CN109789216A

CN109789216A - 基于离子物种的皮肤治疗局部制剂

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Publication number: CN109789216A
Application number: CN201780061475.3A
Authority: CN
Inventors: M·扎克雷夫斯基; S·梅内加蒂
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2016-08-29
Filing date: 2017-08-29
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2037-08-29
Also published as: US10912834B2; EP3503927A1; KR20190042691A; WO2018044920A1; JP2019526626A; KR102552848B1; JP7179354B2; JP2022168149A; CN109789216B; CA3035414C; US20190192661A1; US20210162050A1; CA3035414A1

Abstract

公开了含有包含具有烷基链的阳离子和大分子阴离子的络合物的组合物，以及制备和使用方法。该组合物通常是电荷中性的并且在室温和标准压力下为液体。大分子阴离子可以是核酸、肽、蛋白质和/或碳水化合物。该组合物具有增强的穿过皮肤屏障(角质层)并进入皮肤细胞的渗透性，将大分子递送至皮肤细胞。该组合物局部施用于皮肤，特别适用于治疗皮肤病。

Description

基于离子物种的皮肤治疗局部制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年8月29日提交的U.S.S.N.62/380,761的权益和优先权，并且其中允许的内容通过引用整体并入本文。

关于联邦政府资助研究的声明

本发明是在国立卫生研究院授予的批准号5R21CA19133-02的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

参考序列表

依据37C.F.R.§1.52(e)(5)，以创建于2016年8月15日并且大小为3,132个字节的名为“UCSB_2017_042_ST25.txt”的文本文件提交的序列表在此通过引用并入。

技术领域

本发明的领域是透皮药物递送制剂和局部施用的制剂，例如用于治疗皮肤病，以及制备和使用这些制剂的方法。

背景技术

皮肤病是影响全球70％以上人群的最常见的人类疾病之一(Hay等人,Journal ofInvestigative Dermatology,134:1527-1534(2014))。皮肤病的症状从纯粹的美容(例如脂肪团、皱纹和褐斑)到衰弱甚至致命(例如严重的疼痛、皮肤屏障破坏、脱水和全身性感染)(Zakrewsky等人,Journal ofControlledRelease,218:445-456(2015))。皮肤病的高患病率和症状的外在表现以及与严重皮肤病相关的高发病率和死亡率导致显著的身体、情感和经济负担(Hay等人,Journal ofInvestigative Dermatology,134:1527-1534(2014)；Bickers等人,Journal oftheAmerican Academy ofDermatology,55:490-500(2006))。皮肤病估计是全球非致命疾病负担的第四大原因，比慢性阻塞性肺病、糖尿病、骨关节炎和药物滥用更加繁重(Hay等人,Journal ofInvestigative Dermatology,134:1527-1534(2014)。然而，皮肤病的有效治疗仍未得到很好的解决(Hay等人,JournalofInvestigative Dermatology,134:1527-1534(2014)；Bickers等人,Journal of theAmerican Academy of Dermatology,55:490-500(2006)；Freeman E.E.,Journal ofInvestigative Dermatology,134:2663-2665(2014))。

局部和透皮药物递送相对于其他常见递送途径(例如口服、皮下和静脉内)提供许多优点。这些优点包括避免与胃肠(GI)道相关的主要降解途径，减少与全身毒性相关的副作用，以及无针给药。Brown等人,“Dermal and transdermal drug delivery systems:current andfutureprospects”,Drug Delivery,13:175-87(2006)。

不幸的是，皮肤的最外层，即角质层(SC)，充当大多数异物的屏障，严重限制了许多分子的被动扩散。为克服这一障碍，已采用了几种策略，包括使用化学渗透促进剂(CPE)。已经证明CPE通过破坏SC中的脂质组成和组织来增强各种分子穿过皮肤的运输(Karande等人,Proceedings ofthe National Academy ofSciences ofthe United States ofAmerica,102:4688-93(2005))。然而，脂质破坏的程度通常与皮肤刺激密切相关(Karande2005)。

对于细菌性皮肤感染的治疗，存在药物递送的第二运输屏障-细菌生物膜。受生物膜保护的细菌占人类细菌感染的65％，对抗生素的抗性比未受保护的细菌高50-500倍。Palmer等人,“Molecular techniques to detect biofilm bacteria in long bonenonunion:a case report”,Clinical orthopaedics and related research,469:3037-42(2011)。抗生素抗性是由细胞外聚合物(EPS)例如多糖、腐殖酸和核酸造成的运输屏障引起的。尽管SC和细菌生物膜的化学组成不同，但克服由SC和生物膜造成的运输屏障可以类似的方式实现，例如通过流化或通过合适的溶剂提取屏障组分。

例如，已经花费了大量努力来实现局部siRNA的更有效递送。克服SC屏障的策略包括物理方法，例如微针贴片(Chong等人,Journal ofControlled Release,166:211-219(2013))和激光消融(Lee等人,Human gene therapy,20:580-588(2009))；主动方法，例如超声促渗(Tran等人,8^th International Symposium on Therapeutic Ultrasound,423-427(2009))和离子电渗(Kigasawa等人,Internationaljournal ofpharmaceutics,383:157-160(2010))；和被动方法，例如肽(Hsu等人,Proceedings ofthe NationalAcademyofSciences of the United States of America,108:15816-15821(2011)；Lin等人,Archives of Dermatological Research,304:139-144(2012)；Uchida等人,JournalofPharmacology and Experimental Therapeutics,388:443-450(2011)；Yi等人,Molecular Therapy,19:362-371(2011))和球形核酸(Randeria等人,Proceedings oftheNationalAcademy ofSciences ofthe United States ofAmerica,112:5573-5578(2015)；Zheng等人,Proceedings ofthe National Academy ofSciences ofthe United StatesofAmerica,109:11975-11980(2012))。

然而，皮肤病症状通常表现在大表面积并且通常限制基于装置的方法的使用。被动递送方法通常可用于大表面积的应用；然而，目前的被动方法具有局限性，包括复杂的合成和使用siRNA缀合化学的必要性(Hsu等人,Proceedings ofthe NationalAcademy ofSciences ofthe United States ofAmerica,108:15816-15821(2011)；Chen等人,Journalof Controlled Release,179:33-41(2014)；Meade等人,Nat Biotech,32:1256-1261(2014)；Cutler等人,Journal oftheAmerican Chemical Society,132:1376-1391(2012))。

需要改善治疗组合物的透皮运输而不刺激皮肤的组合物和方法。

因此，本发明的一个目的是提供用于改善治疗剂、预防剂或诊断剂的透皮运输的组合物。

本发明的另一个目的是提供用于治疗皮肤内疾病和病症的改进组合物。

本发明的另一个目的是提供改善治疗剂、预防剂或诊断剂的透皮运输的方法。

本发明的又一个目的是提供治疗皮肤疾病和病症的改进方法。

发明内容

本文公开了用于改善治疗剂、预防剂或诊断剂的透皮运输的组合物。该组合物包括大分子阴离子和具有烷基链阳离子的络合物。该组合物通常是电荷中性的，并且在室温和标准压力下为液体形式。在一些方面，大分子阴离子和烷基链阳离子的比例可以偏离1:1。在这方面，可以足够的量存在另外的小抗衡离子如钠或氯化物以提供电荷中性组合物。

合适的大分子阴离子包括RNA干扰分子，例如小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)和微小RNA(miRNA)、肽、蛋白质和/或多糖，例如透明质酸。

合适的具有烷基链的阳离子包括苄基二甲基烷基，例如苄基二甲基辛基铵(BDOA)、苄基二甲基十四烷基铵(BDTA)、苄基二甲基硬脂基铵(BDSA)。在一些实施例中，阳离子在烷基链中含有8个碳，例如苄基二甲基辛基铵(BDOA)或阳离子在烷基链中含有18个碳，例如苄基二甲基硬脂基铵(BDSA)。

通常，阳离子的烷基链长度赋予络合物期望的性质，使得络合物可以穿过皮肤屏障(SC)运输并进入皮肤细胞。期望的性质包括足够的疏水性、流体动力学尺寸和对皮肤无刺激性。

本文所述的组合物适于局部施用于皮肤而不使用装置推动组合物穿过角质层和/或表皮、改变皮肤的孔隙度、从皮肤上去除层或刺穿皮肤，例如微针装置、电子穿孔器或离子穿孔器。通常，不需要对皮肤进行额外的干预，例如注射、超声促渗、磨损、电穿孔或离子穿孔，以将组合物中的药剂递送穿过角质层，任选地递送至表皮的一层或多层。

本文所述的组合物具有合适的疏水性以穿过皮肤屏障并进入皮肤细胞。优选地，药剂被递送穿过表皮并进入真皮。任选地，药剂被递送超出真皮。

该组合物可用于治疗皮肤的一种或多种状况，包括美容或疾病状况。美容状况包括皱纹、老年斑(肝斑)、疤痕、痤疮等。疾病状况包括皮肤的炎症、感染、自身免疫、过敏、肿瘤和其他慢性、后天性或急性疾病。

附图说明

图1是显示对数标度的辛醇-水分配系数P_o/w(Log P_o/w)随苄基二甲基烷基氯化铵的烷基链长度和针对不同烷基链长度的包覆的siRNA而变化的线图。误差条表示n＝3的平均值+SD。氯化物盐的Log P_o/w是公布的实验值和预测值(参见表2)。

图2A和2B是显示递送到猪皮的不同皮肤层的游离siRNA或包覆的siRNA的施用剂量百分比的条形图。图2A显示了siRNA1递送的施用剂量百分比。当用IL部分包覆时，siRNA1的透皮递送显著增强。递送深度从左到右增加。裸FAM-siRNA1(空心条)，BDOA-FAM-siRNA1(阴影条)，BDTA-FAM-siRNA1(交叉阴影条)和BDSA-FAM-siRNA1(实心条)。误差条表示n＝3的平均值+SD。与裸FAM-siRNA1(空心条)相比，*p<0.05。图2B显示了siRNA2递送的施用剂量百分比。递送深度从左到右增加。裸FAM-siRNA2(空心条)，BDOA-FAM-siRNA2(阴影条)，BDTA-FAM-siRNA2(交叉阴影条)和BDSA-FAM-siRNA2(实心条)。误差条表示n＝3的平均值+SD。与裸siRNA2(空心条)相比，*p<0.05。

图3A、3B和3C是显示当细胞用各种浓度的以下各项培育时，在4小时培育后相对于对照的细胞活力百分比的线图：裸FAM-siRNA1和包覆的FAMsiRNA1(图3A)、单独的裸FAM-siRNA1和IL部分(图3B)或裸FAM-siRNA2和包覆的FAM-siRNA2(图3C)。误差条表示n＝6的平均值+SD。相对于对照(仅用培养基培育)，*p<0.05。

图4是显示当HEKa细胞用各种浓度(nM)的BDOA-FAM-siRNA1培育72小时时相对于对照的细胞活力百分比的线图。误差条表示n＝6的平均值+SD。相对于对照(仅用培养基培育)，*p<0.05。

图5是显示当HEKa细胞用各种siRNA1制剂培育或未经处理时GAPDH蛋白质水平(GAPDH/总蛋白质(相对于未处理的对照标准化))的变化的条形图。BDOA-siRNA1在体外在HEKa细胞中导致显著的基因沉默。GAPDH表达是相对于对照(仅用培养基培育的细胞)的。误差条表示n＝6的平均值+SD。相对于对照，*p<0.05。

图6是显示用各种siRNA制剂处理的皮肤细胞的活力百分比(相对于无UV对照)的变化的条形图。应用于MatTek Epiderm^TM组织后，BDOA-siRNA不会引起皮肤刺激。通过对照(未暴露于UV光的组织)使％活力标准化。误差条表示n＝3的平均值+SD。没有观察到统计学上显著的差异。

图7A是显示用各种siRNA制剂和UV处理、用UV和生理盐水处理或未处理(无UV)的MatTek Epiderm^TM组织中的标准化弹性蛋白酶水平的变化的条形图。图7B是显示用各种siRNA制剂和UV处理、用UV和生理盐水处理或未处理(无UV)的MatTek Epiderm^TM组织中的标准化弹性蛋白水平的变化的条形图。包覆的siRNA显著限制了在使用UVB光照射MatTek组织后弹性蛋白酶上调和随后的弹性蛋白降解。通过UV对照(暴露于UV光并用生理盐水处理的组织)使弹性蛋白酶表达标准化。通过无UV对照(未暴露于UV光的组织)使弹性蛋白表达标准化。误差条表示n＝3的平均值+SD。与UV；生理盐水对照相比，**p<0.01。与无UV对照相比，*p<0.05。

具体实施方式

I.定义

术语“烷基链”是指直链、支链和环状烃基。除非另有说明，否则烷基包括含有一个或多个双键或三键的烃基。含有至少一个环系的烷基是环烷基。含有至少一个双键的烷基是烯基，含有至少一个三键的烷基是炔基。

