CN105213210A - 表面素在化妆品上的应用 - Google Patents
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Abstract
一种由微生物Bacilus？subtilis所生产的生物表面活性剂(biosurfactant)—表面素(surfactin)，该表面素是一个天然环型的脂胜肽，由七个氨基酸形成一个环状的结构；且该表面素具有皮肤抗老化、抗皱、增加化妆品皮肤穿透力(助渗剂)、起泡剂及乳化剂等功能。
Description
技术领域
本发明是关于表面素的应用方法，特别指表面素在化妆品上的应用方法。
背景技术
1.人类皮肤结构及其老化因子
皮肤为人体表面主要器官，厚度因部位、年龄及性别会有所不同；且皮肤主要功能为人体第一道屏障，可避免人体内部组织直接受到外在环境因子的损害，如：紫外线照射、温度变化、湿度变化、悬浮微粒的伤害以及病毒或细菌直接进入人体，因此皮肤容易受到外界因子刺激而启动老化机制代谢已损伤的细胞。
(1)细胞老化及基因缺损
老化作用从细胞开始逐渐影响至组织与器官，使各部分组织器官结构与功能逐渐衰退。在LeonardHayflick于1963年的研究中，将冻存的人体分离细胞加以培养进行继代实验，发现细胞分裂一定次数后发生了形变；由结果发现人体细胞有其分裂上限次数，细胞约分裂50次后其分裂速率及外观皆会改变，产生不规则的分裂方式，造成粒状型、扭曲型等不正常的细胞外观使细胞凋亡；此研究认为生物体生长周期于受精卵时就已决定，事先就已经设定一生物体的生命时钟，以人类来说，细胞分裂50次，大约可达120年。由于人体并无端粒酶可将细胞复制时所缺失的片段重新复制，致使经多次细胞复制、分裂过程中基因受损，而使得细胞周期有其限制，该限制又称为GlassCeiling，此一老化为不可逆且无法避免的过程。
(2)紫外线
皮肤与其他器官都会随着时间而老化，但较不同的地方是皮肤于日常生活中会受到环境因子的刺激，而使皮肤老化较人体其他组织与器官也较为剧烈。在众多环境老化因子中，以紫外线(ultraviolet，UV)照射最具影响力；紫外线波长范围10～400nm，能量范围为3eV至124eV，依波长可分为三种紫外线阶层:(1)长波紫外线(UV-A)，其波长介于315～400nm，可直接穿透地球大气层照射至地表，并可穿透皮肤真皮层，造成皮肤黑斑、老化及皱纹，其穿透力为三种波长中最强者；(2)中波紫外线(UV-B)波长介于280～315nm，会造成皮肤红肿、热、痛，严重甚至脱皮或者类似灼伤的症状，照射至地球时会被平流层中的臭氧层吸收，只有极少部分会通过臭氧层到达地表；(3)短波紫外光(UV-C)波长介于100～280nm，能量最强并有相当危险的伤害能力，但因其波长短会于大气层被吸收，只有小于总太阳光的0.1％能到达地表，且一般遮蔽防晒及玻璃屏障就可有效阻挡。有研究发现UV-A对于人类皮肤成纤维母细胞中会诱发基质金属蛋白酶的产生，基质金属蛋白酶家族会将皮肤胶原蛋白、弹性蛋白及细胞间基质等物质分解，使皮肤进行老化；UV-A会迫使细胞内自由基浓度提高，其浓度过高亦会使细胞提早老化更甚者细胞凋亡。
(3)自由基
自由基(Freeradical)理论是目前科学界最为一致认同的老化理论，由1954年美国林肯大学医学院DenhamHarmamM.D.提出但并未受到重视，二十年后自由基理论才逐渐被接受，如今已成为老化理论的主流之一，DenhamHarmam并于1995年荣获提名诺贝尔医学奖。正常原子是具有成对的电子，而自由基是含有不成对电子的氧原子物质；电子于不成对的状态下极度不稳定，故自由基会将正常原子的电子移转，使细胞构成基质发生改变，并造成细胞死亡。
自由基的重要来源除了自身新陈代谢或合成营养素之外，其导致老化来源为环境污染、紫外线、放射线、吸烟、杀虫剂及许多化学药品，尤其是环境污染(汽车的废气，工厂排放的SO2)都会增加体内大量有害自由基。
自由基攻击可分成细胞膜损害及DNA损害。对人类细胞而言，含氧的自由基包括有超氧阴离子O2 -、过氧化氢H2O2、氢氧基自由基OH-等，都统称为活性氧分子；过剩的自由基容易攻击细胞膜上不饱和脂肪酸。当自由基攻击细胞膜上不饱和脂肪时，形成脂肪过氧化酶(lipidperoxidase)，并氧化血管内壁低密度胆固醇并且抑制前列腺素合成酶(prostacyclineSynthetase)，造成动脉硬化、糖尿病、关节炎、白内障、老化、冠状动脉疾病等。若自由基深入到细胞核攻击DNA，使得遗传讯息改变进而导致癌症；此外，自由基可诱导老化基因并促进老化作用发生，研究指出约80％～90％的老化性、退化性疾病与自由基有关，其中包括癌症、老人痴呆症、帕金森氏症、肌肉营养不良、皮肤黑斑沉积、皱纹生成、黄班、退化心脏病、中风、溃疡、类风湿性关节炎及多发性硬化等。
细胞对自由基的防御机制：由细胞合成的各种抗氧化酶，如谷胱甘肽过氧化酵素(glutathionePeroxidase,GPx)、超氧歧化酶(superoxideDismutase，SOD)等酵素和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)，能清除超氧阴离子 等体内自然产生的物质；研究报告指出长寿动物体内的SOD含量比较高，而人类是目前所知体内SOD含量最高的动物。年长老化、体质改变、环境因素等，皆可能使体内抗氧化酶出现不足状况进而导致老化。
(4)发炎反应
发炎反应为当组织受伤或感染时产生的反应。首先肥大细胞(Mastcell)会到达组织，并会附着在内皮细胞释放出：
(1)组织胺(Histamine)：氨基酸的衍生物，会使微血管(capillary)通透性增加，局部血管扩张，使血浆(plasma)及吞噬细胞等物质能够通过，并造成痒及过敏反应。
(2)肿瘤坏死因子(TumorNecrosisFactor，TNF)：细胞素(cytokine)会杀死目标细胞并活化免疫系统，使淋巴细胞加速增殖且阻止病原体的增殖，并可吸引吞噬细胞过来。
(3)前列腺素(Prostaglandin)：使微血管扩张，导致于膨胀压迫神经末梢引发疼痛，在发炎反应过后会产生脓(pus)，脓由死细胞及体液构成，通常会被巨噬细胞消化。
特定的细胞因子就会活化自身环氧化酵素(cyclooxygenase，COX)，其中包括COX-1及COX-2两大类。COX会使花生四烯酸大量转变为PGE2和PGF2α等前列腺素。近期研究发现，在大多数正常组织都没有发现COX–2的存在，但是确可在各种癌症病人中检测出来，这显示了COX–2在肿瘤病患中的重要性。另，COX–2为一诱导酶，其功能为活化巨噬细胞或其他细胞，并充斥于炎症组织。
发炎部位产生热感，主因为血管扩张素或组织胺被释放，使得血管扩张及血液流量增加所造成。有些细胞会释放出IL-17(Interleukin-1alpha)的炎性细胞因子，或旧称白细胞介素(Inflammatorycytokines)等物质；用以活化特定白血球白三烯来抵挡致敏原；其中细胞因子还包括趋化因子，该趋化因子会启动细胞趋化机制以及干扰素，中止宿主细胞进行蛋白质的合成。而生长因子与细胞毒性分子也可能被释出，进行组织的疗愈。上述物质分泌时会使周围细胞也受到影响，导致细胞间基质流失进而老化。
由上述四点老化成因可得知皮肤老化过程中，因表皮层角质细胞及真皮层纤维母细胞的增生减缓，造成皮肤内真皮层细胞外基质的大分子成分及结构性蛋白发生改变，而导致皮肤的皱褶、皮肤变薄、肤色黯淡、皮肤弹性降低及保湿度降低等老化现象。而紫外线则会诱导皮肤间质蛋白酶生成，该蛋白酶会分解皮肤胶原蛋白及弹性纤维蛋白组织，且紫外线亦会造成细胞内自由基浓度提高，进而导致皮肤产生发炎反应并提前进行老化；另，经紫外线照射过后，皮肤会产生活性氧化物质使细胞膜、结构蛋白、核酸等细胞结构遭到破坏，最终导致皮肤细胞癌化、死亡，并使皮肤基质流失造成外表皱纹累积。
2.人类抗老化蛋白
有研究指出，细胞受到红酒中的化学物质白藜芦醇(resveratrol)或热量限制的刺激时，会启动sirtuinsfamily使其细胞周期延长。而Sinclair及其MITLeonardGuarente实验室发现，酵母菌中一种特殊的Sirtuins蛋白是以二种特定方式影响老化过程，Sirtuins可协助调控细胞中的基因活性并修补DNA中的断裂。
