CN113637708A - 一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种CRISPR‑cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用。所述CRISPR‑cas9基因编辑系统递送载体包括脂质纳米颗粒和离子液体。本发明同时采用脂质纳米颗粒和离子液体负载CRISPR‑cas9基因编辑系统，能够提高基因编辑效率，此外，控制咪唑型离子液体1‑烷基‑3‑甲基咪唑阳离子([Cnmim]+)的烷基链长度或制备过程中脂质纳米颗粒溶液、CRISPR‑cas9基因编辑系统溶液和离子液体溶液的混合顺序，能够进一步提高基因编辑效率。

Description

一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗通过将外源正常基因导入靶细胞，以纠正异常基因表达缺陷引起的疾病，以达到治疗目的，有希望纠正人类的各种疾病和缺陷。CRISPR-cas9基因编辑系统的出现为基因编辑提供了一种简单有效的方法，促进了基因疗法的发展，为治疗遗传疾病提供了新的途径。
CRISPR-cas9基因编辑系统由单导向RNA(sgRNA)和Cas9蛋白组成，sgRNA识别其在基因组中的靶序列，Cas9蛋白在sgRNA的引导下对靶序列进行切割，CRISPR-cas9系统的具有多样性、模块化和有效性的特点，已经成为目前细胞基因组工程中最强大的平台。目前，CRISPR-cas9已经被用于基因删除、基因突变、转录激活和基因筛查，在眼科学、神经科学、免疫学、内分泌、癌症研究、基因筛查、疾病诊断和药物靶点的研究领域均得到应用。
虽然CRISPR-cas9系统在基因编辑上虽然具有巨大的潜力，但是如何进行CRISPR-cas9 系统的安全、有效和准确的递送是将其用于治疗时面临的重大挑战。目前，CRISPR-cas9系统通过三种形式进行递送：(1)递送编码Cas9蛋白和sgRNA的质粒；(2)递送Cas9mRNA 和单独的sgRNA的混合物；(3)递送Cas9蛋白和sgRNA形成的核糖核蛋白(RNP)复合物，其中，递送RNP复合物作用迅速、基因编辑效率高、同时能降低毒性和免疫反应。
脂质纳米颗粒是目前最常用的CRISPR-cas9递送系统之一，带负电的核酸能和带正电的脂质通过电荷作用形成脂质纳米颗粒，并且能保护核酸免受核酸酶的降解，并通过内吞作用或巨胞饮作用进入靶细胞。脂质纳米颗粒具有易制备，安全性好的优点，脂质纳米粒能够有效地将RNP复合物传递到小鼠大脑中进行体内基因编辑，如CN111246846A公开了一种可用于体内递送生物活性剂的组合物，所述组合物包含阳离子脂质、辅助脂质和生物稳定性增强剂，能够递送RNP复合物等生物活性剂，但是脂质纳米颗粒递送效率较低，尤其是在递送同时包含核酸和蛋白的RNP复合物上，由于Cas9蛋白带正电荷，使得负载效率较低，因此需对脂质纳米颗粒或RNP复合物进行修饰。
Zuris等(参见：Zuris JA,Thompson D B,Shu Y,et al.Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editingin vitro and in vivo[J].Nature Biotechnology,2014,33(1):73-80)将带负电的绿色荧光蛋白GFP融合到Cas9蛋白上，使Cas9 蛋白融合蛋白和sgRNA组成的RNP复合物能被常规的带正电荷的脂质颗粒递送，结果表明，利用阳离子脂质传递GFP-Cas9:sgRNA复合物可以高效地对靶基因进行修饰，其特异性显著高于递送表达Cas9和sgRNA的DNA。
但是，对脂质纳米颗粒或RNP复合物进行化学修饰会增加操作技术的复杂性，对纳米颗粒或RNP复合物的结构、稳定性和活性会产生不确定的影响，并且通用性较差。
因此，提供一种简单高效、且操作简单的核糖核蛋白递送载体对于基因编辑具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用，所述CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体采用脂质纳米颗粒和离子液体，二者相互配合，无需进行化学修饰，即可高效递送基因编辑系统，提高基因编辑效率。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明采用一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体，所述CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体包括脂质纳米颗粒和离子液体。
离子液体是一类常温下呈液态的盐，具有良好的溶解性、理化性质可设计性、性质稳定等优点。
本发明首次发现离子液体能提高脂质纳米颗粒对CRISPR-cas9基因编辑系统的递送效率，提高CRISPR-cas9的基因编辑效率。
优选地，所述CRISPR-cas9基因编辑系统包括核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)。
优选地，所述核糖核蛋白包括单向导RNA和Cas9蛋白。
优选地，所述的脂质纳米颗粒可以为市售(如LipofectamineTM 2000、LipofectamineTM 3000、RNAiMAXTM或LipofectamineTM CRISPRMAX)或配制的脂质纳米颗粒，配制的脂质纳米颗粒可由以下方法获得：将磷脂、胆固醇及其它类脂(如离子化脂质或PEG-脂质)共溶于氯仿和无水乙醇组成溶剂中，通过搅拌去除有机溶剂后进行超声，分离出脂质体，再将其重悬于Tris-HCl或磷酸缓冲液中。
优选地，所述脂质纳米颗粒含有胆固醇、离子化脂质、PEG-脂质和磷脂。
优选地，所述的离子液体包括胆碱型离子液体和/或咪唑型离子液体。
优选地，所述胆碱型离子液体包括胆碱阳离子([Cho]+)和阴离子，所述阴离子包括无机阴离子和/或有机阴离子。
优选地，所述咪唑型离子液体包括1-烷基-3-甲基咪唑阳离子([Cnmim]+，n为正整数) 和阴离子，所述阴离子包括无机阴离子和/或有机阴离子。
优选地，所述1-烷基-3-甲基咪唑阳离子中所述烷基为C1～C16的直连烷基或支链烷基，包括但不限于C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15，优选为C12～C16的直连烷基或支链烷基。
本发明中，控制1-烷基-3-甲基咪唑阳离子中所述烷基为C12～C16的直连烷基或支链烷基，能够进一步提高所递送的CRISPR-cas9的基因编辑效率。
优选地，所述胆碱型离子液体和咪唑型离子液体中的无机阴离子各自独立地包括硫酸根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、卤素离子、磷酸氢根离子或磷酸二氢根离子中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述胆碱型离子液体和咪唑型离子液体中的有机阴离子各自独立地包括乳酸根离子、甲酸根离子、C1～C10烷基羧酸根离子、三氟甲磺酰亚胺离子、多库酯酸根离子、烟碱酸离子、水杨酸根或香叶酸根离子中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体的制备方法，所述制备方法包括：
将脂质纳米颗粒和离子液体混合，即得到所述CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体。
