JP2022543444A - カチオン性ポリマーにグラフトしたトリアゾール化合物を含む核酸分子を細胞にトランスフェクトするための組成物及びその用途 - Google Patents

カチオン性ポリマーにグラフトしたトリアゾール化合物を含む核酸分子を細胞にトランスフェクトするための組成物及びその用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、核酸分子を細胞にトランスフェクトするための組成物及びその用途に関する。本発明は、(i)一般式(I)、好ましくは一般式(III)の少なくとも1つの化合物、又はその互変異性体、メソマー、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、若しくは混合物、又はその許容される塩、及び(ii)許容される賦形剤、緩衝剤、細胞培養培地、又はトランスフェクション培地を含む、細胞、好ましくは真核細胞に核酸分子をトランスフェクトするのに適した組成物であって、式中、Y1、Y2、Y3、Z1、Z2、Z3、X1、X2、R3、P+、R及びVは本明細書で定義される通りである、組成物を対象とする。本発明はまた、前記組成物の使用、及び生細胞のインビトロ又はエクスビボのトランスフェクションのための方法に関する。

Description

本発明は、カチオン性ポリマーにグラフトした複素環化合物、特にトリアゾール誘導体を含む、核酸分子を細胞にトランスフェクトするための組成物、及びその用途に関する。本発明は、(i)一般式(I)の少なくとも1つの化合物、好ましくは一般式(III)の少なくとも1つの化合物、又はその互変異性体、メソマー、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、若しくは混合物、又はその許容される塩、及び(ii)許容される賦形剤、緩衝剤、細胞培養培地、又はトランスフェクション培地を含む、細胞、好ましくは真核細胞に核酸分子をトランスフェクトするのに適した組成物であって、式中、Y1、Y2、Y3、Z1、Z2、Z3、X1、X2、R3、P+、R及びVは、本明細書で定義される通りである、組成物を対象とする。本発明はまた、前記組成物の使用、及び生細胞のインビトロ又はエクスビボのトランスフェクションのための方法に関する。
遺伝子導入は、外来性遺伝子のコピーを生細胞に導入し、その遺伝子産物の合成を誘導するプロセスである。トランスフェクションは、非ウイルス性の方法を利用して核酸(DNA又はRNA)を真核細胞に意図的及び人為的に導入するプロセスである。トランスフェクションは、現代の生物学及び医学の発展にとって根本的に重要なものであり、遺伝子の機能及び制御に関する知見の多くを提供してきた。
本発明によるトランスフェクションは、種々の細胞、例えば哺乳類細胞及び昆虫細胞、初代細胞、細胞株、安定細胞、又は腫瘍細胞において達成し得る。トランスフェクションは、細胞内で新しい外来タンパク質を発現させる可能性、又は天然に存在するタンパク質を過剰発現若しくはサイレンシングさせる可能性を提供することによる、インビトロゲノム研究のための強力なツールである。
本発明によるトランスフェクションは、エクスビボ又はインビボのプロトコルによって治療に適用し得る。非ウイルスベクターを用いた核酸ベースの治療は、種々の組織/器官又は腫瘍における様々な疾患、遺伝性疾患、免疫疾患、がん又はウイルス感染を標的とし得る。細胞標的化は、異なる機構によって達成され、トランスフェクション試薬の性質及び特性、方法又はプロトコル、組成又は配合、及び投与経路に依存する(Kaestnerら、2015)。
バイオプロダクションにおいて、本発明によるトランスフェクションは、組換えタンパク質、ペプチド又は抗体を過剰産生する安定的な細胞クローンを生成するために使用し得る。より近年には、一過性の遺伝子発現(TGE)を可能にするトランスフェクションは、研究及びプロセス開発段階に有用な中程度のレベルの組換えタンパク質又は抗体を迅速に産生するための価値ある方法となりつつある。一過性遺伝子発現プロセスは、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス(LV)又はアデノウイルス等の組換えウイルスの産生に都合の良いように適用される(Mertenら、2016; Van Der Loo及びWright、2015)。このようなプロセスは、キャプシドタンパク質、ヘルパータンパク質、エンベロープタンパク質、ウイルスポリメラーゼ又はレギュレーター、又はウイルスゲノムを含む、ウイルスの産生に必要な異なる成分を細胞内で発現する多数の発現ベクター(プラスミド)をトランスフェクトすることからなる。ウイルスの産生には、HEK293及び誘導体細胞、HeLa、BHK-21、A549、又は昆虫細胞等の高産生性の細胞が用いられる。トランスフェクションは、血清を含む培地、又はタンパク質を含まない、既知組成若しくは完全に合成された培地中で培養された高細胞密度の接着細胞又は浮遊適応細胞において達成し得る。
トランスフェクションは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRE/LOXタンパク質、又はCRISPR Cas-9タンパク質等の、ゲノムの改変、操作又は編集を誘導するために必要な種々の成分を細胞に導入する方法である。
DNAトランスフェクションは、タンパク質若しくはペプチド及び/又は核酸、例えばメッセンジャーRNA、ロングRNA、マイクロRNA、低分子ヘアピンRNA、低分子干渉RNA等のプロモーターによって駆動される遺伝子発現を引き起こすプラスミドDNAを使用する。
殆ど全ての場合において、プラスミドDNAはトランスフェクションの目的で使用されてきたが、これは、その固有の安定性、及び宿主ゲノムと一体化して安定した遺伝子発現をもたらす能力、又はエピソームの形態で核内に留まり一過性遺伝子発現をもたらす能力によるものである。しかし、「トランスフェクション困難」細胞(HTT)と呼ばれる一部の細胞は、実験室条件で日常的に使用されている標準的な形質転換細胞株と比較して、DNAトランスフェクションに抵抗性であるか、又は示すトランスフェクション及び遺伝子発現のレベルが低い。これらの「トランスフェクション困難」細胞は、LipoFectAmine(登録商標)2000及び3000(ThermoFisher社)、TransIT reagents(登録商標)(MirusBio社)、FuGene(登録商標)(Promega社)、XtremeGene(登録商標)(Roche社)、jetPRIME(登録商標)(Polyplus-transfection社)又はViaFect(登録商標)(Promega社)等の前世代の市販のトランスフェクション試薬でトランスフェクトした場合、50%未満のトランスフェクション効率を示す。
HTT細胞の遺伝子発現効率を向上させるための近年の進歩は、プラスミドDNAコンストラクトではなくメッセンジャーRNA(mRNA)配列によるトランスフェクションであり、これにより、大多数の細胞種、特に困難なHTT細胞においてトランスフェクション及び遺伝子発現レベルの著しい向上が示された。この利点は、核への到達及び浸透が大きな制限となるDNAトランスフェクションとは対照的に、トランスフェクトされたmRNAは細胞作用のために核に到達する必要がないという事実によって説明される。プラスミドDNAの移入についてはよく理解されていないが、効率的なDNAトランスフェクションは、主に活発な細胞の増殖率と関連しており、この場合、トランスフェクトされたDNAが核膜の破壊中に核内空間に拡散し得る。殆どの分裂終了細胞又は非分裂細胞において、DNAトランスフェクションは効果的ではない。HTT細胞の大部分、例えば神経細胞、又は神経組織由来の他の細胞種、樹状細胞若しくはマクロファージ等の初代血液細胞、又は初代肝細胞等は、有糸分裂のレベルが低いか、又は有糸分裂がないことが示されている。しかし、他のHTT細胞では、トランスフェクション効率の低さは、細胞の脆弱性、細胞原形質膜へのトランスフェクション物質の結合の低さ、エンドサイトーシス能力の低さ、又はトランスフェクトされたDNAの核への非効率的な細胞内輸送等の他の要因によって説明し得る。
プラスミドDNAのトランスフェクションは、培養によって増殖した細胞でタンパク質を過剰発現させる最も一般的な方法である。遺伝的DNA物質を細胞に導入する方法の多くは、リン酸カルシウム、カチオン性リポソーム、ペプチド又はポリマー等の試薬の使用を含む。トランスフェクションに失敗した場合、一般的に試薬が原因と認識される。特にHTT細胞へのトランスフェクション試薬の効率を、新しいコンセプト及び次世代の試薬によって向上させることは未だに必要とされている。
真核細胞におけるDNAトランスフェクションでは、ポリアニオン性DNA分子を試薬と結合又は混合させることによって、トランスフェクション複合体又は凝集体を形成することを含む。最も一般的に使用される試薬のうち、カチオン性脂質、ペプチド又はポリマーは、負に荷電したDNAと相互作用するのに適している。カチオン試薬が過剰に使用されると、正の性質を持つ複合体又は凝集体が生成される。このような複合体は、細胞原形質膜上に存在する、ヘパラン硫酸等の負に荷電したグリコサミノグリカンと相互作用することができる(Labatmoleurら、1996、Mislick及びBaldeschwieler、1996)。複合体の細胞膜結合は、エンドサイトーシス機構による細胞の内在化又は取り込みを誘導する。トランスフェクション複合体はエンドソームに輸送され、ここでトランスフェクション試薬は膜融合活性及び/又はエンドソーム溶解による膜不安定化を示し、細胞質中にDNAを放出する。エンドソームからの放出された後、トランスフェクトされたDNAは、核周辺空間に拡散し、核内に浸透する必要がある。プラスミドDNAはサイズが大きいため、核膜孔複合体を通って拡散することができないため、核内移行は制限的な工程となっている。
カチオン性リポソーム又は凝集体は、DNAトランスフェクション用の非ウイルスベクターの中で、カチオン性脂質を、リン脂質又はコレステロール等の他の種類の脂質と組み合わせるか、又は配合して、負に荷電したDNAに結合し、負に荷電した細胞膜に結合でき、最終的に細胞トランスフェクションを行う正に荷電したリポソーム、小胞又はミセルを生成することからなる主要クラスの1つである。先行技術において、最初の合成カチオン性脂質は、FelgnerらによるN-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)である。1:1の比率でジオレオイルホスファチジルエタノールアミンと組み合わせると、DOTMAはインビトロで細胞をトランスフェクトすることができるカチオン性リポソームを形成した。正に荷電したトリメチルアンモニウム極性頭部に基づいて、1,2ビス(オレイルオキシ)-3,3-(トリメチルアンモニウム)プロパンクロリド(DOTAP)等の他のモノカチオン性脂質が開発された。他の先行技術化合物は、ポリカチオン性極性頭部に基づいており、例えばBehrらによって1989年に記載された脂質、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)又はジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン(DPPES)であり、ここでカルボキシスペルミンはアンモニウム基の代わりに用いられているか、又はリン脂質部分は3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロールヒドロクロリド(DC-CHOL)等のコレステロール誘導体に置換され(Gao及びHuang、1991)ている。これらの先駆的な研究以来、トランスフェクション効率を向上させた新規のカチオン性脂質試薬の作製を目標に、多くのカチオン性脂質が設計された。これらの試薬の多くは市販されており、近年のLipoFectAmine3000(登録商標)試薬は、市販されているカチオン性脂質の中で最も進歩した試薬の代表である。しかしながら、全ての細胞種でトランスフェクションが有効であるわけではない、及びカチオン性脂質系では細胞毒性が未だに重要な懸念事項であるため、依然として制限があることが観察されている。
カチオン性ポリマーは、その骨格に高密度の荷電アミノ基を提供するという利点を持ち、トランスフェクション試薬の第二の主要なクラスである。生理学的なpHで正の電荷を有するカチオン性ポリマーは、DNAを複合体形成させて粒子又は凝集体にし、細胞結合を開始させ、エンドサイトーシスにより細胞内への取り込みを引き起こすことができる。ポリリジン(PLL)は最初に使用されたポリマーであるが、示されたトランスフェクション効率は非常に限られていた(Wu及びWu、1987、Zenkeら、1990)。それぞれ不安定化したエンドソームの酸性pHを緩衝化し、細胞質中のDNAの放出をより誘導するためにクロロキンのような弱塩基(Erbacherら、1996)又はインフルエンザペプチドのような膜融合ペプチド(Planckら、1994)等の添加物を添加した場合、その効率が改善し得る。Behrらは、ポリエチレンイミン(PEI)がPLLよりもトランスフェクションにより有効なポリマーであることを示した(Boussifら、1995)。PEIはアミノ基の密度が高く、生理学的なpHでは完全にプロトン化されない。PEIと複合体形成したDNAをエンドサイトーシスした後、ポリマーは緩衝能を有し、これにより「プロトンスポンジ」活性を誘導し、小胞の膨張とエンドソーム溶解により、最終的に添加物の補助なしに細胞質内にDNAを放出する(Boussifら、1995; Sonawaneら、2003)。分枝型と直鎖型のPEIはいずれもトランスフェクションに有効であるが、直鎖型の形態はより効率的であり(Itakaら、2004)、血清の存在によって阻害されず、分枝型形態と比較して毒性も低いことが示された。20年以上前から、PEIのトランスフェクション効率を向上させ、毒性を低減するか、又は生分解性PEIベースのポリマーの代替品を提案するために、多くの戦略が開発されてきた。
多くの研究が、ヒスチジル又はベンジル残基(US8658150、Chandrashekharら、2012)をポリマーにグラフトすることによって、PEIの固有のプロトンスポンジエンドソーム溶解活性を最適化することに集中していた。DNA/PEI複合体の溶解性を上昇させ、細胞毒性を低減するために、親水性基の付加(EP2070970)のような他の改変が検討された。N-アシル基を用いて(EP0262641)、ポリマーの生分解性を上昇させるため、又はリポポリマーを生成するために(US20090022746、WO2006/041617)、疎水性官能基がPEIに付加された。種々の細胞株において、より高い遺伝子トランスフェクション効率が観察された。しかし、「トランスフェクション困難」細胞における効率は非常に限定的なままであった。
他のカチオン性ポリマー、例えばキトサン(Erbacherら、1998)、ポリアミドアミン(PAMAM)デンドリマー(Tomaliaら、1985、Haensler及びSzoka、2003)、分解又は破砕したデンドリマー(Tangら、1996)、構造的に可撓性のデンドリマー(Liuら、2011)、ポリアミノエステル(Littleら、2004)、ポリ(α[4-アミノブチル]-L-グリコール酸)(Akincら、2003)、カチオン性シクロデキストリン両親媒性物質(Cryanら、2004)、ポリ(N-メチルビニルアミン)(Dreanら、2018)、ポリ(2-N-ジメチルアミノエチル)メタクリレート(PDMAEMA)、ポリアリルアミン(Boussifら、1999)、ポリオルニチン(Dongら、1993)、ポリアルギニン(Alhakamyら、2013)、ポリヒスチジン(Putmanら、2003)及び細胞浸透ペプチド(CPP)(Gupta、2005)がDNAトランスフェクションについて記載されている。
PEI等のカチオン性ポリマーは、分裂終了細胞をトランスフェクトすることができることが報告されている(Brunnerら)。しかし、有糸分裂とそれに続く核膜の破壊がない場合、プラスミドDNAは、その1kbpを超える大きなサイズのために、核膜孔複合体を通して核内に入ることができないことが示された(Lukacsら、2000)。エンドソームから放出されると、DNAは、いくつかのカチオン性ポリマーと依然として結合しており、これが、ヌクレアーゼによる分解からの保護に寄与していた(Lechardeurら、1999)。DNAは、細胞質に存在するタンパク質、特にダイニンと相互作用することができ、これにより核に向かう微小管ベースの移動、又はNLSシグナルを有する転写因子との結合が可能になり、これによりインポーチン経路を介してDNAを核膜孔複合体に導き得ることが知られている(Baiら、2017)。
カチオン性ポリマーは、DNA/カチオン性ポリマー複合体を静脈内、腹腔内、皮内、腫瘍内、又は脳内注入等の様々な投与経路によって直接注入する、遺伝子治療アプローチのためのインビボ用途に適した送達試薬の1つのクラスである。許容される賦形剤及び/又は緩衝剤と共に製剤化したカチオン性ポリマーは、インビボにおける遺伝子導入に適している。特に、PEIはインビボ用途に有効なポリマーとして報告されている(Boussifら、1995)。
ピラゾール、イミダゾール、又はトリアゾール誘導体等の複素環化合物、特にトリアゾール誘導体は、その特殊な構造特性及び電子豊富な環境から、幅広い生物活性を示す。トリアゾール誘導体は、エンドソーム内のpHに影響を与える特性を有し得る。また、トリアゾールは、核酸との水素結合に寄与し得る。トリアゾールにシクロアルキル部分又はアリール部分を付加することにより、核酸塩基とのπ-πスタッキング等の補助的な疎水性相互作用がもたらされる可能性がある。全体として、これらの特性によって、核酸との相互作用を微調整し、新たなDNAキャリアーを開発する可能性がもたらされる可能性がある。
US8658150 EP2070970 EP0262641 US20090022746 WO2006/041617
本発明者らは、芳香族複素環化合物、特にトリアゾール誘導体を用いて、核酸分子、例えばDNAへの親和性及び結合を微調整し、酸性条件下における緩衝能を最適化し、及び/又は核内での拡散、結合及び取り込みを増加させることによって、トランスフェクション試薬を改良する方法を提供する。
したがって、本発明の目的は、核酸分子を細胞にトランスフェクトするためのより効率的なトランスフェクション組成物又は製剤を提供することにある。
本発明の他の目的は、細胞に投与するための前記組成物又はそのような組成物を含む製剤を用いて、核酸分子をトランスフェクトする方法を提供することにある。
本発明者らは、カチオン性ポリマーによるトランスフェクションの効率を向上させるために、置換複素環化合物、特にイミダゾール、トリアゾール、ピラゾール誘導体の構造に基づくスクリーニングを実施した。このような置換複素環化合物を、様々な分子量のカチオン性ポリマー、特にポリエチレンイミン(PEI)ポリマーにグラフトし、コンジュゲートの微調整を行った。DNA等の核酸分子のトランスフェクションを容易にする最適な構造を定義するために、多くのバリエーションが提案された。疎水性を示す複素環が開発され、これらは核内移行を潜在的に促進する細胞質タンパク質に対する結合モチーフとなる可能性がある。
本発明は、(i)一般式(I)の少なくとも1つの化合物、又はその互変異性体、メソマー、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、若しくは混合物、又はその許容される塩、並びに(ii)許容される賦形剤、緩衝剤、細胞培養培地又はトランスフェクション培地を含む、細胞、好ましくは真核細胞に核酸分子をトランスフェクトするのに適した組成物であって、
Figure 2022543444000002
式中、
- Y1、Y2及びY3は、同一であっても異なっていてもよく、C又はNを表し、ただし、Y1、Y2及びY3の少なくとも2つはNであり、更にY1、Y2及びY3の少なくとも1つ、及び2つ以下は、それぞれZ1、Z2及びZ3で置換されており、