PhilippOberdoerffer,Sinclair实验室，则利用微数组平台于老鼠细胞中探测酵母菌sirtuin基因并寻找哺乳类动物的sirtuin基因序列；而老鼠研究结果亦证实了在脊椎动物上也有类似于酵母菌中的sirtuin基因。Oberdoerffer则发现，Sirtuin在哺乳类动物系统中的主要功能之一是监督基因表现的模式；所有基因都会出现在所有细胞中，但于特定时间里，只有少数几个基因需要活化，若错误基因被活化则会导致细胞损伤进而使其进入细胞凋亡。
Sirtuins会将被抑制表现的基因去乙酰化，使其不受到环境因子破坏，并使受抑制基因维持其关闭状态，保持细胞基因稳定；Sirtuins可协助保存染色质(chromatin)，将基因与组蛋白(histone)共同收缩及包覆，并使其保持闲置状态；当DNA因紫外光或自由基而受损时，Sirtuins会于受损处协助DNA修补机制；Sirtuins其保护功能可在基因造成永久性伤害前，将基因与蛋白包覆住以达到保护的效果。若未受Sirtuins保护，组蛋白会开始成松散状，被保存抑制的基因则会重新被启动，而使基因容易受外界干扰而损伤。
当小鼠老化时，DNA受损速率会增加，此种损害会使基因表现失去管制，染色质不受其控制旋开，此时Sirtuins则会帮助控管全基因组的失控；而在此失控中被活化的基因，有许多是直接与老化显型有直接关联的基因。
其他研究则发现，未受Sirtuins控管失控的小鼠基因，会持续不断地在老化的小鼠中出现。Oberdoerffer利用一只经过基因改造的淋巴瘤小鼠动物模型，当给予小鼠额外的sirtuin基因拷贝，或喂食小鼠sirtuin活化剂(activator)--白藜芦醇时，发现小鼠的平均寿命会被延长24％～46％。
LeonardGuarente的研究则指出，透过新药物的使用，随着时间稳定Sirtuins的重新分配，将会有新的方式来保护细胞避免老化。根据这种特定的机制，虽然DNA损伤会使老化恶化，但起因并非DNA受损本身，而是基因缺乏调控所致；Oberdoerffer研究亦指出，此调控基因活性的过程，称为外遗传(Epigenetics，表遗传)，不同于DNA中的实质突变；而透过对此原理的验证，发现能够以刺激Sirtuins的方式逆转老化。
3.皮肤穿透加强剂(TransdermalPenetrationEnhancers,TPE)
新药研究需耗费很多金钱及时间，故给药系统的开发，越来越受重视。最常见的药物服用方式，包括口服给药、皮下组织注射给药及经皮给药。口服给药是一种最常用的给药方式，药物在经口服后，通过胃肠粘膜吸收进入血液，达到局部或全身的治疗作用。而口服给药的缺点在于：药物经体内吸收慢而不规则，使得药物无法达到治疗作用；再者药物到达血液前要先经过肝脏，使得药物的药效受到破坏，也对肝脏造成负担；有些药物则因肠内无法吸收或具有刺激性而不能口服；而口服给药的最大缺点，在于药物会在体内造成副作用，使得病患会有恶心、呕吐等身体上的不适应。另一种给药方式为皮下组织注射法，该方法是将药物直接注入皮下，经皮下微血管吸收而输送到全身，其优点在于药物不会受到胃液和肝脏影响，可以直接进入血管并流经身体各个部位，达到治疗目的；皮下组织注射法与口服法相比，大大的提升了给药的速率，但对于长期依赖注射给药的病人来说，却需要长期承受因注射所造成的疼痛负担。又另一种给药方式为经皮给药系统(TransdermalDrugDeliverysystem,TDDS)，于该系统中药物是通过皮肤来吸收的；给药后，药物会在预定时间内，穿过皮肤角质层，并经微血管渗透吸收后，进入血液循环而产生作用，进而达到全身治疗的目的(Saundersetal.,1999)。
经皮给药治疗系统具有的优点包括:生产容易、成本低廉、可以恒定速率进入体内、可于血液中长时间维持稳定的浓度、减少给药频率、低毒副作用、避免肝脏的首过效应、降低药物代谢、减少用药的个体差异、提高生体可用率及小剂量即可达到治疗的效果等优点。另，经皮给药适用于年幼、老人或不易服药的病患；用药方便，发生问题时能立即移除，停止给药。由于经皮给药具有上述的优点，此系统备受瞩目；目前经皮给药的开发研究，已从局部向全身、靶向器官及控释机制发展，并已应用在临床上(Shinetal.,2005)。
经皮给药系统最大的障碍就是皮肤的角质层，角质层(stratumcorneum,SC)是皮肤的最上层，由扁平长型的角质细胞组成，角质细胞的四周则环绕着层状的脂肪(Norlen,2001)；角质层最主要的功能为阻止外界物质进入体内、防止体内水分散失，为皮肤最外层的屏障(Bouwstraetal.,2003)。1973年学者Breathnach等人利用电子显微镜发现角质层细胞间隙充满了脂肪，开始认为角质层脂肪在皮肤障壁功能上扮演重要的地位(Breathnachetal.,1973)。亦有研究指出，当角质层温度上升时，角质层细胞间脂肪的流动性增加，皮肤经皮吸收渗透性也随之增加(Goldenetal.,1987)；若将角质层中的脂质去除后，则可明显增加亲水性及两性药品对皮肤的渗透性，但对亲脂性的药物不具显著的影响(Tsaietal.,2001)。
克服经皮吸收的障碍问题，可使用下列三种方法:第一种是物理方法，给予一个外来的能量，使皮肤造成短暂性的孔洞，促进药物吸收；常见的处理方式有超声波(ultrasound)、电离子透入(iontophoresis)、微型针头列阵(microneedlearray)及热能量(thermalenergy)。第二种则为生化方法，利用合成生物转化前驱物以及和新陈代谢的抑制剂共同投药，以增加药物的吸收。第三种为化学方法，使用微脂粒(liposome)包覆药物或添加皮肤穿透加强剂(penetrationenhancer)，微脂粒是由弯曲的双层脂质组成，形成亲水朝外疏水端在内的双面亲水夹层，可同时作为油性与水性物质的载体，油性药物可嵌入脂质双层中，而水性药物则可包覆在微脂粒的水相中；微脂粒与细胞作用的机制有四种，第一种为膜组成交换(intermembranetransfer)，即微脂粒膜的组成与细胞膜的组成中有一部份互相交换；第二种是吸着(adsorption)，微脂粒附着于细胞膜；第三种方式是膜融合(fusion)，微脂粒与细胞膜融合，将包容物送进细胞内；最后一种是吞食(phagocytosis,endocytosis)，微脂粒被细胞吞食。而皮肤穿透加强剂(penetrationenhancer)是指可加速药物穿透皮肤的速度及含量，但不会对皮肤造成严重刺激及伤害的物质(WilliamsandBarry,1991)；皮肤穿透加强剂主要是作用在角质层的脂质层(intercelluar)，扰乱其规则结构及提高其流动性，并且作用在角蛋白(keratin)上，松弛角细胞结构，增加药物在角质层中的溶解度，达到增加药物吸收的目的(WalkerandSmith,1996)。添加皮肤穿透加强剂是相当具有发展潜力的助渗方法(Saundersetal.,1999)。
界面活性剂是一种良好的皮肤穿透加强剂，对生物膜及皮肤都有协助渗透的效果(Lopezetal.,2000)，近年来已经广泛的应用于药物穿透(Nokhodchietal.,2003；Shokrietal.,2001)。2001年Nokhodchi等人的研究指出，界面活性剂烷基硫酸盐(sodiumlaurylsulfate,SLS)、溴化十六烷三甲基铵(cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)及氯化苯二甲烃铵(BenzalkoniumChloride)可促进小鼠皮肤对抗忧郁药物Diazepam的吸收(Shokrietal.,2001)。Nokhodchi等人对另一个关于抗忧郁药物的研究指出，界面活性剂烷基硫酸盐(sodiumlaurylsulfate,SLS)、溴化十六烷三甲基铵(cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)及氯化苯二甲烃铵(BenzalkoniumChloride)可促进小鼠皮肤对抗忧郁药物lorazepam的吸收(Nokhodchietal.,2003)。而表面素对人工合成的细胞膜、原生生物的细胞膜及真核生物的细胞膜具有相当好的亲和力(Maget-DanaandPtak,1995；Sheppardetal.,1991；Tsukagoshietal.,1970b)；且表面素对和细胞膜的结合是具有高度选择性的，这是因为表面素对于胆固醇(cholesterol)及磷脂质(phospholipid)的亲和力很高，而细胞膜的结构就是以这两个物质为主(HosonoandSuzuki,1985)。若和化学合成的界面活性剂相比，表面素较温和，不会对皮肤造成伤害。
