斑马鱼肠下血管丛荧光图片);B.斑马鱼生存率;C、D.分别为斑马鱼肠下血管从长度、面积;
图18是实施例4中使用穿膜肽iRGD对NPs进行靶向修饰,介导siVEGF抑制斑马鱼肠下血管丛生成情况,A.不同浓度iRGD-NPs介导siVEGF抑制斑马鱼血管生成(A1-A4.分别为blank、siVEGF-NPs、siVEGF/iRGD-NPs 50、siVEGF/iRGD-NPs 100时斑马鱼肠下血管丛荧光图片);B.斑马鱼生存率;C、D.分别为斑马鱼肠下血管丛长度、面积;
图19是实施例4中斑马鱼生长状态及其发育形态,A.正常发育斑马鱼;B.畸形发育斑马鱼;C.斑马鱼死亡胚胎;
图20是实施例4中斑马鱼体内VEGF相对表达量。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1
下面将结合具体的实施方式进一步说明本发明,但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
以下实施例中使用的材料如下
平均分子量为1800和25000的聚乙烯亚胺(PEI)均由Aldrich公司购得。海藻酸钠,粘度300cps(Lot M3H5540,Nacalaitespue INC.,Kyoto,Japan)。胆固醇氯甲酸酯阿法埃莎Alfa Aesar。二氯甲烷购于广州试剂有限公司。氧化海藻酸钠,实验室室自制。盐酸阿霉素,购于广州艾斯金生物技术有限公司。siRNA,购于广州锐博生物科技有限公司。iRGD,购于吉尔生化(上海)有限公司。RIPA,购于CST公司。MCF-7,购于中国科学院细胞库。刃天青,购于广州艾斯金生物科技有限公司。斑马鱼,flk-1型,购于中山大学转化医学中心,1-苯基-2-硫脲(PTU),购于中山大学转化医学中心,1%亚甲基蓝,购于广州艾斯金生物科技有限公司。
实施例1
一、siRNA和抗癌药靶向共递送系统的制备过程
本实施例提供负载化疗药物盐酸阿霉素(DOX)、靶向血管内皮生长因子VEGF的siRNA(siVEGF),肿瘤靶向穿膜肽iRGD的纳米囊泡(NPs)靶向共递送化疗药/基因治疗体系的制备方法,包括以下步骤:
(1)脂多糖胺纳米囊泡NPs的制备,如图1所示,可申请人前期合成的脂多糖胺(lipopolysaccharide-amine,LPSA)(申请号200910193876.1以及201210008056.2)为反应原料,具体采用申请号为201210008056.2实施例1中的产品为原料。
(2)DOX/NPs的合成
新鲜配制1mg/mL的DOX/PBS溶液(pH=7.4,0.05mol/L)4mL,将其加入20mL的锥形瓶中,随后加入16mg LPSA(步骤(1)中制备的脂多糖胺LPSA纳米囊泡NPs),37℃下磁力搅拌2h,超声15min后,再分别继续搅拌0、2、4、8、16h,然后将反应溶液转移至截留分子量为50kDa的超滤管离心15min(7500g/min),紫外分光光度计测量滤液在483nm处的吸光度,据此计算DOX的包封率、载药量,并找出包封率最大时LPSA和DOX的最佳孵育时间。
其中,包封率指纳米囊泡中包埋的药物量占初始药物总量的百分率,载药量指纳米囊泡中药物量占载药纳米粒总重量的百分率。除非特别声明,后续实验均选此孵育时间制备载DOX的纳米囊泡。按前述方法配制DOX:NPs投料质量比为0.125:1、0.25:1、0.5:1、1:1的溶液进行反应,反应结束后使用分子截留量50kDa的超滤管进行过滤,测量滤液的吸光度,并将超滤后的浓缩液冻干备用。
(3)siRNA/DOX-NPs的制备
将FAM-siRNA(Cy5标记的无功能性siRNA)粉末溶于无核酶水配制成100nM的溶液,然后分别与不同浓度的NPs溶液等体积混合,配制成[NPs]/[siRNA]摩尔质量比=0、0.6、1.2、1.7、2.9、5.9、11.1、16.7、33.3(g/mmol)的复合液,室温下静置30min后,进行凝胶电泳。随后将终浓度为100nM(此浓度为试剂使用推荐浓度)的FAM-siRNA溶液分别与1mg/mL的NPs、DOX/NPs溶液等体积混合,室温下分别静置15、30、60、120、240min后使用截留分子量为50kDa的超滤管离心15min(7500g/min),除去未被NPs负载的FAM-siRNA,并收集滤液用于后续的测定。
(4)DOX/siRNA/iRGD-NPs的制备
称取一定质量冻干后的LPSA配制成1mg/mL的溶液,分别与不同浓度的iRGD溶液等体积混合,配制成一系列不同摩尔质量比[iRGD]/[N]([N]为NPs中N元素的摩尔质量)的复合液,室温下静置30min后使用截留分子量为50kDa的超滤管离心15min(7500g/min),microBCA试剂盒测定滤液在562nm处吸光度,据此计算iRGD的负载率。
随后,在最佳[iRGD]/[N]摩尔质量比的条件下,使iRGD溶液与NPs溶液等体积混合后分别静置15、30、60、120、240min,超滤,收集滤液测定iRGD的负载率。
最后,将不同浓度的iRGD溶液与siRNA/DOX-NPs溶液等体积混合,使[iRGD]/[N]摩尔质量比=1、4、20、100,复合完成后使用截留分子量为50kDa的超滤管进行过滤,收集滤液测定iRGD的负载率。
(5)DOX、siRNA、iRGD负载率的计算
DOX:配制一系列标准浓度的DOX溶液,使用紫外分光光度计测定溶液在483nm处的吸光度,绘制DOX浓度-吸光度标准曲线。将合成后的溶液于截留分子量为50kDa超滤管中离心15min(7500g/min),收集滤液于EP管中,使用紫外分光光度计测定滤液在483nm处的吸光度,再根据标准曲线计算得到滤液的浓度,从而计算DOX负载率。DOX负载率(%)=(加入的DOX总质量-未复合的DOX质量)/DOX初始加入质量×100%。
siRNA:1)定量分析:siRNA的负载率通过测定FAM-siRNA的荧光强度来计算。配制一系列标准浓度的FAM-siRNA溶液,采用酶标仪测定溶液的荧光强度(激发波长、发射波长分别为495nm、525nm),绘制浓度-荧光强度标准曲线。随后采用酶标仪测定滤液的荧光强度,通过标准曲线计算得到滤液的浓度,从而计算siRNA的负载率。siRNA负载率(%)=(加入的siRNA总质量-未复合的siRNA质量)/siRNA初始加入质量×100%;2)定性分析:采用凝胶电泳对siRNA的负载进行定性分析。称取1g琼脂糖粉末溶解于100mL TAE缓冲液中,制备1%的凝胶,微波炉加热使琼脂糖粉末溶解,待溶液放凉至不烫手后倒入带有梳子的制胶槽,待溶液凝结后即可使用。随后配制一系列不同摩尔质量比的[siRNA]/[NPs](mmol/g)复合溶液,室温静置30min。加样前,用TAE缓冲液浸泡没过凝胶。取50μL复合物+10μL 6×loading buffer(loading buffer中事先混合10×sybrgreen)。混合后取20μL样品加入凝胶孔中,加样后,90V电压条件下电泳20min,结束后将整块胶取出,用紫外显影拍照。