- Z1は、H、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、若しくはX2-P+を表すか、又はZ1は存在しない、
- Z2は、H、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル、C6～C18アリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、C5～C10ヘテロアリール、ハロゲン、OH、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキルアミン、C1～C12アルコキシ、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル-C1～C12アルコキシ、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、若しくはX2-P+を表すか、又はZ2は存在しない、
- Z3は、H、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル、C6～C18アリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、C5～C10ヘテロアリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、C2～C18アルキリデン、OH、グアニジン、ハロゲン、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、若しくはX2-P+を表すか、又はZ3は存在しない、
- X1及びX2は、同一であっても異なっていてもよく、CO又はCH2を表す、
- R3は、(CH2)m、(CH2)m-CHCH3-(CH2)n-、(CH2)m-C(CH3)2-(CH2)n-、(CH2)m-O-(CH2)n-、(CH2)m-S-(CH2)n-、(CH2)m-CH2-O-を表し、mは1～3の間の整数を表し、好ましくはmは2に等しく、nは1～3の間の整数を表す、
- P+は、グラフトカチオン性ポリマーを表し、これは、二級アミン、三級アミン、一級アミンと二級アミンとの混合物、一級アミンと三級アミンとの混合物、二級アミンと三級アミンとの混合物、又は一級アミン、二級アミン及び三級アミンの混合物を含むポリアミンである、
- R又はVは、H、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル又はシクロアルキル、C6～C18アリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C24エステル、C5～C10ヘテロアリール、C5～C10ヘテロシクリル、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル-C5～C10ヘテロアリール、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+を表す、
ただし、
- Z1、Z2、Z3、R又はVの1つのみが、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表す、組成物に関する。
本発明の好ましい実施形態において、細胞、好ましくは真核細胞に核酸分子をトランスフェクトするのに適した組成物は、(i)一般式(III)の少なくとも1つの化合物、又はその互変異性体、メソマー、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、若しくは混合物、又はその許容される塩、並びに(ii)許容される賦形剤、緩衝剤、細胞培養培地、又はトランスフェクション培地を含み、
Figure 2022543444000003
式中、
- Z1は、H、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、若しくはX2-P+を表すか、又はZ1は存在しない、
- Z2は、H、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル、C6～C18アリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、C5～C10ヘテロアリール、ハロゲン、OH、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキルアミン、C1～C12アルコキシ、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル-C1～C12アルコキシ、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、若しくはX2-P+を表すか、又はZ2は存在しない、
- Z3は、H、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル、C6～C18アリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、C5～C10ヘテロアリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、C2～C18アルキリデン、OH、グアニジン、ハロゲン、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、若しくはX2-P+を表すか、又はZ3は存在しない、
- X1及びX2は、同一であっても異なっていてもよく、CO又はCH2を表す、
- R3は、(CH2)m、(CH2)m-CHCH3-(CH2)n-、(CH2)m-C(CH3)2-(CH2)n-、(CH2)m-O-(CH2)n-、(CH2)m-S-(CH2)n-、(CH2)m-CH2-O-を表し、mは1～3の間の整数を表し、好ましくはmは2に等しく、nは1～3の間の整数を表す、
- P+は、グラフトカチオン性ポリマーを表し、これは、二級アミン、三級アミン、一級アミンと二級アミンとの混合物、一級アミンと三級アミンとの混合物、二級アミンと三級アミンとの混合物、又は一級アミン、二級アミン及び三級アミンの混合物を含むポリアミンである、
- R又はVは、H、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル又はシクロアルキル、C6～C18アリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C24エステル、C5～C10ヘテロシクリル、C5～C10ヘテロアリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル-C5～C10ヘテロアリール、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+を表し、
ただし、
- Z1、Z2又はZ3の少なくとも1つが存在し、好ましくはZ1又はZ3が存在し、
- Z1、Z2、Z3、R又はVの1つのみがX1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+を表す。
上記組成物の特定の実施形態において、Z1、Z2又はZ3の1つのみが存在し、好ましくはZ1又はZ3が存在する。
本明細書において定義される「互変異性体」という用語は、水素原子及び電子の位置のみが異なる構造異性体を指す。互変異性体の例としては、ケトン-エノール、エナミン-イミン、アミド-イミド酸、ラクタム-ラクチム、ニトロソ-オキシム、ケテン-イノール、アミノ酸、又はホスファイト-ホスホン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「メソマー」又は「メソ化合物」という用語は、2つ以上のキラル中心を有するが光学的に不活性な立体異性体を指す。
本明細書において定義される「ラセミ体」又は「ラセミ混合物」という用語は、等しい割合の2つのエナンチオマーの混合物を指す。
本明細書において定義される「エナンチオマー」という用語は、鏡像である立体異性体、すなわち鏡像異性体を指す。
本明細書において定義される「ジアステレオマー」という用語は、2つ以上のキラル中心を有するが、互いに鏡像でない化合物の異性体を指す。
本明細書において定義される「許容される賦形剤」という用語は、薬学的に許容されるビヒクルを指し、これは、生理学的に許容される、すなわち、宿主、特にヒトと接触する組成物におけるその使用に適切な、したがって非毒性の、任意の物質又は物質の組合せである。これは、任意の従来の種類の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤補助剤を指していてもよい。適切な許容される賦形剤の例としては、グルコース、ガラクトース、ラクトース、デキストロース、マルトース、マンニトール、スクロース、トレハロース、ポリエチレングリコール、又はプルロニック酸が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「緩衝剤」という用語は、溶液のpHを調整、維持又は制御する薬剤を指す。緩衝剤は、緩衝溶液を含む、弱酸又は弱塩基のいずれでもよい。適切な緩衝剤の例としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素カルシウム、クエン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、水酸化マグネシウム、炭酸水素マグネシウム、酢酸カリウム、酢酸トリス、酢酸ナトリウム、一塩基性リン酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、クエン酸カリウム、又は酸化マグネシウムが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「細胞培養培地」又は「トランスフェクション培地」という用語は、血清含有培地、合成培地、動物成分不含有培地又は既知組成培地、特に細胞を生きたまま維持するため、又は細胞を増殖させるため、分化させるため、又は拡大するため、又はトランスフェクションを増強するための培地を指す。
本明細書において定義される「C1～C18アルキル」という用語は、1～18個の炭素原子を含む直鎖又は分枝鎖の炭化水素鎖の任意の一価の基を表す。「C1～C6アルキル」という用語は、1～6個の炭素原子を有するアルキル基を表す。適切なC1～C18アルキル基の例としては、C1～C4アルキル基、例えばメチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、i-ブチル、s-ブチル又はt-ブチル、C6～C8アルキル基、例えばn-ヘキシル、n-ヘプチル又はn-オクチル、並びにn-ペンチル、2-エチルヘキシル、3,5,5-トリメチルヘキシル、n-ノニル、n-デシル、n-ウンデシル、n-ドデシル又はn-オクタデシルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「C1～C12アルコキシ」という用語は、式-OR'の基を表し、式中、R'は、C1～C12アルキルである。適切なC1～C12アルコキシ基の例としては、C1～C6アルコキシ基、例えばメトキシ(-OCH3)、エトキシ(-OCH2CH3)、t-ブトキシ(-OC(CH3)3)、又は-O(CH2)5CH3が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「C6～C18アリール」という用語は、6～18個の炭素原子を含む芳香族炭化水素の任意の一価の基を表す。適切なC6～C18アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アントラセニル又はフェナントレニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「C6～C18アリール-C1～C18アルキル」という用語は、本明細書で定義されるアルキル基に結合した、本明細書で定義されるアリール基を表す。適切なC6～C18アリール-C1～C18アルキル基の例としては、ベンジル、フェニルエチル(又はフェネチル)、フェニルプロピル、フェニルブチル、フェニルペンチル、フェニルヘキシル、ナフチルメチル、ナフチルエチル、ナフチルプロピル、ナフチルブチル、ナフチルペンチル、ナフチルヘキシル、アントラセニルメチル、アントラセニルエチル、アントラセニルプロピル、アントラセニルブチル、アントラセニルペンチル、アントラセニルヘキシル、フェナンスレニルメチル、フェナンスレニルエチル、フェナンスレニルプロピル、フェナンスレニルブチル、フェナンスレニルペンチル又はフェナンスレニルヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「C2～C18ヘテロアルキル」という用語は、O、N、又はS等の1つ又は複数のヘテロ原子で置換された本明細書で定義されるアルキル基を表す。
本明細書において定義される「C5～C10ヘテロアリール」という用語は、酸素、窒素及び硫黄から独立して選択される1～3個のヘテロ原子を含む単環式又は二環式の5～10員芳香族基の任意の一価の基を表す。適切なC5～C10ヘテロアリール基の例としては、フリル、チエニル、ピロリル、ピラゾイル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾイル、チアゾリル、オキサゾリル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、1-ベンゾフリル、1-ベンゾチエニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、1,2-ベンズイソオキサゾリル、2,1-ベンズイソオキサゾリル、1,2-ベンズイソチアゾリル、2,1-ベンズイソチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、ピリジル、ピリジニウム、キノリニル、キノリニウム、イソキノリニル、イソキノリニウム、ピリダジニル、シノリニル、フタラジニル、ピリミジニル、キナゾリニル、ピラジニル又はキノキサリニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「C1～C18アルキルアミン」という用語は、炭素原子に結合した水素原子の1つがアミノ基で置き換えられている、1～18個の炭素原子を含む直鎖又は分枝鎖の炭化水素鎖の任意の一価の基を表す。適切なC1～C18アルキルアミンの例としては、nが1～18の間の整数を表す-(CH2)n-NH2、-CH2NHCH3、-CH2CH(CH3)-NH2、又はnが1～6の間の整数を表す-(CH2)nN(CH3)2が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「C1～C18アルキル-C1～C12アルコキシ」という用語は、本明細書で定義されるアルコキシ基に結合した、本明細書で定義されるアルキル基を表す。
本明細書において定義される「C2～C18アルキリデン」という用語は、同じ炭素原子から2つの水素原子を除去することによってアルカンから誘導される二価の基を指し、自由価は二重結合(=CR2)の一部である。適切なC2～C18アルキリデンの例としては、=CH2、=CH(CH2CH3)、又は=C(CH3)2が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「ハロゲン」という用語は、F、Cl、Br又はIの原子を表す。
本明細書において定義される「C1～C24エステル」という用語は、式-C(O)OR''の基を表し、式中、R''は、C1～C24アルキル、特に本明細書に定義されるC1～C18アルキルである。
本明細書において定義される「C5～C10ヘテロシクリル」という用語は、O、N、又はS等の1つ又は複数のヘテロ原子を含む単環式又は二環式の5～10員環の任意の一価の基を指す。適切なヘテロシクリル基の例としては、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル又はアゼパニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
他に言及しない限り、本明細書で定義された基(group)及び基(radical)は、非置換であっても、1つ又は複数の置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシカルボニル、アルカノイル、アロイル、ホルミル、ニトリル、ニトロ、アミド、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールチオ、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルアミノ及びジアリールアミノ等によって置換されていてもよい。
本発明の特定の実施形態において、組成物は、細胞にトランスフェクトされる少なくとも1つの核酸分子を更に含む。好ましくは、前記核酸分子は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、DNA/RNAハイブリッド、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、CRISPRガイドRNA、及び前記核酸分子をコードする発現ベクター、特に前記核酸分子をコードするプラスミド、又はsiRNA、マイクロRNA、shRNA、CRISPRガイドRNA等の前記核酸分子を発現するプラスミドからなる群から選択される。好ましくは、前記核酸分子は、DNAである。
本発明の組成物において別個の核酸が提供される場合、それらは全てDNA分子であっても、又は全てRNA分子であっても、又はDNA及びRNA分子の混合物、又はDNA鎖及びRNA鎖の会合を含む分子であってもよい。
前記核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、修飾塩基を含んでいても非修飾塩基を含んでいてもよい。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸分子」という用語は、これらの核酸分子を指定するために互換的に使用される。
本発明による組成物は、本明細書に提供される開示に従って、核酸分子と、一般式(I)の少なくとも1つの化合物(本明細書に開示される任意の特定の実施形態を含む)、好ましくは一般式(III)の少なくとも1つの化合物、及び許容される賦形剤、緩衝剤、細胞培養培地又はトランスフェクション培地との配合物として使用され得る。或いは、細胞培養物又は拡大細胞として使用してもよく、ここで、培養物及び/又は拡大細胞として提供する前に、単離された細胞は、前記トランスフェクション用の配合物で処理されている。それ以外の場合、本発明の組成物は、一実施形態として、本発明に従ってトランスフェクションにより前記製剤が導入された細胞又は細胞培養物又は拡大細胞を包含する。細胞は、特に哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞である。細胞は、分裂細胞であっても、又は非分裂細胞であってもよい。
本発明の特定の実施形態において、本発明による組成物は、1～5、好ましくは少なくとも2つの一般式(I)、好ましくは一般式(III)の異なる化合物、又はその互変異性体、メソマー、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、若しくは混合物、又はその許容される塩を含む。
本発明の特定の実施形態において、本明細書で定義される一般式(I)の少なくとも1つの好ましい化合物は、式中、(i)Y1及びY3がNを表し、Y2がCを表す、又は(ii)Y1及びY2がNを表し、Y3がCを表す、又は(iii)Y2及びY3がNを表し、Y1がCを表す、又は(iv)Y1、Y2及びY3がNを表す、化合物である。(iv)Y1、Y2及びY3がNを表す場合、本明細書で定義される一般式(I)の少なくとも1つの好ましい化合物は、一般式(III)の化合物に相当する。