一般传统的方法，药物或营养活性物质只能渗透入表皮的阻隔层(即角质层)，效果并不显著(只达到约百分之零点三的成效)；为解决这个问题，有很多经皮吸收技术被研发出来，目的是有效提升养分的渗透能力，使养分穿越皮肤表皮层及真皮层细胞，因此养分输送方法变成为护肤科技的研究重点之一。
虽然人类皮肤的角质层很薄，其厚度仅为10-25微米，最薄的角质层在上眼皮，仅有6微米厚，但却相当―坚韧‖，是皮肤最重要的保护层。而一般化妆品原料经皮渗入主要是经过3种途径：1.经汗腺管(sweatduct)；2.直接穿过角质层(stratumcorneum)；及3.经过毛囊(hairfollicle)。
化妆品原料以黄金为例，现代黄金美容研究证实，黄金具有解毒、镇静、洁净及去皱的功能，使用后可使肌肤重组细胞因子，促进生理机能、新陈代谢、平衡油脂分泌及保持天然水分，并可抵抗外界引起的过敏。而化妆品原料中常用的奈米金，其大小相当于人类毛细孔的1/200，因此使用含奈米纯金微粒护肤品涂于肌肤时，是希望奈米金能效瞬间深入真皮层细胞。
当奈米金进入真皮层后，奈米金可在基因的层次上，调节真皮细胞功能，其中包括促进真皮细胞产生一系列活性物质，包括SOD、金属硫蛋白、EGF等。由于SOD可清除羟基自由基，金属硫蛋白又能抵抗皮层细胞受紫外线的损伤，所以奈米金对真皮细胞具有抗衰老的效果。亦有其他研究显示奈米金能刺激纤维细胞，进而分泌合成新的胞外基质(ECM)，刺激纤维母细胞分泌胶原蛋白，和刺激纤维细胞呈现及分泌表皮生长因子(EGF)，来分化目标细胞特异的角化细胞生长因子(KGF)；同时也就加强了皮肤的紧致度，让皮肤平滑而充满弹力，发出闪亮的光辉。
4.生物乳化剂(Bioemulsifier)
表面素除了可作为抗菌肽之外，表面素更扮演了另外一个重要的角色，生物乳化剂(bioemulsifier)。1999年Deleu等人发现在抑制乳析及絮凝作用的测试中，伊枯草杆菌素的效果会较表面素好，在对烷类的乳化效果测试中，表面素对烷类的乳化效果，远大于伊枯草杆菌素及丰原素，乳化效果最差的是化学合成的阴离子界面活性剂十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate,SDS)。其他研究显示，添加20mg/L的表面素可增加柴油生物分解性，且更进一步指出pH值会影响表面素对柴油的乳化效力，将pH值调整为7.4时，表面素对柴油的生物分解性最佳。
5.起泡剂
除了一般界面活性剂具有的乳化能力外，表面素亦具有起泡能力(Razafindralamboetal.,1998)。所谓起泡现象是指，表面素会存在于气相及液相的界面中，剧烈摇晃使界面活性剂将空气抓下，形成内含空气的薄膜(Halling,1981)。Razafindralambo等人亦指出，和伊枯草菌素相比，表面素具有较优异的起泡效果，推测是和两者之间的结构有关系，表面素属于阴离子界面活性剂，其脂肪酸碳链较短，而伊枯草杆菌素则为非离子界面活性剂，脂肪酸碳链较长(Razafindralambo,etal.,1998)。
发明内容
本发明的目的在提供一种以表面素(surfactin)制备抗老化(或抗皱纹)化妆品组合物的方法，其中该组合物包含表面素及药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、辅剂等；其中该表面素为一环脂胜肽分子，由7个氨基酸组成(L-天冬氨酸，L-亮氨酸，谷氨酸，L-亮氨酸，L-缬氨酸与两个D-亮氨酸)的环状7肽(heptapeptide)结构，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。此环化7肽连接一个β-羟基脂肪酸，其中又以异14烷(isoC14)羟基为主(17％～35％)；其中该表面素在脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：(1)异C13大于3％；(2)正C13大于0.65％；(3)异C14大于17％；(4)正C14少于41％；及(5)异C15少于11％；其中，优选的，该脂肪酸末端的脂肪酸分布以下列分布：(1)异C13大于10％；(2)正C13大于25％；(3)异C14大于35％；(4)正C14少于25％；及(5)异C15少于3％；其中，更优选的，该脂肪酸末端的脂肪酸分布以下列分布：(1)异C13为11％；(2)正C13为26％；(3)异C14为37％；(4)正C14为24％；及(5)异C15为2％；其中该表面素的分子量为1022或1036Da；其中该表面素包含其化学异构物。(参见中华民国专利申请号097137532)。
其中该抗老化(或抗皱纹)化妆品组合物可进一步包含下列至少一种：醇类、酯类、复合多醣体、坚果油及维生素；其中该醇类包括下列至少一种：C16-18醇、丁二醇、戊二醇、辛二醇、丙三醇、16醇、18醇、22醇及丙二醇；其中该酯类包括下列至少一种：橄榄油鲸蜡醇酯(OLIVEM1000)、单硬脂酸甘油酯(GSM)、十四酸异丙酯(IPM)、十六酸异丙酯(IPP)及三酸甘油酯；其中该复合多醣体系包括下列至少一种：汉生胶、银耳多醣体、葡聚多醣体、狭叶番泻籽多醣体；其中该坚果油包括下列至少一种：阿甘油、夏威夷核果油、酪梨油、小麦胚芽油、橄榄油；其中该维生素包括下列至少一种：维生素A、维生素B、维生素C、维生素E、维生素F、维生素K。
其中该抗老化(或抗皱纹)化妆品组合物用以促进纤维母细胞的增殖、抗紫外光老化、抗氧化、促进sertuin1基因的表现、促进胶原蛋白的增生和抑制基质金属蛋白酶(Matrixmetallopeptidase)；其中该基质金属蛋白酶为基质金属蛋白酶九型(Matrixmetallopeptidase9)。
本发明进一步提供一种以表面素(surfactin)制备增加皮肤穿透力的组合物的方法，其中该组合物包含表面素及药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、辅剂等；其中该表面素为一种环脂胜肽，该表面素包括连接至β羟基脂肪酸的七胜肽序(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。该表面素在脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：(1)异C13大于3％；(2)正C13大于0.65％；(3)异C14大于17％；(4)正C14少于41％；及(5)异C15少于11％；其中，优选的，该脂肪酸末端的脂肪酸分布以下列分布：(1)异C13大于10％；(2)正C13大于25％；(3)异C14大于35％；(4)正C14少于25％；及(5)异C15少于3％；其中，更优选的，该脂肪酸末端的脂肪酸分布以下列分布：(1)异C13为11％；(2)正C13为26％；(3)异C14为37％；(4)正C14为24％；及(5)异C15为2％；其中该表面素的分子量为1022或1036Da；其中该表面素包含其化学异构物；其中该增加皮肤穿透力的组合物可进一步包含下列至少一种：醇类、酯类、复合多醣体、坚果油及维生素；其中该醇类包括下列至少一种：C16-18醇、丁二醇、戊二醇、辛二醇、丙三醇、16醇、18醇、22醇及丙二醇；其中该酯类包括下列至少一种：橄榄油鲸蜡醇酯(OLIVEM1000)、单硬脂酸甘油酯(GSM)、十四酸异丙酯(IPM)、十六酸异丙酯(IPP)及三酸甘油酯；其中该复合多醣体包括下列至少一种：汉生胶、银耳多醣体、葡聚多醣体、狭叶番泻籽多醣体；其中该坚果油包括下列至少一种：阿甘油、夏威夷核果油、酪梨油、小麦胚芽油、橄榄油；其中该维生素包括下列至少一种：维生素A、维生素B、维生素C、维生素E、维生素F、维生素K。
其中该增加皮肤穿透力的组合物用以促进化妆品原料穿透皮肤；其中该化妆品原料为皮质类固醇(dexamethasone)、玻尿酸(hyaluronicacid)、聚谷氨酸(Gamma-polyglutamicacid)和奈米金(gold-nanoparticles)。