“核酸”是指由至少两个核苷酸制成的聚合物。核酸可以是单链的，如在RNA的情况下，或者是双链的，如在DNA的情况下。核酸可以由天然存在的核苷酸制成，或者可以含有一种或多种非天然核苷酸。核酸还可以包括核酸的衍生物和类似物，包括肽核酸(被嘌呤和嘧啶碱基取代的聚氨基酸序列)和二醇核酸(其中环状核糖组分被通过磷酸二酯键连接的非环状二醇或三醇置换)。

术语“多糖”是指由至少两个通过糖苷键连接的单糖单元制成的化合物。除非另有说明，否则多糖可仅含有糖组分，或者也可含有非糖组分，例如氨基酸和小分子糖苷配基。分子量大于约10,000Da的多糖可称为“高分子量多糖”，而分子量小于约10,000Da的多糖可称为“低分子量多糖”。多糖分子量可以使用本领域技术人员已知的标准方法测定，包括但不限于质谱法(例如，通过ESI或MALDI针对消化的片段的)或从已知的碳水化合物序列计算。多糖可以是天然存在的或非天然存在的、合成的或半合成的。

术语“蛋白质”是指通过肽键彼此连接以形成多肽的氨基酸聚合物，其链长度足以产生至少可检测的三级结构。分子量大于约100kDa的蛋白质可称为“高分子量蛋白质”，而分子量小于约100kDa的蛋白质可称为“低分子量蛋白质”。术语“低分子量蛋白质”排除了缺少被认为是蛋白质所必需的至少三级结构必需条件的小肽。蛋白质分子量可以使用本领域技术人员已知的标准方法测定，包括但不限于质谱法(例如，ESI、MALDI)或从已知氨基酸序列和糖基化计算。蛋白质可以是天然存在的或非天然存在的、合成的或半合成的。

“亲水性”是指具有易与水相互作用的强极性基团的物质。亲水性可通过测量其在水(或缓冲水溶液)和与水不混溶的有机溶剂(例如辛醇、二氯甲烷或甲基叔丁基醚)之间的分配系数来量化。如果在平衡后，在水中获得比在有机溶剂中更高浓度的化合物，则该化合物被认为是亲水的。例如，如果有机溶剂是辛醇，则负log P值表示该化合物是亲水的。

“疏水性”是指对水缺乏亲和力的物质；倾向于排斥并且不吸水以及不溶于水或与水混合。疏水性可以通过测量其在水(或缓冲水溶液)和与水不混溶的有机溶剂(例如辛醇、二氯甲烷或甲基叔丁基醚)之间的分配系数来量化。如果在平衡后，在有机溶剂中比在水中获得更高浓度的化合物，则该化合物被认为是疏水的。例如，如果有机溶剂是辛醇，那么正log P值表明该化合物是疏水的。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻所治疗的疾病状态或病况的一种或多种症状或以其他方式提供所需药理学和/或生理学作用的剂量。精确剂量取决于多种因素，例如受试者依赖性变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病或病症以及所施用的治疗。有效量的作用可以是相对于对照的。这些对照在本领域中是已知的并且在本文中讨论，并且可以是例如在药物或药物组合施用之前或不施用药物或药物组合时的受试者的状况，或者在药物组合的情况下，可以将组合的作用与仅施用一种药物的作用进行比较。

本文提供的数值范围包括给定范围内的所有值。除非另有说明，否则这包括给定的最小值、给定的最大值以及最小值和最大值之间的值。对于涉及整数的数值范围，除非另有说明，否则范围包括最小值和最大值之间的所有整数。

术语“约”的使用通常描述以约+/-10％的范围高于或低于规定值的值；在其他方面，值的范围可以是以约+/-5％的范围高于或低于规定值的值；在其他方面，值的范围可以是以约+/-2％的范围高于或低于规定值的值；在其他方面，值的范围可以是以约+/-1％的范围高于或低于规定值的值。前述范围旨在通过上下文清楚，并且不暗示进一步的限制。

II.组合物

本文所述的组合物包括大分子阴离子和具有烷基链的阳离子的络合物。该组合物适合局部施用于受试者，例如人或其他哺乳动物。该组合物通常是电荷中性的。

通常，络合物内的大分子阴离子和阳离子通过非共价相互作用相关联，例如氢键、范德华相互作用、静电相互作用和硬脂酸排列。该络合物形成离子液体组合物(IL)，其某些性质在公开号WO 2015/066647中公开，其相关部分通过引用并入本文。

大分子阴离子与具有烷基链长度的阳离子络合形成组合物，例如离子液体组合物。与具有烷基链的阳离子络合的特定大分子阴离子在本文中称为“包覆的阴离子”，例如包覆的siRNA。

A.离子液体

离子液体(IL)是结晶或无定形盐、两性离子或其混合物，其在处于或接近于大多数常规盐为固体的温度下为液体。例如，离子液体在低于200℃，或低于100℃，或低于80℃的温度下处于液态。一些离子液体的熔化温度在室温附近，例在10℃和40℃之间，或在15℃和35℃之间。

离子液体是有机盐或有机盐的混合物，它们在室温和标准压力下呈液态。

两性离子是整体中性带电分子，其在分子中的不同化学基团上带有形式正电荷和负电荷。离子液体的实例描述于Riduan等人,Chem.Soc.Rev.,42:9055-9070,2013；Rantwijk等人,Chem.Rev.,107:2757-2785,2007；Earle等人,Pure Appl.Chem.,72(7):1391-1398,2000；和Sheldon等人,Green Chem.,4:147-151,2002。

离子液体含有至少一种阴离子和至少一种阳离子组分。任选地，IL含有另外的氢键供体(即可以提供-OH或-NH基团的任何分子)，实例包括但不限于醇、脂肪酸和胺。

所述至少一种阴离子和至少一种阳离子组分可以任何摩尔比存在。示例性摩尔比(阳离子:阴离子)包括但不限于1:1、1:2、2:1、1:3、3:1、2:3、3:2和这些比例之间的范围。

在一些方面，IL组合物是深共晶溶剂(DES)。DES由形成共晶的混合物构成，其熔点远低于IL中的任一个单独组分。示例性DES包括但不限于油酸胆碱、己酸胆碱、香叶酸胆碱、丙二酸胆碱(丙二酸胆碱二钠)和脲-胆碱。在这些中，制剂是DES而不是真正的离子液体，因为过量的羧酸盐排除了1:1的离子配对。

1.大分子阴离子

络合物中大分子阴离子的分子量通常大于500Da，任选大于750Da、大于800Da、大于900Da、大于1kDa或大于5kDa。任选地，大分子阴离子的分子量大于10kDa、大于15kDa、大于20kDa、大于30kDa、大于40kDa。大分子阴离子的尺寸通常小于500kDa、400kDa、300kDa、100kDa，任选地小于50kDa。例如，大分子阴离子的分子量通常在500Da至50kDa、500Da至100kDa、500Da至300kDa、500Da至400kDa、500Da至500kDa、750Da至50kDa、750Da至100kDa、750Da至300kDa、750Da至400kDa、750Da至500kDa、800Da至50kDa、800Da至100kDa、800Da至300kDa、800Da至400kDa、800Da至500kDa、900Da至50kDa、900Da至100kDa、900Da至300kDa、900Da至400kDa、900Da至500kDa、1kDa至50kDa、1kDa至100kDa、1kDa至300kDa、1kDa至400kDa、1kDa至500kDa、5kDa至50kDa、5kDa至100kDa、5kDa至300kDa、5kDa至400kDa、5kDa至500kDa、10kDa至50kDa、10kDa至100kDa、10kDa至300kDa、10kDa至400kDa、10kDa至500kDa、15kDa至50kDa、15kDa至100kDa、15kDa至300kDa、15kDa至400kDa或15kDa至500kDa的范围内。

a.核酸

用于治疗、诊断、预防、营养或药物递送用途的任何核酸均可用于IL组合物中。合适的核酸包括互补DNA(cDNA)、DNA适体、DNA酶、RNA适体、外部指导序列、RNA干扰分子如小干扰RNA、反义RNA、短发夹RNA和微小RNA(miRNA)、吗啉代、信使RNA(mRNA)、长非编码RNA(IncRNA)、长基因间非编码RNA(lincRNA)以及核酶和形成三链体的分子。核酸一旦到达细胞内就能够调节基因的功能。

反义分子被设计成通过规范或非规范碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子和靶分子的相互作用被设计成通过例如RNAse H介导的RNA-DNA杂交降解促进靶分子的破坏，或者中断通常将在靶分子上发生的加工功能，例如转录或复制。优选地，反义分子以小于或等于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的解离常数(Kd)结合靶分子。

适体是长度为15-50个碱基的小核酸，其折叠成确定的二级和三级结构，例如茎环或G-四联体，并且进化为识别特定靶标。针对所需靶标进化适体的方法是本领域已知的。任选地，适体以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的Kd结合靶分子。优选地，适体可以极高程度的特异性结合靶分子。

优选的核酶切割RNA或DNA底物，更优选切割RNA底物。

形成三链体的核酸分子与双链或单链核酸相互作用。优选地，形成三链体的分子以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的Kd结合靶分子。

外部指导序列(EGS)结合形成络合物的靶核酸分子，其被RNase P识别，然后RNaseP切割靶分子。EGS可以被设计成特异性靶向选择的RNA分子。制备和使用EGS分子以促进多种不同靶分子的切割的方法是本领域已知的。

基因表达也可以通过RNA干扰(RNAi)以高度特异性方式有效沉默。小干扰RNA(siRNA)是一种双链RNA，其可以诱导序列特异性转录后基因沉默，从而减少或甚至抑制基因表达。使用合成的短双链RNA可以在哺乳动物细胞中实现序列特异性基因沉默，所述合成的短双链RNA模拟由酶Dicer产生的siRNA(Elbashir等人,Nature,411:494498(2001))(Ui-Tei等人,FEBSLett 479:79-82(2000))。siRNA可以是化学合成或体外合成的，或者可以是短双链发夹样RNA(shRNA)在细胞内加工成siRNA的结果。通常使用算法和常规DNA/RNA合成仪设计合成的siRNA。供应商包括(Austin,Texas)、(Ashland,Massachusetts)、(Lafayette,Colorado)、Glen Research(Sterling,Virginia)、MWB Biotech(Esbersberg,Germany)、(Boulder,Colorado)和(Dusseldorf,Germany)。siRNA也可以使用试剂盒在体外合成，例如Ambion的siRNA构建试剂盒。

其他有用的核酸分子包括CRISPR、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锁核酸(LNA)即修饰的RNA核苷酸(参见例如，Braasch等人,Chem.Biol.,8(1):1-7(2001))、肽核酸(PNA)。

CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复序列，Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats)是含有碱基序列的多个短定向重复的DNA基因座的首字母缩略词。在WO 2013/176772和WO 2014/018423中详细描述了使用CRISPR/Cas系统制备用于基因组编辑的组合物的方法。

示例性ZFN公开于例如美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等人Proc.,Natl.Acad.Sci.USA 89(1992):4275-4279；Li等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2764-2768(1993)；Kim等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:883-887(1994a)；Kim等人J.Biol.Chem.269:31,978-31,982(1994b)。

TALEN具有与ZFN类似的整体结构，主要区别在于DNA结合结构域来自TAL效应蛋白，转录因子来自植物病原菌。工程化TAL以与特定核酸结合的方法描述于Cermak等人,Nucl.Acids Res.1-11(2011)；美国公开申请号2011/0145940和Miller等人NatureBiotechnol.,29:143(2011)。TALEN结合结构域的一般设计原理可以在例如WO2011/072246中找到。

用于化学组装PNA的方法是已知的。参见例如，美国专利号5,539,082；5,527,675；5,623,049；5,714,331；5,736,336；5,773,571；和5,786,571。

基于吗啉代的亚基的性质通常包括：通过稳定的不带电荷的主链键联以寡聚形式连接的能力；支持核苷酸碱基(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷、尿嘧啶或肌苷)的能力，使得形成的聚合物可以与具有高解链温度的互补碱基靶核酸(包括靶RNA)杂交，甚至与短至10-14个碱基的寡聚物杂交；寡聚物被主动运输到哺乳动物细胞中的能力；和寡聚物:RNA异源双链体抵抗RNA酶降解的能力。

b.载体

合适的病毒载体包括重组逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和杆状病毒。这些表达载体是本领域熟知的(Boeckle和Wagner,The AAPS Journal,8(4):E731-E742(2006)；Hu,Acta Pharmacologica Sinica,26(4):405-416(2005))。包括质粒、粘粒、噬菌粒及其等同物的细菌表达载体是本领域已知的，并在T.A.Brown.Chapter 2-Vectors forGene Cloning:Plasmids and Bacteriophages.Gene Cloning and DNA Analysis:AnIntroduction(第6版).(2010)Wiley-Blackwell.ISBN 978-1405181730中详细讨论。

c.肽和蛋白质

在某些方面，大分子阴离子是肽或蛋白质。合适的肽或蛋白质包括引入健康或患病皮肤细胞所需或期望的任何肽或蛋白质。例如，赋予皮肤细胞抗衰老、抗炎、抗原、抗增殖或抗细胞凋亡反应的肽可适合作为大分子阴离子。