一般式(III)の化合物の構造は対称的であるため、RとVが入れ替わっていてもよく、Z1とZ3が入れ替わってもよい。したがって、Rに対する定義は、Vにも適用され、Z1に対する定義は、Z3にも適用される。
本発明の特定の実施形態において、本明細書で定義される、一般式(I)、好ましくは一般式(III)の少なくとも1つの好ましい化合物は、(i)Z1がHを表す、又は(ii)Z1がX1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に定義する通りである、より好ましくは、Z1がX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい、化合物である。
本発明の特定の実施形態において、本明細書で定義される、一般式(I)、好ましくは一般式(III)の少なくとも1つの好ましい化合物は、(i)Z2が、H、C1～C12アルコキシ、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキルを表す、より好ましくはZ2が、H、CH3、CF3又はOCH3を表す、更により好ましくは、Z2がCH3を表す、又は(ii)Z2が、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に定義する通りである、より好ましくは、Z2が、X1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい、化合物である。
本発明の特定の実施形態において、本明細書で定義される、一般式(I)、好ましくは一般式(III)の少なくとも1つの好ましい化合物は、(i)Z3が、H、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C6アルキル、又は直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、好ましくはフルオロベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表すか、又は(ii)Z3が、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に定義する通りである、より好ましくは、Z3が、X1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい、化合物である。
本発明の好ましい実施形態において、(i)Z1が、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に定義する通りである、より好ましくは、Z1がX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい場合、(ii)Z2は、H、C1～C12アルコキシ、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキルを表し、より好ましくは、Z2は、H、CH3、CF3又はOCH3を表し、及び/又は(iii)Z3は、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキル、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、好ましくはフルオロベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表す、及び/又は(iv)R又はVは、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル又はシクロアルキル、C6～C18アリール、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C24エステル、C5～C10ヘテロシクリル、C5～C10へテロアリール又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル-C5～C10ヘテロアリールを表す。
本発明の他の好ましい実施形態において、(i)Z2が、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に定義する通りである、より好ましくは、Z2が、X1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい場合、(ii)Z1は、Hを表し、及び/又は(iii)Z3は、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキル、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、好ましくはフルオロベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表し、及び/又は(iv)R又はVは、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル又はシクロアルキル、C6～C18アリール、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C24エステル、C5～C10ヘテロシクリル、C5～C10へテロアリール又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル-C5～C10へテロアリールを表す。
本発明の他の好ましい実施形態において、(i)Z3が、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に定義する通りである、より好ましくは、Z3が、X1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい場合、(ii)Z1は、Hを表す、及び/又は(iii)Z2は、H、C1～C12アルコキシ又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキルを表し、より好ましくは、Z2は、H、CH3、CF3又はOCH3を表し、及び/又は、(iv)R又はVは、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル又はシクロアルキル、C6～C18アリール、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C24エステル、C5～C10ヘテロシクリル、C5～C10へテロアリール、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル-C5～C10ヘテロアリールを表す。
本発明の他の好ましい実施形態において、(i)R又はVが、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に定義する通りである、より好ましくはZ3が、X1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい場合、(ii)Z1はHを表し、及び/又は(iii)Z2は、H、C1～C12アルコキシ、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキルを表し、及び/又は(iv)Z3は、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキル、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、好ましくはフルオロベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表す。
本発明の特定の実施形態において、本明細書で定義される一般式(I)、好ましくは一般式(III)の少なくとも1つの好ましい化合物は、(i)Z1、Z2又はZ3の1つのみが、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に定義する通りである、より好ましくはZ1、Z2又はZ3の1つのみが、X1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい、及び/又は(ii)Z1がHを表す、及び/又は(iii)Z2が、H、C1～C12アルコキシ、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキルを表す、より好ましくは、Z2が、H、CH3、CF3又はOCH3を表す、及び/又は(iv)Z3が、H、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキルを表す、化合物である。
本発明の特定の実施形態において、本明細書で定義される一般式(I)、好ましくは一般式(III)の少なくとも1つの好ましい化合物は、(i)R又はVが、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に定義する通りである、より好ましくはZ3が、X1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい場合、(ii)Z3が存在し、Z3がH、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキル、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、好ましくはフルオロベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表す、化合物である。
本発明の特定の実施形態において、定義される一般式(I)、好ましくは一般式(III)の少なくとも1つの好ましい化合物は、グラフトカチオン性ポリマーが、直鎖又は分枝鎖ポリエチレンイミン(PEI)、PEIデンドリマー、ポリプロピレンイミン(PPI)、ポリ(アミドアミン)(PAA)及びデンドリマー(PAMAM)、カチオン性シクロデキストリン、ポリアルキルアミン、ポリヒドロキシアルキルアミン、ポリ(ブチレンイミン)(PBI)、スペルミン、N置換ポリアリルアミン、N置換キトサン、N置換ポリオルニチン、N置換ポリリジン(PLL)、N置換ポリビニルアミン、ポリ(β-アミノエステル)、多分枝ポリ(アミノエステル)(h-PAE)、ネットワークポリ(アミノエステル)(n-PAE)、ポリ(4-ヒドロキシ-1-プロリンエステル)(PHP-エステル)及びポリ-β-アミノ酸からなる群から選択される化合物である。好ましくは、グラフトカチオン性ポリマーは、直鎖又は分枝鎖のPEIであり、より好ましくは直鎖のPEIである。
グラフトカチオン性ポリマーは、1～50%、好ましくは5～30%の範囲のグラフト比率を有していてもよく、より好ましくは20%である。
本明細書において定義される「グラフト比率」という用語は、側鎖による一級又は二級アミノ基上のグラフトモノマーの数を、元のカチオン性ポリマーに存在する全モノマーの数で割った数を指す。グラフト比率は、カチオン性ポリマーの分子量、ポリマーにグラフトされた側鎖の化学反応性、又は得られる生物学的効果に依存する。前記グラフト比率は、当技術分野でよく知られた測定方法、例えばNMRによって決定することができる。
グラフトカチオン性ポリマーは、1kDa～500kDa、好ましくは1kDa～50kDa、より好ましくは5kDa～50kDa又は1kDa～15kDaの範囲の平均分子量(Mw)を有していてもよい。特に、グラフトカチオン性ポリマーは、6、8、10、15、22又は30kDa、好ましくは6、8、10、15又は30kDaの平均分子量(Mw)を有していてもよい。
グラフトカチオン性ポリマーは、塩化物、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、炭酸塩、コハク酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、又はカルボン酸塩等の対イオンと会合し得る。
本発明の特定の実施形態において、本明細書で定義される、一般式(I)、好ましくは一般式(III)の少なくとも1つの好ましい化合物は、Y1、Y2、Y3、Z1、Z2、Z3、X1、X2、R3及びP+が本明細書で定義する通りであり、R又はVが、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル又はシクロアルキル、C6～C18アリール、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C24エステル、C5～C10ヘテロシクリル、C5～C10ヘテロアリール、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル-C5～C10ヘテロアリール、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+を表す、化合物である。
好ましくは、R又はVは、H、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、イソプロピル、sec-ブチル、シクロペンチル、フェニル、フルオロフェニル、ベンジル、ピリジン、2-ピリジン、3-ピリジン、フルオロベンジル、置換モルホリニル、置換ピペラジニル、4-ヒドロキシベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表し、より好ましくは、R又はVは、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、イソプロピル、sec-ブチル、シクロペンチル、フェニル、ベンジル、フルオロベンジル、4-ヒドロキシフェネチル、2-ピリジン又は3-ピリジンを表す。
Z1、Z2、Z3、X1、X2、R3及びPに関連する式(III)の化合物の最も好ましい実施形態は、式(I)の化合物について本明細書で定義する通りである。
本発明の特定の実施形態において、好ましい化合物は、Z1、Z2又はZ3の1つのみ、好ましくはZ1が、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が式(I)、好ましくは式(III)で定義される通りである化合物である。
本発明の特定の実施形態において、好ましい化合物は、R又はVの1つのみがX1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が、式(I)、好ましくは式(III)で定義される通りである化合物である。
本発明の特定の実施形態において、好ましい化合物は、Y1、Y2及びY3がNを表す化合物である。これらの化合物は、一般式(III)の化合物に相当する。
本発明の特定の実施形態において、好ましい化合物は、Z3が直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、好ましくはフルオロベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表す化合物である。
本発明の特定の実施形態において、好ましい化合物は、RがH、メチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ベンジル、フルオロベンジル、ピリジン、2-ピリジン、3-ピリジン、フェニル、フルオロフェニル、置換モルホリニル又は置換ピペラジニルを表す化合物である。
本発明の特定の実施形態において、好ましい化合物は、VがH、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が式(I)、好ましくは式(III)で定義される通りである化合物である。
本発明の好ましい実施形態において、好ましい化合物は、(i)Y1、Y2及びY3がNを表す、及び/又は(ii)VがX1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が式(I)で定義される通りである、及び/又は(iii)RがHを表す、及び/又は(iv)Z3が、フルオロベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表す化合物である。
本発明の好ましい実施形態において、好ましい化合物は、(i)Y1、Y2及びY3がNを表す、及び/又は(ii)Z1がX1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表す、及び/又は(iii)VがHを表す、及び/又は(iv)Rが、ベンジル、フルオロベンジル、ピリジン、2-ピリジン、3-ピリジン、メチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、フェニル、フルオロフェニル、置換モルホリニル、又は置換ピペラジニルを表す、化合物である。
本発明の特定の実施形態によれば、好ましい化合物は、Table 1(表1)に開示されている、化合物2.19～2.61、好ましくは化合物2.19、2.22、2.23、2.42、2.43、2.44、2.46、2.47、2.54、2.55、2.56、2.57、2.58、2.59、2.60及び2.61に対応する。
Figure 2022543444000004
Figure 2022543444000005
Figure 2022543444000006
Figure 2022543444000007
Figure 2022543444000008
本発明の特定の実施形態において、一般式(III)の少なくとも1つの化合物は、以下の化合物からなる群から選択される:
Figure 2022543444000009
Figure 2022543444000010
Figure 2022543444000011
本発明の好ましい実施形態において、一般式(III)の少なくとも1つの化合物は、以下の化合物:2.19、2.22、2.42、2.43、2.44、2.46、2.47、2.54、2.55、2.56、2.57、2.58、2.59、2.60及び2.61からなる群から選択され、更により好ましくは、化合物2.22である。
一般式(I)、好ましくは一般式(III)の少なくとも1つの化合物は、当技術分野でよく知られている種々の方法に従って調製し得る。
本発明はまた、本発明の組成物を用いた外来性核酸の取り込みによる細胞形質転換、細胞治療又は遺伝子治療のためのインビボ用途に使用するための本発明による組成物に関する。細胞は、真核細胞、特に哺乳類細胞、特にヒト細胞、特に初代細胞であってもよく、分裂細胞又は非分裂細胞のいずれであってもよい。
本発明はまた、本発明による組成物を細胞に導入することを含む、生細胞のインビトロ又はエクスビボのトランスフェクションのための方法にも関する。前記生細胞は、血清含有培地、合成培地、動物成分不含有培地又は既知組成培地中で提供又は維持されていてもよい。
本発明はまた、細胞、細胞株又は細胞、好ましくは哺乳類細胞、昆虫細胞、初代細胞、接着細胞、浮遊細胞、分裂細胞、例えば肝細胞、非分裂細胞、例えば神経細胞、及びがん細胞からなる群から選択される細胞、細胞株又は細胞に少なくとも1つの核酸分子をトランスフェクトするための本発明による組成物のインビトロ又はエクスビボの使用に関するものであり、前記細胞、細胞株又は細胞は、任意に、スフェロイド、オルガノイド、2D又は3D細胞培養物に組織化されているか、又は繊維若しくはマトリクス培養物として、及び/又はバイオリアクター内で提供される。