本发明更提供一种以表面素(surfactin)制备乳化剂组合物的方法，其中该乳化剂组合物包含表面素及药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、辅剂等；其中该表面素为一种环脂胜肽，该表面素包括连接至β羟基脂肪酸的七胜肽序(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
该表面素在脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：(1)异C13大于3％；(2)正C13大于0.65％；(3)异C14大于17％；(4)正C14少于41％；及(5)异C15少于11％；其中，优选的，该脂肪酸末端的脂肪酸分布以下列分布：(1)异C13大于10％；(2)正C13大于25％；(3)异C14大于35％；(4)正C14少于25％；及(5)异C15少于3％；其中，更优选的，该脂肪酸末端的脂肪酸分布以下列分布:(1)异C13为11％；(2)正C13为26％；(3)异C14为37％；(4)正C14为24％；及(5)异C15为2％；其中该表面素的分子量为1022或1036Da；其中该表面素包含其化学异构物；其中该乳化剂组合物可进一步包含下列至少一种：脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨醇酐酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸丙二醇酯、卵磷脂。
其中该乳化剂组合物用以增加起泡力、增加乳化作用、增加滑顺感；其中该乳化剂组合物用以增加清洁用品的起泡力，该清洁用品为洗发精、洗面奶、洗手乳及沐浴精等；其中该乳化剂组合物用以增加化妆品的乳化力，该化妆品为身体乳、面霜、精华液、隔离霜等；其中该乳化剂组合物用以增加清洁用品的滑顺感，该清洁用品为洗发精、洗面奶、洗手乳及沐浴精等。
附图说明
图1为不同浓度表面素对于小鼠胚胎纤维母细胞(BALB/3T3cloneA31Musmusculusembryofibroblast)的长寿基因(sertuin1基因)mRNA表现的影响；将小鼠胚胎纤维母细胞培养于不同浓度的表面素(0、25、50、75、100μM)，培养时间为6、12、24、36、48小时；
图2为白藜芦醇(Resveratrol)、五胜肽(Palmitoylpentapeptide-3)及表面素对细胞增殖的影响；将小鼠胚胎纤维母细胞培养于不同浓度的表面素(0、25、50、75、100μM)、白藜芦醇(0、5、10、20、30μM)和五胜肽(0、3、5、8、10μM)，培养时间为48小时；
图3为表面素抗光老化的作用；不同浓度的表面素对受过紫外光照射后的小鼠胚胎纤维母细胞的存活率的影响；细胞以5J/cm2、10J/cm2及15J/cm2的紫外光照射后，添加25、50、75、100及125μM浓度的表面素，培养24小时后，以MTT法测试细胞活存率；
图4为表面素对小鼠胚胎纤维母细胞的抗氧化压力的保护效果；细胞以100、150、200及250μM浓度的过氧化氢处理后，再添加0、25、50、75及100μM浓度的表面素，培养24小时，然后以MTT法测试细胞存活率；
图5为表面素与五胜肽对小鼠胚胎纤维母细胞的胶原蛋白含量(collagendose)的影响；其中胶原蛋白含量是以Sircolcollagenassay来测量；小鼠胚胎纤维母细胞是以不同浓度的表面素(0、25、50、75、100μM)和五胜肽(0、3、5、8、10μM)培养24小时；PBS：磷酸盐缓冲溶液；a,b,ab,c,d代表若符号相同则没有统计上的差异；
图6为表面素(SF)与五胜肽(PPP-3)对基质金属蛋白酶(Matrixmetallopeptidase9)的抑制能力；基质金属蛋白酶的量是以酵素免疫测定法(ELISA)来测量；小鼠胚胎纤维母细胞分别培养于不同浓度的五胜肽(0、3、5、8及10μM)与表面素(0、25、50、75及100μM)；a,b,c代表若符号相同则没有统计上的差异；
图7为表面素促进皮肤吸收皮质类固醇的测试；实验分成两组，控制组以PBS(pH＝7.4)100μl混合异硫氰酸(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的皮质类固醇(dexamethasone)，添加于1cm2无菌脱脂棉并以透气贴布固定于小鼠背部；实验组为以异硫氰酸标记的皮质类固醇添加0、0.2、0.5、1、2、5％的表面素来处理；实验结果则以共轭焦显微镜观侦测其荧光亮度；(A)～(F)图依序为皮质类固醇添加0、0.2、0.5、1、2、5％表面素；SF:表面素；
图8为表面素促进皮肤吸收保湿因子玻尿酸(HA)的测试；实验分成两组，控制组以PBS(pH＝7.4)100μl混合异硫氰酸(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的玻尿酸(hyaluronicacid)，添加于1cm2无菌脱脂棉，并以透气贴布固定于小鼠背部。实验组为以异硫氰酸标记的玻尿酸添加0、0.2、0.5、1、2、5％的表面素处理一小时；实验结果则以共轭焦显微镜观侦测其荧光亮度；(A)～(F)图依序为玻尿酸添加0、0.2、0.5、1、2、5％的表面素；SF:表面素；
图9为表面素促进皮肤吸收保湿因子(γ-GPA)的测试；实验分成两组，控制组以PBS(pH＝7.4)100μl混合异硫氰酸(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的γ-GPA，添加于1cm2无菌脱脂棉并以透气贴布固定于小鼠背部；实验组以异硫氰酸标记的γ-GPA添加0、1％、2％、5％、10％、15％、20％的表面素处理一小时，实验结果则以共轭焦显微镜观侦测其荧光亮度；(A)～(G)图依序为γ-GPA添加0、1％、2％、5％、10％、15％、20％的表面素；
图10为表面素具促进奈米金经皮肤吸收的效果；奈米金的量是以荧光显微镜来测量；绿色荧光代表奈米金的存在，混合有表面素的奈米金实验组可以于小鼠(BALB/c)真皮层发现有较多的奈米金；绿色亮点为毛囊自体荧光(hairfolliclesautofluorescence)；SCsurface:角质层(Stratumcorneum)表面；
图11为表面素的乳化力分析；将不同浓度的表面素溶于pH为6.4、7.4及8.4的缓冲溶液中，取出2ml并添加3ml柴油于试管中，以震荡(vortex)2分钟，于室温下静置24小时后，测量其乳化指数(emulsificationindex,E24)；
图12为表面素的起泡力分析；将不同浓度粗纯化表面素溶于pH为7.4的缓冲溶液中，以震荡(vortex)两分钟后静置1小时后，测量其泡沫高度，并计算其最大起泡密度(foammaximumdensity,MD)；
图13显示的为表面素浓度和起泡高度之间的关系；
图14显示的为表面素浓度与浊度(Turbidity％)之间的关系；
图15显示的为稀释于聚合物和界面活性剂复合物(polymer-surfactantcomplex)后，含有表面素的洗发精会有沉淀的产生。
具体实施方式
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。其中以下各实施例以具有以下特征的表面素来实施：该表面素为一种环脂胜肽，且该表面素包括连接至β羟基脂肪酸(beta-hydroxyfattyacid)(连结13～15个碳氢链)的七胜肽序(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu；其中该脂肪酸的异C14约为37％。
实施例一表面素对人类皮肤及小鼠胚胎纤维母细胞的抗老化试验
实验材料与方法
1.实验细胞株
Humanskinfibroblast(CCD-966SK)购自BCRC生物资源保存及研究中心－编号：60153。
2.MouseBALB/3T3embryo(BALB/3T3CloneA31)购自BCRC生物资源保存及研究中心－编号：60009。
3.实验动物
由国家实验动物中心购得单一性别的BALB/cByJNarl品系小白鼠，体重约为200～250千克，饲养条件为人工光照每日12小时、湿度75％和温度25℃，饲养于含空调设备的海洋大学生命科学动物房，并由专人照顾给予足够的饲料及饮水。