合适的肽和蛋白质包括结构蛋白质，例如胶原蛋白；酶，例如藻酸酶、DNA酶、RNA酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶、脂肪酶；病毒抗原；细菌抗原；真菌抗原；干扰素；细胞因子；肿瘤抗原，例如黑素瘤相关抗原(MAGE)等。

d.多糖

在某些方面，大分子阴离子可以是多糖。多糖可包括中性、带正电或带负电的单糖单元，条件是多糖具有净负电荷。一种或多种单糖单元可以是直链或环状的。环状单元可以是α-端基异构体或β-端基异构体和L-异构体或D-异构体的任何组合。多糖可以是天然存在的或合成衍生的。

多糖的分子量可为约1kDa至约2,000kDa(包括端值)，约1kDa至约100kDa(包括端值)，约1kDa至约50kDa(包括端值)，约1kDa至约20kDa(包括端值)，约3kDa至约6kDa(包括端值)或约10kDa至20kDa(包括端值)。在一些方面，多糖的分子量可大于500kDa、大于750kDa或甚至大于2,000kDa。

某些多糖的分子量可为约500kDa至约2,000kDa(包括端值)，约500kDa至约750kDa(包括端值)，或约750kDa至约2,000kDa(包括端值)。在其他方面，多糖的分子量可小于1,000Da，优选地在约300Da和约1,000Da之间，包括端值。

优选的碳水化合物包括糖胺聚糖(GAG)，包括但不限于低分子量肝素(LMWH)、未分级肝素(UFH)、软骨素、角蛋白和透明质酸(Yip等人,Molecular Cancer Therapeutics,2006,5:2139-2148)。

其他有用的多糖包括奈帕朗尼(necuparanib)(M402，Momenta Pharmaceuticals,Inc.)，硫酸肝素或未分级肝素(UFH)，低分子量肝素(LMWH)，例如依诺肝素(enoxaparin)达肝素(dalteparin)那屈肝素钙(nadroparin calcium)亭扎肝素(tinzaparin)阿地肝素(ardeparin)德林戈肝素(delingoparin)、贝米肝素(bemiparin)、瑞维肝素(reviparin)或舍托肝素(certoparin)，或非抗凝血肝素，例如O-脱硫肝素(ODSH)、舒洛地昔(sulodexide)、可德兰硫酸盐(curdlan sulfate)、阿卡波糖(acarbose)磺达肝素(fondaparinux)透明质酸钠赛乐辛(cylexin)(CY-1503)、瑞维潘赛(rivipansel)(GMI-1070)、GSC-150、Manα(1-2)Man、唾液酸化路易斯^a、唾液酸化路易斯^x及其模拟物、GQ1bα及其模拟物、和路易斯^a及其模拟物(Ernst等人,Nature Reviews Drug Discovery,2009,8:661-77)、舒洛地昔(Keryx Biopharmaceuticals)。

在其他方面，多糖可以是植物或真菌衍生的化合物，例如果胶、半乳甘露聚糖/甘露聚糖、木葡聚糖或β-葡聚糖/香菇多糖。其它合适的多糖包括脱壳聚糖、褐藻糖胶、半乳聚糖、角叉菜胶、k-角叉菜胶、半乳岩藻多糖、甘露葡糖醛酸岩藻多糖、阿拉伯半乳聚糖、硫酸木甘聚糖、木半乳岩藻多糖、石莼聚糖、葡聚糖及其衍生物，以及其他化合物，例如Chattopadhyay,International Journal ofPolymer Science,2010,2010:1-7；或Patel,3Biotech,2012,2:171-185)所述。

多糖，即肝素、依诺肝素、达肝素、那屈肝素、亭扎肝素和德林戈肝素、ODSH、非抗凝血肝素和舒洛地昔已经在临床试验中测试了在不孕症、吸入性损伤、炎症、外阴痛、溃疡性结肠炎、糖尿病足部溃疡、妊娠并发症、烧伤、囊性纤维化、肺部病况、分娩、微量白蛋白尿、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺癌和血管闭塞性癌症，以及结肠腺癌等病况中的疗效(Page,ISRNPharmacology,2013,2013:1-13)。

褐藻糖胶已由于抗氧化、免疫刺激、降脂、抗菌和抗过敏作用而被注意。褐藻糖胶和石莼聚糖也用于纳米医学中用于伤口愈合，以及用于体外和体内控制的药物释放(Patel,3Biotech,2012,2:171-185)。

半乳聚糖、角叉菜胶和k-角叉菜胶表现出抗氧化、免疫刺激、消炎和抗伤痛感受、抗凝血和抗病毒作用。半乳岩藻多糖和甘露葡糖醛酸岩藻多糖可能具有抗肿瘤作用。阿拉伯半乳聚糖可能具有抗凝血和抗血栓作用。硫酸木甘聚糖和木半乳岩藻多糖表现出抗病毒作用，特别是对抗流感、疱疹和人类免疫缺陷病毒等病毒(Patel,3Biotech,2012,2:171-185)。

葡聚糖是支链多糖。葡聚糖及其许多天然存在的和合成的衍生物都表现出抗血栓形成活性。

用于局部施用于受试者的一组特定多糖包括多糖，例如海藻酸盐、琼脂、海藻酸(对齐)、角叉菜胶、几丁质、壳聚糖、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖(CM-葡聚糖)、几丁质-葡聚糖、羧甲基纤维素(CMC)、糊精、糖原、瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、蜂蜜、羟丙基淀粉磷酸酯、透明质酸、羟乙基纤维素、甲基纤维素、粘多糖(葡糖胺聚糖)、果胶、糖表面活性剂、海藻多糖、岩藻聚糖、褐藻糖胶、黄芪胶(E 413)、黄原胶、它们的衍生物和它们的组合，优选透明质酸。

在其他方面，多糖可以与活性剂缀合，例如疫苗、蛋白质或小分子。可以与多糖缀合的示例性疫苗包括嗜血杆菌b、肺炎球菌和脑膜炎球菌疫苗。可以与多糖缀合的示例性蛋白质包括天花粉蛋白、表皮生长因子和抗癌酶天冬酰胺酶和羧肽酶G2。可以与多糖缀合的示例性小分子治疗剂包括多柔比星(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)、喜树碱(camptothecin)、丝裂霉素(mitomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和紫杉醇(paclitaxel)。

2.阳离子

络合物中合适的具有烷基链的阳离子包括阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂具有以下通式：

其中Q是氮(N)或磷(P)，

其中R₁、R₂、R₃和R₄独立地是不存在的、氢、经取代的烷基、未经取代的烷基、经取代的烯基、未经取代的烯基、经取代的炔基、未经取代的炔基、经取代的烷氧基、未经取代的烷氧基、经取代的氨基、未经取代的氨基、经取代的烷基氨基、未经取代的烷基氨基、经取代的烷硫基、或未经取代的烷硫基、经取代的芳基、未经取代的芳基、经取代的杂芳基、未经取代的杂芳基、经取代的C₃-C₃₀环烷基、未经取代的C₃-C₃₀环烷基、经取代的杂环基、未经取代的杂环基，以及任何一对R₁、R₂、R₃和R₄独立地组合形成五元和/或六元环，其中由任何一对R₁、R₂、R₃和R₄组合形成的五元和/或六元环任选地包括另外的杂原子。

在一些方面，通过组合任何一对R₁、R₂、R₃和R₄，任选地包括另外的杂原子形成的五元和/或六元环，可以是杂环或杂芳族的。

在一些方面，阳离子表面活性剂具有上述式I的通式，不同之处在于阳离子表面活性剂不是十六烷基三甲基铵、癸基三甲基铵、苄基二甲基十二烷基铵、肉豆蔻基三甲基铵或十二烷基吡啶鎓。

在一些方面，阳离子表面活性剂具有上述式I的通式，并且R₁、R₂、R₃和R₄中的至少一个独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基。

在一些方面，阳离子表面活性剂具有上述式I的通式，并且R₁、R₂、R₃和R₄中的至少一个独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，并且不同之处在于阳离子表面活性剂不是苄基二甲基十二烷基铵。

在一些方面，阳离子表面活性剂具有上述式I的通式，并且R₁独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，R₂、R₃和R₄独立地是经取代的烷基或未经取代的烷基，条件是当R₂、R₃和R₄是经取代的烷基时，经取代的烷基不是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基。

在一些方面，阳离子表面活性剂具有上述式I的通式，并且R₁独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，R₂、R₃和R₄独立地是经取代的烷基或未经取代的烷基，条件是当R₂、R₃和R₄是经取代的烷基时，经取代的烷基不是经取代的芳烷基或未取代的芳烷基，条件是阳离子表面活性剂不是苄基二甲基十二烷基铵。

上述任何阳离子表面活性剂可包括各种长度(即链长度)的碳链，如链内最长数目的连续键合的碳原子所定义。链长度可以在三至二十个碳原子之间，包括端值。

在一些方面，链长度变化并且可取决于大分子阴离子的总电荷以形成电荷中性、疏水性、对皮肤无刺激性的络合物。

在一些方面，形成络合物的阳离子表面活性剂具有如下所示的式：

其中n是三至十九之间的任何整数，包括三或十九。式II范围内的阳离子表面活性剂的实例示于表4和5中。

在一些方面，络合物中的阳离子表面活性剂具有式II的式，不同之处在于阳离子表面活性剂不是苄基二甲基十二烷基铵。

在一些方面，络合物中的阳离子表面活性剂具有式II的式，其中n为6、12或16。这些阳离子表面活性剂通常也分别称为苄基二甲基辛基铵、苄基二甲基十四烷基铵或苄基二甲基硬脂基铵。

阳离子表面活性剂中碳链的长度可以影响阳离子:阴离子络合物的疏水性、阳离子:阴离子络合物的流体动力学尺寸和络合物的聚集效力。例如，实例1、表2和3以及图1显示，虽然阴离子保持不变(siRNA1)，但烷基链长度的长度影响络合物的疏水性、流体动力学尺寸和聚集性质。

应理解，阳离子表面活性剂的属或本文所述或本文表或实例中提及的特定阳离子表面活性剂可以被具体包括、排除或以任何组合与阴离子大分子的属或本文所述或本文表或实例中提及的特定阴离子大分子组合。

C.任选的其他治疗剂、诊断剂、预防剂和/或营养剂

除了上述络合物之外，组合物还任选地包括一种或多种另外的化学或生物分子，其在体内提供治疗、诊断、预防或营养作用。基于待治疗或预防的疾病或病症选择分子(在本文中也称为“药物”)。药物可以是小分子或大分子，例如蛋白质或肽。

组合物中可以包括多种药物作为另外的药剂(即除了络合物中的药剂之外)。

虽然组合物通常是电荷中性的，但另外的药物可带正电荷或带负电荷并含有其自身的抗衡离子，其可以与用于中和大分子离子的抗衡离子相同或不同。用于中和药物的合适抗衡离子包括适用于生物学应用的离子，例如钠、钙、镁、氯离子、磷酸根、硫酸根等。

或者，另外的药物可以是电荷中性的。

预期用于组合物的药物包括但不限于以下类别和药物的实例以及这些药物的替代形式，例如替代盐形式、游离酸形式、游离碱形式和水合物：

镇痛剂/退热剂(例如阿司匹林(aspirin)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生钠(naproxen sodium)、丁基原啡因(buprenorphine)、盐酸右丙氧芬(propoxyphene hydrochloride)、萘磺酸右丙氧芬(propoxyphene napsylate)、盐酸哌替啶(meperidine hydrochloride)、盐酸氢吗啡酮(hydromorphone hydrochloride)、吗啡(morphine)、羟考酮(oxycodone)、可待因(codeine)、重酒石酸二氢可待因(dihydrocodeine bitartrate)、戊唑星(pentazocine)、重酒石酸氢可酮(hydrocodonebitartrate)、左啡诺(levorphanol)、二氟尼柳(diflunisal)、水杨酸三乙醇胺(trolaminesalicylate)、盐酸纳布啡(nalbuphine hydrochloride)、甲芬那酸(mefenamic acid)、布托啡诺(butorphanol)、水杨酸胆碱、布他比妥(butalbital)、柠檬酸苯托沙敏(phenyltoloxamine citrate)、柠檬酸苯海拉明(diphenhydramine citrate)、左美丙嗪(methotrimeprazine)、盐酸桂麻磺碱(cinnamedrine hydrochloride)和甲丙氨酯(meprobamate))；