第三方面，本发明提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物包括第一方面所述的 CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体和CRISPR-cas9基因编辑系统。
优选地，所述CRISPR-cas9基因编辑系统包括核糖核蛋白。
优选地，所述核糖核蛋白包括单向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白。
第四方面，本发明提供一种第三方面所述的基因编辑组合物的制备方法，所述制备方法包括：
将第一方面所述的CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体和CRISPR-cas9基因编辑系统混合，即得到所述基因编辑组合物。
优选地，所述制备方法包括制备方法I、制备方法II、制备方法III或制备方法Ⅳ中的任意一种。
所述制备方法I包括：将离子液体溶液和CRISPR-cas9基因编辑系统溶液混合，加入脂质纳米颗粒溶液，进行孵育。
所述制备方法II包括：将离子液体溶液与脂质纳米颗粒溶液混合，加入CRISPR-cas9基因编辑系统溶液，进行孵育。
所述制备方法III包括：将脂质纳米颗粒溶液和CRISPR-cas9基因编辑系统溶液混合，加入离子液体溶液，进行孵育。
优选地，所述制备方法III包括：将脂质纳米颗粒溶液加入CRISPR-cas9基因编辑系统溶液中，加入离子液体溶液，进行孵育。
本发明中，控制先将脂质纳米颗粒溶液和CRISPR-cas9基因编辑系统溶液混合后再加入离子液体溶液，能够进一步提高所制备的基因编辑组合物的基因编辑效率。
所述制备方法Ⅳ包括：将离子液体溶液与脂质纳米颗粒溶液混合，充分混匀，得到含有离子液体的脂质纳米颗粒溶液，将离子液体溶液与CRISPR-cas9基因编辑系统溶液混合，得到含有离子液体的CRISPR-cas9基因编辑系统溶液，将所述含有离子液体的脂质纳米颗粒溶液和含有离子液体的CRISPR-cas9基因编辑系统溶液混合，进行孵育。
优选地，所述制备方法I、制备方法II、制备方法III和制备方法Ⅳ中孵育的时间各自独立地为5～30min，包括但不限于6min、7min、8min、9min、10min、15min、20min、22 min、24min、25min、26min、27min、28min或29min。
优选地，所述制备方法I、制备方法II、制备方法III和制备方法Ⅳ中孵育的温度各自独立地为20～30℃，包括但不限于21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃或29℃。
优选地，所述制备方法I、制备方法II、制备方法III和制备方法Ⅳ中脂质纳米颗粒溶液、 CRISPR-cas9基因编辑系统溶液和离子液体溶液的体积比各自独立地为1:1:(0.01～0.1)，包括但不限于1:1:0.02、1:1:0.03、1:1:0.04、1:1:0.05、1:1:0.06、1:1:0.07、1:1:0.08或1:1:0.09。
优选地，所述CRISPR-cas9基因编辑系统溶液包括核糖核蛋白复合物溶液。
优选地，所述核糖核蛋白复合物溶液的制备方法包括将单向导RNA和Cas9蛋白加入培养基中，获得所述核糖核蛋白复合物溶液。
优选地，所述核糖核蛋白复合物溶液中核糖核蛋白复合物的质量百分比为0.001％～0.01％，包括但不限于0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.008％或0.009％，优选为0.003％～0.008％。
优选地，所述核糖核蛋白复合物中单向导RNA和Cas9蛋白的质量比为(1～20):1，包括但不限于2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1或19:1，优选为(3～10):1。
优选地，所述脂质纳米颗粒溶液的制备方法包括将脂质纳米颗粒加入培养基中，获得所述脂质纳米颗粒溶液。
优选地，所述脂质纳米颗粒溶液中脂质纳米颗粒的体积百分比为0.5％～20％，包括但不限于0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、10％、12％、14％、16％、 18％或19％，优选为1％～10％。
优选地，所述基因编辑组合物中离子液体的浓度为0.01μmol/L～150000μmol/L，包括但不限于0.02μmol/L、0.03μmol/L、0.04μmol/L、0.05μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、 4μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L、10000μmol/L、50000μmol/L、70000μmol/L、90000μmol/L、110000μmol/L、120000μmol/L、130000μmol/L、140000μmol/L、141000μmol/L、142000μmol/L、145000μmol/L、148000μmol/L或149000μmol/L，优选为 0.15μmol/L～15000μmol/L。
优选地，所述的离子液体先加入细胞培养基中配制成高浓度的离子液体溶液。
优选地，所述离子液体溶液的浓度为1μmol/L～500000μmol/L，包括但不限于1μmol/L、 2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、1000μmol/L、10000μmol/L、100000μmol/L、200000μmol/L、300000μmol/L、350000μmol/L、400000μmol/L、420000μmol/L、450000μmol/L、480000μmol/L或490000μmol/L，优选为5 μmol/L-400000μmol/L。
本发明中，常规的细胞培养基包括MEM培养基、Opti-MEM培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、RPMI 1640培养基或DMEM/F-12培养基等，均能用于配制CRISPR-cas9基因编辑系统溶液、脂质纳米颗粒溶液和离子液体溶液。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体或第三方面所述的基因编辑组合物。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括稀释剂、赋形剂或助溶剂中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，如第一方面所述的CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体、第三方面所述的基因编辑组合物或第五方面所述的药物组合物在制备基因编辑产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明同时采用脂质纳米颗粒和离子液体作为递送载体，无需化学修饰，即可高效递送CRISPR-cas9基因编辑系统，并提高CRISPR-cas9基因编辑系统的基因编辑效率；