4.抗老化基因表现量测试
(1)人类及小鼠基因cDNA序列选殖
本实验利用TRIzolreagent(Invitrogen,USA)抽取人类皮肤纤维母细胞及小鼠胚胎纤维母细胞的TotalRNA，经RNA电泳分析后；利用反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)进行人类皮肤纤维母细胞sirtuin1、sirtuin3及小鼠胚胎纤维母细胞sirtuin1基因序列的克隆；并由基因数据库(GeneBank)寻找已知的sirtuins基因序列，利用GCGprogram寻找相似性高的序列，设计一对引物(Primer)，进行聚合酶连锁反应(Polymerasechainreaction，PCR)；再取一小部分反应产物经由1.2％凝胶电泳分析，当出现与预期基因片段大小相符的产物时，将所剩下的产物经由低熔点琼脂凝胶电泳后，将所需胶体的产物由凝胶上切下，进行凝胶萃取以取得纯化的特定大小DNA片段，此纯化片段与克隆载体pGEM-T-easyvector(pGEM-T-easycloningkit,Promega,USA)进行连接反应，再转型入胜任细胞中；最后经由小量培养后，抽取克隆载体进行测序，将序列资料利用美国生物信息中心(NCBI)网站的BLAST程序进行比对。经由以上步骤克隆出正确的部分人类皮肤纤维母细胞sirtuin1、sirtuin3及小鼠胚胎纤维母细胞sirtuin1cDNA序列的克隆株后，将克隆株再次转型入胜任细胞中复制，并抽取高纯度质体保存，以便进行后续实验。
(2)细胞TotalRNA的萃取
RNA在自然环境中容易受到RNase的分解，所以实验前必须将所用的器具以高温灭菌，并在烘箱中烘干。在操作过程中配戴手套及口罩。取欲进行实验的细胞实验组，迅速将800μLTRIzolTMreagent加入培养皿中，再将冲洗下来的细胞液放置于灭菌Tube中，加入所使用TRIzolTMreagent总体积1/5的氯仿(Chloroform)，强力摇晃30秒，于室温下静置15分钟，再于4℃以13200rpm离心15分钟，将上清液抽出至新的1.5mL微量离心管中。此时RNA会溶于上清液的水层中，将上清液吸入另一个干净的1.5mL微量离心管中，加入所使用TRIzolTMreagent体积1/2的异丙醇(Isopropanol)及高盐溶液(1.2MSodiumChloride及0.8MSodiumcitrate)，均匀摇晃后于-20℃下静置30分钟，再于4℃以13200rpm离心15分钟以沉淀RNA；小心的移除上清液，先加入800μL的100％绝对酒精摇晃冲洗后，于4℃以13200rpm离心10分钟后，移除100％酒精。小心吸取并移除上清液，以55℃干燥RNA沉淀物5分钟。将沉淀物溶解在15μLDEPC水中。置于55℃下10分钟以溶解RNA，最后储存在-80℃冷冻冰柜中备用。
(3)RNA浓度与纯度的测量
以分光光度计测量OD260，计算RNA浓度的标准为1OD260＝40μgofRNA/mL，其公式40μg×dilutefactor×A260＝μg/mL。RNA纯度以OD260/OD280的比值为依据，比值介于1.9～2.0之间为纯度较高的RNA。
(4)反转录(ReverseTranscription，RT)
取5μg的TotalRNA于200μL微量离心管中并以DEPC水将总体积调整至13μL，加入1μL的oligo(dT)18、10mMdNTPs，置于冰上。再加入5×AMVbuffer4μl及AMV1μl(40units/μL)，均匀混合，于42℃反应60分钟以合成cDNA，再以70℃作用10分钟以终止反应。
(5)聚合酶连锁反应(Polymerasechainreaction，PCR)
将RT做好的cDNA模板(Template)，以Taqpolymerase进行聚合酶连锁反应(PolymeraseChainReaction，PCR)扩增分析。取1μLcDNA加入0.5μL的10mMdNTPs、2.5μl的10×PCRbuffer、专一性引物(Genespecificprimer，GSP)各0.5μL及0.25μLTaqpolymerase，并加入二次灭菌水将总体积调整至25μL。将反应管置入PCR反应器(DNAthermalcycler；AppliedBiosystems2720ThermalCycler)中，设定以下条件反应：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒；64℃退火30秒；72℃延伸1分钟；变性、退火、延伸步骤重复30个循环后保存在4℃下。取反应后的PCR产物5～15μL，以1.5％琼脂凝胶进行电泳分析，经溴化乙锭(EtBr)染色10分钟后，以水退染约10分钟，置于照相系统DigitalGelImageSystem撷取影像，并以UN-SCAN-ITgel-GelAnalysisSoftwareVersion6.1定量分析。
(6)实时定量聚合酶连锁反应(Real-timequantitativePCR)
利用荧光染剂SYBRgreenI可镶嵌在DNA双股凹槽上，经由卤素灯激发而产生荧光的特性，侦测其荧光值的量。当SYBRgreenI没有镶嵌在双股DNA上时，荧光背景值非常低；当SYBRgreenI开始镶嵌在PCR放大的标的基因片段上时，荧光值讯号也会相对的提高。如无非特异性引物的结合，或GenomicDNA的污染等干扰影响，PCR反应合成目的基因的状态可区分为的DNA合成为两倍倍增的几何级数倍增期(Geometricphase)，与反应物不足，基因合成非两倍倍增的线性增加期(Linearphase)；以及最后反应物耗尽、失效，达反应终点的高原期(Plateauphase)。因此要侦测目的基因在组织器官的表现量，必须在PCR反应的几何级数倍增期定量才具有意义。Real-timequantitativePCR的原理就是利用不同浓度模板在相同PCR反应条件下，含有高浓度模板的反应会较快达到几何级数倍增期，相对的低浓度的模板则较慢达到，将定义达到几何级数倍增期中点的临界PCR循环数目定为CT(Thresholdcycle)，也就是说CT值会随模板浓度降低而升高。利用用不同浓度标准品在同步定量PCR反应的CT值，由软件计算绘制标准曲线与回归公式，以内插法换算代测样品内含有目的基因绝对表现量。同时若要得到MeltingCurve，则在目的基因放大循环后进行meltingtemperature40℃～99℃的连续荧光侦测，分析meltingcurve的结果可以了解引物是否会自行有互补的现象，或是引物的专一性，以更正确的帮助了解实验定量的正确性。
将96wellPCRplate放置在4℃预冷的96wellPCRplate专用冰盒上，分别加入10μLSYBRgreen、各4μL的Real-timePCR专一性引物(表1)，最后加入2μL的RT产物作为PCR反应的模板，贴上96wellPCRplate专用膜后置于4℃离心机中以1500rpm离心3分钟，将样品离心至PCRplate底部。将PCRplate置入实时定量PCR反应器中(Rochelightcycler480RealtimePCR)中，设定以下反应条件：热启动(Hotstart)反应以95℃反应5分钟；扩增反应(Amplification)以95℃变性30秒、60℃退火30秒，进行40个循环；并连续侦测荧光值，以判断扩增的产物是否皆为相同的退火温度。完成反应后将反应数据以Roche软件进行分析。实验所得的数据，以SPSS软件，运用单变量分析(One-wayanalysisofvariance)，依Duncan’sMultipleRangeTest比较各因子间显著差异程度(p<0.05)，所得数据以平均值±标准偏差(Mean±SD)表示。
表1Real-timePCR专一性引物
| Primer | Sequence | Base | |
| SEQ ID NO.2 | Mouse-RSP16-F | 5’-CTGGGTATCT TGACTAAGCC TGAC-3’ | 24 |
| SEQ ID NO.3 | Mouse-RSP16-R | 5’AGTTCTCCAC CTCTTTCT CAATCC-3’ | 24 |