iRGD:采用micro BCA试剂盒对iRGD的负载率进行测定。配制一系列标准浓度的iRGD溶液,0-40μg/mL(0、1.25、2.5、5、10、20、40μg/mL),每个浓度3个复孔,每孔150μL样品+150μL ABC工作液(A、B、C液体积比=25:24:1),加样后将96孔板置于摇床37℃孵育2h,采用酶标仪测定溶液在562nm处的吸光度,由此绘制浓度-吸光度的标准曲线。然后将超滤管过滤后的滤液收集于EP管中,稀释100倍后使用micro BCA试剂盒测定滤液在562nm处的吸光度,通过标准曲线计算iRGD的负载率。iRGD负载率(%)=(加入的iRGD总质量-未复合的iRGD质量)/iRGD初始加入质量×100%。
(6)DOX/siRNA/iRGD-NPs最佳制备比
将制备的不同质量比(0.125:1、0.25:1、0.5:1、1:1)DOX/NPs溶于超纯水中,配制成1mg/mL的溶液,使用0.22μm滤头过滤后于4℃保存备用。通过细胞摄取与细胞毒性实验,筛选出制备DOX/NPs的最佳投料质量比。随后以DOX为荧光指示剂,配制[iRGD]/[N]摩尔质量比=2.5、5、10、20的复合溶液,通过细胞摄取实验筛选出使载体具有靶向性能时[iRGD]/[N]最佳摩尔质量比。其中siRNA为试剂推荐使用浓度100nM。
(7)粒径、Zeta电位
将样品NPs、iRGD-NPs、DOX/iRGD-NPs、siVEGF/iRGD-NPs、DOX/siVEGF/iRGD-NPs配制成1mg/mL的溶液,使用1M的HCl和NaOH溶液调节pH=7.4,采用Nano-ZS90型粒度仪测定样品的粒径及Zeta电位。
(8)透射电镜
使用超纯水将样品DOX/siVEGF/iRGD-NPs配成1mg/mL溶液,超声分散后与磷钨酸溶液(1wt%,pH=6.7)共混,吸取10μL样品溶液置于300目铜网上,等待1-2min至铜网上的液体挥发,重复上述操作3-4次。随后将铜网置于室温中自然风干30min,再使用JEM-1400透射电镜(加速电压120kV)进行观察拍照。
(9)储存稳定性
测定载药系统DOX/siRNA/iRGD-NPs的PBS溶液在4℃下的储存稳定性,定期取样,对样品的粒径、电位、PDI进行测定。
二、结果与讨论
2.1 DOX/NPs的实验结果
盐酸阿霉素(DOX)是临床上用于多种癌症治疗的一线药物,如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、急性淋巴细胞白血病的治疗。然而,由于DOX为小分子化学药物,在体内代谢速度快,且无特异选择性,因而毒副作用大,使其应用受到限制。本实施例中,利用两亲性纳米囊泡可以包载亲水性药物的特性,以NPs包载DOX,期望能解决前述DOX使用中的问题,降低毒性,提高其抗肿瘤效果。
图2是DOX/NPs的实验结果,其中A图为DOX的标准曲线,B图为时间对DOX/NPs包封率、载药量的影响。
不同质量比DOX/NPs对DOX包封率、载药量的影响如下表1所示。
表1 不同质量比DOX/NPs对DOX包封率、载药量的影响
质量比 | 包封率(%) | 负载量(%) |
0.125:1 | 100±0.00 | 11.11±0.00 |
0.25:1 | 96.57±0.05 | 19.31±0.01 |
0.5:1 | 94.57±0.04 | 32.61±0.02 |
1:1 | 93.41±0.02 | 46.70±0.01 |
首先,采用紫外分光光度法绘制DOX吸光度与浓度的标准曲线,以一系列不同浓度DOX溶液在483nm处的OD值对其浓度进行线性回归,可得到回归方程:y=0.0138x+0.0064(相关系数R2=0.999),表明DOX在0μg/mL-50μg/mL的浓度范围内,其浓度与吸光度之间具有良好的线性关系(如图2中A图)。然后固定DOX与NPs的投料质量比为0.25:1,探索DOX与NPs共孵育时间对DOX包封率及载药量的影响。
由图2中B图可知,延长共孵育时间,DOX的包封率与载药量增加,当共孵育至18h时,DOX的包封率为97.21±3.28%,接近100%,说明18h为合适的共孵育时间,此时载药量为19.55±0.53%。
随后在最佳反应时间为18h的条件下,改变DOX/NPs之间的质量比,研究不同质量比DOX/NPs对DOX包封率、载药量的影响。
由表1可知,随着DOX/NPs投料质量比的增加,DOX包封率逐渐下降,载药量逐渐增加。由此可知,当反应时间为18h,DOX/NPs投料质量比≦0.125:1时,DOX能够完全被NPs负载。
2.2 siRNA/DOX-NPs的实验结果
RNA干扰(RNA interference,RNAi)作为近年来一门新兴的生物学技术,在治疗癌症、病毒感染、神经退行性等多种疾病方面得到广泛的应用。RNAi技术是指通过特异性沉默胞浆中的信使RNA,从而介导基因沉默。但裸siRNA在体内却面临一系列的障碍,如siRNA易被核酸酶降解、肾脏清除、半衰期短等。且游离的siRNA为阴离子亲水性双链小RNA,不易被细胞吸收。为了能将siRNA靶向递送至特定靶细胞,并发挥其基因沉默作用,提高治疗效果,则需借助安全高效特异性强的纳米载体。因此,本实施例中利用脂多糖胺纳米囊泡中带正电的PEI与siRNA中带负电的磷酸基团之间的静电相互作用力,将siRNA负载于NPs上,期望siRNA能克服体内递送时的一系列生理屏障,靶向到达肿瘤部位,并发挥其特异性沉默功能。
首先,配制了一系列不同摩尔质量比[siRNA]/[NPs](mmol/g)的复合液,通过凝胶电泳法,探索了NPs对siRNA的负载能力。
图3是siRNA/DOX-NPs的实验结果图。
由图3中A图可知,当[NPs]/[siRNA](g/mmol)≧16.7时,NPs可完全阻滞siRNA,说明NPs对siRNA具有良好的负载能力。
然后,使用浓度为100nM的siRNA溶液与1mg/mL的NPs溶液进行复合,通过定性定量两种方法,探索时间对NPs负载siRNA的影响。其中在siRNA的定量分析中,采用siRNA的荧光强度与浓度之间的曲线关系来进行计算。如图3中B图所示siRNA标准曲线,以siRNA的荧光强度(激发波长、发射波长分别为495nm、525nm)对其浓度进行线性回归,得到回归方程:y=0.000487324x+0.01823(相关系数R2=0.999),表明siRNA在0nM-1000nM的浓度范围内,其浓度与荧光强度之间具有良好的线性关系。从图3中C图、E图中siRNA-NPs的凝胶电泳条带图中可见,siRNA与NPs室温下复合15min后,siRNA能完全被NPs阻滞,且定性结果与定量结果一致。由此说明,siRNA与NPs能够通过静电相互作用力在短时间内迅速复合。
与此同时,也测定了时间对DOX/NPs负载siRNA的影响,由图3中D图、F图可知,DOX/NPs在15min内能高效阻滞siRNA。这可能与NPs特殊的囊泡结构有关。NPs由两亲两性的接枝共聚物脂多糖胺(LPSA)在水中自组装形成。LPSA由疏水的胆固醇(Cholesteryl,Cho)、亲水带负电荷的海藻酸钠(Oxidized alginate,OA)、亲水带正电荷的聚乙烯亚胺(PEI,分子量1.8k)组成,在水溶液中LPSA自组装形成以部分质子化的PEI为内外冠、以疏水的Cho与中和后的PEI/OA聚电解质复合物为膜层的纳米囊泡。NPs的囊泡属性及囊泡内外表面的PEI可共同起到高效压缩负载保护siRNA的作用。此外通过静电相互作用或亲疏水相互作用,囊泡还可以单独或者同时负载疏水/亲水/双亲药物。因此,在包载了抗癌药物DOX后,NPs仍能高效负载治疗基因siRNA。