(2)本发明中，控制咪唑型离子液体1-烷基-3-甲基咪唑阳离子中所述烷基为C12～C16 的直连烷基或支链烷基，能够进一步提高所递送的CRISPR-cas9的基因编辑效率；
(3)本发明中，控制先将脂质纳米颗粒溶液和CRISPR-cas9基因编辑系统溶液混合后再加入离子液体溶液，能够进一步提高所制备的基因编辑组合物的基因编辑效率。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明实施例中以针对绿色荧光蛋白基因为例，制备基因编辑组合物，并对编辑效率进行分析，咪唑型离子液体[C12mim][Cl]、[C14mim][Cl]和[C16mim][Cl]中烷基均为直链烷基。
实施例1
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法I制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列为(SEQ ID NO.1)：
mG*mC*mC*GUCCAGCUCGACCAGGAUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGU UAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU *mUmU(*为硫代磷酸化修饰的核苷酸，m为2’-O-甲基化修饰的核苷酸)；
Cas9蛋白的氨基酸序列为(SEQ ID NO.2)：
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGET AEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFG NIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDV DKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIA LSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSD ILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDF YPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSF IERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLL FKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENE DILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQ SGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKG ILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILK EHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVL TRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGF IKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFF YSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSV KELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQK GNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILAD ANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDAT LIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSRADPKKKRKV；
制备离子液体溶液：称取47238μg胆碱型离子液体[Cho][Cl]，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为67666μmol/L的[Cho][Cl]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒(ThermoFisher scientific,13778030)加入60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将1.5μL的[Cho][Cl]溶液加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的脂质纳米颗粒溶液，充分混匀后25℃孵育10分钟，获得所述基因编辑组合物。
实施例2
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法I制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和500ng的sgRNA加入至75μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列为(SEQ ID NO.3)：
mG*mA*mG*CUGGACGGCGACGUAAACGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGU UAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU *mU*mU；
Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取胆碱型离子液体[Cho]2[SO4]11628μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为7650μmol/L的[Cho]2[SO4]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将1.8μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将2μL的[Cho]2[SO4]溶液加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的脂质纳米颗粒溶液，充分混匀后25℃孵育10分钟，获得所述基因编辑组合物。
实施例3
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法I制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和667ng的sgRNA加入至117μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列为(SEQ ID NO.4)：
mA*mA*mG*UUCAGCGUGUCCGGCGAGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGU UAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU *mU*mU；
Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取胆碱型离子液体[Cho][H2PO4]36014μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为32800μmol/L的[Cho][H2PO4]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入60 μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将2.5μL的[Cho][H2PO4]溶液加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的脂质纳米颗粒溶液，充分混匀后25℃孵育10分钟，获得所述基因编辑组合物。
实施例4
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法I制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列与实施例1中的一致，Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取胆碱型离子液体[Cho][Sal]16549μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为13733μmol/L的[Cho][Sal]溶液；[Cho][Sal]为阴离子水杨酸的胆碱型离子液体；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将3μL的离子液体溶液加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的脂质纳米颗粒溶液，充分混匀后25℃孵育10分钟，获得所述基因编辑组合物。
实施例5
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法I制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和1333ng的sgRNA加入至106μL的Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列为(SEQ ID NO.5)：
mG*mC*mA*CUGCACGCCGUAGGUCAGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGU UAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU *mU*mU，Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取胆碱型离子液体[Cho][Nico]8814μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为7800μmol/L的[Cho][Nico]溶液；[Cho][Nico]为阴离子烟碱酸的胆碱型离子液体；
制备脂质纳米颗粒溶液：将6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入60 μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将4μL的离子液体溶液加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的脂质纳米颗粒溶液，充分混匀后25℃孵育10分钟，获得所述基因编辑组合物。
实施例6
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法I制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和444ng的sgRNA加入至64μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列为(SEQ ID NO.6)：
mG*mC*mC*GUCCAGCUCGACCAGGAUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGU UAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU *mUmU，Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取咪唑型离子液体[C4mim][Cl](其中烷基为正丁基)295ug，用 Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为338μmol/L的[C4mim][Cl]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将1.2μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将1.5μL的[C4mim][Cl]溶液加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的脂质纳米颗粒溶液，充分混匀后25℃孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例7
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法I制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和400ng的sgRNA加入至55μL的Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列为(SEO ID NO.7)：
mG*mA*mG*CUGGACGGCGACGUAAACGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGU UAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU *mU*mU，Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取咪唑型离子液体[C4mim][H2PO4](其中烷基为异丁基)600μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为510μmol/L的[C4mim][H2PO4]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将2.4μL的脂质纳米颗粒加入60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将2μL的[C4mim][H2PO4]溶液加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的脂质纳米颗粒溶液，充分混匀后25℃孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例8
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法I制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和571ng的sgRNA加入至91μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列为(SEO ID NO.8)：
mG*mC*mC*GUCCAGCUCGACCAGGAUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGU UAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU *mUmU，Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取咪唑型离子液体[C12mim][Cl]246.17μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为171μmol/L的[C12mim][Cl]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将3μL的[C12mim][Cl]溶液加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的脂质纳米颗粒溶液，充分混匀后25℃孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例9
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法I制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和400ng的sgRNA加入至55μL的Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列为(SEO ID NO.9)：
mG*mC*mC*GUCCAGCUCGACCAGGAUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGU UAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU *mUmU，Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取咪唑型离子液体[C14mim][Cl]1065μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为677μmol/L的[C14mim][Cl]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将1.5μL的[C14mim][Cl]溶液加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的脂质纳米颗粒溶液，充分混匀后25℃孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例10
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法I制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；sgRNA的序列与实施例1 中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取咪唑型离子液体[C16mim][Cl]1160μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为677μmol/L的[C16mim][Cl]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将1.5μL的[C16mim][Cl]溶液加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的脂质纳米颗粒溶液，充分混匀后25℃孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例11
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法II制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列与实施例1中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取胆碱型离子液体[Cho][Cl]47238μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为67666μmol/L的[Cho][Cl]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将1.5μL的[Cho][Cl]溶液加入50μL的脂质纳米颗粒溶液中，25℃混匀10分钟，加入 50μL的RNP复合物溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物；
实施例12
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法II制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；sgRNA的序列与实施例1 中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取胆碱型离子液体[Cho][Sal]16549μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为13733μmol/L的[Cho][Sal]溶液；[Cho][Sal]为阴离子水杨酸的胆碱型离子液体；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将3μL的[Cho][Sal]溶液加入50μL的脂质纳米颗粒溶液中，25℃混匀10分钟，加入50 μL的RNP复合物溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例13
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法II制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；sgRNA的序列与实施例1 中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取咪唑型离子液体[C16mim][Cl]1160μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为677μmol/L的[C16mim][Cl]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将1.5μL的[C16mim][Cl]溶液加入50μL的脂质纳米颗粒溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的RNP复合物溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例14
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法III制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；sgRNA的序列与实施例1 中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取胆碱型离子液体[Cho][Cl]47238μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为67666μmol/L的[Cho][Cl]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将50μL的脂质纳米颗粒加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入1.5μL的[Cho][Cl]溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例15
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法III制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；sgRNA的序列与实施例1 中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取胆碱型离子液体[Cho][Sal]16549μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为13733μmol/L的[Cho][Sal]溶液；[Cho][Sal]为阴离子水杨酸的胆碱型离子液体；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将50μL的脂质纳米颗粒加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入3μL的[Cho][Sal]溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例16
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法III制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；sgRNA的序列与实施例1 中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取咪唑型离子液体[C16mim][Cl]1160μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为677μmol/L的[C16mim][Cl]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将50μL的脂质纳米颗粒加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入1.5μL的[C16mim][Cl]溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例17
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法Ⅳ制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；sgRNA的序列与实施例1 中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取胆碱型离子液体[Cho][Cl]47238μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为67666μmol/L的[Cho][Cl]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将0.75μL的[Cho][Cl]溶液加入50μL的脂质纳米颗粒溶液中，充分混匀，将0.75μL的 [Cho][Cl]溶液加入50μL的含RNP复合物溶液中，充分混匀，将含有[Cho][Cl]的脂质纳米颗粒溶液加入至含有[Cho][Cl]的RNP复合物溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例18
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法Ⅳ制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；sgRNA的序列与实施例1 中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取胆碱型离子液体[Cho][Sal]16549μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为13733μmol/L的[Cho][Sal]溶液；[Cho][Sal]为阴离子为水杨酸的胆碱型离子液体；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将0.75μL的离子液体溶液加入50μL的脂质纳米颗粒溶液中，充分混匀，将0.75μL的离子液体溶液加入50μL的含RNP复合物溶液中，充分混匀，将含有离子液体的脂质纳米颗粒溶液加入至含有离子液体的RNP复合物溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
实施例19
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，采用制备方法Ⅳ制备获得，制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；sgRNA的序列与实施例1 中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备离子液体溶液：称取咪唑型离子液体[C16mim][Cl]1160μg，用Opti-MEM培养基定溶至5mL，获得浓度为677μmol/L的[C16mim][Cl]溶液；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将50μL的脂质纳米颗粒加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入1.5μL的离子液体溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物；
将0.75μL的[C16mim][Cl]溶液加入50μL的脂质纳米颗粒溶液中，充分混匀，将0.75μL 的[C16mim][Cl]溶液加入50μL的含RNP复合物溶液中，充分混匀，将含有[C16mim][Cl]的脂质纳米颗粒溶液加入至含有[C16mim][Cl]的RNP复合物溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
对比例1
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，与实施例1相比，区别在于将[Cho][Cl]溶液替换为等量Opti-MEM培养基，具体制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列与实施例1中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将1.5μL的Opti-MEM培养基加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的脂质纳米颗粒溶液，充分混匀后25℃孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
对比例2
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，与实施例11相比，区别在于将[Cho][Cl]溶液替换为等量Opti-MEM培养基，具体制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列与实施例1中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将1.5μL的Opti-MEM培养基加入50μL的脂质纳米颗粒溶液中，25℃混匀10分钟，加入50μL的RNP复合物溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物；
对比例3
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，与实施例14相比，区别在于将[Cho][Cl]溶液替换为等量Opti-MEM培养基，具体制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；
sgRNA的序列与实施例1中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将50μL的脂质纳米颗粒加入50μL的RNP复合物溶液中，25℃混匀10分钟，加入1.5μL的Opti-MEM培养基，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物；
对比例4
本实施例提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物针对绿色荧光蛋白基因，与实施例17相比，区别在于将[Cho][Cl]溶液替换为等量Opti-MEM培养基，具体制备方法如下：
制备RNP复合物溶液：将4000ng的Cas9蛋白和800ng的sgRNA加入至160μL的 Opti-MEM培养基中，25℃混匀10分钟，获得RNP复合物溶液；sgRNA的序列与实施例1 中的一致；Cas9蛋白的氨基酸序列与实施例1中的一致；
制备脂质纳米颗粒溶液：将3.6μL的LipofectamineTM CRISPRMAX脂质纳米颗粒加入 60μL的Opti-MEM培养基中，获得脂质纳米颗粒溶液；
将0.75μL的Opti-MEM培养基加入50μL的脂质纳米颗粒溶液中，充分混匀，将0.75μL 的Opti-MEM培养基加入50μL的含RNP复合物溶液中，充分混匀，将含有Opti-MEM培养基的脂质纳米颗粒溶液加入至含有Opti-MEM培养基的RNP复合物溶液，25℃充分混匀后孵育10分钟，获得基因编辑组合物。
试验例1
本试验例评价测试实施例1-19和对比例1-4制备的基因编辑组合物编辑绿色荧光蛋白基因的编辑效率，具体方法为：
在24孔细胞培养板中的每个孔中分别加入0.5mL细胞数量为1×105的表达绿色荧光蛋白的Hela-EGFP细胞，在37℃二氧化碳培养箱中孵育24小时后，分别在每个孔中加入50μL 实施例1-19和对比例1-4制备的基因编辑组合物，每种基因编辑组合物均进行3个复孔试验，将加样后的24孔板置于37℃二氧化碳培养箱中孵育48小时后，弃去培养基，用200μLPBS 冲洗细胞，100μL胰酶进行消化后离心收集细胞，溶细胞染色液冲洗细胞两次后，用1mL 细胞染色液将细胞进行重悬后用流式细胞仪测定组合物的基因编辑效率，基因编辑效率＝无绿色荧光的Hela-EGFP细胞数量/总细胞数量×100％，结果如表1所示，基因编辑效率为3 个复孔的平均值。
表1
Figure BDA0003202155890000171
Figure BDA0003202155890000181
如表1所示，实施例1-19均采用脂质纳米颗粒和离子液体与RNP复合物制备基因编辑组合物，所述基因编辑组合物具备高效编辑效率，基因编辑效率高于16.1％，最高为35.8％，而对比例1-4中未采用离子液体，基因编辑效率最高仅为13.4％，表明本发明同时采用脂质纳米颗粒和离子液体作为递送载体，并进一步制备基因编辑组合物，能够显著提高基因编辑组合物的基因编辑效率。
此外，将实施例6、7和实施例8、9、10对比可知，实施例8、9、10制备的基因编辑组合物的编辑效率更高，表明本发明控制1-烷基-3-甲基咪唑阳离子([Cnmim]+)的烷基链长为12～16个碳原子，能够进一步提高基因编辑组合物的编辑效率，将实施例14与实施例1、 11和17对比可知，实施例14采用方法III，实施例1、11和17分别采用方法I、II和Ⅳ，实施例14制备的基因编辑组合物的的基因编辑效率更高，表明本发明控制先将脂质纳米颗粒溶液和CRISPR-cas9基因编辑系统溶液混合后再加入离子液体溶液，能够进一步提高所制备的基因编辑组合物的基因编辑效率。
综上所述，本发明同时采用脂质纳米颗粒和离子液体负载CRISPR-cas9基因编辑系统，能够提高基因编辑效率，此外，控制1-烷基-3-甲基咪唑阳离子([Cnmim]+)的烷基链长度或制备过程中脂质纳米颗粒溶液、CRISPR-cas9基因编辑系统溶液和离子液体溶液的混合顺序，能够进一步提高基因编辑效率。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院过程工程研究所
<120> 一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用
<130> 20210806
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccguccagc ucgaccagga uggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 2
<211> 1379
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1370 1375
<210> 3
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagcuggacg gcgacguaaa cggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 4
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaguucagcg uguccggcga gggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 5
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcacugcacg ccguagguca gggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 6
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<210> 7
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
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guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 8
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
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guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 9
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
gccguccagc ucgaccagga uggguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103

Claims (10)

1.一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体，其特征在于，所述CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体包括脂质纳米颗粒和离子液体。
2.根据权利要求1所述的CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体，其特征在于，所述CRISPR-cas9基因编辑系统包括核糖核蛋白；
优选地，所述核糖核蛋白包括单向导RNA和Cas9蛋白；
优选地，所述脂质纳米颗粒含有胆固醇、离子化脂质、PEG-脂质和磷脂；
优选地，所述的离子液体包括胆碱型离子液体和/或咪唑型离子液体。
3.根据权利要求2所述的CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体，其特征在于，所述胆碱型离子液体包括胆碱阳离子和阴离子，所述阴离子包括无机阴离子和/或有机阴离子；
优选地，所述咪唑型离子液体包括1-烷基-3-甲基咪唑阳离子和阴离子，所述阴离子包括无机阴离子和/或有机阴离子；
优选地，所述1-烷基-3-甲基咪唑阳离子中所述烷基为C1～C16的直连烷基或支链烷基，优选为C12～C16的直连烷基或支链烷基；
优选地，所述胆碱型离子液体和咪唑型离子液体中的无机阴离子各自独立地包括硫酸根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、卤素离子、磷酸氢根离子或磷酸二氢根离子中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述的胆碱型离子液体和咪唑型离子液体中的有机阴离子各自独立地包括乳酸根离子、甲酸根离子、C1～C10烷基羧酸根离子、三氟甲磺酰亚胺离子、多库酯酸根离子、烟碱酸离子、水杨酸根或香叶酸根离子中的任意一种或至少两种的组合。
4.一种权利要求1-3任一项所述的CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将脂质纳米颗粒和离子液体混合，即得到所述CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体。
5.一种基因编辑组合物，其特征在于，所述基因编辑组合物包括权利要求1-3任一项所述的CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体和CRISPR-cas9基因编辑系统；
优选地，所述CRISPR-cas9基因编辑系统包括核糖核蛋白；
优选地，所述核糖核蛋白包括单向导RNA和Cas9蛋白。
6.一种权利要求5所述的基因编辑组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将权利要求1-3任一项所述的CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体和CRISPR-cas9基因编辑系统混合，即得到所述基因编辑组合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括制备方法I、制备方法II、制备方法III或制备方法Ⅳ中的任意一种；
所述制备方法I包括：将离子液体溶液和CRISPR-cas9基因编辑系统溶液混合，加入脂质纳米颗粒溶液，进行孵育；
所述制备方法II包括：将离子液体溶液与脂质纳米颗粒溶液混合，加入CRISPR-cas9基因编辑系统溶液，进行孵育；
所述制备方法III包括：将脂质纳米颗粒溶液和CRISPR-cas9基因编辑系统溶液混合，加入离子液体溶液，进行孵育；
所述制备方法Ⅳ包括：将离子液体溶液与脂质纳米颗粒溶液混合，充分混匀，得到含有离子液体的脂质纳米颗粒溶液，将离子液体溶液与CRISPR-cas9基因编辑系统溶液混合，得到含有离子液体的CRISPR-cas9基因编辑系统溶液，将所述含有离子液体的脂质纳米颗粒溶液和含有离子液体的CRISPR-cas9基因编辑系统溶液混合，进行孵育；
优选地，所述制备方法I、制备方法II、制备方法III和制备方法Ⅳ中孵育的时间各自独立地为5～30min；
优选地，所述制备方法I、制备方法II、制备方法III和制备方法Ⅳ中孵育的温度各自独立地为20～30℃；
优选地，所述制备方法I、制备方法II、制备方法III和制备方法Ⅳ中脂质纳米颗粒溶液、CRISPR-cas9基因编辑系统溶液和离子液体溶液的体积比各自独立地为1:1:(0.01～0.1)。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述CRISPR-cas9基因编辑系统溶液包括核糖核蛋白复合物溶液；
优选地，所述核糖核蛋白复合物溶液的制备方法包括将单向导RNA和Cas9蛋白加入培养基中，获得所述核糖核蛋白复合物溶液；
优选地，所述核糖核蛋白复合物溶液中核糖核蛋白复合物的质量百分比为0.001％～0.01％；
优选地，所述核糖核蛋白复合物中单向导RNA和Cas9蛋白的质量比为(20～1):1；
优选地，所述脂质纳米颗粒溶液的制备方法包括将脂质纳米颗粒加入培养基中，获得所述脂质纳米颗粒溶液；
优选地，所述脂质纳米颗粒溶液中脂质纳米颗粒的体积百分比为0.5％～20％；
优选地，所述离子液体溶液的浓度为1μmol/L～500000μmol/L。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3任一项所述的CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体或权利要求5所述的基因编辑组合物；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料；
优选地，所述辅料包括稀释剂、赋形剂或助溶剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.如权利要求1-3任一项所述的CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体、权利要求5所述的基因编辑组合物或权利要求9所述的药物组合物在制备基因编辑产品中的应用。
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