| SEQ ID NO.4 | Mouse-SIT1-F | 5’TGTGGCTCC ATCCTACCT-3’ | 18 |
| SEQ ID NO.5 | Mouse-SIT1-R | 5’-CATTCCTGG GACGCTTAT-3’ | 18 |
| SEQ ID NO.6 | Human-GADPH-F | 5’-ATGAGGTGC ATCGCCCTC TTT-3’ | 21 |
| SEQ ID NO.7 | Human-GAPDH-R | 5’-TCAGGCAAAAGCTTTCTC TCG-3’ | 21 |
| SEQ ID NO.8 | Human-SIT1-F | 5’-GGBGACTAC TTGGACATY CTGGC-3’ | 23 |
| SEQ ID NO.9 | Human-SIT1-R | 5’-TTGCTCCAC ACATATTTRCCRC-3’ | 22 |
| SEQ ID NO.10 | Human-SIT3-F | 5’-GGATTTGGA CGTGCGACCAA-3’ | 20 |
| SEQ ID NO.11 | Human-SIT3-R | 5’-CGTGTCAGT GCTGTGTCGCT-3’ | 20 |
| SEQ ID NO.12 | T7 | 5’-TAATACGAC TCACTATAGGG-3’ | 20 |
| SEQ ID NO.13 | SP6* | 5’-ATTTAGGTG ACACTATAG AAT-3’ | 21 |
| SEQ ID NO.14 | Oligo d(T)* | 5’-TTTTTTTTT TTTTTTTTT-3’ | 18 |
*:反向引子(reverseprimer)
结果
表面素促进小鼠胚胎纤维母细胞的长寿基因(sertuin1基因)表现和增殖
由图1可知，表面素可以促进小鼠胚胎纤维母细胞的长寿基因(sertuin1基因)的表现；当给予小鼠胚胎纤维母细胞不同浓度的表面素时，不同浓度的表面素对于sertuin1基因的表现，具有不同的效果；当给予小鼠胚胎纤维母细胞表面素6小时后，50μM、75μM的表面素具有促进sertuin1基因表现的效果；当给予小鼠胚胎纤维母细胞表面素12小时后，25μM的表面素具有促进sertuin1基因表现的效果；当给予小鼠胚胎纤维母细胞表面素36时后，50μM、100μM的表面素具有促进sertuin1基因表现的效果；当给予小鼠胚胎纤维母细胞表面素48后，50μM的表面素具有促进sertuin1基因表现的效果。其中50μM的表面素对于促进sertuin1基因的表现，具有最好的效果。
图2为白藜芦醇(Resveratrol)、五胜肽(Palmitoylpentapeptide-3)及表面素对小鼠胚胎纤维母细胞的增殖的影响；由图2可以得知表面素具有促进小鼠胚胎纤维母细胞增殖的效果，且以75μM的表面素促进细胞增殖的效果最佳，50μM的表面素促进细胞增殖的效果次佳。另，表面素促进细胞增殖的效果亦较白藜芦醇和五胜肽佳。
实施例二表面素具有抗光老化与抗氧化作用
1.表面素具有抗光老化修护功能
将细胞分盘后，培养4小时使其固定于培养皿后，以UV-A波长的紫外线灯管作为光紧迫来源，于紫外光杂交箱中对实验细胞照射其能量浓度为0J/cm2、10J/cm2及15J/cm2，照射后添加25、50、75、100及125μM浓度的表面素，培养24小时后，以MTT法测试细胞活存率。
由图3可知，表面素具有抗光老化修护功能；当给予小鼠胚胎纤维母细胞照射10J/cm2之紫外光后，25、50、75、100及125μM浓度的表面素皆具有增加细胞存活率的效果，且以75μM浓度的表面素效果最佳；当给予小鼠胚胎纤维母细胞照射15J/cm2的紫外光后，25、50、75、及100μM浓度的表面素皆具有增加细胞存活率的效果，且以50μM浓度的表面素效果最佳。
2.表面素具有抗氧化修护功能
将小鼠胚胎纤维母细胞分盘后，培养4小时使其固定于培养皿后，以过氧化氢作为氧化紧迫来源；细胞以100、150、200及250μM浓度的过氧化氢处理后，再添加25、50、75及100μM浓度的表面素，培养24小时，然后以MTT法测试细胞活存率。
由图4可知，表面素可以增加以过氧化氢处理过的小鼠胚胎纤维母细胞的存活率。其中25、50、75μM浓度的表面素皆有良好的效果，而75μM浓度的表面素的效果最为显著。
实施例三表面素对小鼠胚胎纤维母细胞的胶原蛋白增长效果
1.胶原蛋白浓度分析
使用胶原蛋白浓度分析试剂盒(SircolTMsolublecollagenassaykit)分析培养基中胶原蛋白总浓度。分析方法简述如下：
取待分析样品与不同浓度的标准品0.1mL置于1.5mL离心管。加入1mLdyereagent，以震荡混合器振荡35min。离心12000rpm10min，倒去上清液。小心的以吸水纸除去离心管边缘的残留液，勿碰触沉淀物。加入1mLAlkalireagent溶解沉淀物，呈色稳定后取出0.2mL置入96孔盘，以ELISAreader读取570nm处的吸光值。
2.表面素具有增加小鼠胚胎纤维母细胞的胶原蛋白的效果
由图5可知，表面素可以增加小鼠胚胎纤维母细胞的胶原蛋白的增生；与给予磷酸盐缓冲溶液(Phosphatebufferedsaline,PBS)培养的对照组相比较，25、50、75及100μM的表面素对于增加细胞内的胶原蛋白，皆有很好的效果，而其中以100μM的效果最佳。而软脂五胜肽(Palmitoylpentapeptide-3,PPP-3)亦能够增加细胞内的胶原蛋白含量，但其效果与表面素相比较，表面素的效果似乎较好。
实施例四表面素具有抑制基质金属蛋白酶(Matrixmetallopeptidase9)的效果
1.基质金属蛋白酶(Matrixmetallopeptidase9)抑制效果测定
将小鼠胚胎纤维母细胞培养分盘后，加入商用活性抗皱物质3、5、8及10μM(Palmitoylpentapeptide-3)与加入25、50、75及100μM表面素进行比较，分析方式为以AbnovaMMP-9(Mouse)ELISAKit和ELISAReader进行细胞中基质金属蛋白酶九型的浓度分析。
2.表面素具有抑制基质金属蛋白酶的效果
由图6可知，50、75及100μM的表面素具有抑制基质金属蛋白酶的效果；且以50μM的表面素抑制效果最佳。
实施例五表面素促进化妆品原料皮肤穿透
1.实验方法
实验进行前，先进行背部剃毛的动作。将6-8周小白鼠以麻醉剂舒泰(Zoletil)进行腹腔注射将麻醉，使动物躺平后，用电动剃毛刀轻柔地将背部的毛剃除，以脱毛膏去除剩余体毛。并将动物安置在有保暖灯的笼子(cage)中，并且给予饮水照顾。实验前，以舒泰(Zoletil)将小白鼠进行麻醉。实验分成两组，控制组以PBS(pH＝7.4)100μl混合异硫氰酸(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的玻尿酸(hyaluronicacid)或皮质类固醇(dexamethasone)，添加于1cm2无菌脱脂棉并以透气贴布固定于小鼠背部。实验组则以玻尿酸或皮质类固醇各添加0.2、0.5、1、2、5％surfactin处理。
处理一小时后将小鼠以CO2窒息法牺牲小鼠，以酒精将皮肤上残留的药品清理，剪下小鼠背部皮肤，以Optimumcuttingtemperaturecompound(O.C.T)(Japen)包埋后进行冷冻切片(CM-2000,Leica,Germany)。
2.表面素可促进皮质类固醇穿透皮肤
由图7可知，表面素可促进皮质类固醇穿透皮肤；藉由观察荧光的强度，可以知道各实验组中皮质类固醇穿透皮肤的量；荧光强度越强者，代表其穿透皮肤的皮质类固醇量越多；其中图7中的(B)、(C)、(D)、(E)可观察到较对照组(A)多的荧光；也就是说，0.2、0.5、1、2％的表面素可以增加皮质类固醇穿透皮肤的量。
3.表面素促进皮肤吸收保湿因子玻尿酸(HA)
由图8可知，表面素可促进皮肤吸收玻尿酸；荧光强度越强者，代表其穿透皮肤的玻尿酸量越多；其中以图8中的(A)所观察到的荧光强度最强；意即1％的表面素促进皮肤吸收保湿因子玻尿酸的效果最佳。
4.表面素促进皮肤吸收保湿因子聚谷氨酸(Gamma-polyglutamicacid,γ-GPA)