抗生素(例如新霉素(neomycin)、链霉素(streptomycin)、氯霉素(chloramphenicol)、头孢菌素(cephalosporin)、氨苄青霉素(ampicillin)、青霉素(penicillin)、四环素(tetracycline)和环丙沙星(ciprofloxacin))；

抗糖尿病药(例如双胍类和磺酰脲类衍生物)；

抗真菌剂(例如灰黄霉素(griseofulvin)、酮康唑(ketoconazole)、伊曲康唑(itraconizole)、两性霉素B(amphotericin B)、制霉菌素(nystatin)和杀假丝菌素(candicidin))；

抗高血压药(例如普萘洛尔(propranolol)、普罗帕酮(propafenone)、氧烯洛尔(oxyprenolol)、硝苯地平(nifedipine)、利血平(reserpine)、咪噻吩(trimethaphan)、苯氧苄胺(phenoxybenzamine)、盐酸帕吉林(pargyline hydrochloride)、地舍平(deserpidine)、二氮嗪(diazoxide)、胍乙啶单硫酸盐(guanethidine monosulfate)、米诺地尔(minoxidil)、利血胺(rescinnamine)、硝普钠(sodium nitroprusside)、蛇根木(rauwolfia serpentina)、阿舍西隆(alseroxylon)和酚妥拉明(phentolamine))；

抗炎药(例如(非甾体)吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、萘普生(naproxen)、布洛芬、雷米芬酮(ramifenazone)、吡罗昔康(piroxicam)、(甾体)可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氟扎可特(fluazacort)、塞来昔布(celecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松龙(prednisolone)和泼尼松(prednisone))；

抗肿瘤药(例如环磷酰胺(cyclophosphamide)、放线菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、丝裂霉素、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine，BCNU)、甲基-CCNU、顺铂、依托泊苷(etoposide)、喜树碱及其衍生物、苯芥胆甾醇(phenesterine)、紫杉醇及其衍生物、多西紫杉醇(docetaxel)及其衍生物、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、他莫昔芬(tamoxifen)和哌泊舒凡(piposulfan))；

免疫抑制剂(例如环孢菌素(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、咪唑立宾(mizoribine)和FK506(他克莫司(tacrolimus)))；

抗偏头痛剂(例如麦角胺(ergotamine)、普萘洛尔、半乳糖二酸异美汀(isometheptene mucate)和氯醛比林(dichloralphenazone))；

抗心绞痛剂(例如β-肾上腺素能阻断剂；钙通道阻断剂如硝苯地平(nifedipine)和地尔硫卓(diltiazem)；和硝酸盐如硝酸甘油、二硝酸异山梨醇酯、季戊四醇四硝酸酯和赤藓醇四硝酸酯)；

抗关节炎剂(例如保泰松(phenylbutazone)、舒林酸(sulindac)、青霉胺(penicillamine)、双水杨酸酯(salsalate)、吡罗昔康、硫唑嘌呤、吲哚美辛、甲氯芬那酸(meclofenamate)、硫代苹果酸金钠(gold sodium thiomalate)、酮洛芬、金诺芬(auranofin)、金硫葡糖(aurothioglucose)和托美汀钠(tolmetin sodium))；

抗痛风剂(例如秋水仙碱(colchicine)和别嘌呤醇(allopurinol))；

抗凝血剂(例如肝素、肝素钠和华法林钠(warfarin sodium))；

血栓溶解剂(例如尿激酶、链激酶和阿替普酶(alteplase))；

抗纤维蛋白溶解剂(例如氨基己酸)；

血液流变剂(例如己酮可可碱(pentoxifylline))；

抗血小板剂(例如阿司匹林)；

抗组胺剂/止痒剂(例如羟嗪(hydroxyzine)、苯海拉明(diphenhydramine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、马来酸溴苯那敏(brompheniramine maleate)、盐酸赛庚啶(cyproheptadine hydrochloride)、特非那定(terfenadine)、富马酸氯马斯汀(clemastine fumarate)、曲普利啶(triprolidine)、卡比沙明(carbinoxamine)、二苯拉林(diphenylpyraline)、苯茚胺(phenindamine)、阿扎他定(azatadine)、曲吡那敏(tripelennamine)、右旋氯苯那敏马来酸盐(dexchlorpheniramine maleate)、甲地嗪(methdilazine)和)；

用于钙调节的药剂(例如降钙素(calcitonin)和甲状旁腺激素)；

抗菌剂(例如阿米卡星硫酸盐(amikacin sulfate)、氨曲南(aztreonam)、氯霉素、氯霉素棕榈酸酯(chloramphenicol palmitate)、环丙沙星(ciprofloxacin)、克林霉素(clindamycin)、克林霉素棕榈酸酯(clindamycin palmitate)、克林霉素磷酸酯(clindamycin phosphate)、甲硝唑(metronidazole)、盐酸甲硝唑(metronidazolehydrochloride)、硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)、盐酸林可霉素(lincomycinhydrochloride)、硫酸妥布霉素(tobramycin sulfate)、盐酸万古霉素(vancomycinhydrochloride)、硫酸多粘菌素B(polymyxin B sulfate)、多粘菌素钠(colistimethatesodium)和硫酸粘杆菌素(colistin sulfate))；

抗病毒剂(例如干扰素α、β或γ、齐多夫定(zidovudine)、盐酸金刚烷胺(amantadine hydrochloride)、利巴韦林(ribavirin)和阿昔洛韦(acyclovir))；

抗微生物剂(例如头胞菌素，如头孢唑林钠(cefazolin sodium)、头孢拉定(cephradine)、头孢克洛(cefaclor)、头孢匹林钠(cephapirin sodium)、头孢唑肟钠(ceftizoxime sodium)、头孢哌酮钠(cefoperazone sodium)、头孢替坦二钠(cefotetandisodium)、头孢呋辛(cefuroxime e azotil)、头孢噻肟钠(cefotaxime sodium)、头孢羟氨苄一水合物(cefadroxil monohydrate)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢噻吩钠(cephalothin sodium)、盐酸头孢氨苄一水合物(cephalexin hydrochloridemonohydrate)、头孢孟多酯钠(cefamandole nafate)、头孢西丁钠(cefoxitin sodium)、头孢尼西钠(cefonicid sodium)、头孢雷特(ceforanide)、头孢曲松钠(ceftriaxonesodium)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢拉定(cephradine)和头孢呋辛钠(cefuroxime sodium)；青霉素，如氨苄青霉素、阿莫西林(amoxicillin)、苄星青霉素G(penicillin G benzathine)、环青霉素(cyclacillin)、氨苄青霉素钠、青霉素G钾、青霉素V钾、哌拉西林钠(piperacillin sodium)、苯唑西林钠(oxacillin sodium)、盐酸巴坎西林(bacampicillin hydrochloride)、氯唑西林钠(cloxacillin sodium)、替卡西林二钠(ticarcillin disodium)、阿洛西林钠(azlocillin sodium)、羧苄西林茚满钠(carbenicillin indanyl sodium)、青霉素G普鲁卡因(penicillin G procaine)、甲氧西林钠(methicillin sodium)和萘夫西林钠(nafcillin sodium)；红霉素(erythromycin)，如琥乙红霉素(erythromycin ethylsuccinate)、红霉素、依托红霉素(erythromycinestolate)、乳糖酸红霉素(erythromycin lactobionate)、硬脂酸红霉素(erythromycinstearate)和琥乙红霉素(erythromycin ethylsuccinate)；和四环素，如盐酸四环素、盐酸强力霉素(doxycycline hyclate)和盐酸米诺环素(minocycline hydrochloride)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin))；

抗感染药(例如GM-CSF)；

甾族化合物、激素和激素类似物(例如肠降血糖素(incretin)和肠降血糖素模拟物，如GLP-1和艾塞那肽(exenatide)；雄激素，如达那唑(danazol)、环戊丙酸睾酮(testosterone cypionate)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、乙睾酮(ethyltestosterone)、庚酸睾酮(testosterone enathate)、甲睾酮(methyltestosterone)和氟甲睾酮；雌激素，如雌二醇(estradiol)、雌酮硫酸酯哌嗪(estropipate)和结合雌激素；孕激素，如乙酸甲氧基孕酮(methoxyprogesterone acetate)和乙酸炔诺酮(norethindrone acetate)；皮质类固醇，如曲安西龙(triamcinolone)、倍他米松(betamethasone)、倍他米松磷酸钠(betamethasone sodium phosphate)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松磷酸钠(dexamethasone sodium phosphate)、乙酸地塞米松(dexamethasone acetate)、泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松龙乙酸酯悬浮液(methylprednisolone acetate suspension)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、甲基泼尼龙(methylprednisolone)、泼尼松龙磷酸钠(prednisolone sodium phosphate)、甲基泼尼松龙琥珀酸钠(methylprednisolonesodium succinate)、氢化可的松琥珀酸钠(hydrocortisone sodium succinate)、己曲安奈德(triamcinolone hexacetonide)、氢化可的松(hydrocortisone)、氢化可的松环戊丙酸酯(hydrocortisone cypionate)、泼尼松龙(prednisolone)、乙酸氟氢可的松(fludrocortisone acetate)、乙酸帕拉米松(paramethasone acetate)、泼尼松龙乙酸特丁酯(prednisolone tebutate)和乙酸泼尼松龙(prednisolone acetate)；和甲状腺激素，如左甲状腺素钠(levothyroxine sodium))；

降血糖剂(例如人胰岛素、纯化的牛胰岛素、纯化的猪胰岛素、重组产生的胰岛素、胰岛素类似物、格列本脲(glyburide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列吡嗪(glipizide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)和妥拉磺脲(tolazamide))；

降血脂剂(例如氯贝特(clofibrate)、右旋甲状腺素钠(dextrothyroxinesodium)、普罗布考(probucol)、普伐他汀(pravastitin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)和烟酸(niacin))；

用于红细胞生成刺激的药剂(例如促红细胞生成素)；

油溶性维生素(例如维生素A、D、E、K等)；

以及其他药物，如米托坦(mitotane)、卤代亚硝脲(halonitrosourea)、蒽环霉素(anthrocycline)和玫瑰树碱(ellipticine)。

这些和其他类别的有用药物的描述以及每个类别中的物种列表可见于Martindale,The Extra Pharmacopoeia,第30版(The Pharmaceutical Press,London1993)，其公开内容通过引用整体并入本文。

D.示例性络合物

上述阴离子和阳离子可以组合形成IL。例如，核酸、载体、阴离子肽或蛋白质、阴离子多糖及其组合可与式I的阳离子组合。示例性络合物包括：

(i)siRNA和阳离子表面活性剂的示例性络合物

在一些形式中，IL含有如上所述与式I的阳离子表面活性剂络合的siRNA，(i)不同之处在于阳离子表面活性剂不是十六烷基三甲基铵、癸基三甲基铵、苄基二甲基十二烷基铵、肉豆蔻基三甲基铵或十二烷基吡啶鎓；(ii)R₁、R₂、R₃和R₄中的至少一个独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基；(iii)R₁、R₂、R₃和R₄中的至少一个独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，并且其中阳离子表面活性剂不是苄基二甲基十二烷基铵；(iv)R₁独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，R₂、R₃和R₄独立地是经取代的烷基或未经取代的烷基，条件是当R₂、R₃和R₄是经取代的烷基时，经取代的烷基不是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基；或(iv)R₁独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，R₂、R₃和R₄独立地是经取代的烷基或未经取代的烷基，条件是当R₂、R₃和R₄是经取代的烷基时，经取代的烷基不是经取代的芳烷基或未取代的芳烷基，并且其中阳离子表面活性剂不是苄基二甲基十二烷基铵。

在一些形式中，IL含有与式II的阳离子表面活性剂络合的siRNA

其中n是三至十九之间的任何整数，包括三或十九，不同之处在于阳离子表面活性剂不是苄基二甲基十二烷基铵，其中siRNA选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及其组合。

在一些形式中，IL含有与阳离子表面活性剂络合的siRNA，所述阳离子表面活性剂选自羟乙基三甲基铵、十四烷基三甲基铵、苄基二甲基十四烷基铵、苄基二甲基硬脂基铵及其组合，其中siRNA选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及其组合。

在一些形式中，IL含有与选自苄基二甲基十四烷基铵、苄基二甲基硬脂基铵及其组合的阳离子表面活性剂络合的siRNA，其中siRNA选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及其组合。