2.3DOX/siRNA/iRGD-NPs的实验结果
纳米载药递送系统作为肿瘤治疗中的研究热点,可通过肿瘤组织的高渗透滞留(EPR)效应被动靶向到肿瘤组织,但被动靶向无特异选择性。为减少被动靶向过程中对正常组织造成的损伤、加强治疗药物在肿瘤部位的富集,可通过在纳米载体表面进行靶向修饰改性,使纳米载体具备主动靶向的性能。本研究中,选用能靶向αVβ3整合素(肿瘤新生血管内皮细胞、多种肿瘤细胞表面高表达,而成熟血管内皮细胞和正常细胞不/低表达)的穿膜肽iRGD对NPs进行靶向修饰,且研究证明,iRGD通过物理混合的方法能与纳米载体复合且具有较好的效果。因此,选用物理混合的方法,使iRGD负载于NPs上,并采用micro BCA试剂盒测定iRGD的负载率。由图4中A图可知,采用micro BCA蛋白定量测试试剂盒在562nm处的OD值对iRGD的浓度进行二次拟合,得到回归方程:y=-0.000149229x^2+0.01536x+0.09318(相关系数R2=0.995),表明iRGD在浓度0-40μg/mL的范围内,其浓度与吸光度之间具有良好的线性关系。
随后,通过固定NPs中N元素的摩尔量,配制一系列不同摩尔比[iRGD]/[N]的复合液,探索NPs对iRGD的最大负载量。
图4是DOX/siRNA/iRGD-NPs的实验结果图。
由图4中C图可见,当[iRGD]/[N]≦100时,mg NPs对iRGD的负载量随摩尔比[iRGD]/[N]的增加而增加,当[iRGD]/[N]≧100时,mg NPs对iRGD的负载量随[iRGD]/[N]摩尔比的增加而降低。之后在最佳摩尔比[iRGD]/[N]=100的条件下,探讨了时间对iRGD负载率的影响。从图4中B图可知,iRGD的负载率随复合时间的增加而增加,当复合时间为240min时,iRGD的负载率最大,为93.6±1.58%。
最后,配制了iRGD与siRNA/DOX-NPs的摩尔比[iRGD]/[N]=1、4、20、100的复合液,探索NPs在负载化疗药物DOX与治疗基因siRNA后对iRGD的负载能力。
由下表2可知,当[iRGD]/[N]≦20时,siRNA/DOX-NPs对iRGD的负载率达到100%,而当[iRGD]/[N]=100时,iRGD的负载率下降到18.93±1.28%。因此说明,NPs在负载DOX、siRNA之后,对iRGD的负载能力减弱。可以猜想,iRGD为弱阴性粒子,其主要通过NPs表面带正电的PEI与iRGD结合,当NPs负载siRNA之后,NPs表面的正电性减弱,因此,使得NPs对iRGD的负载能力减弱。
表2 siRNA/DOX-NPs对不同浓度iRGD负载率的影响
2.4 DOX/siRNA/iRGD-NPs最佳配比的筛选
将不同投料质量比DOX/NPs合成得到的样品,分别进行细胞摄取与毒性实验。细胞摄取结果如图5所示,图5中A3图-A6图分别为DOX/NPs=0.125:1、0.25:1、0.5:1、1:1时细胞转染结果,当DOX/NPs=0.125:1时,细胞荧光较弱,随着DOX/NPs质量比的增加,细胞荧光增强,细胞摄取率增加;细胞毒性结果中(图6),随着DOX/NPs质量比的增加,细胞存活率降低,当DOX/NPs质量比≧0.5:1时,细胞存活率低于自由DOX组。
随后以DOX为荧光指示剂,能靶向αVβ3整合素(肿瘤新生血管内皮细胞、多种肿瘤细胞表面高表达,而成熟血管内皮细胞和正常细胞不/低表达)的穿膜肽iRGD修饰后的NPs为载体,MCF-7为靶细胞,通过MCF-7对DOX/iRGD-NPs的摄取情况来探索不同摩尔比[iRGD]/[N]下iRGD-NPs的靶向性能,以筛选出当纳米载体具有靶向性能时[iRGD]/[N]的最佳合成配比。结果如图7可见,当[iRGD]/[N]=2.5时,细胞荧光强度稍强于DOX/NPs组,且随着[iRGD]/[N]比的增加,即随着iRGD浓度的增加,细胞荧光强度增加,但当[iRGD]/[N]=20时,细胞毒性增加。
研究认为,当细胞对药物的摄入量增加时,将会更大程度的打乱细胞原有的结构和功能,进而引起更高的毒性。因此,随着DOX/NPs质量比的增加,细胞摄取率增加,细胞存活率降低,且DOX作为小分子化学药物,其在杀死肿瘤细胞的同时,会损伤正常组织细胞。
所以,综合上述结果,选取DOX/NPs=0.25:1的质量配比、[iRGD]/[N]摩尔比=2.5时的制备配比用于后续实验。
且由此也说明,DOX/siRNA/iRGD-NPs系统在DOX/NPs质量比=0.25:1、siRNA浓度=100nM,[iRGD]/[N]摩尔比=2.5时,具有较低的细胞毒性,且具备主动靶向性能。
2.5粒径及Zeta电位
纳米靶向递送系统中纳米载体的粒径对于其进入细胞进行转染有着至关重要的作用。本实施例中,将配制的样品用0.22μm滤头过滤后,使用Nano-ZS90型粒度仪测定样品的粒径及Zeta电位。由表3可知,NPs、iRGD-NPs、DOX/iRGD-NPs、siRNA/iRGD-NPs、DOX/siRNA/iRGD-NPs的粒径分别为110.2、129.6、108.0、154.4、113.1nm,Zeta电位分别为47.1、24.0、8.43、6.95、12.6mV。NPs在与iRGD、siRNA复合后粒径均有所增加,尤其是NPs同时负载iRGD、siRNA后,粒径为增加至154.4nm。可以猜想,iRGD与siRNA一样,均通过静电相互作用力与NPs表面质子化的PEI结合而负载于NPs表面,从而造成NPs粒径增加。而NPs在与DOX、siRNA、iRGD复合后其Zeta电位均有所下降。进一步说明,iRGD可能通过静电相互作用与NPs表面带正电荷的PEI结合而负载于NPs上。
表3 DOX/siRNA/iRGD-NPs粒径、Zeta电位
2.6透射电镜
前期的研究中可知,LPSA在水溶液中可通过疏水的Cho基团之间的相互作用,以及PEI与OA之间的静电相互作用形成以部分质子化PEI为内外冠、以中和后的PEI/OA复合物聚电解质与疏水的Cho为膜层的纳米囊泡。由图8可见,经iRGD靶向修饰后的NPs仍能保持囊泡的球状结构,直径约为48.5nm。然而通过电镜照片分析得出的粒径比动态光散射粒径仪(DLS)测出的粒径结果(113.1nm)(表3)小,主要原因是这两种测量方式的环境有所不同,DLS是在水溶液中进行,并且DLS测定的结果是对溶液内所有纳米粒径进行测量,取正态分布平均值,NPs在50-150nm之间均有分布,而透射电镜的粒径结果是通过软件对采集的照片进行分析,具有一定的局限性。此外还与透射电镜制样、观察过程有关,因为透射电镜样品需要在真空无水条件下进行观察,观察过程中水分的蒸发使得纳米球内部中空,纳米球囊塌陷,导致粒径有所下降。
2.7储存稳定性