由图9可知，表面素可促进皮肤吸收保湿因子(γ-GPA)；荧光强度越强者，代表皮肤吸收的聚谷氨酸量越多；其中第9图中的(B)、(C)、(D)、(E)、(F)、(G)皆可观察到较对照组(A)多的荧光；也就是说，1、2、5、10、10、15、20％的表面素皆可以增加皮肤吸收聚谷氨酸的量。
5.表面素促进奈米金(gold-nanoparticles,2nm)经由皮肤的吸收
当我们使用奈米金与表面素混合涂抹于老鼠表皮后，经一段时间，摘取皮肤进行冷冻切片，由于奈米金可自行发光，因此可直接以光学显微镜观察奈米金在皮肤表皮层与真皮层的荧光含量。结果显示使用传统工艺乳化得到的护肤品膏体，其内部结构为胶团状或胶束状，因此不利于皮肤吸收奈米金，奈米金仅在表皮层被发现。而于添加12.5ppm表面素后，可显著促进奈米金经由皮肤吸收的效果(图10)。
由以上研究结果可知，本发明表面素可以取代化学合成的界面活性剂，广泛应用于经皮给药系统。
实施例六表面素乳化力分析
乳化指数为界面活性剂的重要指标之一，本发明参考Cooper等人所使用的方法，测量界面活性剂对柴油的乳化指数。将不同浓度粗纯化表面素溶于pH为6.4、7.4及8.4的缓冲溶液中，取出2ml并添加3ml柴油于试管中，以震荡(vortex)2分钟，于室温下静置24小时，测量乳化层高度与溶液总高度之比值乘上100％即为该待测液之乳化指数。油品乳化能力的大小以乳化指数(emulsificationindex,E24)表示，其中E24的公式如下所列:
E24(％)＝(乳化层高度÷溶液总高度)×100％
由图11可知表面素于pH＝7.4时，具有较佳的乳化力，且当表面素于pH＝7.4和160μg/ml浓度时，具有最佳的乳化力。
实施例七表面素可作为起泡剂
1.起泡力分析
界面活性剂具有低起泡性的特性，本发明即为测试粗纯化的表面素是否具起泡性。参考Razafindralambo等人所使用的方法，将不同浓度粗纯化表面素溶于pH为7.4的缓冲溶液中，以震荡(vortex)两分钟后静置1小时，测量其泡沫高度。起泡力以最大起泡密度(foammaximumdensity,MD)表示，将总液体高度除以最大起泡高度即可得到最大起泡密度。
2.表面素可作为起泡剂
表面素具有许多生物特性，包含一般界面活性剂皆有的起泡及乳化能力(Razafindralamboetal.,1998)。所谓起泡现象是指，表面素会存在于气相及液相的界面中，剧烈摇晃使界面活性剂将空气抓下，形成内含空气的薄膜(Halling,1981)。本发明测试BacillussubtilisTH生产的表面素是否具有起泡的活性，结果显示加入大于150μg的表面素于缓冲液中，MD值没有明显下降，最低MD值为1.23(图12)；推测可能是添加于去离子水中的表面素浓度已达临界微胞浓度(Criticalmicelleconcentration,CMC)，表面素形成微胞状，只剩下单体在溶液中作用。图13显示的为表面素浓度和起泡高度之间的关系。Razafindralambo等人指出，表面素最低MD值可达0.10，和伊枯草菌素相比，表面素具有较优异的起泡效果，推测是和两者之间的结构有关系，表面素属于阴离子界面活性剂，且其脂肪酸碳链较短，而伊枯草杆菌素则为非离子界面活性剂，脂肪酸碳链较长(Razafindralamboetal.,1998)。BacillussubtilisTH生产的表面素具有起泡能力，可当应用于清洁剂、洗发精、洗手乳等个人保养品。
实施例八表面素作为滑顺剂
表面素于冲洗时会表现出色的滑顺感(Flushingwillshowgoodsenseofsmooth)，而在低浓度的情况下，会产生液滴(coacervate)现象。
1.表面素可降低浊度
(1)把洗发精的相对浓度调整为0.01-1.0，相对浓度＝洗发精原液(g)/(洗发精原液(g)+水(g))。
(2)测定(1)溶液420ml中的透过率(％、温度40℃)、简单地表示它的浊度(Turbidity)(％)＝100–透过率(％)。由图14可知，与清洁用品中常用的乳化剂—月桂醇聚醚硫酸酯钠盐(sodiumlaurethsulfate)相比较，本发明的表面素更能够降低洗发精的浊度，意即增加洗发精的滑顺感。
2.表面素会产生液滴(coacervate)现象
表面素于冲洗时会表现出色的滑顺感(senseofsmooth)，而在低浓度的情况下，会产生液滴(coacervate)现象。由图15可以知道，在稀释于聚合物和界面活性剂复合物(polymer-surfactantcomplex)后—意即液滴(coacervate)现象，含有表面素的洗发精会有沉淀的产生；因此而减少了摩擦感(frictionsensitivity)，增加滑顺感(senseofsmooth)。
上述实施例及图式仅为本发明的较佳实施例而已，当不能以之限定本发明实施的范围，即大凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利涵盖的范围内。
Claims (43)
1.一种表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该组合物包含表面素及药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、辅剂等。
2.如权利要求1所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该表面素为一种环脂胜肽，该表面素包括连接至β羟基脂肪酸的七胜肽序列(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu，该表面素在脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：
(1)异C13大于3％；
(2)正C13大于0.65％；
(3)异C14大于17％；
(4)正C14少于41％；及
(5)异C15少于11％。
3.如权利要求2所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：
(1)异C13大于10％；
(2)正C13大于25％；
(3)异C14大于35％；
(4)正C14少于25％；及
(5)异C15少于3％。
4.如权利要求3所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：(1)异C13为11％；(2)正C13为26％；(3)异C14为37％；(4)正C14为24％；及(5)异C15为2％。
5.如权利要求1所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该表面素的分子量为1022或1036Da。
6.如权利要求1所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该表面素包含其化学异构物。
7.如权利要求1所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该抗老化化妆品组合物可进一步包含下列至少一种：醇类、酯类、复合多醣体、坚果油及维生素。
8.如权利要求7所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该醇类包括下列至少一种：C16-18醇、丁二醇、戊二醇、辛二醇、丙三醇、16醇、18醇、22醇及丙二醇。
9.如权利要求7所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该酯类包括下列至少一种：橄榄油鲸蜡醇酯(OLIVEM1000)、单硬脂酸甘油酯(GSM)、十四酸异丙酯(IPM)、十六酸异丙酯(IPP)及三酸甘油酯。
10.如权利要求7所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该复合多醣体包括下列至少一种：汉生胶、银耳多醣体、葡聚多醣体、狭叶番泻籽多醣体。
11.如权利要求7所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该坚果油包括下列至少一种：阿甘油、夏威夷核果油、酪梨油、小麦胚芽油、橄榄油。