(ii)阴离子多糖和阳离子表面活性剂的示例性络合物

在一些形式中，IL含有与式I的阳离子表面活性剂络合的阴离子多糖。

在一些形式中，IL含有如上所述与式I阳离子表面活性剂络合的阴离子多糖(例如透明质酸、海藻酸盐、海藻酸、糖胺聚糖等)，不同之处在于(i)阳离子表面活性剂不是十六烷基三甲基铵、癸基三甲基铵、苄基二甲基十二烷基铵、肉豆蔻基三甲基铵或十二烷基吡啶鎓；(ii)R₁、R₂、R₃和R₄中的至少一个独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基；(iii)R₁、R₂、R₃和R₄中的至少一个独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，并且其中阳离子表面活性剂不是苄基二甲基十二烷基铵；(iv)R₁独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，R₂、R₃和R₄独立地是经取代的烷基或未经取代的烷基，条件是当R₂、R₃和R₄是经取代的烷基时，经取代的烷基不是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基；或(iv)R₁独立地是经取代的烷基，其中经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，R₂、R₃和R₄独立地是经取代的烷基或未经取代的烷基，条件是当R₂、R₃和R₄是经取代的烷基时，经取代的烷基不是经取代的芳烷基或未取代的芳烷基，并且其中阳离子表面活性剂不是苄基二甲基十二烷基铵。

在一些形式中，IL含有透明质酸、海藻酸盐、海藻酸、糖胺聚糖及其组合，优选透明质酸，与式II的阳离子表面活性剂络合

其中n是三至十九之间的任何整数，包括三或十九，不同之处在于阳离子表面活性剂不是苄基二甲基十二烷基铵。

在一些形式中，IL含有透明质酸、海藻酸盐、海藻酸、糖胺聚糖及其组合，优选透明质酸，与选自羟乙基三甲基铵、十四烷基三甲基铵、苄基二甲基十四烷基铵、苄基二甲基硬脂基铵及其组合的阳离子表面活性剂络合。

在一些形式中，IL含有与选自羟乙基三甲基铵、十四烷基三甲基铵、苄基二甲基十四烷基铵、苄基二甲基硬脂基铵及其组合的阳离子表面活性剂络合的透明质酸。

E.组合物的性质

阳离子和大分子阴离子形成络合物，其通常是电荷中性的，足够疏水以穿过皮肤屏障并进入皮肤细胞。另外，组合物通常对皮肤无刺激性。

1.电荷中性

通常，组合物是电荷中性的。

在组合物中包含的络合物中，可以含有各种烷基链长度的阳离子和大分子阴离子通常以1:1的电荷比混合。然而，可使用其他电荷比混合各种烷基链长度的阳离子和大分子阴离子，例如，合适的电荷比(大分子阴离子上的电荷与烷基链阳离子上的电荷)包括0.5:1、1:1或2:1，以及它们之间的比率。在一些方面，各种烷基链长度的阳离子和大分子阴离子以1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1的摩尔比，或任何合适的摩尔比混合以赋予整个络合物电荷中性。当大分子阴离子上的电荷与烷基链阳离子上的电荷的比率偏离一(1:1)时，额外的抗衡离子可以足以中和络合物上的电荷的量存在。用于中和药物的合适抗衡离子包括适用于生物学应用的离子，例如钠、钙、镁、氯离子、磷酸根、硫酸根等。

除了络合物中的那些离子之外，还可以通过包含其他离子来赋予组合物的电荷中性。例如，可以将大分子离子络合物悬浮或溶解在缓冲液中，例如磷酸盐缓冲盐水。

2.络合物在组合物中的疏水性

形成的络合物的疏水性可以通过以Log₁₀值表示的辛醇/水分配系数(P_o/w)表征(表2)。通常，具有不同烷基链长度的阳离子和大分子阴离子的络合物的疏水性由其辛醇/水分配系数(P_o/w)确定，比大分子阴离子与钠离子络合时的疏水性大至少一个Log(10)单位(LogP_o/w)。

在一些方面，由其辛醇/水分配系数确定的大分子阴离子的疏水性增加了一至五个Log(10)单位(Log P_o/w)的因数。

为了确定络合物中给定大分子阴离子的疏水性，可以确定在感兴趣的络合物中大分子阴离子的Log P_o/w，并与相同的大分子阴离子在与钠离子络合时的Log P_o/w进行比较。可以使用任何标准测试来测量P_o/w分配系数。以下提供示例性测试。

可以在室温下将5mL ddH₂O与5mL辛醇混合过夜。然后将含有与钠离子或与具有烷基链的阳离子络合的大分子阴离子的络合物加入混合物中，并再次在室温下在黑暗中混合过夜。培育过夜后，将溶液离心以分离辛醇层和水层。存在于各层中的大分子阴离子的浓度通过UV-Vis光谱法或荧光光谱法使用例如SAFIRE、XFLUOR4、V4.50酶标仪(Tecan GroupLtd,Morrisville,NY)定量。为了检测siRNA，可以在485nm的激发和520nm的发射下进行荧光检测，并且可以验证该方法的线性、准确度和精确度。Log P_o/w可以作为辛醇层与水层相比的荧光比率的对数加以计算。

3.对皮肤无刺激性

本文所述的组合物通常对皮肤无刺激性。IL中的每种组分(即阴离子和阳离子组分)本身可能刺激皮肤。然而，当施用于皮肤表面时，组合物中包含的络合物中使用的离子组分的组合不具有刺激性，或基本上无刺激性(即，最多导致最小的皮肤反应)。

组合物可引起最小的皮肤反应或没有皮肤反应，例如发红、皮疹、瘙痒、灼热或刺痛感。最小的皮肤反应可以被理解为具有刺激迹象的轻微皮肤反应，但是对于受试者而言不是不舒服或疼痛的。

例如，即使当大分子阴离子和单独的阳离子中的任一种或两种刺激皮肤时，组合物对皮肤也是无刺激性的。

通常，组合物对皮肤细胞无毒。当施用于皮肤时，组合物不会在健康皮肤细胞中引起任何不良反应，例如健康皮肤细胞活力的降低。

例如，组合物在体外或体内对健康皮肤细胞的细胞毒性和与钠阳离子络合的大分子阴离子的体外或体内细胞毒性基本上相同。

4.运输通过皮肤层

通常，组合物具有足够的疏水性以运输通过一个或多个皮肤屏障层(例如SC)和/或通过一个或多个皮肤细胞层(例如表皮和真皮)而不需要额外的皮肤处理来增加其孔隙率，或推动组合物通过SC和/或皮肤的一个或多个附加层。

人体皮肤可分为表皮和真皮。这些组分中的每一个都细分为多个层。

a.运输通过表皮

表皮分为五个亚层：角质层、透明层、颗粒层、棘层和生发层(也称为“基底层”)。表皮没有血管，并且通过真皮的扩散得到滋养。

表皮被分成几层细胞，这些细胞通过最内层的有丝分裂形成。当它们分化并充满角蛋白时，它们向上移动地层改变形状和组成。它们最终到达称为角质层的顶层，其充当皮肤屏障层，并且脱落。表皮的最外层由25至30层死细胞组成。

本文所述的络合物能够运输通过表皮的五个不同亚层并到达真皮。通常，在局部施用于皮肤后，与具有烷基链的阳离子络合的大分子阴离子运输通过角质层并到达表皮的各个亚层，其量大于当与钠离子络合时局部施用相同的大分子阴离子后获得的量。与具有烷基链的阳离子络合的大分子阴离子可以在局部施用后通过一层或多层皮肤，例如表皮的一层或多层，甚至通过一层或多层真皮。

在这些方面，组合物通过皮肤的一层或多层的量大于当与钠离子络合时局部施用相同的大分子阴离子后获得的量。

任选地，在局部施用后，与具有烷基链的阳离子络合的大分子阴离子通过皮肤的所有层。在这方面，组合物通过皮肤的所有层的量大于当与钠离子络合时局部施用相同的大分子阴离子后获得的量。

b.运输进入真皮

真皮是在由上皮组织组成的表皮下面的皮肤层。真皮在结构上分为两个区域：与表皮相邻的称为乳头状区域的表面区域，以及称为网状区域的深层较厚的区域。

真皮通过基底膜与表皮紧密连接。它还拥有许多神经末梢，提供触觉和热量。它包含毛囊、汗腺、皮脂腺、顶泌腺、淋巴管和血管。真皮中的血管提供营养并从其自身细胞以及表皮的基底层清除废物。

优选地，在将组合物局部施用于皮肤后，与具有烷基链的阳离子络合的大分子阴离子运输通过表皮并进入一层或多层真皮中，其量大于当与钠离子络合时局部施用相同的大分子阴离子后获得的量。

III.制备组合物的方法

制备组合物的方法是本领域已知的，并由Nishimura等人,Biomaterials,26:5558-5563(2005)描述。

通常，所述方法包括阳离子的氯化物盐并将它们转化为其相应的氢氧化物盐，例如通过使用阴离子交换树脂(例如，来自Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX的Amberlite IRA-402氢氧化物形式的阴离子交换树脂)，如方案1中所示出。阳离子的氯化物盐以合适的浓度(例如1.0重量％的浓度)溶解在超纯ddH₂O(例如，来自LifeTechnologies,Grand Island,NY的超纯ddH₂O)中，并在持续搅拌下与过量的树脂混合1小时。然后将浆液离心以沉淀树脂并收集上清液。完全阴离子交换可以通过在逐滴添加硝酸银(例如，来自Sigma Aldrich,St.Louis,MO的ddH₂O中的2g/mL硝酸银溶液)后没有沉淀来验证。可以将阳离子氢氧化物的最终溶液冷冻干燥以去除ddH₂O。

方案1

类似地，如方案2所示，可以使用阳离子交换树脂(例如，来自Santa CruzBiotechnology,Dallas,TX的Amberlite IR-120氢阳离子交换树脂)将大分子阴离子钠盐转化为酸性形式。完全阳离子交换可以通过滴定验证。氢形式的大分子阴离子的最终溶液可以冷冻干燥以去除ddH₂O。

方案2

如方案3中所示，通过在合适的溶剂中加入阳离子(例如，阳离子的氢氧化物形式，任选地阳离子表面活性剂，在甲醇中)，可以将大分子阴离子上的酸性基团络合，任选地中和至相应的阳离子。使中和在室温下在持续搅拌下进行合适的一段时间，例如过夜。然后去除溶剂(例如甲醇)，例如通过旋转蒸发，随后冷冻干燥，并将包覆的阴离子储存在例如-20℃，直至进一步使用。

方案3

IV.使用组合物的方法

将组合物以有效量局部施用于受试者(人或其它哺乳动物)皮肤上，以便将络合物运输通过角质层，并优选运输至或通过一层或多层表皮。可将有效量的络合物运输至真皮。任选地，将络合物递送至超过一层或多层真皮的细胞。络合物可以单独或者与一种或多种与另外的治疗剂、诊断剂、预防剂或营养剂组合运输通过皮肤的各个层。

络合物运输通过角质层，任选地到达或通过表皮和/或真皮的不同层而无需对皮肤进行额外处理以增加皮肤的孔隙度，去除一层或多层角质层，和/或在局部施用组合物之前、同时或之后，推动组合物的络合物或组分穿过皮肤。

当施用于个体皮肤时，组合物不会引起过度刺激，例如由发红、灼热和/或瘙痒感所证明。

IL络合物中的每种组分(即阴离子和阳离子组分)或IL和药物中的离子组分本身可能刺激皮肤。然而，组合物中使用的离子组分(或离子组分和药物)的组合在施用于皮肤表面时不会刺激。

本文所述的组合物可以有效量局部施用以治疗皮肤病。在一些实施例中，组合物含有RNAi分子，例如siRNA。任选地，组合物含有络合物，例如BDOA-siRNA。

A.靶向递送

可以选择组合物以将药物递送至特定部位，例如在角质层、表皮和/或真皮内，或者通过皮肤的所有层并且超过皮肤的所有层。

如实例中所示，不同的IL显示出三种不同的运输方案，这取决于所用的IL：1)在供体溶液中的药物保留。2)在SC、表皮和真皮内增强的定位和保留。3)增强透皮渗透穿过皮肤的所有层并进入受体溶液。在所有方面，组合物对皮肤没有刺激性，尽管一种或多种组分本身可能是刺激性的。

在一些方面，选择组合物的组分(例如阳离子组分、阴离子组分)，使得待递送的药剂(或络合物)在皮肤层内递送。这对于治疗皮肤疾病或病症特别有用，例如治疗感染、割伤、烧伤或皮疹。

在其他方面，选择组合物的组分(例如阳离子组分、阴离子组分和/或药物)，使得待递送的药物运输通过皮肤，例如超出真皮层。

在其他方面，可以选择组合物的组分，使得它们防止药物(或其他物质)转移通过角质层。这可用作保护皮肤或治疗大开口伤口的涂层。用于这些组合物的合适络合物具有限制其渗透的特征。与穿过角质层的组合物相比，这些特征包括聚集体或颗粒的形成、粘度增加和/或密度增加。