本明細書において定義される「接着細胞」という用語は、増殖のために固体支持体を必要とし、したがって、足場依存性である細胞を指す。接着細胞の例としては、MRC-5細胞、HeLa細胞、Vero細胞、NIH-3T3細胞、L293細胞、CHO細胞、BHK-21細胞、MCF-7細胞、A549細胞、COS細胞、HEK293細胞、Hep G2細胞、SNN-BE(2)細胞、BAE-1細胞又はSH-SY5Y細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「浮遊細胞」という用語は、増殖のために固体支持体を必要とせず、したがって、足場非依存性である細胞を指す。浮遊細胞の例としては、NSO細胞、U937細胞、Namalawa細胞、HL60細胞、WEHI231細胞、Yac1細胞、Jurkat細胞、THP-1細胞、K562細胞又はU266B1細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において定義される「スフェロイド」という用語は、三次元構造を保持する培養中の細胞の球状の異種凝集体を指す。
本明細書において定義される「オルガノイド」という用語は、インビボと同様の方法で自己組織化された器官特異的な細胞種の集合でできた三次元構造を指す。
本明細書において定義される「繊維又はマトリクス培養物」という用語は、マトリクスに自己組織化した不溶性の弾性繊維又は細胞外タンパク質から構成される三次元細胞培養支持体を指す。
前記トランスフェクションは、安定的であっても一過性であってもよく、標準的であっても逆であってもよい。
本明細書に開示されるように、本発明による組成物は、共トランスフェクションのための複数の異なる核酸、特に、複数のプラスミドDNA、プラスミドDNA及びオリゴヌクレオチド、プラスミドDNA及びmRNAからなる群から選択されるものを含んでいてもよい。
トランスフェクトされる前記少なくとも1つの核酸分子は、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、又は抗体若しくはその機能的抗原結合領域、特にそのVH及び/又はVL鎖をコードする遺伝子であってもよい。前記タンパク質は、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、酵素、構造タンパク質、受容体、膜貫通タンパク質、治療タンパク質、サイトカイン、毒素、発癌タンパク質、抗癌遺伝子、アポトーシス促進タンパク質、アポトーシス抑制タンパク質、ポリメラーゼ、転写因子及びキャプシドタンパク質からなる群から選択されてもよい。
本発明はまた、ゲノム工学、細胞リプログラミング、特に分化した細胞の人工多能性幹細胞(iPC)へのリプログラミング、細胞の分化、又は遺伝子編集のための、本発明による組成物のインビトロ又はエクスビボの使用に関する。このような使用は、生物製剤の産生、治療目的の細胞の調製、又は細胞の機能若しくは挙動の研究のため、特にトランスフェクション後の細胞の拡大のステップのために、インビトロ又はエクスビボでの細胞培養において実施することができ、又はそれを必要とする宿主における治療目的のためにインビボで実施することができる。
本発明はまた、本発明による組成物のインビトロ又はエクスビボの使用であって、(i)生物製剤、特に組換えタンパク質、ペプチド又は抗体をコードする生物製剤の産生における使用、又は(ii)前記組成物が、共トランスフェクションのための複数のプラスミド等の複数の核酸分子を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス(LV)、アデノウイルス、腫瘍溶解ウイルス、又はバキュロウイルス等の組換えウイルスの産生における使用、又は(iii)前記組成物が、共トランスフェクションのための複数のプラスミド等の複数の核酸分子を含む、ウイルス又はウイルス様粒子の産生における使用に関する。
したがって、本発明はまた、(i)生物製剤、特に組換えタンパク質、ペプチド又は抗体をコードする生物製剤の産生、又は(ii)本発明による組成物が共トランスフェクションのための複数の核酸分子を含む、組換えウイルス、例えばアデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス(LV)、アデノウイルス、腫瘍溶解ウイルス、又はバキュロウイルスの産生、又は(iii)本発明による組成物が共トランスフェクションのための複数の核酸分子を含む、ウイルス又はウイルス様粒子の産生のための方法に関する。
AAVの産生方法の好ましい実施形態において、前記組成物は、(i)化合物2.22、2.23、2.43、2.44、2.47、2.54、2.57、2.60及び2.61からなる群から選択される少なくとも1つの化合物、並びに(ii)許容される賦形剤、緩衝剤、細胞培養培地、又はトランスフェクション培地を含む。
LVの産生方法の好ましい実施形態において、前記組成物は、(i)少なくとも化合物2.22、及び(ii)許容される賦形剤、緩衝剤、細胞培養培地、又はトランスフェクション培地を含む。
本明細書において定義される「生物製剤」という用語は、タンパク質、若しくは核酸又はその組合せ、細胞又はウイルス、細胞区画、オルガノイド、及び組織等の生物実体を指す。
本発明の特定の実施形態において、本発明による組成物又は前記方法の前記インビトロ又はエクスビボの使用は、組換えウイルスの産生のためであり、前記組成物は、接着細胞又は浮遊細胞、例えばHEK293及び誘導体細胞、HeLa、BHK-21、A549又は昆虫細胞にトランスフェクトするための、プラスミドベクター等の複数の発現ベクターを含み、ここで、前記ベクター、特にプラスミドは、ウイルス又はウイルス様産生のためのウイルス構造配列及び移入ベクターゲノムを発現し、任意に移入ベクターゲノムによってコードされる目的の分子を発現するコンストラクトである。
本発明の特定の実施形態において、前記組換えウイルスは、細胞治療又は遺伝子治療のためのインビボ用途に使用するためのものである。
本発明の特定の実施形態において、本発明は、アデノ随伴ウイルス(AAV)又はレンチウイルス(LV)等の組換えウイルスの産生における本発明による組成物のインビトロ又はエクスビボの使用に関し、前記組成物は、(i)化合物2.22、2.23、2.42、2.43、2.44、2.46、2.47、2.54、2.57、2.60及び2.61の群から選択される少なくとも1つの化合物、並びに(ii)許容される賦形剤、緩衝剤、細胞培養培地又はトランスフェクション培地を含む。好ましくは、化合物2.22を含む組成物は、LVの産生において使用され、化合物2.22、2.23、2.43、2.44、2.47、2.54、2.57、2.60及び2.61からなる群から選択される少なくとも1つの化合物を含む組成物は、AAVの産生において使用される。
特に断らない限り、上述した実施形態は全て互いに組み合わせることができる。したがって、別々の実施形態の文脈で記載される特徴は、単一の実施形態において組み合わされてもよい。
本発明の他の特徴及び利点は、後に続く実施例から明らかになり、また図面にも示される。
一般式(I)の化合物の化学構造。 Caco-2、Hep G2、MDCK及びMCF-10Aに実施例3の化合物をトランスフェクトした後のGFP発現の百分率。比率1:3及び1:4は、化合物1μLあたりのDNAのμgの比率を示す。 浮遊HEK-293T細胞からのAAV-2の産生。GFPレポーター遺伝子を発現するAAV-2ベクターを、FreeStyle F17培地で浮遊増殖させたHEK-293T細胞において産生した。細胞を播種し、3日間培養した後、3つのプラスミド(RepとCapを発現するpAAV-RC2ベクター、Adeno E2A、Adeno E4、及びAdeno VAヘルパー因子を発現するpHelperベクター、及びCMVプロモーターの制御下でGFPを発現するpAAV-GFPコントロールベクター)をPEIpro(登録商標)又は種々の化合物と共に1:2又は1:3 DNAμg/試薬μLの比率でトランスフェクトした。AAV力価(形質導入単位、TU/mL)は、トランスフェクションの72時間後に決定した。結果は、比率1:2及び1:3のPEIpro(登録商標)トランスフェクションと比較した、相対的なAAV-2形質導入単位/mL(TU/mL)として表される。 浮遊HEK-293T細胞からのレンチウイルス粒子の産生。GFPレポーター遺伝子を発現するレンチウイルスを、FreeStyle F17培地で浮遊増殖させたHEK-293T細胞において産生した。細胞を播種し、3日間培養した後、4つのプラスミドを、PEIpro(登録商標)又は化合物2.22と共に、1:2の総DNAμg/試薬μLの比率でトランスフェクトした。レンチウイルス力価(形質導入単位、TU/mL)をトランスフェクションの72時間後に決定した。 一般式(III)の化合物の化学構造。 Hep G2細胞に化合物2.22及び2.53～2.61をトランスフェクトした後のGFP発現の百分率。比率1:3及び1:4は、化合物1μLあたりのDNAのμgの比率を示す。 化合物2.22及び2.53～2.61を用いた浮遊HEK-293T細胞からのAAV-2の産生。GFPレポーター遺伝子を発現するAAV-2ベクターを、FreeStyle F17培地で浮遊増殖させたHEK-293T細胞において産生した。細胞を播種し、3日間培養した後、3つのプラスミド(RepとCapを発現するpAAV-RC2ベクター、Adeno E2A、Adeno E4、及びAdeno VAヘルパー因子を発現するpHelperベクター、及びCMVプロモーターの制御下でGFPを発現するpAAV-GFPコントロールベクター)をPEIpro(登録商標)又は種々の化合物と共に1:2のDNAμg/試薬μL比率でトランスフェクトした。AAV力価(形質導入単位、TU/mL)は、トランスフェクションの72時間後に決定した。結果は、相対的なAAV-2形質導入単位/mL(TU/mL)として表される。 浮遊HEK-293T細胞からのAAV-2の産生に対する、トランスフェクトされたDNAの量とDNA 1μgあたりの化合物2.22の比率の影響。GFPレポーター遺伝子を発現するAAV-2ベクターを、FreeStyle F17培地で浮遊増殖させたHEK-293T細胞において産生した。細胞を播種し、3日間培養した後、3つのプラスミド(RepとCapを発現するpAAV-RC2ベクター、Adeno E2A、Adeno E4、及びAdeno VAヘルパー因子を発現するpHelperベクター、及びCMVプロモーターの制御下でGFPを発現するpAAV-GFPコントロールベクター)を、化合物2.22(窒素濃度15mMで製剤化)と共に異なるDNAμg/試薬μLの比率(1:1.5～1:3の比率)でトランスフェクトした。AAV力価(形質導入単位、TU/mL)は、トランスフェクションの72時間後に決定した。結果は、相対的なAAV-2形質導入単位/mL(TU/mL)として表される。細胞生存率は、トリパンブルーアッセイを用いて、トランスフェクションの72時間後に決定した。 浮遊HEK-293T細胞からのAAV-2の産生に対する化合物2.22とのDNA複合体形成の時間の影響。GFPレポーター遺伝子を発現するAAV-2ベクターを、FreeStyle F17培地で浮遊増殖させたHEK-293T細胞において産生した。細胞を播種し、3日間培養した後、3つのプラスミド(RepとCapを発現するpAAV-RC2ベクター、Adeno E2A、Adeno E4、及びAdeno VAヘルパー因子を発現するpHelperベクター、及びCMVプロモーターの制御下でGFPを発現するpAAV-GFPコントロールベクター)を、化合物2.22(窒素濃度15mMで製剤化)と共に、1:2のDNA/試薬μL比率で、1μg DNA/106細胞でトランスフェクトした。AAV力価(形質導入単位、TU/mL)は、トランスフェクションの72時間後に決定した。結果は、相対的なAAV-2形質導入単位/mL(TU/mL)として表される。
実験セクション
材料及び方法
細胞培養
Caco-2(ATCC(登録商標)HTB-37(商標))ヒト結腸上皮細胞は、1%非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、2mMグルタミン、及び100U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを添加した20%FBSを含むDMEM 4.5g/Lグルコース中で、37℃、大気雰囲気5%CO2で増殖させた。
MCF 10A(ATCC(登録商標)CRL-10317(商標))ヒト乳腺上皮細胞は、SingleQuots(商標)Supplements and Growth Factors(Lonza社)及び100ng/mlコレラ毒素を添加したMEBM(Lonza社)中で、37℃、大気雰囲気5%CO2で増殖させた。
Hep G2(ATCC(登録商標)HB-8065(商標))ヒト肝癌細胞は、1%非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、2mMグルタミン、及び100U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを添加した10%FBSを含むMEM(Ozyme社)中で、37℃、大気雰囲気5%CO2で増殖させた。
MDCK(ATCC(登録商標)CCL-34(商標))Madin-Darbyイヌ腎臓上皮細胞は、2mMグルタミン及び100U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを添加した10%FBSを含むMEM(Ozyme社)中で、37℃、大気雰囲気5%CO2で増殖させた。
初代ヒト皮膚線維芽細胞は、10%FBS、1%非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、2mMグルタミン、及び100U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEM(Ozyme社)中で、37℃、大気雰囲気5%CO2で増殖させた。
トランスフェクションアッセイ(96ウェルフォーマット)
トランスフェクションの1日前に、Caco-2、MCF 10A、Hep G2、及びMDCK細胞をそれぞれ125μLの完全培地に1ウェルあたりそれぞれ10000、25000、25000、10000個の細胞(96ウェルプレートフォーマット)で播種し、37℃、大気雰囲気5%CO2でインキュベートした。トランスフェクションの日に、pCMV-EGFPLuc DNA(Clontech社)200ngをOPTIMEM(Thermo Fisher社)20μLに添加し、ボルテックスで混合し、室温(rt)で5分間インキュベートした。次に、一般式(I)、好ましくは一般式(III)の化合物0.6又は0.8μL(窒素濃度7.5mM)を希釈したDNA上に添加し、ボルテックスで混合し、室温で10分間インキュベートした。トランスフェクションDNA溶液(20μL)をウェル内に添加し、プレートを37℃、大気雰囲気5%CO2で24時間インキュベートした。
GFP発現解析のために、トランスフェクションの1日後に細胞培養培地を除去し、1ウェルあたりトリプシン-EDTA(1x、Lonza社)50μLを添加し、プレートを37℃で5分間インキュベートした。完全培地150μLを添加してトリプシンを中和し、Guava easyCyte 6HTサイトメーター(Millipore社)を用いてフローサイトメトリー(励起488nm、放出520nm)によりGFP発現を解析した(2000イベント)。
組換えウイルス産生
HEK-293T(ATCC(登録商標)CRL-3216(商標)):ヒト胚性腎臓細胞は、ヒト胚性腎臓293細胞の高トランスフェクション可能な誘導体であり、SV40 T-抗原を含む。HEK-293T細胞は、組換えウイルス産生、遺伝子発現、及びタンパク質産生に広く使用されている。
接着細胞については、HEK-293T細胞を、10%FBS、2mMグルタミン、及び100U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEM 4.5g/Lグルコース15mL中で、145cm2ペトリ皿に5×106細胞で播種し、37℃、大気雰囲気5%CO2でインキュベートした。
AAV-2を、3つのプラスミド、RepとCapを発現するpAAV-RC2ベクター、Adeno E2A、Adeno E4、及びAdeno VAヘルパー因子を発現するpHelperベクター、及びCMVプロモーターの制御下でGFPを発現するpAAV-GFPコントロールベクターを共トランスフェクトすることによってAAV-2 Helper Free Packaging System(カタログ番号VPK-402、Cell BIOLABS, INC社)を用いて、HEK-293T細胞において産生させた。pAAV-RC2、pHelper、及びpAAV-GFPをそれぞれ2:2:1の比率でトランスフェクション複合体(ペトリ皿あたり総DNA 10μg)を調製した。プラスミドをOPTIMEM総体積1.5mLで希釈した。その後、化合物20又は30μLを希釈したDNA上に添加し、ボルテックスで混合し、室温で10分間インキュベートした。トランスフェクション複合体を細胞上に添加し、プレートを37℃、大気雰囲気5%CO2で72時間インキュベートした。
浮遊細胞については、HEK-293T細胞を、125mLフラスコErlenmeyer(Corning社)中で、4%グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、及び0.1%プルロニックを添加したFreeStyle F17 27mLに1×106細胞/mLで播種した。細胞を、37℃、大気雰囲気8%CO2で攪拌しながら(130rpm)24時間インキュベートした。プラスミド(pAAV-GFP-pAAV-RC2-pHelper、比率2:2:1)をFreeStyle F17 3mLで希釈した。その後、希釈したDNA上に化合物を添加し(DNA 1μgあたり2又は3μLの比率)、ボルテックスで混合し、室温で10分間インキュベートした。トランスフェクション複合体を細胞上に添加し(1×106細胞あたりDNA 2μg)、プレートを37℃、大気雰囲気8%CO2で攪拌しながら(130rpm)72時間インキュベートした。
pRSV-REVパッケージングベクター、pCgpVパッケージングベクター、及びpCMV-VSV-Gエンベロープベクターを含むViraSafe(登録商標)Lentiviral Packaging System、Pantropic(カタログ番号VPK-20、CELL BIOLABS社)を用いてレンチウイルス粒子を産生した。pLenti6.3/V5-GW/EmGFP発現コントロールベクターはThermo Fisher社製であった。
HEK-293T細胞は、125mLフラスコErlenmeyer(Corning社)中、4%グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、及び0.1%プルロニックを添加したFreeStyle F17 27mLに1×106細胞/mLで播種した。細胞を、37℃、大気雰囲気8%CO2で攪拌しながら(130rpm)24時間インキュベートした。プラスミド(pRSV-REV-pCgpV-pCMV-VSV-G-pLenti6.3、比率1:1:1:3)をFreeStyle F17 3mLで希釈した。その後、化合物を希釈したDNA上に添加し(DNA 1μgあたり2μLの比率)、ボルテックスで混合し、室温で10分間インキュベートした。トランスフェクション複合体を細胞上に添加し(1×106細胞あたりDNA 2μg)、プレートを37℃、大気雰囲気8%CO2で攪拌(130rpm)しながら72時間インキュベートした。
レンチウイルスベクターについては許容性HT1080細胞、及びAAV-2ベクターについてはHEK-293T細胞に、96ウェルでポリブレン(8μg/mL)の存在下で感染した後、GFPレポーター遺伝子を発現するウイルスベクターを使用することによって、形質導入単位(TU/mL)を決定した。GFP発現は、形質導入72時間後にサイトメトリーにより解析して、形質導入単位を決定した。
(実施例1)
グラフトポリマーの調製のための一般的な手順
ステップ1:グラフト化