12.如权利要求7所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该维生素包括下列至少一种：维生素A、维生素B、维生素C、维生素E、维生素F、维生素K。
13.如权利要求1所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该抗老化化妆品组合物用以促进纤维母细胞的增殖、胶原蛋白的增生或sertuin1基因的表现。
14.如权利要求1所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该抗老化化妆品组合物用以抗紫外光老化或抗氧化。
15.如申请专利范围第1项之表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该抗老化化妆品组合物用以抑制基质金属蛋白酶(Matrixmetallopeptidase)。
16.如权利要求1所述的表面素制备抗老化化妆品组合物的用途，其中该基质金属蛋白酶为基质金属蛋白酶九型(Matrixmetallopeptidase9)。
17.一种表面素(surfactin)制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该组合物包含表面素及药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、辅剂等。
18.如权利要求17所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该表面素为一种环脂胜肽，该表面素包括连接至β羟基脂肪酸的七胜肽序列(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu，该表面素在脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：
(1)异C13大于3％；
(2)正C13大于0.65％；
(6)异C14大于17％；
(7)正C14少于41％；及
(8)异C15少于11％。
19.如权利要求18所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：
(1)异C13大于10％；
(2)正C13大于25％；
(3)异C14大于35％；
(4)正C14少于25％；及
(5)异C15少于3％。
20.如权利要求19所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：(1)异C13为11％；(2)正C13为26％；(3)异C14为37％；(4)正C14为24％；及(5)异C15为2％。
21.如权利要求17所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该表面素的分子量为1022或1036Da。
22.如权利要求17所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该表面素包含其化学异构物。
23.如权利要求17所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该增加皮肤穿透力的组合物可进一步包含下列至少一种：醇类、酯类、复合多醣体、坚果油及维生素。
24.如权利要求23所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该醇类包括下列至少一种：C16-18醇、丁二醇、戊二醇、辛二醇、丙三醇、16醇、18醇、22醇及丙二醇。
25.如权利要求23所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该酯类包括下列至少一种：橄榄油鲸蜡醇酯(OLIVEM1000)、单硬脂酸甘油酯(GSM)、十四酸异丙酯(IPM)、十六酸异丙酯(IPP)及三酸甘油酯。
26.如权利要求23所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该复合多醣体包括下列至少一种：汉生胶、银耳多醣体、葡聚多醣体、狭叶番泻籽多醣体。
27.如权利要求23所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该坚果油包括下列至少一种：阿甘油、夏威夷核果油、酪梨油、小麦胚芽油、橄榄油。
28.如权利要求23所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该维生素包括下列至少一种：维生素A、维生素B、维生素C、维生素E、维生素F、维生素K。
29.如权利要求17所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该组合物用以促进化妆品原料穿透皮肤。
30.如权利要求29所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该化妆品原料为皮质类固醇(dexamethasone)。
31.如权利要求29所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该化妆品原料为玻尿酸(hyaluronicacid)。
32.如权利要求29所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该化妆品原料为聚谷氨酸(Gamma-polyglutamicacid)。
33.如权利要求29所述的表面素制备增加皮肤穿透力的组合物的用途，其中该化妆品原料为奈米金(gold-nanoparticles)。
34.一种表面素(surfactin)制备乳化剂组合物的用途，其中该组合物包含表面素及药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、辅剂等。
35.如权利要求34所述的表面素制备乳化剂组合物的用途，其中该表面素为一种环脂胜肽，该表面素包括连接至β羟基脂肪酸的七胜肽序列(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu，该表面素在脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：
(1)异C13大于3％；
(2)正C13大于0.65％；
(9)异C14大于17％；
(10)正C14少于41％；及
(11)异C15少于11％。
36.如权利要求35所述的表面素制备乳化剂组合物的用途，其中该脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：
(1)异C13大于10％；
(2)正C13大于25％；
(3)异C14大于35％；
(4)正C14少于25％；及
(5)异C15少于3％。
37.如权利要求36所述的表面素制备乳化剂组合物的用途，其中该脂肪酸末端的脂肪酸分布如下：(1)异C13为11％；(2)正C13为26％；(3)异C14为37％；(4)正C14为24％；及(5)异C15为2％。
38.如权利要求34所述的表面素制备乳化剂组合物的用途，其中该表面素的分子量为1022或1036Da。
39.如权利要求34所述的表面素制备乳化剂组合物的用途，其中该表面素包含其化学异构物。
40.如权利要求34项所述的表面素制备乳化剂组合物的用途，其中该乳化剂组合物可进一步包含下列至少一种：脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨醇酐酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸丙二醇酯、卵磷脂。
41.如权利要求34所述的表面素制备乳化剂组合物的用途，其中该乳化剂组合物用以增加起泡力。
42.如权利要求34所述的表面素制备乳化剂组合物的用途，其中该乳化剂组合物用以增加乳化作用。
43.如权利要求34所述的表面素制备乳化剂组合物的用途，其中该乳化剂组合物用以增加滑顺感。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20180619 Termination date: 20190629 |