将DOX/siRNA/iRGD-NPs的PBS溶液在4℃条件下储存3个月后对其粒径、Zeta电位、PDI进行测定,得到载药囊泡的粒径、Zeta电位、PDI分别为104.8nm、13.8mV、0.693。由此发现,载药囊泡在4℃储存3个月后,粒径下降,但储存前后载药囊泡的粒径相对误差=5.39%,在误差范围之内,所以可以认为其粒径、Zeta电位基本不变,因此,DOX/siRNA/iRGD-NPs靶向共递送系统在4℃条件下具有良好的稳定性。
本实施例通过以上物理共混的方法,将化疗药物DOX、治疗基因siVEGF、靶向穿膜肽iRGD负载于NPs上,构建DOX/siRNA/iRGD-NPs纳米靶向共递送系统,并探索DOX、siRNA、iRGD三者的最佳制备比,同时对DOX/siRNA/iRGD-NPs的粒径、Zeta电位、形貌、储存稳定性等进行表征。
结果表明,当DOX/NPs投料质量比=0.25:1、siRNA=100nM、[iRGD]/[N]=2.5时,DOX/siRNA/iRGD-NPs具有低细胞毒性及主动靶向性能;NPs、iRGD-NPs、DOX/siRNA/iRGD-NPs的粒径分别为110.2、129.6、113.1nm,Zeta电位分别为47.1、24.0、12.6mV;在4℃条件下储存3个月后,DOX/siRNA/iRGD-NPs其粒径、Zeta电位基本保持不变。
实施例2
在肿瘤细胞及新生血管内皮细胞表面,最为广泛且高表达的整合素是αVβ3,特别是在肿瘤血管生成的过程中,αVβ3发挥着重要的作用。而αVβ3受体在成熟的血管内皮细胞和绝大多数正常组织中一般不表达或者少表达,在肿瘤组织新生血管内皮细胞及多种恶性肿瘤细胞表面上均有较高的表达。
神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1,NRP-1)是一种位于形成中的神经纤维轴突上的跨膜糖蛋白,NRP-1在多种肿瘤中都高表达,如胰腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和胃癌等。各种肿瘤细胞的存活和生长都严重依赖于细胞自身NRP-1的表达。本申请采用Western Blot技术筛选出高表达αVβ3受体、NRP-1的肿瘤细胞,随后通过细胞摄取、细胞毒性抑制实验,探索DOX/siRNA/iRGD-NPs对肿瘤细胞靶向抑制能力。
1.1细胞的筛选
1.1.1细胞培养与传代
常规培养293T、293FT、MCF-7、Hela细胞。
1.1.2细胞蛋白的提取
采用常规方法提取细胞蛋白,并使用BCA蛋白含量检测试剂盒检测蛋白浓度。
1.1.3 Western Blot
采用Western Blot技术分离蛋白质。
1.2 FAM-siRNA/iRGD-NPs细胞摄取
1.2.1 FAM-siRNA/iRGD-NPs的细胞摄取(定性)
将MCF-7细胞悬液种于激光共聚焦皿中,1×105细胞/皿,每个皿中加入完全培养基2000μL(GIBCO DMEM,含10%胎牛血清,100μg/mL的链霉素和100μg/mL的青霉素);在5%CO2,37℃培养箱中培养24h后,待细胞长至70%时,吸去原有的培养基,加入100μL FAM-siRNA/iRGD-NPs复合物和900μL无血清培养基,无血清转染15、30、60、120、240min后,吸去培养基,并用无菌的PBS溶液轻轻吹洗细胞3遍。随后每孔加入500μL DAPI染料液,静置5min后使用PBS溶液轻轻吹洗细胞3遍,于激光共聚焦显微镜下拍照。然后在最佳摄取时间的条件下,使用复合物FAM-siRNA/iRGD-NPs、FAM-siRNA-NPs与MCF-7共孵育,并于激光共聚焦显微镜下拍照。
1.2.2流式细胞仪测试(定量)
将MCF-7细胞悬液种于6孔板中,1×105细胞/孔,每孔加入2000μL完全培养基,在5%CO2,37℃培养箱中培养24h后,每孔加入100μL复合物(FAM-siRNA-NPs、FAM-siRNA/iRGD-NPs,实施例1中配比和方法制备获得)和900μL无血清培养基,以不做任何处理的细胞为空白对照组。常规孵育4h后,吸去培养基,用无菌的PBS溶液轻轻吹洗细胞3遍。每孔加入500μL胰酶消化,待细胞变圆后,加入等体积完全培养基终止消化,使用移液枪轻轻吹打10-15s后将细胞收集于EP管中,1000g/min离心5min收集细胞。离心后的细胞成团聚集于EP管底部,加入300μL含0.5%多聚甲醛的PBS进行分散,收集于流式玻璃管中,标明序号,进行流式检测,测量细胞的荧光强度及带荧光的细胞百分数。
1.2.3 DOX/iRGD-NPs细胞毒性抑制实验
1.2.3.1磷酸盐缓冲溶液的配制
采用常规方法配制。
1.2.3.2细胞的培养、传代
采用常规方法。
1.2.3.3 DOX/siRNA/iRGD-NPs的制备
将制备好的DOX/siRNA/iRGD-NPs(实施例1中方法制备获得)溶液在超净工作台中用0.22μm的滤头过滤,得到无菌的载药纳米囊泡,进行相关实验。
1.2.3.4 DOX/iRGD-NPs细胞毒性抑制实验
将MCF-7细胞悬液接种于96孔板中,每孔加入200μL完全培养基(GIBCO DMEM,含10%胎牛血清,100μg/mL的链霉素和100μg/mL的青霉素),常规培养24h,待细胞融合度达到90%时,根据NPs=0.67mg/mL配制转染液,吸去原有培养基,按每孔等体积量加入20μL各复合物溶液(NPs、iRGD-NPs、DOX、DOX/NPs、DOX/iRGD-NPs,实施例1中方法制备获得)和180μL新鲜无血清培养基,于5%CO2,37℃培养箱中孵育4h后换成新鲜的完全培养基继续孵育44h,之后再加入10%不含酚红的Alamar-Blue溶液20μL,常规避光孵育4h后采用Bio-Rad550型酶标仪于570/600nm波长处测定溶液的吸光度值(OD),并以不做任何处理的细胞存活率为100%对结果进行标准化,计算细胞存活率。计算方法如下:
细胞存活率=(A复合物-A空白)÷(A对照-A空白)×100%
(A为570nm和600nm处的吸光度差值,A对照为未加复合物的细胞,A空白为未加任何试剂的细胞)
1.3结果与讨论
1.3.1细胞筛选
为筛选出高表达αVβ3、Neuropilin-1的肿瘤细胞,选取293T、293FT、MCF-7、Hela 4种细胞进行常规培养,通过Western Blot来检测各种细胞中αVβ3、Neuropilin-1蛋白的表达,挑选出适合本研究的靶细胞。
从图9分析可知,在4种细胞中,MCF-7在αVβ3、NRP-1蛋白的表达上均高于293T、293FT、Hela细胞,因此,选取MCF-7为本研究的靶细胞。
1.3.2细胞摄取
首先,以Cy5标记的无功能性siRNA(FAM-siRNA)为荧光指示剂,使细胞与iRGD-NPs分别孵育15、30、60、120、240min,随后使用DAPI进行细胞核染色,通过激光共聚焦显微镜观察细胞对iRGD-NPs的动力学摄取情况。结果如图10所示,当孵育时间为240min时,细胞摄取率最高。然后,将复合物FAM-siRNA-NPs、FAM-siRNA/iRGD-NPs分别与细胞孵育4h,随后使用DAPI染色后于激光共聚焦显微镜下拍照。结果如图11中A图所示,iRGD-NPs组的荧光强度较NPs组更强,且细胞摄取率更高。