丸底フラスコに、水中のカチオン性ポリマー(1当量)(出発物質4mL/mmol)を添加し、続いてN-メチルモルホリン又はNMM(2当量)を添加した。カルボキシレート(0.3～1当量)を添加し、続いてMeOH(ポリマー16mL/mmol)を添加した。10分間攪拌した後、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド又はDMTMM(0.6～2当量)を添加し、混合物を室温で12～24時間攪拌した。その後、MeOHを真空で除去し、水(出発物質4mL/mmol)、続いて3M HCl(出発物質1mL/mmol)溶液を添加した。残渣を50mM HCl浴中で透析カセットを用いて精製した。
ステップ2:酸から出発する「クリック」ケミストリーによるトリアゾールの合成
Figure 2022543444000012
nBuOHと水の2:1(v/v)溶液にアルキン(1当量)、アジド(1当量)、CuSO4(0.01当量)及びアスコルビン酸ナトリウム(0.03当量)を添加した。反応物を室温で24時間攪拌した。その後、NaOH(5M、2当量)を添加し、有機溶媒を真空で除去した。残渣を、水中0～100%CH3CNを溶出液として使用する逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
ステップ3:エステルから出発する「クリック」ケミストリーによるトリアゾールの合成
Figure 2022543444000013
nBuOHと水の2:1(v/v)溶液にアルキン(1当量)、アジド(1当量)、CuSO4(0.01当量)及びアスコルビン酸ナトリウム(0.03当量)を添加した。反応物を室温で24時間攪拌した。その後、NaOH(5M、2当量)を添加し、有機溶媒を真空で除去した。残渣を、水中0～100%CH3CNを溶出液として使用する逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
ステップ4:エステル部分の鹸化
EtOH中のエステルの溶液に、LiOHの3M溶液を滴加し、混合物を室温で週末の間攪拌した。その後、溶媒を真空で除去し、残渣をBiotage Flash精製システムを用いてH2O/MeCNを溶出液として使用するSiO2上の逆相FCによって精製した。得られた酸を凍結乾燥し、固体を得た。
ステップ5:ルテニウム触媒によるエステルから出発する「クリック」ケミストリーによるトリアゾールの合成。
Cp*RuCl(cod)をマイクロ波バイアルに添加した。次に、バイアルを排気し、アルゴン(3x)で逆充填した。アルキン(1,1当量)、アルシン(1当量)及びトルエンをAr下でバイアルに添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。トルエンを蒸発させ、生成物をH2O及びMeCNを使用する逆相クロマトグラフィーで精製した。
エステルをEtOH及びNaOH 1M(1,1当量)に再採取し、完了するまで攪拌した(その後、HPLCを実施)。EtOHを蒸発させ、生成物をH2O及びMeCNを用いる逆相クロマトグラフィーにより精製した。生成物を凍結乾燥した。
ステップ6:1,2,3-トリアゾールの合成。
80℃、MeCN中のトリアゾール及びK2CO3。R-Brを滴加し、80℃で一晩攪拌した。濾過して、固体をMeCNで洗浄した。濾液を蒸発させ、逆相クロマトグラフィー(H2O:MeCN)により精製した。2つの画分を回収した。
エステルをEtOH及びNaOH 1M(1,1当量)に再採取し、完了するまで攪拌した。EtOHを蒸発させ、生成物を逆相クロマトグラフィーH2O:MeCNにより精製した。
(実施例2)
本発明の化合物の合成
- 生成物2.19の合成
Figure 2022543444000014
中間体2.19aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=87%; m=520mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.75 (s, 1H), 7.34 - 7.25 (m, 2H), 7.18 - 7.04 (m, 2H), 5.50 (s, 2H), 2.65 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.17 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.55 (dq, J = 23.6, 7.8 Hz, 3H).
Figure 2022543444000015
生成物2.19を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=36%; m=21mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.12 - 6.41 (m, 5H), 5.68 - 4.93 (m, 2H), 4.05 - 2.88 (m, 17H), 2.79 - 0.87 (m, 8H).
- 生成物2.20の合成
Figure 2022543444000016
中間体2.20aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=51%; m=261mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.75 (s, 1H), 7.34 - 7.25 (m, 2H), 7.18 - 7.04 (m, 2H), 5.50 (s, 2H), 2.65 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.17 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.64 - 1.45 (m, 3H).
Figure 2022543444000017
生成物2.20を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=71%; m=31mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.17 - 6.68 (m, 5H), 5.60 - 5.28 (m, 2H), 4.10 - 2.93 (m, 27H).
- 生成物2.21の合成
Figure 2022543444000018
中間体2.21aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=27%; m=148mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.71 (s, 1H), 7.32 - 7.24 (m, 2H), 7.09 (td, J = 8.8, 2.0 Hz, 2H), 5.55 - 5.46 (m, 2H), 2.86 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.45 (t, J = 7.5 Hz, 2H).
Figure 2022543444000019
生成物2.21を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=29%; m=12mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.90 - 6.37 (m, 5H), 5.58 - 5.25 (m, 2H), 4.20 - 2.91 (m, 36H).
- 生成物2.22の合成
Figure 2022543444000020
中間体2.22aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=28%; m=78mg; 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 7.57 (s, 1H), 6.93 - 6.84 (m, 2H), 6.68 - 6.60 (m, 2H), 4.54 - 4.45 (m, 2H), 3.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.99 - 2.91 (m, 2H), 2.53 - 2.44 (m, 2H).
Figure 2022543444000021
生成物2.22を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=87%; m=44mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.82 - 6.34 (m, 5H), 4.60 - 4.06 (m, 2H), 4.00 - 3.07 (m, 22H), 3.06 - 2.24 (m, 7H).
- 生成物2.23の合成
Figure 2022543444000022
中間体2.23aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=87%; m=258mg; 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 7.53 (s, 1H), 6.98 - 6.87 (m, 2H), 6.75 - 6.63 (m, 2H), 4.53 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.08 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.69 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.26 - 2.16 (m, 2H), 1.91 (tt, J = 8.3, 6.9 Hz, 2H).
Figure 2022543444000023
生成物2.23を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=100%; m=48mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.14 - 6.01 (m, 5H), 4.62 - 4.11 (m, 2H), 3.99 - 2.76 (m, 26H), 2.73 - 0.92 (m, 8H).
- 生成物2.24の合成
Figure 2022543444000024
中間体2.24aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=67%; m=379mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.62 (s, 1H), 7.24 - 7.14 (m, 2H), 7.05 - 6.92 (m, 2H), 5.35 (s, 2H), 2.54 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.08 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.73 (tt, J = 8.2, 7.0 Hz, 2H).
Figure 2022543444000025
生成物2.24を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=97%; m=42mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.90 - 6.74 (m, 5H), 5.57 - 5.15 (m, 2H), 4.19 - 3.11 (m, 35H), 2.91 - 1.47 (m, 6H).
- 生成物2.25の合成
Figure 2022543444000026
生成物2.25を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=85%; m=41mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.84 - 6.46 (m, 5H), 5.54 - 4.94 (m, 2H), 4.15 - 3.11 (m, 26H), 2.97 - 1.11 (m, 8H).
- 生成物2.26の合成
Figure 2022543444000027
生成物2.26を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=80%; m=44mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.00 - 6.36 (m, 5H), 5.60 - 4.93 (m, 2H), 4.12 - 3.01 (m, 19H), 2.79 - 0.93 (m, 8H).
- 生成物2.27の合成
Figure 2022543444000028
中間体2.27aを、一般的な手順、ステップ3(実施例1)と同様に調製した。収率=65%; m=305mg; 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.03 (s, 1H), 8.00 - 7.91 (m, 2H), 7.31 - 7.21 (m, 2H), 5.36 (s, 2H), 3.96 (s, 3H).
Figure 2022543444000029
中間体2.27bを、一般的な手順、ステップ4(実施例1)と同様に調製した。収率=35%; m=97mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.07 (s, 0H), 7.71 - 7.59 (m, 1H), 7.19 - 7.04 (m, 1H), 4.96 (s, 1H).
Figure 2022543444000030
生成物2.27を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=67%; m=28mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 9.33 - 7.35 (m, 5H), 6.13 - 5.19 (m, 2H), 4.17 - 3.22 (m, 42H).
- 生成物2.28の合成
Figure 2022543444000031
中間体2.28aを、一般的な手順、ステップ3(実施例1)と同様に調製した。収率=62%; m=272mg; 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 8.59 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.10 (dt, J = 7.9, 1.1 Hz, 1H), 7.93 (td, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H), 7.38 (ddd, J = 7.6, 4.9, 1.2 Hz, 1H), 5.45 (s, 2H), 3.83 (s, 3H).
Figure 2022543444000032
中間体2.28bを、一般的な手順、ステップ4(実施例1)と同様に調製した。収率=94%; m=236mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.44 - 8.38 (m, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.89 - 7.74 (m, 2H), 7.31 (ddd, J = 6.0, 5.0, 2.8 Hz, 1H), 5.02 (s, 2H).
Figure 2022543444000033
生成物2.28を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=47%; m=23mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.06 - 6.11 (m, 5H), 5.55 - 4.96 (m, 2H), 4.26 - 2.20 (m, 20H).
- 生成物2.29の合成
Figure 2022543444000034
中間体2.29aを、一般的な手順、ステップ3(実施例1)と同様に調製した。収率=81%; m=355mg; 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 9.08 (s, 1H), 8.64 - 8.46 (m, 2H), 8.28 (tt, J = 6.3, 1.6 Hz, 1H), 7.55 (dd, J = 8.0, 4.7 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H), 3.84 (s, 2H).
Figure 2022543444000035
中間体2.29bを、一般的な手順、ステップ4(実施例1)と同様に調製した。収率=88%; m=287mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.76 (dd, J = 2.3, 0.9 Hz, 1H), 8.40 (dd, J = 5.0, 1.6 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.07 (ddd, J = 8.0, 2.3, 1.6 Hz, 1H), 7.42 (ddd, J = 8.0, 5.0, 0.9 Hz, 1H), 5.01 (s, 2H), 1.09 (t, J = 7.1 Hz, 2H).
Figure 2022543444000036
生成物2.29を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=76%; m=29mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 9.28 - 7.21 (m, 5H), 5.94 - 5.16 (m, 2H), 4.19 - 2.35 (m, 19H).
- 生成物2.30の合成
Figure 2022543444000037
生成物2.30を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=66%; m=32mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 9.47 - 7.87 (m, 5H), 6.08 - 5.50 (m, 2H), 4.32 - 2.94 (m, 50H).
- 生成物2.31の合成
Figure 2022543444000038
中間体2.31aを、一般的な手順、ステップ3(実施例1)と同様に調製した。収率=82%; m=354mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 9.46 - 7.68 (m, 5H), 6.03 - 5.32 (m, 2H), 4.28 - 2.83 (m, 50H). 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 8.34 (s, 1H), 7.88 - 7.80 (m, 2H), 7.51 - 7.41 (m, 2H), 7.41 - 7.32 (m, 1H), 5.39 (s, 2H), 3.83 (s, 3H).
Figure 2022543444000039
中間体2.31bを、一般的な手順、ステップ4(実施例1)と同様に調製した。収率=99%; m=325mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.08 (s, 1H), 7.71 - 7.62 (m, 2H), 7.46 - 7.37 (m, 2H), 7.41 - 7.30 (m, 1H), 4.94 (s, 2H).