B.待治疗的病况

本文所述的IL组合物可用于透皮大分子阴离子递送，任选地与治疗、诊断、预防和/或营养药物一起使用。

IL组合物可以施用于皮肤表面以治疗皮肤疾病或病症，包括但不限于特应性皮炎、痤疮、伤口、皮疹、毛囊炎、疖疮、痈病真菌感染和其他感染源疾病。

C.有效量

有效量随待治疗的病况和大分子阴离子以及任选地递送至皮肤的其他药物而变化。用一种或多于一种局部施用的组合物可以达到有效量。例如，含有10ng、20ng、50ng、100ng、1μg、10μg、20μg、50μg、100μg或10mg的一种或多种药物(大分子阴离子，任选地含有其他药物)的每次施用可以施用于皮肤部位，并分别递送10ng、20ng、50ng、100ng、1μg、10μg、20μg、50μg、100μg、1mg、10mg、20mg、50mg或100mg药剂的有效剂量。

可通过改变施用次数、通过改变每次施用中药剂的量或两者来递送有效剂量的活性剂。活性剂的有效量可以在1天、2-3天的时期内或一周、或几周至3-6个月的时期内递送。

合适的剂量包括将含有0.001μg至1000mg的大分子阴离子和/或药物的合适体积的组合物局部施用于待治疗的受试者的皮肤部位。

D.剂型

IL组合物可以是将有效量的大分子阴离子和/或药物递送至皮肤的剂量单位和剂型。

可以使用适合递送至皮肤的任何剂型。组合物可以是膜、贮库、贴剂或纯液体、乳膏、洗剂的形式。可以预先包装剂型以通过单次或多次施用递送有效量的大分子阴离子。

在一个方面，通过药物递送装置将组合物递送至皮肤表面，所述药物递送装置含有用于保持组合物的储库。任选地，储库还含有一种或多种另外的药物。

在另一方面，组合物可包含在药物递送装置内。可以使用具有不同几何形状和结构的各种不同装置。例如，该装置可以是多室装置，其含有IL组合物，任选地，另外的室含有一种或多种另外的药剂。

通常，剂型在不需要注射装置，例如具有微针的装置，或用于增加皮肤渗透性或推动络合物穿过皮肤的其他装置或药剂的情况下递送，因为IL组合物能够穿过皮肤屏障并达到皮肤细胞。

实例

实例1.包覆的siRNA的合成和表征

材料和方法

如前所述(Nishimura等人,Biomaterials,26:5558-5563(2005))通过酸碱中和合成用离子液体(IL)部分包覆的siRNA。苄基二甲基烷基氯化铵盐购自SigmaAldrich(St.Louis,MO)。FAM-GAPDH siRNA(siRNA1，5'-FAM-GACGUAAACGGCCACAAG UUC-3'(SEQ IDNO:1))、FAM-GAPDH siRNA(siRNA2，5'-FAM-GUGUGAACCACGAGAAAUAUU-3'(SEQ ID NO:2))、FAM-弹性蛋白酶siRNA(siRNA3，5'-FAM-UCACUUACAGGAUCUAUAAUU-3'(SEQ ID NO:3))和FAM-对照siRNA(siRNA4，5'-FAM-UAAGGCUAUGAAGAGAUACUU-3'(SEQ ID NO:4))购自Dharmacon,Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)。

使用Amberlite IRA-402氢氧化物形式的阴离子交换树脂(Santa CruzBiotechnology,Dallas,TX)将氯化物盐转化为其相应的氢氧化物盐。将苄基二甲基烷基氯化铵盐以1.0重量％的浓度溶解在超纯ddH₂O(Life Technologies,Grand Island,NY)中，并在持续搅拌下与过量树脂混合1小时。然后将浆液离心以沉淀树脂并收集上清液。通过逐滴添加硝酸银(2g/mL在ddH₂O中，Sigma Aldrich,St.Louis,MO)后没有沉淀来验证完全阴离子交换。将苄基二甲基烷基氢氧化铵的最终溶液冷冻干燥以去除ddH₂O。类似地，使用Amberlite IR-120氢阳离子交换树脂(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)将siRNA钠盐转化为酸性形式。通过滴定验证完全阳离子交换。将氢形式的siRNA的最终溶液冷冻干燥以去除ddH₂O。通过在甲醇中加入等价的苄基二甲基烷基氢氧化铵来中和siRNA上的酸性基团。使中和在室温下在持续搅拌下进行过夜。然后通过旋转蒸发去除甲醇，随后冷冻干燥，并将包覆的siRNA储存在-20℃下直至进一步使用。

通过元素分析证实了包覆的siRNA的组成。用CE-440快速分析元素分析仪(ExeterAnalytical,North Chelmsford,MA)进行CHN元素分析。在小铝胶囊中称量样品大小～1mg。将胶囊置于保护性镍套管中，装入自动进样器轮中，并通过机械操作的石英钢包引入燃烧炉中。碳、氮和氢的重量百分比通过在富氧氦气氛中在1000℃下的高温燃烧来确定。

通过测量在辛醇和水中的分配(Log P_o/w)来表征包覆的siRNA。在室温下将5mLddH₂O与5mL辛醇混合过夜。然后将FAM-siRNA或包覆的FAM-siRNA加入混合物中并再次在室温下在黑暗中混合过夜。培育过夜后，将溶液离心以分离辛醇层和水层。使用SAFIRE、XFLUOR4、V4.50酶标仪(Tecan Group Ltd,Morrisville,NY)通过荧光光谱法定量各层中存在的FAM-siRNA的浓度。在485nm的激发和520nm的发射下进行荧光检测，并验证该方法的线性、准确度和精确度。测量期间的线性范围为0.25pmol/mL至25pmol/mL(r²＝0.9999)。LogP_o/w可以作为辛醇层与水层相比的荧光比率的对数加以计算。

通过光子相关光谱法(Zetasizer Nano series,Malvern Instruments Ltd.,Worcestershire,UK)测定聚集倾向。将包覆的FAM-siRNA溶解于ddH₂O或辛醇中并超声处理30分钟。测量在25℃下以173°的固定角度进行。使用红色激光进行测量以避免来自FAM标记的siRNA的干扰。这里引用的尺寸是包覆发siRNA流体动力学直径的数字平均值。

统计分析

报告的数据是平均值±SD，除非另有说明。在适当的情况下，统计显著性通过单向ANOVA和事后检验或Microsoft Excel中的双尾、未配对的学生t检验得到证实。显著性水平设定为p<0.05。

结果

使用简单、可扩展的两步法合成用阳离子部分包覆的siRNA以形成离子液体，所述两步法由阳离子/阴离子交换，然后进行酸碱中和组成(方案1-3)。

如前所述，使用苄基二甲基烷基铵作为IL部分(Nishimura等人,Biomaterials,26:5558-5563(2005))。使用三种不同的烷基链长度：辛基(BDOA)、十四烷基(BDTA)和硬脂酰基(BDSA)(表5)。此外，使用了几种不同的siRNA序列，包括两种不同的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)敲低序列(缩写为siRNA1和siRNA2)以及基质金属蛋白酶-12(MMP-12)敲低序列(缩写为siRNA3)和非沉默对照siRNA序列(缩写为siRNA4)(表5)。然后将络合物冻干以去除所有残留的水。使用元素分析确认1:1离子配对和最终组合物(表1)。具体而言，碳、氮和氢的重量百分比与预期值没有显著差异。

包覆的siRNA通过辛醇/水分配(P_o/w)表征(表2)。正如所预期，所有包覆的siRNA都很好地分配到辛醇中。虽然裸siRNA1是高度亲水的(Log P_o/w＝-3.76±0.13)，但是包覆的siRNA1是疏水性的，Log P_o/w范围介于BDOA-siRNA1的1.43±0.04至BDTA-siRNA1的3.79±0.38。无论使用何种siRNA序列，都观察到类似的结果(表2)。此外，所有包覆的siRNA都比它们相应的苄基二甲基烷基铵盐更疏水。例如，BDOA氯化物仅略微疏水，Log P_o/w＝0.85(预测值)。相反，BDOA-siRNA1的疏水性是～4倍。

表1.使用元素分析验证的用IL部分包覆的siRNA的合成。

表1显示了FAM-siRNA1和用IL部分包覆的siRNA1的碳、氢和氮的重量％以及碳/氮比。括号中给出n＝3的标准偏差。显示了预期值和测量值，并将测量值与预期值进行比较，这强烈暗示IL部分的掺入。

表2.用IL部分包覆的siRNA比天然siRNA和天然IL部分显著更疏水。

表2显示了FAM-siRNA1和-siRNA2的Log P_o/w。括号中给出n＝3的标准偏差。¹预测值；²Hansch等人,Exploring QSAR-Hydrophobic,Electronic,and StericConstants.Washington,DC:American Chemical Society,第182页(1995)；³Hansch等人,American Chemical Society.,第188页(1995)。

使用动态光散射(DLS)测定了辛醇和水中的包覆的siRNA的大小和聚集倾向。与不易渗透皮肤的聚合络合物相比，产生了在分子尺度上用IL部分包覆的siRNA，其易于穿过皮肤屏障并到达皮肤细胞。由于siRNA序列似乎不影响分配，因此这里仅研究siRNA1。重要的是，DLS测量表明，包覆的siRNA1形成单独的络合物，并且不在辛醇中聚集(代表SC)(表3)。亲水性裸siRNA1不溶于辛醇，因此不进行DLS。然而，在水中，裸siRNA1的流体动力学直径为1.06±0.32nm。所有包覆的siRNA都可溶于辛醇。包覆的siRNA1在辛醇中的流体动力学直径大于裸siRNA1在水中的流体动力学直径，并且随着IL部分的烷基链长度的增加而增加。在水中观察到BDTA和BDSA-siRNA1的聚集。具体地，BDTA-和BDSA-siRNA1在水中的流体动力学直径分别为182.0±92.4和846.4±176.1nm。相反，未观察到BDOA-siRNA1在水中聚集(流体动力学直径＝1.63±0.16nm)。作为对照，还测定了siRNA聚合络合物(RNAiMax,Life Technologies,Grand Island,NY)的大小。与裸siRNA1类似，RNAiMax-siRNA1不溶于辛醇，因此不进行DLS。在水中，流体动力学半径为88.3±1.2nm。总之，数据显示，包覆的siRNA不会在辛醇中聚集，因此与聚合络合物相反，可以作为单一络合物移动通过疏水性SC。

表3.用IL部分包覆的siRNA的DLS测量显示形成在辛醇(代表SC)中没有聚集的单个络合物，而在水中聚集取决于IL部分的烷基链长度。

表显示了包覆的FAM-siRNA的有效络合物直径(nm)。括号中给出n＝3的标准偏差。

实例2.包覆的siRNA有效地运输通过皮肤。

材料和方法

皮肤运输的测量

在该研究中使用全厚度猪皮(Lampire Biological Laboratories,Pipersville,PA)。将所有皮肤样品储存在-80℃。在使用前立即解冻皮肤并修剪毛发。用PBS(pH 7.4)清洁皮肤片并测量皮肤电导率以确保样品完整。如前所述(Chen等人,Journal ofControlledRelease,179:33-41(2014)；Karande等人,Nature Biotechnology,22:192-197(2004))，在Franz扩散池(FDC)中评估皮肤渗透。简而言之，用pH 7.4的PBS填充受体隔室。每种测试制剂一式三份进行评估。在SC面朝上的情况下安装皮肤，供体室保持干燥并在施用测试制剂之前向大气开放30分钟。小心地去除皮肤下面(真皮)和受体溶液之间的所有气泡。将150μL的50μM FAM-siRNA或包覆的FAM-siRNA施用于皮肤表面。将FDC在37℃温和搅拌下培育24小时。24小时后，通过用PBS(pH 7.4)洗涤五次从皮肤上去除制剂。通过用胶带(Transparent Tape,3M Corporate,St.Paul,MN)剥离从表皮分离SC。连续进行十条胶带。将剥离的胶带收集在玻璃瓶中，如下：SC 1＝第1胶带，SC 2-10＝第2-第10胶带。假设10个胶带去除整个SC。胶带剥离后，用手术无菌手术刀将表皮与真皮分离。将表皮和真皮切成小块并转移到单独的玻璃小瓶中。最后，将来自受体溶液的3mL体积转移到玻璃小瓶中。为了提取荧光siRNA，将3mL甲醇和PBS pH 7.4(1:1，v/v)混合物加入每个小瓶中并在室温下振荡过夜。然后将溶液离心10分钟以沉淀皮肤组织。取出上清液，必要时稀释，并如上所述通过荧光光谱法测定荧光探针的浓度。