随后采用流式细胞仪定量分析iRGD-NPs的细胞靶向能力。将复合物FAM-siRNA-NPs、FAM-siRNA/iRGD-NPs分别与细胞共孵育4h后,用0.25%的胰酶将细胞消化下来,使用流式细胞仪测定细胞摄取率及荧光强度。结果如图11中B图、C图所示,在细胞摄取率上,NPs组与iRGD-NPs组并无明显的差别;荧光强度上,FAM-siRNA/iRGD-NPs组稍高于FAM-siRNA-NPs组。这可能与NPs高效的胞液递送性能有关,NPs作为纳米载体具有较高的细胞摄取率,因此,经iRGD改性后的NPs在细胞摄取率上增加不会太明显;而由荧光强度结果分析可知,单个细胞摄取的FAM-siRNA/iRGD-NPs较FAM-siRNA-NPs多,从而在总摄取率相当的情况下,有较高的荧光强度,因此说明,iRGD能赋予NPs细胞靶向性能。
1.3.3细胞毒性抑制实验
本实施例选择Alamar-Blue法测定iRGD-NPs载药系统对MCF-7的毒性。
由图12可见,与NPs相比,经iRGD靶向修饰后的囊泡对细胞的毒性与NPs组相当,两组之间细胞存活率并无明显差异;自由药物DOX对细胞造成的毒性较大,细胞存活率较低,被NPs和iRGD-NPs包载后的DOX,较自由DOX组细胞存活率有所下降,其中DOX/iRGD-NPs较DOX/NPs细胞存活率下降更为明显。说明,经iRGD靶向修饰后的DOX/siVEGF/iRGD-NPs共递送系统能特异性靶向肿瘤细胞,且通过化疗药物DOX的抗肿瘤作用,高效抑制肿瘤细胞的生长。
本实施例通过Western Blot技术筛选出表面高表达iRGD靶向受体αVβ3、Neuropilin-1的MCF-7细胞,再通过细胞摄取和细胞毒性抑制实验探索DOX/siRNA/iRGD-NPs体系对MCF-7肿瘤细胞的靶向抑制能力。细胞摄取结果表明,DOX/siRNA/iRGD-NPs在孵育时间为4h时细胞摄取率最高,且与MCF-7共孵育4h后,siRNA/iRGD-NPs较siRNA-NPs对MCF-7具有较好的靶向能力。细胞毒性抑制实验中,DOX/iRGD-NPs组细胞存活率<DOX/NPs组细胞存活率<DOX组细胞存活率。由此说明,DOX/siRNA/iRGD-NPs靶向共递送系统能靶向肿瘤细胞,并介导DOX高效杀死肿瘤细胞,从而高效抑制肿瘤的生长。
实施例3
DOX/siRNA/iRGD-NPs肿瘤球靶向穿透能力分析
1、肿瘤球的培养
本实施例选取MCF-7为靶细胞,采用悬滴法与悬浮培养法相结合,构建肿瘤球细胞模型,以FAM-siRNA为荧光指示剂,探索经iRGD靶向修饰后的NPs体外肿瘤球靶向穿透能力。
肿瘤球的培养过程采用常规方法。
2、肿瘤球穿透实验
以FAM-siRNA为荧光指示剂,将肿瘤球与复合物溶液FAM-siRNA-NPs、FAM-siRNA/iRGD-NPs于5%CO2,37℃培养箱孵育4h后,用预冷的PBS轻轻吹洗肿瘤球3遍,随后加入200μL 4%多聚甲醛固定30min,再使用PBS轻轻吹洗3遍,置于PBS溶液中4℃保存,用于后续激光共聚焦显微镜拍照。
3、结果与讨论
3.1肿瘤球的培养
在本实施例中,采用悬滴法与悬浮培养相结合的方式来进行肿瘤球的培养,并通过控制不同悬滴时间、不同悬浮培养时间、不同细胞数的变化,探索了悬滴时间、悬浮培养时间及细胞数对肿瘤球形成的影响。首先,将相同细胞数的细胞悬液滴在100mm2培养皿盖子上,反向盖好,于5%CO2,37℃培养箱分别悬滴1、2、3、4天后,用吸管将悬滴吸入铺有2%琼脂糖的96孔板中,加入200μL无血清培养基,于显微镜下拍照。
由图13中A图-D图可见,当悬液悬滴1天后,聚集的细胞较为松散,不利于悬液的转移及后续的悬浮培养;悬滴至第2天时,聚集的细胞较为紧密,便于转移。之后,我们将相同细胞数的悬液于培养皿悬滴两天后,转移至铺有2%琼脂糖的96孔板中,加入200μL无血清培养基,5%CO2,37℃培养箱分别培养1、2、3、4天后于显微镜下拍照。
由图13中E图-H图可见,随着培养天数的增加,细胞开始慢慢聚集,到第4天时,可聚集形成一个致密的球体。最后,我们在悬滴时间为2天,培养时间4天的条件下,对含不同细胞数的细胞悬液进行培养。
由图14可见,细胞数在5000-50000的范围内均可形成大小不一的球体,但当细胞数大于35000时,形成的肿瘤球更加致密,且成球率也更高。
4.3.2肿瘤球靶向穿透能力
通过体外肿瘤球模型模拟体内肿瘤微环境,来探讨iRGD-NPs的靶向穿透能力。结果如图15所示,当NPs、iRGD-NPs与肿瘤球共孵育4h后,FAM-siRNA/iRGD-NPs组较FAM-siRNA-NPs组荧光强度更强。说明,iRGD能够赋予NPs靶向穿透的能力,使iRGD-NPs较未靶向修饰的NPs有更好的穿透效果。主要原因如下:首先iRGD中的RGD基序和αvβ3整合素(肿瘤新生血管内皮细胞、多种肿瘤细胞表面高表达,而成熟血管内皮细胞和正常细胞不/低表达)结合促进载药囊泡靶向肿瘤细胞,然后被细胞的蛋白酶切断为CRGDR/K和GPD/EC片段后,通过CRGDR/K和NRP-1结合,诱导细胞内摄,从而使纳米粒进入细胞,实现其肿瘤靶向、细胞膜穿透、肿瘤组织穿透和深层递送作用。
因此,本实施例采用悬滴与悬浮培养相结合的方法,以MCF-7为靶细胞建立肿瘤球模型,探讨iRGD的靶向穿透能力。通过对MCF-7肿瘤球的培养,发现当细胞数大于35000、悬液悬滴时间为2d、悬浮培养4d时,能够形成致密的肿瘤球。肿瘤球靶向穿透实验发现,iRGD-NPs较NPs有较好肿瘤球穿透性能,说明iRGD能够赋予NPs靶向穿透能力。
实施例4
siRNA/iRGD-NPs靶向抑制血管生成能力
针对VEGFR-2的siVEGF为治疗基因,已证实的高效、低毒的脂多糖胺纳米囊泡为载体,经由iRGD靶向修饰后负载siVEGF构成递送系统,以斑马鱼为抗肿瘤血管生成模型,研究siVEGF/iRGD-NPs递送系统对斑马鱼肠下血管丛的影响。
1.siVEGF/iRGD-NPs抑制斑马鱼血管生成实验
1.1斑马鱼的培养
采用常规方法培养。
1.2鱼卵的收集
采用常规方法收集。
1.3药物处理
当斑马鱼胚胎发育至24hpf时,在倒置荧光显微镜下挑选出带荧光的鱼卵,如果带荧光,则可以看到明显的带荧光条带,而非整个发绿的鱼卵;将带荧光的鱼卵用Holtbuffer溶液清洗干净后加入6孔板中,每孔20个;吸出6孔板中培养液,加入500μL siVEGF-NPs复合溶液(终浓度100nM的siVEGF溶液与浓度分别为0.5、0.67、1mg/mL的NPs溶液等体积复合)+4.5mL已加PTU的Holt buffer培养液(PTU浓度为0.025mmol/L),每个浓度做3个复孔,并以未做任何处理的鱼卵为空白对照。给药后的斑马鱼胚胎置于28.5℃恒温培养箱孵育至72hpf。之后在最佳的NPs浓度条件下,配制一系列不同终浓度(50、100、200、400、800μg/mL)的siVEGF/iRGD-NPs复合物,每个浓度做3个平行样,以未做处理的鱼卵做空白对照,siVEGF-NPs为阳性对照组。给药后的斑马鱼胚胎置于28.5℃恒温培养箱孵育至72hpf。
1.4体式显微镜下胚胎观察方法