Figure 2022543444000040
生成物2.31を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=58%; m=24mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.60 - 6.52 (m, 6H), 5.90 - 5.15 (m, 2H), 4.23 - 2.90 (m, 32H).
- 生成物2.32の合成
Figure 2022543444000041
中間体2.32aを、一般的な手順、ステップ3(実施例1)と同様に調製した。収率=87%; m=380mg; 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 8.82 - 8.45 (m, 3H), 7.92 (s, 2H), 5.45 (s, 2H), 3.84 (s, 3H).
Figure 2022543444000042
中間体2.32bを、一般的な手順、ステップ4(実施例1)と同様に調製した。収率=100%; m=351mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.49 - 8.43 (m, 2H), 8.34 (s, 1H), 7.70 - 7.64 (m, 2H), 5.02 (s, 2H).
Figure 2022543444000043
生成物2.32を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=91%; m=32mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 9.17 - 8.00 (m, 5H), 6.13 - 5.23 (m, 2H), 4.21 - 3.01 (m, 74H).
- 生成物2.33の合成
Figure 2022543444000044
中間体2.33aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=59%; m=49mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.90 (s, 1H), 4.40 - 4.32 (m, 2H), 3.69 - 3.62 (m, 6H), 2.52 - 2.45 (m, 4H), 2.14 - 2.00 (m, 4H).
Figure 2022543444000045
生成物2.33を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=89%; m=15mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.63 - 7.84 (m, 1H), 4.52 - 4.23 (m, 3H), 4.13 - 2.86 (m, 27H), 2.74 - 1.54 (m, 4H).
- 生成物2.34の合成
Figure 2022543444000046
中間体2.34aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=48%; m=51mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.92 (s, 1H), 7.35 - 7.26 (m, 2H), 7.09 - 7.01 (m, 2H), 6.98 (tt, J = 7.4, 1.1 Hz, 1H), 4.41 - 4.33 (m, 2H), 3.71 (s, 2H), 3.14 - 3.07 (m, 4H), 2.69 - 2.61 (m, 4H), 2.14 - 2.00 (m, 4H).
Figure 2022543444000047
生成物2.34を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=98%; m=17mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.67 - 7.86 (m, 1H), 7.64 - 6.61 (m, 5H), 4.66 - 4.19 (m, 3H), 4.11 - 3.09 (m, 31H), 2.80 - 1.74 (m, 4H).
- 生成物2.35の合成
Figure 2022543444000048
中間体2.35aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=19%; m=20mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.24 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 7.95 (s, 1H), 6.64 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 4.40 - 4.33 (m, 2H), 3.81 - 3.77 (m, 2H), 3.67 - 3.60 (m, 4H), 2.66 - 2.58 (m, 4H), 2.12 - 2.00 (m, 4H).
Figure 2022543444000049
生成物2.35を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=44%; m=7mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.58 - 7.90 (m, 3H), 7.07 - 6.43 (m, 1H), 4.57 - 4.19 (m, 3H), 4.23 - 2.99 (m, 32H), 2.83 - 1.68 (m, 4H).
- 生成物2.36の合成
Figure 2022543444000050
中間体2.36aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=51%; m=78mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.39 (ddd, J = 5.0, 1.7, 1.0 Hz, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.85 - 7.71 (m, 1H), 7.30 (ddd, J = 7.3, 5.0, 1.5 Hz, 1H), 4.43 - 4.35 (m, 2H), 2.20 - 2.03 (m, 4H).
Figure 2022543444000051
生成物2.36を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=77%; m=14mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 9.15 - 7.11 (m, 5H), 4.57 - 4.15 (m, 1H), 4.07 - 2.86 (m, 13H), 2.74 - 1.68 (m, 4H).
- 生成物2.37の合成
Figure 2022543444000052
中間体2.37aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=14%; m=38mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.00 (s, 1H), 7.57 - 7.47 (m, 2H), 7.09 - 6.95 (m, 2H), 4.26 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.08 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.76 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 1.49 - 1.35 (m, 2H).
Figure 2022543444000053
生成物2.37を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=24%; m=9mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.23 - 6.04 (m, 5H), 4.39 - 2.72 (m, 18H), 2.70 - 0.56 (m, 6H).
- 生成物2.38の合成
Figure 2022543444000054
中間体2.38aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=11%; m=27mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.97 (s, 1H), 7.51 (dd, J = 8.7, 5.3 Hz, 2H), 7.02 (t, J = 8.9 Hz, 2H), 4.23 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.76 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 1.45 (p, J = 7.6 Hz, 2H), 1.21 - 1.09 (m, 2H).
Figure 2022543444000055
生成物2.38を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=18%; m=6mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.31 - 6.11 (m, 5H), 4.33 - 2.72 (m, 21H), 2.68 - 0.15 (m, 6H).
- 生成物2.39の合成
Figure 2022543444000056
中間体2.39aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=35%; m=11mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.01 (s, 1H), 7.60 - 7.53 (m, 2H), 7.39 - 7.25 (m, 3H), 4.24 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.09 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.76 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 1.48 - 1.35 (m, 2H).
Figure 2022543444000057
生成物2.39を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=53%; m=133mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.49 - 6.15 (m, 6H), 4.52 - 2.83 (m, 21H), 2.66 - 0.54 (m, 6H).
- 生成物2.40の合成
Figure 2022543444000058
中間体2.40aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=76%; m=184mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.88 (s, 1H), 7.54 - 7.47 (m, 2H), 7.35 - 7.20 (m, 3H), 4.14 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.76 - 1.64 (m, 2H), 1.43 (p, J = 7.6 Hz, 2H), 1.21 - 1.06 (m, 2H).
Figure 2022543444000059
生成物2.40を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=12%; m=4mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.94 - 6.37 (m, 6H), 4.43 - 2.84 (m, 19H), 2.68 - 0.23 (m, 8H).
- 生成物2.41の合成
Figure 2022543444000060
中間体2.41aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=26%; m=46mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.41 (s, 1H), 7.20 - 7.01 (m, 5H), 4.08 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.78 (s, 2H), 2.00 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.72 - 1.50 (m, 2H), 1.32 (tt, J = 15.0, 9.9 Hz, 2H).
Figure 2022543444000061
生成物2.41を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=75%; m=26mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.99 - 6.38 (m, 6H), 4.32 - 1.58 (m, 30H).
- 生成物2.42の合成
Figure 2022543444000062
中間体2.42aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=57%; m=96mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.15 (s, 1H), 7.05 - 6.86 (m, 5H), 3.92 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.67 (s, 2H), 1.97 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.54 - 1.42 (m, 2H), 1.39 - 1.27 (m, 2H), 1.05 - 0.92 (m, 2H).
Figure 2022543444000063
生成物2.42を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=87%; m=27mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.58 - 6.61 (m, 6H), 4.55 - 0.72 (m, 33H).
- 生成物2.43の合成
Figure 2022543444000064
中間体2.43aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=24%; m=36mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.78 (s, 1H), 8.43 - 8.37 (m, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.09 (dt, J = 8.1, 1.9 Hz, 1H), 7.43 (ddd, J = 8.0, 5.0, 0.9 Hz, 1H), 4.38 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.06 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.91 - 1.79 (m, 2H), 1.54 - 1.42 (m, 2H), 1.26 - 1.14 (m, 2H).
Figure 2022543444000065
生成物2.43を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=38%; m=17mg;; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 9.38 - 7.80 (m, 5H), 4.58 - 0.92 (m, 31H).
- 生成物2.44の合成
Figure 2022543444000066
中間体2.44aを、一般的な手順、ステップ2(実施例1)と同様に調製した。収率=25%; m=38mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.45 - 8.40 (m, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.85 - 7.79 (m, 2H), 7.34 - 7.30 (m, 1H), 4.37 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.91 - 1.79 (m, 2H), 1.54 - 1.42 (m, 2H), 1.27 - 1.14 (m, 2H).
Figure 2022543444000067
生成物2.44を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=64%; m=29mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.79 - 7.46 (m, 5H), 4.56 - 2.83 (m, 23H), 2.72 - 0.78 (m, 8H).
- 生成物2.45の合成
Figure 2022543444000068
生成物2.45を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=49%; m=18mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.01 - 6.82 (m, 5H), 5.62 - 5.23 (m, 2H), 4.04 - 3.18 (m, 66H), 2.95 - 1.63 (m, 6H).
- 生成物2.46の合成
Figure 2022543444000069
生成物2.46を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=93%; m=156mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.98 - 8.37 (m, 3H), 8.27 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 4.61 - 4.32 (m, 2H), 4.05 - 3.13 (m, 18.5H), 2.56 - 2.18 (m, 2H), 2.12 - 1.79 (m, 2H), 1.73 - 1.42 (m, 2H), 1.42 - 1.14 (m, 2H).
- 生成物2.47の合成
Figure 2022543444000070
生成物2.47を、一般的な手順、ステップ1(実施例1)と同様に調製した。収率=99%; m=44mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 8.00 - 6.02 (m, 5H), 4.66 - 4.05 (m, 1H), 3.97 - 2.01 (m, 32H).
- 生成物2.48の合成
Figure 2022543444000071
生成物2.48を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=28%; m=83mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.75 - 7.23 (s, 1H), 7.15 - 6.38 (m, 4H), 4.64 - 4.17 (m, 2H), 4.14 - 2.00 (m, 25H).
- 生成物2.49の合成
Figure 2022543444000072
生成物2.49を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=5%; m=13mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.78 - 7.32 (s, 1H), 7.20 - 6.31 (m, 4H), 4.66 - 4.31 (m, 2H), 4.22 - 2.20 (m, 27H).
- 生成物2.50の合成
Figure 2022543444000073
生成物2.50を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=18%; m=29mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.71 - 7.19 (s, 1H), 7.15 - 6.34 (m, 4H), 4.65 - 4.09 (m, 2H), 4.06 - 0.57 (m, 26H).
- 生成物2.51の合成
Figure 2022543444000074
生成物2.51を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=36%; m=13mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.68 - 7.45 (m, 1H), 7.14 - 6.62 (m, 4H), 4.67 - 4.42 (m, 2H), 4.39 - 4.17 (m, 5H), 3.38 - 2.73 (m, 16H), 2.58 - 2.33 (m, 2H), 1.99 - 1.01 (m, 35H).
- 生成物2.52の合成
Figure 2022543444000075
生成物2.52を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=43%; m=63mg; 1H NMR (400 MHz, 重水) δ 7.84 - 7.31 (s, 1H), 7.28 - 6.48 (m, 4H), 4.69 - 4.33 (m, 2H), 4.30 - 1.04 (m, 25H).
- 生成物2.53の合成
Figure 2022543444000076
中間体2.53aを、一般的な手順、ステップ3及び4と同様に調製した。収率=34%; m=151mg; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 6.69 (s, 1H), 3.39 - 3.21 (m, 2H), 1.20 - 0.94 (m, 4H), 0.26 (s, 9H).
Figure 2022543444000077
生成物2.53を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=37%; m=25mg; 1H NMR (400MHz, 重水) δ 8.07 - 7.88 (m, 1H), 4.60 - 3.35 (m, 2H), 4.08 - 3.05 (m, 24H), 2.90 - 1.97 (m, 4H), 1.55 - 1.05 (m, 9H)
- 生成物2.54の合成
Figure 2022543444000078
中間体2.54aを、一般的な手順、ステップ3及び4と同様に調製した。収率=69%; m=287mg; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 6.64 (s, 1H), 3.32 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 1.17 - 1.00 (m, 4H), 0.90 (tt, J = 8.4, 5.0 Hz, 1H), -0.02 - -0.18 (m, 2H), -0.22 - -0.35 (m, 2H).
Figure 2022543444000079
生成物2.54を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=34%; m=24mg; 1H NMR (400MHz, 重水) δ 7.99 - 7.78 (m, 1H), 4.61 - 4.38 (m, 2H), 4.06 - 3.26 (m, 21H), 2.66 - 1.95 (m, 5H), 1.15 - 1.01 (m, 2H), 0.88 - 0.70 (m, 2H).
- 生成物2.55の合成
Figure 2022543444000080
中間体2.55aを、一般的な手順、ステップ3と同様に調製した。収率=52%; m=251mg; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.28 (s, 1H), 4.39 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.14 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.28 - 3.09 (m, 1H), 2.34 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.22 (p, J = 7.0 Hz, 2H), 2.11 (s, 2H), 1.88 - 1.56 (m, 6H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
Figure 2022543444000081
中間体2.55bを、一般的な手順、ステップ4と同様に調製した。収率=定量的; m=223mg; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.65 (s, 1H), 4.35 - 4.21 (m, 2H), 3.12 - 2.96 (m, 1H), 2.15 - 1.91 (m, 6H), 1.77 - 1.49 (m, 6H).
Figure 2022543444000082
生成物2.55を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=40%; m=22mg; 1H NMR (400MHz, 重水) δ 8.04 - 7.83 (m, 1H), 4.59 - 4.34 (m, 2H), 4.07 - 3.04 (m, 25H), 2.60 - 1.97 (m, 6H), 1.80 - 1.47 (m, 6H)
- 生成物2.56の合成
Figure 2022543444000083
中間体2.56aを、一般的な手順、ステップ3と同様に調製した。収率=80%; m=350mg; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.26 (s, 1H), 4.38 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.14 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.09 (七重線, J = 6.9 Hz, 1H), 2.34 (dd, J = 7.4, 6.4 Hz, 2H), 2.29 - 2.14 (m, 2H), 1.31 (s, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.26 (td, J = 7.1, 0.6 Hz, 3H).
Figure 2022543444000084
中間体2.56bを、一般的な手順、ステップ4と同様に調製した。収率=定量的; m=340mg; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.75 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 4.39 (td, J = 6.4, 5.8, 2.8 Hz, 2H), 3.03 (pd, J = 6.9, 0.7 Hz, 1H), 2.25 - 2.05 (m, 4H), 1.30 (s, 3H), 1.29 (s, 3H).
Figure 2022543444000085
生成物2.56を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=45%; m=32mg; 1H NMR (400MHz, 重水) δ 8.09 - 7.90 (m, 1H), 4.61 - 4.36 (m, 2H), 4.09 - 3.20 (m, 21H), 3.17 - 2.97 (m, 1H), 2.62 - 2.03 (m, 4H), 1.45 - 1.16 (m, 6H).
- 生成物2.57の合成
Figure 2022543444000086
中間体2.57aを、一般的な手順、ステップ5と同様に調製した。収率=55%; m=287mg; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.73 - 7.66 (m, 2H), 7.56 - 7.40 (m, 4H), 7.38 - 7.27 (m, 2H), 4.39 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 4.31 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.14 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.04 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 2.48 (s, 3H), 2.43 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.30 (s, 2H), 2.31 - 2.23 (m, 1H), 2.27 - 2.19 (m, 2H), 2.15 - 2.03 (m, 1H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.19 (t, J = 7.1 Hz, 2H).
Figure 2022543444000087
中間体2.57bを、一般的な手順、ステップ4と同様に調製した。収率=定量的; m=280mg; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.79 - 7.10 (m, 5H), 4.56 - 4.17 (m, 2H), 2.57 - 1.89 (m, 7H).
Figure 2022543444000088
生成物2.57を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=55%; m=44mg; 1H NMR (400MHz, 重水) δ 7.68 - 6.86 (m, 5H), 4.53 - 3.03 (m, 20H), 2.62 - 1.58 (m, 7H).
- 生成物2.58の合成
Figure 2022543444000089
中間体2.58aを、一般的な手順、ステップ5と同様に調製した。収率=49%; m=224mg; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.35 - 4.25 (m, 2H), 4.19 - 4.08 (m, 2H), 3.23 - 2.96 (m, 1H), 2.42 - 2.34 (m, 4H), 2.22 - 2.09 (m, 2H), 1.36 - 1.30 (m, 6H), 1.29 - 1.18 (m, 3H).
Figure 2022543444000090
中間体2.58bを、一般的な手順、ステップ4と同様に調製した。収率=定量的; m=219mg; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 4.37 - 4.27 (m, 2H), 3.31 - 3.18 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 2.27 - 2.13 (m, 2H), 2.15 - 2.03 (m, 2H), 1.34 (s, 3H), 1.32 (s, 3H).
Figure 2022543444000091
生成物2.58を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=64%; m=48mg; 1H NMR (400MHz, 重水) δ 4.49 - 4.22 (m, 2H), 3.99 - 3.03 (m, 20H), 2.76 - 1.87 (m, 7H), 1.34 - 1.04 (m, 6H).
- 生成物2.59の合成
Figure 2022543444000092
中間体2.59aを、一般的な手順、ステップ3と同様に調製した。収率=41%; m=199mg; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.25 (s, 1H), 4.39 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.14 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.96 (h, J = 7.0 Hz, 1H), 2.34 (td, J = 7.1, 1.0 Hz, 2H), 2.21 (p, J = 7.0 Hz, 2H), 1.75 - 1.62 (m, 1H), 1.60 - 1.46 (m, 1H), 1.41 - 1.16 (m, 8H), 0.90 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
Figure 2022543444000093
中間体2.59bを、一般的な手順、ステップ4と同様に調製した。収率=定量的; m=194mg; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.75 (s, 1H), 4.44 - 4.35 (m, 2H), 2.92 (h, J = 7.0 Hz, 1H), 2.19 - 2.08 (m, 4H), 1.74 - 1.49 (m, 2H), 1.47 - 1.10 (m, 6H), 0.91 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
Figure 2022543444000094
生成物2.59を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=58%; m=44mg; 1H NMR (400MHz, 重水) δ 7.98 - 7.77 (m, 1H), 4.58 - 4.31 (m, 2H), 4.07 - 3.16 (m, 20H), 3.05 - 2.77 (m, 1H), 2.60 - 1.98 (m, 4H), 1.66 - 1.42 (m, 2H), 1.34 - 1.04 (m, 5H), 0.92 - 0.64 (m, 3H).
- 生成物2.60の合成
Figure 2022543444000095
中間体2.60aを、一般的な手順、ステップ6と同様に調製した。収率=44%; m=586mg; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.75 - 7.68 (m, 1H), 7.58 (s, 1H), 4.48 (td, J = 6.8, 1.9 Hz, 2H), 4.21 - 4.04 (m, 2H), 2.43 - 2.29 (m, 2H), 2.29 - 2.19 (m, 2H), 1.33 - 1.18 (m, 3H).
Figure 2022543444000096
中間体2.60bを、一般的な手順、ステップ4と同様に調製した。収率=定量的; m=567mg; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.01 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 4.52 - 4.43 (m, 2H), 2.23 - 2.10 (m, 4H).
Figure 2022543444000097
生成物2.60を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=46%; m=33mg; 1H NMR (400MHz, 重水) δ 8.09 - 7.95 (m, 1H), 7.89 - 7.76 (m, 1H) 4.59 - 4.41 (m, 2H), 4.04 - 3.12 (m, 16H), 2.55 - 1.99 (m, 4H).
- 生成物2.61の合成
Figure 2022543444000098
中間体2.61aを、一般的な手順、ステップ6と同様に調製した。収率=27%; m=362mg; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.59 (s, 2H), 4.51 (td, J = 6.6, 1.1 Hz, 2H), 4.13 (qd, J = 7.1, 1.2 Hz, 2H), 2.36 - 2.26 (m, 4H), 1.24 (td, J = 7.1, 1.1 Hz, 3H).
Figure 2022543444000099
中間体2.61bを、一般的な手順、ステップ4と同様に調製した。収率=定量的; m=350mg; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.54 (s, 2H), 4.42 - 4.34 (m, 2H), 2.16 - 2.00 (m, 4H).
Figure 2022543444000100
生成物2.61を、一般的な手順、ステップ1と同様に調製した。収率=41%; m=29mg; 1H NMR (400MHz, 重水) δ 7.84 - 7.67 (m, 2H), 4.60 - 4.39 (m, 2H), 4.08 - 3.12 (m, 16H), 2.57 - 1.99 (m, 4H).
(実施例3)
化合物2.19～2.26
トランスフェクション活性のスクリーニング
化合物2.19～2.26を、Caco-2(ヒト結腸上皮細胞)、Hep G2(ヒト肝癌細胞)、MDCK(Madin-Darbyイヌ腎臓上皮細胞)、及びMCF-10A(ヒト乳腺上皮細胞)の4つの異なる細胞株におけるDNAトランスフェクション能について評価した。化合物のスクリーニング(図2)は、0.6又は0.8μLの本発明の1つの化合物、すなわち、化合物2.19～2.26(窒素濃度7.5mM)からなる群から選択される1つの化合物と複合体形成した、200ngのpCMV-EGFPLuc DNA(Clontech社)(DNA 1μg/化合物3μL(比率1:3)の比率又はDNA 1μg/化合物4μL(比率1:4)の比率をそれぞれ規定する)をトランスフェクトすることによって、96ウェルプレートにおいて実施した。GFPを発現する細胞の百分率(%GFP)は、トランスフェクション1日後にサイトメトリーアッセイによって決定した。コントロールとして、22KDaの直鎖状ポリエチレンイミンであり、試験化合物の親カチオン性ポリマー骨格を表す、jetPEI(登録商標)を用いたトランスフェクションを実施した。
化合物2.19～2.16はポリマーを表し、ここで、トリアゾール環を使用してフルオロベンジル又はヒドロキシフェノール(又は4-ヒドロキシフェネチル)部分をグラフトし、カチオン性ポリマーが式(III)のR又はVにグラフトされる。全ての化合物は有意なトランスフェクション活性を示したが、最適な化合物は使用する細胞株に依存した。
(実施例4)
化合物2.22、2.23、2.41、2.42、2.43、2.46及び2.47を用いる組換えウイルスのバイオプロダクション
DNAトランスフェクションは、一過性遺伝子発現(TGE)プロセスによる組換えタンパク質及びウイルスのバイオプロダクションに主に用いられる技術の1つである。AAV及びレンチウイルスの産生に関して、最も一般的に用いられている方法は、産生細胞株、HEK293接着又は浮遊細胞にウイルス及び治療遺伝子を送達するためのトランスフェクションである。多くのシステムにおいて、多くのプラスミドの共トランスフェクションは、リン酸カルシウムとの共沈、又は組換えウイルスのこのようなバイオプロダクションのために商用として推奨されるPEIpro(登録商標)(Polyplus-transfection社)等のカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を介したトランスフェクション等の化学的方法によって行われる。
AAV及びレンチウイルス粒子は、HEK-293T細胞から、目的の遺伝子及び必要なウイルス成分を含むいくつかのプラスミドの一過性に共トランスフェクションによって産生し、完全な組換えウイルス粒子を産生した。GFPレポーター遺伝子を発現するAAV-2及びレンチウイルスベクターを種々の化合物を用いて産生し、トランスフェクション3日後に形質導入単位(TU/mL)を評価することによって、ウイルス産生性を決定した。産生性のレベルは、接着及び浮遊ウイルス産生システムで広く使用されているPEIpro(登録商標)トランスフェクション試薬で得られたレベルと比較した。
実施例3の多くの化合物を、トリアゾール環がベンジル(2.41又は2.42)又はピリジニル(2.43～2.46)部分によってグラフトされ、カチオン性ポリマーが式(III)の位置Z1においてトリアゾール環に連結されている他の化合物と同様に、AAV-2の産生について試験した。図3に、得られた結果の一部を示す。トランスフェクションに使用した1:2の比率(化合物1μLあたり総DNA 1μg)では、いくつかの化合物はPEIpro(登録商標)と同様のウイルス産生性を示したが、殆どの化合物は3～8倍と有意にウイルス力価を上昇させた。この改善は、殆どの化合物で確認され、1:3の比率で使用することで向上し、化合物2.43について、ウイルス力価の上昇は10倍を超える最も高い上昇であった。
同様に、レンチウイルスを、4つのプラスミド(pRSV-REVパッケージングベクター、pCgpVパッケージングベクター、pCMV-VSV-Gエンベロープベクター、及びpLenti6.3/V5-GW/EmGFP発現コントロールベクター)を共トランスフェクトした後、浮遊HEK-293T細胞において産生した。トランスフェクションの72時間後に、レンチウイルス力価(TU/mL)を決定した(図4)。化合物2.22を1:3の比率で使用することによって、PEIpro(登録商標)を用いた産生性と比較して、約10倍のLV産生収率の向上が得られた。
(実施例5)
化合物2.53～2.61
トランスフェクション活性のスクリーニング
化合物2.53～2.61を、実施例3の化合物について先に述べたのと同様に3、0.6又は0.8μLの本発明の1つの化合物(窒素濃度7.5mM)と複合体形成したpCMV-EGFPLuc DNA(Clontech社)200ngをトランスフェクトし、それぞれDNA 1μg/化合物3μLの比率又はDNA 1μg/化合物4μLの比率を決定することによって、96ウェルプレートでトランスフェクションにおいてスクリーニングを行った(図6)。
化合物2.53～2.61は、カチオン性ポリマーが式(III)のZ1に連結しており、式(III)のR又はVの位置に種々のアルキル又はサイクル部分が付加された、トリアゾール環を有する化合物を表す。図6は、トリアゾール環のR又はVの位置にアルキル又はシクロアルキル部分をグラフトすることによって、化合物2.54、2.56、2.58又は2.57に例示されるように、トランスフェクションにおいて効率的な化合物が得られることを示している。驚くべきことに、式(III)のR及びVの位置に非置換トリアゾール環を有する化合物2.60及び2.61はHep G2細胞を効率的にトランスフェクトすることができなかった。
組換えウイルスのバイオプロダクション
化合物2.53～2.61を、AAV-2の産生について試験し、図7に、1:2のDNAμg/試薬μLの比率の化合物の得られた結果を示す。AAV力価(形質導入単位、TU/mL)を、トランスフェクションの72時間後に決定した。結果は、相対的なAAV-2形質導入単位/mL(TU/mL)として表される。
化合物2.22をポジティブコントロールとして使用した。化合物2.54及び2.57は有望な結果を示し、図6に示されたトランスフェクション活性と相関があった。Hep G2細胞におけるトランスフェクションの試験とは対照的に、R及びV=Hである化合物2.60及び2.61は、HEK-293T細胞において高いレベルのAAV-2産生性を示した。
(実施例6)
浮遊HEK-293T細胞からのAAV-2の産生のための重要なパラメーター
HEK293細胞に多くのプラスミドを共トランスフェクトすることにより、組換えウイルスの産生が達成される。ウイルス産生性は、プラスミドの総量及びトランスフェクション試薬の体積に大きく影響される。図8に、化合物2.22(窒素濃度15mMで製剤化)を用いたAAV-2産生を示す。異なる量のプラスミドを使用して、浮遊HEK293-T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション試薬の多くの比率も試験し、トランスフェクションの日の、10z細胞あたりのDNA μg/試薬 μLとして表した。結果は、ウイルス産生性が、トランスフェクトしたプラスミドの量に依存することを示す。更に、トランスフェクトしたDNAのそれぞれの量について、最適な産生性はDNA μg/試薬 μLの比率に依存する。本実施例は、式(III)の化合物を用いたトランスフェクション条件を、最適なウイルス産生性を得るために容易に適合させることができることを示している。図9は、浮遊HEK-293T細胞からのAAV-2の産生に対する、化合物2.22とのDNA複合体形成の時間の影響を示す。高いウイルス産生収率を得るためには、細胞培養物にトランスフェクション複合体を添加する前に、最短時間で15分のDNA複合体形成時間が必要である。15分を上回る、より長いDNA複合体形成時間を、ウイルス収率に影響を及ぼすことなく使用することができ、このことは、ウイルス産生活性において、トランスフェクション複合体の安定性が良好であることを示している。この特性から、化合物2.22は、細胞培養体積に応じてトランスフェクション複合体混合物の移送中の時間窓を適合させる必要がある、バイオリアクターでの大規模な用途に特に適していることが示される。
結論
ポリアミンを式(I)、好ましくは式(III)の複素環でグラフトすることに基づく多くの化合物は、がん細胞等の「トランスフェクション困難」細胞での遺伝子発現を誘導する、又はウイルス、AAV、又はLV等の生物製剤の産生性を向上させる性能の改善を示した。
実施例3、4又は5の多くの化合物、特にベンジル、フルオロベンジル、ヒドロキシフェニル、4-ヒドロキシフェネチル、ピリジン又はフェニルトリアゾール誘導体でグラフトしたポリアミンは、高いトランスフェクション効率を示した。
実施例3、4又は5の選択された化合物は、AAV又はLV等の生物製剤の産生性の向上も示しており、このことは、高いトランスフェクション効率と細胞内での遺伝子発現の複合効果によって、形質導入単位として表される高いウイルス力価がもたらされることを示している。また、ウイルス産生性の向上は、例えば、接着細胞又は浮遊細胞等、トランスフェクトされる細胞の種類によらず観察された。得られた結果から、このような化合物は、組換えタンパク質、ペプチド、又は抗体等、他の生物製剤の産生にも興味深いものである可能性があることが示された、
まとめると、本発明の式(I)、好ましくは式(III)の化合物は、化学構造の細かい最適化を各用途、細胞種又はトランスフェクション条件について適合し得るトランスフェクション及びバイオプロダクション目的のための新規試薬を表す。
当業者は、許容される賦形剤又は緩衝剤を用いて、本発明の一般式(I)、好ましくは一般式(III)の化合物を用いたトランスフェクション法をインビボ用途に適合させることができる。一般式(I)、好ましくは一般式(III)の化合物をDNAと混合して、動物又はヒトへの直接注入に適したDNA複合体を生成させることができる。特に、トリス、リン酸塩、又はクエン酸塩緩衝剤等の低塩緩衝剤、又はグルコース、デキストロース、又はマルトース等の賦形剤は、動物及びヒトへの直接注入に許容される製剤を提供することが知られている。DNAと一般式(I)、好ましくは一般式(III)の化合物との混合法の多くは、種々の投与経路から注入できる小さなサイズの粒子(非凝集DNA複合体)を含む製剤を生成することができるために好適である。
参考文献
Figure 2022543444000101
Figure 2022543444000102
Figure 2022543444000103

Claims (26)

  1. (i)一般式(III)の少なくとも1つの化合物、又はその互変異性体、メソマー、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、若しくは混合物、又はその許容される塩、並びに(ii)許容される賦形剤、緩衝剤、細胞培養培地又はトランスフェクション培地を含む、細胞、好ましくは真核細胞に核酸分子をトランスフェクトするのに適した組成物であって、
    Figure 2022543444000104
     式中、
    - Z1は、H、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、若しくはX2-P+を表すか、又はZ1は存在しない、
    - Z2は、H、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル、C6～C18アリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、C5～C10ヘテロアリール、ハロゲン、OH、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキルアミン、C1～C12アルコキシ、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル-C1～C12アルコキシ、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、若しくはX2-P+を表すか、又はZ2は存在しない、
    - Z3は、H、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル、C6～C18アリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、C5～C10ヘテロアリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、C2～C18アルキリデン、OH、グアニジン、ハロゲン、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、若しくはX2-P+を表すか、又はZ3は存在しない、
    - X1及びX2は、同一であっても異なっていてもよく、CO又はCH2を表す、
    - R3は、(CH2)m、(CH2)m-CHCH3-(CH2)n-、(CH2)m-C(CH3)2-(CH2)n-、(CH2)m-O-(CH2)n-、(CH2)m-S-(CH2)n-、(CH2)m-CH2-O-を表し、mは1～3の間の整数を表し、nは1～3の間の整数を表す、
    - P+は、グラフトカチオン性ポリマーを表し、これは、二級アミン、三級アミン、一級アミンと二級アミンとの混合物、一級アミンと三級アミンとの混合物、二級アミンと三級アミンとの混合物、又は一級アミン、二級アミン及び三級アミンの混合物を含むポリアミンである、
    - R又はVは、H、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル又はシクロアルキル、C6～C18アリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C24エステル、C5～C10ヘテロシクリル、C5～C10ヘテロアリール、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のC1～C18アルキル-C5～C10ヘテロアリール、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+を表し、
    ただし、
    - Z1、Z2又はZ3の少なくとも1つが存在し、
    - Z1、Z2、Z3、R又はVの1つのみがX1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+を表す、
    組成物。
  2. 細胞にトランスフェクトされる少なくとも1つの核酸分子、好ましくはデオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、DNA/RNAハイブリッド、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、CRISPRガイドRNA、及び前記核酸分子をコードする発現ベクター、特に前記核酸分子をコードするプラスミド又は前記核酸分子を発現するプラスミドからなる群から選択される核酸分子を更に含む、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記少なくとも1つの核酸分子がDNAである、請求項2に記載の組成物。
  4. R又はVが、H、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、イソプロピル、sec-ブチル、シクロペンチル、フェニル、フルオロフェニル、ベンジル、ピリジン、2-ピリジン、3-ピリジン、フルオロベンジル、置換モルホリニル、置換ピペラジニル、4-ヒドロキシベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表す、より好ましくは、R又はVが、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、イソプロピル、sec-ブチル、シクロペンチル、フェニル、ベンジル、フルオロベンジル、4-ヒドロキシフェネチル、2-ピリジン又は3-ピリジンを表す、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
  5. (i)Z1、Z2又はZ3の1つのみが、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+又はX2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が請求項1に規定の通りである、好ましくはZ1、Z2又はZ3の1つのみがX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい、及び/又は
    (ii)Z1がHを表す、及び/又は
    (iii)Z2が、H、C1～C12アルコキシ、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキルを表す、より好ましくはZ2がH、CH3、CF3又はOCH3を表す、及び/又は
    (iv)Z3が、H、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキルを表す、
    請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
  6. (i)Z1が、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に規定の通りである、より好ましくは、Z1がX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい場合、
    (ii)Z2が、H、C1～C12アルコキシ、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキルを表す、より好ましくはZ2が、H、CH3、CF3又はOCH3を表す、及び/又は
    (iii)Z3が、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキル、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、好ましくはフルオロベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表す、及び/又は
    (iv)R又はVが、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル又はシクロアルキル、C6～C18アリール、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C24エステル、C5～C10ヘテロシクリル、C5～C10ヘテロアリール、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル-C5～C10ヘテロアリールを表す、
    請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
  7. (i)Z2が、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に規定の通りである、より好ましくは、Z2が、X1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい場合、
    (ii)Z1がHを表す、及び/又は
    (iii)Z3が、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキル、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、好ましくはフルオロベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表す、及び/又は
    (iv)R又はVが、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル又はシクロアルキル、C6～C18アリール、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C24エステル、C5～C10ヘテロシクリル、C5～C10へテロアリール、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル-C5～C10ヘテロアリールを表す、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
  8. (i)Z3が、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に規定の通りである、より好ましくは、Z3が、X1-R3-X2-P+を表し、式中、X1が、CH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい場合、
    (ii)Z1がHを表す、及び/又は
    (iii)Z2が、H、C1～C12アルコキシ、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキルを表す、より好ましくは、Z2が、H、CH3、CF3又はOCH3を表す、及び/又は
    (iv)R又はVが、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル又はシクロアルキル、C6～C18アリール、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC2～C18ヘテロアルキル、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C24エステル、C5～C10ヘテロシクリル、C5～C10ヘテロアリール、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル-C5～C10ヘテロアリールを表す、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
  9. (i)R又はVが、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に規定の通りである、より好ましくはZ3が、X1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい場合、
    (ii)Z1がHを表す、及び/又は
    (iii)Z2が、H、C1～C12アルコキシ、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキルを表す、及び/又は
    (iv)Z3が、H、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキル、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、好ましくはフルオロベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表す、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
  10. (i)R又はVが、X1-R3-X2-P+、X1-R3-P+、X1-X2-P+、R3-X2-P+、X1-P+、R3-P+、又はX2-P+、好ましくはX1-R3-X2-P+を表し、式中、X1、X2、R3及びP+が本明細書に規定の通りである、より好ましくはZ3が、X1-R3-X2-P+を表し、式中、X1がCH2を表し、X2がCOを表し、R3が(CH2)mを表し、mが1～3の間の整数を表し、好ましくはmが2に等しい場合、
    (ii)Z3が存在し、Z3がH、直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C18アルキル、好ましくは直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC1～C6アルキル、又は直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のC6～C18アリール-C1～C18アルキル、好ましくはフルオロベンジル又は4-ヒドロキシフェネチルを表す、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記グラフトカチオン性ポリマーが、直鎖又は分枝鎖のポリエチレンイミン(PEI)、PEIデンドリマー、ポリプロピレンイミン(PPI)、ポリ(アミドアミン)(PAA)及びデンドリマー(PAMAM)、カチオン性シクロデキストリン、ポリアルキルアミン、ポリヒドロキシアルキルアミン、ポリ(ブチレンイミン)(PBI)、スペルミン、N置換ポリアリルアミン、N置換キトサン、N置換ポリオルニチン、N置換ポリリジン(PLL)、N置換ポリビニルアミン、ポリ(β-アミノエステル)、多分枝ポリ(アミノエステル)(h-PAE)、ネットワークポリ(アミノエステル)(n-PAE)、ポリ(4-ヒドロキシ-1-プロリンエステル)(PHP-エステル)、及びポリ-β-アミノ酸からなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記グラフトカチオン性ポリマーが、直鎖又は分枝鎖のPEIであり、より好ましくは直鎖のPEIである、請求項11に記載の組成物。
  13. 前記グラフトカチオン性ポリマーが、1～50%、好ましくは5～30%の範囲のグラフト比率、より好ましくは20%のグラフト比率を有する、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記グラフトカチオン性ポリマーが、1kDa～500kDa、好ましくは1kDa～50kDa、より好ましくは5kDa～50kDa又は1kDa～15kDaの範囲の平均分子量(Mw)を有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記グラフトカチオン性ポリマーが、6、8、10、15、22又は30kDaの平均分子量(Mw)、好ましくは6、8、10、15又は30kDaの平均分子量を有する、請求項14に記載の組成物。
  16. 前記一般式(III)の少なくとも1つの化合物が、以下の化合物:
    Figure 2022543444000105
    Figure 2022543444000106
    Figure 2022543444000107
     からなる群から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記一般式(III)の少なくとも1つの化合物が、以下の化合物:
    Figure 2022543444000108
     からなる群から選択される、請求項16に記載の組成物。
  18. 前記一般式(III)の少なくとも1つの化合物が、化合物2.22である、請求項17に記載の組成物。
  19. 請求項2から18のいずれか一項に記載の組成物を細胞に導入することを含む、生細胞のインビトロ又はエクスビボのトランスフェクションのための方法。
  20. 細胞、細胞株又は細胞、好ましくは哺乳類細胞、昆虫細胞、初代細胞、接着細胞、浮遊細胞、分裂細胞、例えば幹細胞、非分裂細胞、例えば神経細胞、及びがん細胞からなる群から選択される細胞、細胞株又は細胞に少なくとも1つの核酸分子をトランスフェクトするための請求項2から18のいずれか一項に記載の組成物のインビトロ又はエクスビボの使用であって、前記細胞、細胞株又は細胞が、任意に、スフェロイド、オルガノイド、2D又は3D細胞培養物に組織化されているか、又は繊維若しくはマトリクス培養物として、及び/又はバイオリアクター内で提供される、使用。
  21. ゲノム工学、細胞リプログラミング、細胞の分化、又は遺伝子編集のための請求項2から18のいずれか一項に記載の組成物のインビトロ又はエクスビボの使用。
  22. (i)生物製剤、特に組換えタンパク質、ペプチド又は抗体をコードする生物製剤、又は(ii)請求項2から18のいずれか一項に記載の組成物が、共トランスフェクションのための複数の核酸分子を含む、組換えウイルス、例えばアデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス(LV)、アデノウイルス、腫瘍溶解ウイルス、又はバキュロウイルス、又は(iii)請求項2から18のいずれか一項に記載の組成物が共トランスフェクションのための複数の核酸分子を含む、ウイルス又はウイルス様粒子の産生のための、方法。
  23. 前記組成物が、(i)化合物2.22、2.23、2.43、2.44、2.47、2.54、2.57、2.60及び2.61からなる群から選択される少なくとも1つの化合物、並びに(ii)許容される賦形剤、緩衝剤、細胞培養培地、又はトランスフェクション培地を含む、AAVの産生のための請求項22に記載の方法。
  24. 前記組成物が、(i)少なくとも化合物2.22、及び(ii)許容される賦形剤、緩衝剤、細胞培養培地、又はトランスフェクション培地を含む、LVの産生のための請求項22に記載の方法。
  25. 前記組成物が、接着細胞又は浮遊細胞、例えばHEK293、HeLa、BHK-21、A549又は昆虫細胞にトランスフェクトするための、プラスミドベクター等の複数の発現ベクターを含み、前記ベクター、特にプラスミドが、ウイルス又はウイルス様産生のためのウイルス構造配列及び移入ベクターゲノムを発現し、任意に移入ベクターゲノムによってコードされる目的の分子を発現するコンストラクトである、組換えウイルスの産生のための請求項22に記載の方法。
  26. 前記組換えウイルスが、細胞治療又は遺伝子治療のためのインビボ用途に使用するためのものである、請求項25に記載の方法。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113603886A (zh) * 2021-08-10 2021-11-05 中国科学院长春应用化学研究所 一种聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用
EP4234609A1 (en) 2022-02-25 2023-08-30 PolyPlus Transfection Methods for purification, detection and quantification of residual pei-based transfection reagents

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4837005A (en) 1986-09-30 1989-06-06 Union Carbide Corporation Partially hydrolyzed, poly(N-acyl)alkylenimines in personal care
DE19751251A1 (de) * 1997-11-19 1999-05-20 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Substituierte Imidazolidinderivate, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmezeutische Präparate
EP0945138A1 (en) * 1997-12-04 1999-09-29 Université Louis Pasteur de Strasbourg Transfection particles
CA2350882C (en) * 1998-11-12 2011-02-22 Invitrogen Corporation Transfection reagents
DE10145134A1 (de) 2000-10-09 2002-05-16 Bayer Ag Komplexe zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen
KR20040104673A (ko) * 2002-04-30 2004-12-10 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 헤마글루티닌 활성을 저하시킨 약제 또는 유전자 운반 조성물
US7358223B2 (en) 2004-10-04 2008-04-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
GB0422877D0 (en) * 2004-10-14 2004-11-17 Univ Glasgow Bioactive polymers
EP1757290A1 (en) * 2005-08-16 2007-02-28 Zentaris GmbH Novel triazole derivatives as ghrelin analogue ligands of growth hormone secretagogue receptors
EP1844772A1 (en) * 2006-04-06 2007-10-17 Polyplus-Transfection SA Compositions for transfection of oligonucleotides active for gene silencing and their biological and therapeutical applications
US20080312174A1 (en) * 2007-06-05 2008-12-18 Nitto Denko Corporation Water soluble crosslinked polymers
GB0724253D0 (en) 2007-12-12 2008-01-30 Fermentas Uab Transfection reagent
FR2928373B1 (fr) * 2008-03-05 2010-12-31 Centre Nat Rech Scient Polymere derive de la polyethylenimine lineaire pour le transfert de gene.
CN102260376B (zh) * 2010-05-24 2013-02-27 中国科学院上海药物研究所 一种用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物及其制备方法和用途
EP3756690A3 (en) * 2013-12-12 2021-03-17 Life Technologies Corporation Membrane-penetrating peptides to enhance transfection and compositions and methods for using same
EP3094731B1 (en) * 2014-01-15 2019-07-17 baseclick GmbH Saccharide-modified nucleic acid molecules
TWI696612B (zh) * 2015-01-29 2020-06-21 日商日本農藥股份有限公司 具有環烷基吡啶基的稠合雜環化合物或其鹽類及含有該化合物的農園藝用殺蟲劑以及其使用方法

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