皮肤运输的可视化

为了可视化FAM-siRNA和包覆的FAM-siRNA向皮肤的运输，如上所述将制剂施用于FDC中的皮肤。在培育24小时后，使用Leica Cryostat CM1850(Leica,Buffalo Grove,IL)制备对应于施用区域的薄切片(20μm)。使用Olympus Fluoview 1000Spectral共聚焦显微镜(Olympus,Center Valley,PA)对切片成像。所有仪器设置在样品之间保持恒定，用于实验条件之间的比较。

结果

如前所述(Chen等人,Journal ofControlledRelease,179:33-41(2014)；Karande等人,Nature Biotechnology,22:192-197(2004))，在Franz扩散池(FDC)中评估皮肤渗透。重要的是，通过用IL部分包覆，siRNA1的皮肤运输显著增强(图2A和2B)。BDOA-、BDTA-和BDSA-siRNA1递送到活表皮中的施用剂量百分比(％)为9.85±2.64、9.60±2.85和7.33±0.24，相较于裸siRNA1仅为2.06±0.15。类似地，BDOA-和BDSA-siRNA1递送到真皮的更深皮肤组织层中的施用剂量％为12.94±2.56和8.89±0.77，相较于裸siRNA1仅为2.26±1.16。有趣的是，当siRNA1用BDTA包覆时，递送到真皮中的％施用剂量实际上被延迟(0.49±0.18)。无论使用何种siRNA序列，都观察到类似的结果(图2B)。

用共聚焦显微镜确认了包覆的FAM-siRNA向皮肤中的递送增强。与未包覆的siRNA相比，当用IL部分包覆时，观察到显著更高的siRNA皮肤运输

实例3.包覆的siRNA对细胞无毒。

材料和方法

细胞培养

所有细胞培养材料均自Life Technologies(Grand Island,NY)获得。人成体表皮角质形成细胞在补充有人角质形成细胞生长补充剂、25U/mL青霉素、25μg/mL链霉素和50μg/mL新霉素的EpiLife培养基中培养。培养物在37℃，5％CO2下生长。

评估细胞培养中的生物相容性

将细胞接种在96孔微量板(Corning Inc.,Coming,NY)中并使其附着和增殖。一旦细胞达到～80％汇合，去除培养基并加入含FAM-siRNA、包覆的FAM-siRNA或苄基二甲基烷基氯化铵盐的培养基。使用单独的培养基作为对照。将细胞与测试溶液在37℃和5％CO₂下培育4小时。培育后，去除测试溶液，用HBSS洗涤细胞，并向每个孔中加入新鲜培养基。使细胞增殖过夜，然后使用MTT细胞增殖测定法(ATCC,Manassas,VA)评估活力。使用SAFIRE、XFLUOR4、V4.50酶标仪(Tecan Group Ltd,Morrisville,NY)根据制造商推荐的方案测定活力。

结果

通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)在体外评估了包覆的siRNA穿过细胞膜的能力。人成体表皮角质形成细胞(HEKa细胞)是活表皮中的主要细胞类型，因此用于所有体外研究。将HEKa细胞与100nM包覆的siRNA1培育4小时。然后洗涤细胞，用Hoechst 33342细胞核染色，并成像以显现siRNA1内化。将包覆的siRNA1的内化与裸siRNA1的内化进行比较。重要的是，与裸siRNA1相比，通过用IL部分包覆来增强细胞内化。另一方面，细胞内化的程度似乎确实取决于所用的IL部分。例如，BDTA表现出最大的内化增强，而BDOA表现出最少的增强。

使用MTT测定法(ATCC,Manassas,VA)在体外评估了针对HEKa细胞的包覆的siRNA的生物相容性。重要的是，高达100nM包覆的siRNA1对HEKa细胞的细胞毒性可忽略不计(图3A)。然而，高于100nM，观察到BDTA-siRNA1和BDSA-siRNA1的细胞毒性。具体地，与仅用培养基培育的HEKa细胞相比，在与1000nM BDTA-或BDSA-siRNA1培育后，％细胞活力为18.48±2.66和67.60±9.92。相反，在用1000nM BDOA-siRNA1培育后未观察到显著的细胞毒性。对于研究的所有浓度，裸siRNA1都是无毒的(图3A-3C)。此外，BDOA、BDTA和BDSA作为游离盐似乎比与siRNA一起包覆递送时更具毒性(图3B)。这种观察在较高浓度下最明显；然而，差异在统计学上不显著(p>0.05)。同样，无论使用何种siRNA序列，都观察到类似的结果(图3C)。

实例4.包覆的siRNA成功地在皮肤细胞中内化。

材料和方法

将细胞接种在涂有聚-D-赖氨酸的玻璃底培养皿(MatTek Corporation,Ashland,MA)上，并使其附着和增殖。一旦细胞达到～80％汇合，去除培养基并加入含FAM-siRNA或包覆的FAM-siRNA的培养基。在标准培养条件下将细胞与测试制剂一起培育4小时。与测试溶液一起培育后，将细胞用5μg/mL Hoechst 33342(Life Technologies,Grand Island,NY)在室温下染色5分钟，然后用汉克氏平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution)(HBSS,Lonza Group Ltd.,Basel,Switzerland)洗涤3次，每次5分钟。使用Olympus Fluoview1000Spectral共聚焦显微镜(Olympus,Center Valley,PA)对细胞成像。对于实验条件之间的任何比较，所有仪器设置保持恒定，并且使用30X硅浸渍物镜来捕获细胞的整个厚度。

结果

BDOA-siRNA表现出与裸siRNA相比优异的运输至深活皮肤层(表皮和真皮)，改善细胞内化的能力，以及与BDTA-和BDSA-siRNA相比优异的生物相容性(图2A-3C)。由于细胞培养中的siRNA通常需要延长的培育时间以引发反应，因此在72小时培育后也证实了BDOA-siRNA细胞内化和生物相容性。如所预期的，与裸siRNA1相比，暴露于BDOA-siRNA172小时后HEKa细胞中的细胞内化显著增强。此外，相对于仅用培养基培育的细胞，观察到高达300nMBDOA-siRNA的细胞毒性可忽略不计(图4)。

作为另外的对照，将BDOA-siRNA1的细胞内化与Lipofectamine RNAiMax-siRNA1进行比较。与RNAiMax-siRNA1相反，BDOA-siRNA1显示出显著更少的细胞内化。然而，有趣的是，BDOA-siRNA1的内化模式却截然不同。具体地，BDOA-siRNA1显示出指示细胞质定位的弥散荧光。相反，RNAiMax-siRNA1显示出指示内体隔离的点状荧光。

实例5.包覆的siRNA成功沉默细胞中的基因表达。

材料和方法

将细胞接种在96孔微量板(Corning Inc.,Coming,NY)中并使其附着和增殖。一旦细胞达到～80％汇合，去除培养基并加入含FAM-siRNA或包覆的FAM-siRNA的培养基。使用单独的培养基作为对照。将细胞与测试溶液在37℃和5％CO2下培育72小时。培育后，定量总蛋白和GAPDH表达。用二喹啉甲酸蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific,Rockford,IL)评估总蛋白质，并使用KDalert GAPDH测定试剂盒(Life Technologies,Grand Island,NY)根据制造商推荐的方案并使用SAFIRE、XFLUOR4、V4.50酶标仪(Tecan Group Ltd,Morrisville,NY)测量GAPDH水平。

结果

首先在体外证实了BDOA-siRNA引发治疗反应的能力。GAPDH用作模型敲低靶标。将BDOA-siRNA1与各种浓度的HEKa细胞一起培育，并如前所述评估GAPDH敲低(Chen等人,Journal ofControlled Release,179:33-41(2014))。作为对照，还研究了裸siRNA1和BDOA-siRNA4(非沉默对照siRNA)。作为另外的对照，RNAiMax-siRNA1和RNAiMax-siRNA4也以制造商推荐的浓度(10nM)使用。如所预期的，裸siRNA1以及非沉默的siRNA4制剂在72小时培育后不会降低HEKa细胞中的GAPDH表达(图5)。此外，与未处理的对照相比，100nM和200nM BDOA-siRNA1在GAPDH表达中没有显示出显著差异。然而，与300nM BDOA-siRNA1一起培育确实导致显著的GAPDH敲低(与未处理的对照相比，58.7±2.0％GAPDH表达)(图5)。类似地，与10nM RNAiMax-siRNA1一起培育导致显著的GAPDH敲低(与未处理的对照相比，GAPDH表达为36.9±3.2％)。

实例6.在MatTek Epiderm^TM组织样品中的包覆的siRNA疾病治疗和生物相容性。

材料和方法

如前所述(Afaq等人,Exp Dermatol,18:553-561(2009))使用MatTek Epiderm^TM人皮肤等效组织来评估使用包覆的siRNA治疗过早皱纹形成。简而言之，使Epiderm^TM组织在37℃和5％CO2下用2.5mL培养基在6孔培养板(Coming Inc.,Corning,NY)中适应24小时。在24小时培育后，更换培养基并将100μL ddH₂O(对照)或50μM天然弹性蛋白酶siRNA(siRNA3)、50μM BDOA-对照非沉默siRNA(siRNA4)、25μM BDOA-siRNA3或50μM BDOA-siRNA3施用于皮肤组织的顶侧。在24小时培育后，去除测试制剂，并使用具有302nm波长和白光管的6瓦UV灯(Cole Parmer,Vernon,IL)将皮肤暴露于200mJ/cm2UVB照射。用Solarmeter型号6.2UV仪(Solar Light Company Inc.,Glenside,PA)测量辐照。曝光后，将新制备的制剂重新施用于皮肤组织并再培育96小时。在实验结束时，收集2mL培养基并分别使用人弹性蛋白ELISA试剂盒和人MMP-12ELISA试剂盒(Biomatik USA LLC.,Wilmington,DE)，按照制造商的推荐方案分析弹性蛋白和弹性蛋白酶含量。根据MatTek的推荐方案，使用MTT测定法确认测试制剂的生物相容性。

结果

针对人皮肤等效组织中的皮肤衰老模型评估BDOA-siRNA的临床潜力(Afaq等人,Exp Dermatol,18:553-561(2009))。已提出弹性蛋白酶上调作为紫外线照射诱导的皱纹形成的重要因素(Tsuji等人,Photochemistry andPhotobiology,74:283-290(2001))。因此，用局部施用的RNAi敲低弹性蛋白酶是治疗和预防皮肤皱纹的建议选择。在UVB照射和施用BDOA-siRNA后，没有观察到组织活力的降低(图6)。此结果确认1)亚红斑剂量的照射和2)BDOA-siRNA的生物相容性。此外，与未暴露于UVB照射的组织相比，UVB照射导致弹性蛋白酶的显著上调(图7A)和弹性蛋白的显著减少(图7B)，证实了疾病模型的有效性。局部施用裸siRNA3或BDOA-siRNA4不能防止弹性蛋白酶上调和随后的弹性蛋白降解。相反，BDOA-siRNA3在50μM和25μM下的施用能够在UVB照射后维持皮肤的未改变状态，因此证实了包覆的siRNA的临床潜力(图7A和7B)。

实例7.阳离子配对透明质酸(HA)是有效的皮肤渗透剂。

材料和方法

根据实例1中描述的方法制备阳离子配对HA。

结果

不同种类的阳离子配对HA及其辛醇-水分配系数显示于表4中。疏水阳离子与透明质酸的配对显著增强其辛醇-水分配系数。预期辛醇-水分配系数的这种增强会增加它们的皮肤渗透性。透明质酸与疏水阳离子的配对使其辛醇-水分配系数提高了高达1,000,000倍，与关于siRNA所发现的相似。预期分配系数的这种显著增强会增加它们的皮肤渗透性。

表4.与HA配对的示例性阳离子及其辛醇-水分配系数。

实例8.在胆碱-香叶酸IL存在下牛血清白蛋白和卵白蛋白的皮肤递送。

材料和方法

如WO 2015/066647中所述制备胆碱和香叶酸深共晶液，并向其中加入荧光标记的白蛋白(牛血清白蛋白或卵白蛋白)。将装有白蛋白的胆碱-香叶酸制剂置于猪皮上24小时，切片皮肤以评估白蛋白的渗透。使用PBS进行对照实验。

结果

当从胆碱和香叶酸递送白蛋白时，观察到白蛋白的显著和深度渗透。预期胆碱和香叶酸制剂的益处将延伸到其他蛋白质，包括胰岛素、抗体和治疗性肽。胆碱和香叶酸的益处也有望延伸到其他离子液体。

BDOA-siRNA在皮肤(表皮和真皮)的深活组织层中表现出最强的增强作用(图2A和2B)。此外，尽管与BDTA-和BDSA-siRNA相比细胞内化效率较低，但BDOA-siRNA在显著更高的浓度下对皮肤细胞显示出可忽略的细胞毒性(图3A-3C)。

如前所述(Afaq等人,Exp Dermatol,18:553-561(2009))，针对人皮肤等效组织中的皮肤衰老模型评估BDOA-siRNA防止皱纹形成的能力。将BDOA包覆的抗弹性蛋白酶siRNA施用于人皮肤等效组织的顶端表面。作为对照，还测试了生理盐水、裸抗弹性蛋白酶siRNA和BDOA包覆的非沉默对照siRNA。UVB照射引起对照组织中显著的弹性蛋白酶上调和弹性蛋白降解(图7A和7B)。相反，用25μM或50μM BDOA包覆的抗弹性蛋白酶siRNA处理的组织显示与未曝光的健康组织(即没有UVB处理)相同的弹性蛋白酶和弹性蛋白含量。

BDOA-siRNA的功效和安全性与其物理化学特性有关。输送程度与包覆的siRNA的疏水性充分相关。裸siRNA是亲水的，并且通过SC的运输是最少的(图2A和2B)。相反，疏水性包覆的siRNA能够以显著量渗透SC。BDTA是最疏水的，并且进入SC的运输量最高。然而，由于BDTA和SC脂质之间的高融合性，BDTA-siRNA保留在皮肤的表层中并且不会渗透到深组织层中。因此，必须寻求平衡以允许增强从供体溶液进入SC中的分配以及从SC进入皮肤的活组织层中的分配。包覆的siRNA的细胞内化也与疏水性充分相关。BDTA-siRNA的Log P_o/w在包覆的siRNA中最高，并且BDTA-siRNA1具有最高程度的细胞内化。相比之下，BDOA-siRNA的Log P_o/w在包覆的siRNA中最低，并且BDOA-siRNA1具有最低程度的细胞内化，尽管仍然显著高于裸siRNA1所观察到的。

包覆的siRNA的疏水性和转运性质之间的关系提供了通过容易地操纵IL部分反物种来调节其功效的机会。通过改变反物种的烷基链长度，疏水性在一定程度上是可调的。用BDOA包覆导致最低的Log P_o/w，而BDTA和BDSA-siRNA的疏水性显著更高。然而，疏水性和链长度之间的关系不是线性的。

具体地，BDTA(烷基链＝14个碳)比BDSA(烷基链＝18个碳)显著更疏水。这与单独的苄基二甲基烷基铵物种的Log P_o/w形成对比，其根据预测和实验确定的值随链长度线性增加(图1，r²＝0.9497)。聚集倾向和聚集体的大小似乎也取决于烷基链长度(表3)。理想地，与聚合络合物相反，包覆的siRNA将作为单个疏水分子运输，以最大化透皮和跨细胞运输。预期聚集成聚合络合物会显著阻碍皮肤运输动力学以及递送深度，因此应通过优化IL部分烷基链长度来避免聚集。示例性阳离子(钠离子用作对照)和阴离子显示于表5中。

表5.研究中使用的示例性阳离子和阴离子。

Lipofectamine RNAiMax是商业上可获得的siRNA聚合络合物平台，其已经多年优化以提供siRNA进入细胞的一致、快速和有效的递送。RNAiMax-siRNA在低30倍的浓度下优于BDOA-siRNA(图5)。因此，该数据不支持BDOA-siRNA用于体外细胞培养中的基因沉默应用。这种差异可能与水溶液中包覆的siRNA的稳定性有关。RNAiMax-siRNA聚合络合物在高盐和缓冲溶液中是稳定的，而包覆的siRNA仅通过1:1离子配对保持在一起，因此预期在稀水条件下溶解。最大化siRNA磷酸基团与IL部分之间的离子缔合可以是减轻解离并随后在溶液中以较低浓度最大化细胞内化和基因沉默的一种可能选择。已知离子液体在纯净以及溶液中都具有不同程度的离子缔合，这取决于离子配对的选择(Zhang等人,JournalofPhysical and Chemical Reference Data,35:1475-1517(2006))。

为了使解离最小化所需的高浓度的苄基二甲基烷基铵包覆的siRNA也被观察到显著的细胞毒性。与运输性质一样，细胞毒性与疏水性充分相关。这并不出人意料，因为疏水性通常用作IL部分细胞毒性的指标(Ranke等人,Ecotoxicology and EnvironmentalSafety,58:396-404(2004)；Ranke等人,Ecotoxicology andEnvironmental Safety,67:430-438(2007))，但可能会对包覆的siRNA的使用施加一些限制，因为可能需要在向皮肤和细胞中的运输增强和生物相容性之间达成平衡。然而，有趣的是，包覆的siRNA似乎比等浓度的IL部分氯化物盐毒性低(图3A-3C)。这表明离子配对可以在一定程度上降低单个组分的细胞毒性，这与先前的离子液体毒性研究一致(Aoyagi等人,TECHNOLOGY,03:214-238(2015)；Zakrewsky等人,Proceedings of the National Academy of Sciences,111:13313-13318(2014))。

另一方面，在人皮肤等效组织中没有观察到毒性作用。因此，生物相容性可能仅是延伸该策略用于细胞培养中或体内全身施用后的敲低的问题。相对于裸siRNA的细胞内化增强和从内体区室的避免或释放与优异的皮肤递送相结合，高度支持BDOA-siRNA用于皮肤中的基因沉默应用。实际上，皮肤呈现出独特的环境，其中包覆的siRNA可以作为单一络合物穿透疏水性SC，然后立即与活表皮中的患病细胞相互作用，从而限制解离的程度并增强细胞内化和基因沉默。这与将BDOA-siRNA施用于人皮肤等效组织后的观察结果一致(图6、7A和7B)。此外，包覆的siRNA的性质和行为与siRNA序列无关。这开启了使用包覆的siRNA治疗多种其他皮肤疾病的可能性，所述疾病存在已知的蛋白质敲低靶标，例如牛皮癣、特应性皮炎、皮肤癌、黄褐斑、先天性厚疣等等(Zakrewsky等人,Journal ofControlledRelease,218:445-456(2015))。此外，这开辟了通过使用同时敲低几个蛋白质靶标的包覆的siRNA混合液更有效治疗的可能性。

因此，用局部施用的RNAi敲低弹性蛋白酶可能是治疗和预防皮肤皱纹的可行选择，并且为患者提供了当前选择的安全替代方案。局部施用的RNAi必须通过皮肤运输到细胞中以引发治疗反应。此外，疗法必须是生物相容的。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

(The Regents of the University of California)

<120> 基于离子物种的皮肤治疗局部制剂

<130> UCSB 2017-042

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAM-GAPDH siRNA，5'至3'显示

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 5' FAM修饰

<400> 1

gacguaaacg gccacaaguu c 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAM-GAPDH siRNA，5'至3'显示

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 5' FAM修饰

<400> 2

gugugaacca cgagaaauau u 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAM-弹性蛋白酶siRNA，5'至3'显示

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 5' FAM修饰

<400> 3

ucacuuacag gaucuauaau u 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAM siRNA，5'至3'显示

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 5' FAM修饰

<400> 4

uaaggcuaug aagagauacu u 21

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> GAPDH的siRNA序列，5'至3'显示

<400> 5

gacguaaacg gccacaaguu cuu 23

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> GAPDH的siRNA序列，5'至3'显示

<400> 6

gaacuugugg ccguuuacgu cuu 23

<210> 7

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> GAPDH的siRNA序列-5'至3'显示

<400> 7

gugugaacca cgagaaauau uuu 23

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> GAPDH的siRNA序列，5'至3'显示

<400> 8

aauauuucuc gugguucaca cuu 23

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 弹性蛋白酶的siRNA序列，5'至3'显示

<400> 9

ucacuuacag gaucuagaau u 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 弹性蛋白酶的siRNA序列，5'至3'显示

<400> 10

uuauagaucc uguaagugau u 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 非沉默siRNA对照序列，5'至3'显示

<400> 11

uaaggcuaug aagagauacu u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 非沉默siRNA对照序列，5'至3'显示

<400> 12

guaucucuuc auagccuuau u 21

Claims

1.一种用于透皮递送大分子的组合物，其包含络合物，所述络合物包含

大分子阴离子，和

阳离子；

其中所述络合物对皮肤无刺激性，和

其中所述组合物是适于局部施用于皮肤的形式。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在室温和标准压力下是液体。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述大分子阴离子和所述阳离子以0.5:1、1:1或2:1的电荷比存在。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述大分子阴离子是选自核酸、肽、蛋白质和多糖的大分子。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述大分子阴离子是核酸。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述大分子阴离子是选自下组的RNA干扰分子：微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和小干扰RNA(siRNA)，优选其中所述大分子阴离子是siRNA。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述大分子阴离子是双链siRNA，其中每条链的长度范围为20至25个核苷酸。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述大分子阴离子是双链siRNA，其中每条链的长度为23个核苷酸。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述大分子阴离子是双链siRNA，其中每条链的长度为21个核苷酸。

10.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述大分子阴离子是多糖。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述多糖选自下组：透明质酸、羧甲基纤维素、阿拉伯树胶、蜂蜜、羟丙基淀粉磷酸酯、粘多糖、软骨素、果胶、糖表面活性剂、海藻多糖、黄芪胶、黄原胶和其衍生物及其组合，优选其中所述多糖是透明质酸。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述阳离子包含长度为三个碳原子至二十个碳原子的烷基链。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述阳离子包含长度为六个碳原子至十六个碳原子的烷基链。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述阳离子具有式II的结构：

其中n是3至19的整数，包括端值。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述阳离子表面活性剂不是苄基二甲基十二烷基铵。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述阳离子是阳离子表面活性剂，选自苄基二甲基辛基铵、苄基二甲基十四烷基铵和苄基二甲基硬脂基铵。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述络合物的疏水性由其辛醇/水分配系数(P_o/w)确定，比所述大分子阴离子与钠阳离子络合时的疏水性大至少一个对数单位(Log P_o/w)。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中当与所述大分子阴离子与钠阳离子络合时的疏水性相比时，所述络合物的疏水性增加1至5个对数单位(Log P_o/w)。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述阳离子增加所述大分子阴离子的疏水性以足以穿过角质层，而没有额外的处理以增加孔隙度或去除角质层。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中单独的所述大分子阴离子和阳离子中的任一种或两种都刺激皮肤。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中相对于与钠阳离子络合的所述大分子阴离子的体外细胞毒性，所述组合物对体外细胞具有基本上相同的细胞毒性。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中所述络合物是电荷中性的。

23.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述阳离子具有式I的结构，

其中Q是氮(N)或磷(P)，

其中R₁、R₂、R₃和R₄独立地为不存在的、氢、经取代的烷基、未经取代的烷基、经取代的烯基、未经取代的烯基、经取代的炔基、未经取代的炔基、经取代的烷氧基、未经取代的烷氧基、经取代的氨基、未经取代的氨基、经取代的烷基氨基、未经取代的烷基氨基、经取代的烷硫基、或未经取代的烷硫基、经取代的芳基、未经取代的芳基、经取代的杂芳基、未经取代的杂芳基、经取代的C₃-C₃₀环烷基、未经取代的C₃-C₃₀环烷基、经取代的杂环基、未经取代的杂环基，以及任何一对R₁、R₂、R₃和R₄独立地组合形成五元和/或六元环，其中由任何一对R₁、R₂、R₃和R₄组合形成的五元和/或六元环任选地包括另外的杂原子。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述阳离子不是十六烷基三甲基铵、癸基三甲基铵、苄基二甲基十二烷基铵、肉豆蔻基三甲基铵或十二烷基吡啶鎓。

25.根据权利要求23所述的组合物，其中R1、R2、R3和R4中的至少一个独立地是经取代的烷基，其中所述经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基。

26.根据权利要求23所述的组合物，其中R1、R2、R3和R4中的至少一个独立地是经取代的烷基，其中所述经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，

条件是所述阳离子不是苄基二甲基十二烷基铵。

27.根据权利要求23所述的组合物，其中R1独立地是经取代的烷基，其中所述经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，R2、R3和R4独立地是经取代的烷基或未经取代的烷基，

条件是当R2、R3和R4是经取代的烷基时，所述经取代的烷基不是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基。

28.根据权利要求23所述的组合物，其中R1独立地是经取代的烷基，其中所述经取代的烷基是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，

其中R2、R3和R4独立地是经取代的烷基或未经取代的烷基，

条件是当R2、R3和R4是经取代的烷基时，所述经取代的烷基不是经取代的芳烷基或未经取代的芳烷基，

条件是所述阳离子表面活性剂不是苄基二甲基十二烷基铵。

29.一种治疗有需要的受试者的一种或多种皮肤病况的方法，所述方法包含向所述受试者的皮肤局部施用有效量的根据权利要求1-28中任一项所述的组合物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中在局部施用所述组合物的步骤之前、之后或同时，

皮肤不进行额外的处理以增加皮肤的孔隙度，去除角质层的全部或一部分，推动所述络合物穿过角质层，或者以其他方式帮助运输所述组合物或所述络合物穿过皮肤的一层或多层。