待斑马鱼胚胎发育至72hpf时,用巴氏吸管将斑马鱼胚胎小心吸出,置于载玻片上,随后使用倒置荧光显微镜对斑马鱼进行拍照观察。
1.5图片采集
将采集的斑马鱼照片使用分析软件(Image-proplus)对斑马鱼肠下血管丛面积和长度进行定量分析。
1.6斑马鱼QPCR实验
按1.3实验方法对斑马鱼进行给药,72hpf后将斑马鱼收集于EP管中(尽量去除培养液),每个EP管中加入1mL Trizol溶液,随后将溶液转移至匀浆器中充分捣碎匀浆,充分捣碎后将溶液转移至新的EP管中,然后按照试剂盒说明进行逆转录及QPCR检测。
2.结果与讨论
2.1 siVEGF/iRGD-NPs抑制斑马鱼血管生成实验
2.1.1斑马鱼鱼卵的挑选
斑马鱼胚胎发育至24hpf时在倒置荧光显微镜下挑选带荧光的鱼卵,如图16所示,若带荧光,则可以看到明显的带荧光的条带(如图16中B图),而非整个发绿的鱼卵(如图16中A图)。正常情况下,鱼卵在24hpf时会有两层,透明、饱满、折光度好。
2.1.2 siVEGF/iRGD-NPs抑制斑马鱼血管生成
本实施例以转基因斑马鱼为模式动物,观测siVEGF-NPs系统对斑马鱼肠下血管丛的抑制作用。结果如图17中A图、C图、D图所示,随着NPs浓度的增加,斑马鱼肠下血管丛长度、面积也随之下降。其中NPs浓度为0.5、0.67、1mg/mL时的平均血管长度分别为blank组的0.76、0.71、0.66倍,平均血管面积分别为blank组的0.57、0.53、0.43倍。而斑马鱼存活率随着NPs浓度的增加而下降,但当NPs浓度=1mg/mL时,斑马鱼仍然具有较高的存活率,为78.89%(图17中B图)。说明NPs具有良好的体内生物相容性,与siVEGF结合后对斑马鱼基本无毒性,不影响斑马鱼正常发育与孵化。
随后在siVEGF终浓度=100nM,NPs浓度=1mg/mL的条件下,使用穿膜肽iRGD对NPs进行靶向修饰,介导siVEGF抑制斑马鱼肠下血管丛生成。由图18中A图、C图、D图可知,随着iRGD-NPs中iRGD浓度的增加,斑马鱼肠下血管长度及面积不断减小,其中siVEGF-NPs、siVEGF/iRGD-NPs 50、siVEGF/iRGD-NPs 100(其中50、100分别表示靶向载体中,iRGD的终浓度为50、100μg/mL)的平均血管长度分别为blank组的0.62、0.52、0.41倍,平均血管面积分别为blank组的0.42、0.37、0.21倍。说明iRGD-NPs能够靶向至斑马鱼新生血管,并高效介导siVEGF特异性沉默VEGF,进而抑制斑马鱼血管生成。
最后将复合物siVEGF/iRGD-NPs与斑马鱼胚胎共孵育72hpf,观察斑马鱼生长状态及其发育形态,结果如图19中B图所示,经iRGD靶向修饰后的NPs,使斑马鱼存活率下降,当iRGD浓度=100μg/mL时,斑马鱼的存活率仅为50%。当iRGD终浓度=200、400、800μg/mL时,斑马鱼大量死亡,如图19中B图、C图所示,斑马鱼畸形生长或在胚胎期就死亡。可以猜想,经iRGD靶向修饰后的NPs能将siVEGF靶向递送至斑马鱼新生血管,并特异性沉默VEGF基因,高效抑制斑马鱼肠下血管丛的生成,从而使斑马鱼因血管生成缺陷导致畸形或者死亡。
2.1.3斑马鱼QPCR实验
采用QPCR技术对siVEGF/iRGD-NPs体系抑制斑马鱼血管生成进行分子生物学验证。结果如图20所示,siVEGF-NPs、siVEGF/iRGD-NPs 50、siVEGF/iRGD-NPs 100的VEGF相对表达量分别为blank组的0.73、0.67、0.42倍,说明siVEGF/iRGD-NPs能靶向至斑马鱼新生血管,并特异性沉默VEGF基因,从而抑制斑马鱼血管生成。
本实施例先利用血管荧光标记的转基因斑马鱼为动物模型,探索NPs介导siVEGF抑制斑马鱼肠下血管生成时最佳浓度,随后使用穿膜肽iRGD对NPs进行靶向修饰,探索其靶向抑制斑马鱼血管生成的能力;最后通过QPCR技术,检测斑马鱼VEGF基因的表达。结果显示,在NPs浓度=1mg/mL时,siVEGF-NPs能够有效抑制斑马鱼肠下血管;使用穿膜肽iRGD对NPs进行靶向修饰后,在siVEGF终浓度=100nM,NPs浓度=1mg/mL,iRGD终浓度=100μg/mL的条件下,siVEGF/iRGD-NPs递送系统能够有效将siVEGF靶向至斑马鱼新生血管部位,抑制斑马鱼血管生成,此时斑马鱼肠下血管丛长度、面积分别为blank组的0.41、0.21倍;QPCR结果发现,在VEGF基因的表达上,siVEGF/iRGD-NPs组较siVEGF-NPs组相对表达量更低。
由此结果说明,经iRGD靶向修饰后,NPs能靶向至新生血管,且有效介导siVEGF特异性沉默VEGF基因,从而抑制斑马鱼血管生成,为DOX/siVEGF/iRGD-NPs共递送系统靶向至肿瘤部位,抑制肿瘤血管生成提供有力证据。
综上,本发明在高效低毒纳米囊泡的基础上,采用穿膜肽iRGD对NPs进行靶向修饰,并同时负载化疗药物DOX、靶向血管内皮生长因子的siRNA(siVEGF),构建DOX/siRNA/iRGD-NPs靶向共递送系统。
首先,分别对DOX、siRNA、iRGD的包封率、载药量进行测定,确定DOX、siRNA、iRGD三者的最佳配比;随后,通过体外细胞筛选、细胞摄取及细胞毒性抑制实验,探索了DOX/siRNA/iRGD-NPs靶向抑制细胞生长的能力;接着,通过肿瘤球模型,探索了DOX/siRNA/iRGD-NPs体系的靶向穿透能力;最后,合成载siVEGF的siVEGF/iRGD-NPs靶向囊泡,通过斑马鱼体内实验,探索体系能否特异靶向至斑马鱼新生血管,并有效抑制其血管生成。
本研究发现:
1)NPs对DOX、siRNA、iRGD均有较高的负载能力,能成功构建DOX/siRNA/iRGD-NPs靶向共递送系统。通过体外细胞实验发现,当DOX与NPs投料质量比=0.25:1、siRNA终浓度为100nM、[iRGD]/[N]摩尔比=2.5时,DOX/siRNA/iRGD-NPs具有低细胞毒性及主动靶向能力。
2)DOX/siRNA/iRGD-NPs在与细胞共孵育240min时具有较高的细胞摄取率,且DOX/siRNA/iRGD-NPs较未靶向修饰的siRNA/DOX-NPs体系有更好的细胞摄取率;DOX/siRNA/iRGD-NPs能特异性靶向肿瘤细胞,并介导DOX高效抑制肿瘤细胞生长。
3)DOX/siRNA/iRGD-NPs较siRNA/DOX-NPs有更好的肿瘤球穿透性,说明iRGD赋予了NPs靶向穿透能力。
4)DOX/siVEGF/iRGD-NPs能靶向斑马鱼新生血管,并介导siVEGF发挥特异性基因沉默效果,高效抑制斑马鱼新生血管生成。
综上所述,DOX/siVEGF/iRGD-NPs可能是一种高效低毒特异性强的肿瘤靶向治疗体系,具有潜在的临床应用前景。
本发明的上述实施例并不是对本发明保护范围的限定,本发明的实施方式不限于此,凡此种种根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,对本发明的方法做出的其它多种形式的修改、替换或变更,均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统的制备方法,其特征是包括以下步骤:
(1)脂多糖胺纳米囊泡NPs的制备
通过酰胺化反应将胆固醇氯甲酸酯Cho引入聚乙烯亚胺PEI,得到胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho;
通过高碘酸钠氧化反应制备得到多醛基氧化海藻酸钠OA;
通过Schiff碱反应将多醛基氧化海藻酸钠OA引入胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho,并通过还原化合物中的亚胺键和醛基得到脂多糖胺LPSA纳米囊泡NPs;
(2)纳米囊泡包裹盐酸阿霉素DOX/NPs的制备
配制盐酸阿霉素DOX/PBS溶液,随后加入步骤(1)中制备的脂多糖胺纳米囊泡NPs,在磁力搅拌下先进行超声处理,再继续搅拌反应,反应结束后离心,制得纳米囊泡包裹盐酸阿霉素DOX/NPs溶液;
(3)siRNA/DOX-NPs的制备
将FAM-siRNA粉末溶于无核酶水制成FAM-siRNA溶液,与纳米囊泡包裹盐酸阿霉素DOX/NPs溶液混合,室温下静置后,离心,除去未被纳米囊泡包裹盐酸阿霉素DOX/NPs负载的FAM-siRNA,获得siRNA/DOX-NPs;
(4)DOX/siRNA/iRGD-NPs的制备
将穿膜肽iRGD溶液与siRNA/DOX-NPs溶液混合,完成后过滤,获得DOX/siRNA/iRGD-NPs。
2.根据权利要求1所述的siRNA和抗癌药靶向共递送系统的制备方法,其特征是:步骤(1)中所述聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2k,其与胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为1:0.5~3。
3.根据权利要求1所述的siRNA和抗癌药靶向共递送系统的制备方法,其特征是:步骤(1)中所述多醛基海藻酸钠OA中的醛基与所述胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho的摩尔比小于1:2,其中所述多醛基海藻酸钠的氧化程度为0.20~0.80。
4.根据权利要求1所述的siRNA和抗癌药靶向共递送系统的制备方法,其特征是:步骤(4)中获得的DOX/siRNA/iRGD-NPs中,DOX/NPs的质量比为0.25:1,siRNA浓度为100nM,所述iRGD与所述NPs中N元素的摩尔质量比为2.5。
5.一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统,其特征是采用权利要求1-4中任一种方法制备获得。
6.权利要求5所述的siRNA和抗癌药靶向共递送系统在制备具有肿瘤细胞靶向抑制能力、靶向穿透能力和体内抑制血管生成能力功效的药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110332771.0A CN113244172B (zh) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | 一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110332771.0A CN113244172B (zh) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | 一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113244172A true CN113244172A (zh) | 2021-08-13 |
CN113244172B CN113244172B (zh) | 2023-05-23 |
Family
ID=77181224
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110332771.0A Active CN113244172B (zh) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | 一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113244172B (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102558569A (zh) * | 2012-01-11 | 2012-07-11 | 中山大学附属第一医院 | 一种脂多糖胺阳离子聚合物及其制备方法和应用 |
WO2016065306A1 (en) * | 2014-10-23 | 2016-04-28 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Amphiphile-polymer particles |
US20160243048A1 (en) * | 2013-10-17 | 2016-08-25 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Cationic nanoparticles for co-delivery of nucleic acids and therapeutic agents |
CA3087606A1 (en) * | 2018-01-22 | 2019-07-25 | Beijing Inno Medicine Co., Ltd | Liposomal nanocarrier delivery system for targeting active cd44 molecule, preparation method therefor, and uses thereof |
-
2021
- 2021-03-29 CN CN202110332771.0A patent/CN113244172B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102558569A (zh) * | 2012-01-11 | 2012-07-11 | 中山大学附属第一医院 | 一种脂多糖胺阳离子聚合物及其制备方法和应用 |
US20160243048A1 (en) * | 2013-10-17 | 2016-08-25 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Cationic nanoparticles for co-delivery of nucleic acids and therapeutic agents |
WO2016065306A1 (en) * | 2014-10-23 | 2016-04-28 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Amphiphile-polymer particles |
CA3087606A1 (en) * | 2018-01-22 | 2019-07-25 | Beijing Inno Medicine Co., Ltd | Liposomal nanocarrier delivery system for targeting active cd44 molecule, preparation method therefor, and uses thereof |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
FERNANDA G KUGERATSKI等: "Multifunctional Applications of Engineered Extracellular Vesicles in the Treatment of Cancer", 《ENDOCRINOLOGY》 * |
HUANG M ET AL.: "Comparison of osteogenic differentiation induced by siNoggin and pBMP-2 delivered by lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes and underlying molecular mechanisms", 《INT J NANOMEDICINE》 * |
JIE ZHAO ET AL.: "iRGD-targeted hybrid nanoparticles reverses multi-drug resistant to effectively combat liver cancer", 《JOURNAL OF DRUG TARGETING》 * |
姜娟等: "整合素受体介导的SiRNA和多柔比星靶向耐药肿瘤的研究", 《中国药学杂志》 * |
焦秀秀等: "纳米载药系统靶向治疗脑胶质瘤的策略", 《第二军医大学学报》 * |
王琴梅等: "多醛基海藻酸钠交联剂的制备及性能", 《应用化学》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113244172B (zh) | 2023-05-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11305024B2 (en) | Cross-linked polymer modified nanoparticles | |
CN108543074B (zh) | 一种用于肿瘤治疗的外泌体包裹的纳米载药系统及其制备 | |
Shi et al. | Doxorubicin‐conjugated immuno‐nanoparticles for intracellular anticancer drug delivery | |
CN108578711B (zh) | 一种乙酰化糖酯-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺共轭物及其制备方法与应用 | |
CN113633625B (zh) | 一种杂膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物及其制备方法 | |
CN111346226A (zh) | 一种自产氧纳米粒及其介导肿瘤光动力治疗的应用 | |
Guo et al. | Doxorubicin-loaded natural daptomycin micelles with enhanced targeting and anti-tumor effect in vivo | |
CN111973573A (zh) | 一种磷酸钙纳米颗粒及其制备方法和应用 | |
CN110559454B (zh) | 一种用于诊疗阿尔兹海默症的纳米复合药物 | |
CN114224838B (zh) | 一种肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统及其制备方法及应用 | |
Hayama et al. | Polymeric micelles modified by folate-PEG-lipid for targeted drug delivery to cancer cells in vitro | |
Chen et al. | A dual-targeting nanocarrier based on modified chitosan micelles for tumor imaging and therapy | |
CN112402626B (zh) | 一种靶向肿瘤的生物伪装纳米递药系统及其制备方法 | |
CN104147608A (zh) | 一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用 | |
CN113244172B (zh) | 一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统及其制备方法和应用 | |
Lin et al. | Exosome-based rare earth nanoparticles for targeted in situ and metastatic tumor imaging with chemo-assisted immunotherapy | |
CN110898231A (zh) | 一种功能化拉洛他赛脂质体及其制备方法与应用 | |
WO2019200354A1 (en) | Therapeutic nanodroplet double emulsions and methods of use thereof | |
CN111298116B (zh) | 多肽载药温敏脂质体及其制备方法和应用 | |
CN112843244A (zh) | 一种尺寸可变的智能化载药纳米簇系统及其制备方法和应用 | |
Xing et al. | Preparation of programmed death-ligand 1 antibody nanoparticles and their lung cancer targeting therapeutic effects | |
CN116869968B (zh) | 一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒及其合成方法、应用 | |
CN114149941B (zh) | 一种表面结合靶向配体的细菌及其应用 | |
Ailuno et al. | Development of Biotinylated Liposomes Encapsulating Metformin for Therapeutic Targeting of Inflammation-Based Diseases | |
CN114699388B (zh) | 靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |