CN115721728B - Dna四面体框架核酸与ccr2抑制剂的复合物及其用途 - Google Patents

Dna四面体框架核酸与ccr2抑制剂的复合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了DNA四面体框架核酸与CCR2抑制剂以摩尔比1:(2～4)的复合而成的复合物，以及该复合物在制备防治肝纤维化、肝硬化的药物中的用途。本发明复合物可以明显降低肝纤维化区域面积，减缓、降低CCl4诱导的Collagen I和α‑SMA的高表达，从而改善肝脏纤维化，延缓病程的发生发展，保护肝脏，防治肝硬化的发生发展。

Description

DNA四面体框架核酸与CCR2抑制剂的复合物及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及DNA四面体框架核酸与CCR2抑制剂的复合物及其用途。
背景技术
肝纤维化是肝脏慢性损伤下的持续、动态的组织修复结果，以细胞外基质的过度沉积为主要表现。多种病因包括慢性病毒感染、酒精损伤、代谢障碍、化学物质损伤等长期作用于肝脏的损伤因素可导致慢性肝炎，并随着时间推移在无干预措施的情况下进展为肝纤维化，出现肝脏功能一定程度的损伤。虽然早期的肝纤维化可以在损伤因素消失后表现为好转，但是上述慢性损伤的彻底控制是很难的。控制不良的慢性损伤因素将导致肝纤维化继续进展为肝硬化，出现明显的肝脏形态和功能的异常，并导致严重的全身并发症，严重威胁患者健康。
C-C趋化因子受体2(CCR2)介导各种炎症性疾病，并在招募炎症/免疫细胞方面发挥关键作用。之前的研究表明，CCR2与心肌炎、肌萎缩侧索硬化症、糖尿病心肌病、骨关节炎和缺血性中风有关。因此，沉默CCR2表达可能对心肌炎、急性心肌梗塞、和脊髓损伤具有治疗作用。
DNA四面体框架核酸(tFNAs)是一种由DNA单链通过自组装合成的具有三维结构的DNA纳米材料，具有良好的生物相容性、可编辑性和生物安全性。一方面，其具有作为药物载体的潜能，另一方面，也有报道显示DNA四面体本身具有一定的药理活性；例如中国专利CN112587544B，即公开了DNA四面体框架核酸对肺纤维化有一定的治疗效果。
目前，有研究报道了tFNAs和CCR2抑制剂(CCR2的siRNA：siCCR2)以摩尔比1:1复合的复合物治疗脑出血的效果([Fu W,Ma L,Ju Y,et al.Therapeutic siCCR2 Loaded byTetrahedral Framework DNA Nanorobotics in Therapy for Intracranial Hemorrhage(Adv.Funct.Mater.33/2021)[J].Advanced Functional Materials,2021,31)，但tFNAs和siCCR2复合物对肝纤维化、肝硬化的作用，尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA四面体框架核酸与CCR2抑制剂的复合物。
本发明提供了一种复合物，它由DNA四面体框架核酸和CCR2抑制剂复合而成，所述DNA四面体和CCR2抑制剂的摩尔比为1:(2～4)。
进一步地，上述DNA四面体和CCR2抑制剂的摩尔比为1:4。
更进一步地，上述CCR2抑制剂是CCR2的小干扰RNA。
更进一步地，上述复合物是由DNA四面体和CCR2的小干扰RNA通过粘性末端互补配对连接而成。
更进一步地，上述DNA四面体由4条单链DNA经碱基互补配对形成，其中2条、3条或4条单链DNA带有粘性末端。
更进一步地，上述DNA四面体由4条带有粘性末端的单链DNA经碱基互补配对形成。
更进一步地，上述DNA四面体的4条带有粘性末端的单链DNA的序列分别如SEQ IDNO.1～4所示。
进一步地，上述CCR2的小干扰RNA的正义链或反义链带有粘性末端，所述粘性末端与DNA四面体的粘性末端互补配对。
更进一步地，上述CCR2的小干扰RNA的正义链序列如SEQ ID NO.5所示，反义链序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了上述的复合物在制备防治肝硬化的药物中的用途。
进一步地，上述防治肝硬化的药物是防治肝纤维化的药物。
更进一步地，上述防治肝纤维化的药物是减缓或降低Collagen I、α-SMA蛋白表达的药物。
本发明的有益效果：本发明提供了一种DNA四面体框架核酸与CCR2抑制剂的复合物，可以明显降低肝纤维化区域面积，减缓、降低CCl4诱导的Collagen I和α-SMA的高表达，从而改善肝脏纤维化，延缓病程的发生发展，保护肝脏，防治肝硬化的发生发展。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明复合物对CCR2的抑制效果。
图2为本发明复合物治疗肝纤维化的结果。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明复合物的制备
将四种DNA单链(S1、S2、S3、S4)和一种RNA(siCCR2)按照1：1:1:1:4的比例溶解于TM Buffer(10mM Tris-HCl,50mM MgCl2,pH＝8.0)中，DNA与RNA的终浓度为1000nM，充分混合，迅速加热至95℃保持10分钟，之后迅速降温至4℃并维持20分钟以上，即可得到本发明复合物tFNA-siCCR2。
序列(5’→3’)如下：
S1(SEQ ID NO.1)：
ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAATTTTTATTGATCTATGATCGTACGAT
S2(SEQ ID NO.2)：
ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCGTTTTTATTGATCTATGATCGTACGAT
S3(SEQ ID NO.3)：
ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCCTTTTTATTGATCTATGATCGTACGAT
S4(SEQ ID NO.4)：
ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCGTTTTTATTGATCTATGATCGTACGAT
siCCR2正义链(SEQ ID NO.5)：
ugcuaaacgucucuccaaaTT(特别的，下划线的TT之间为硫代磷酸酯键连接)
siCCR2反义链(SEQ ID NO.6)：
uugcagagagcuuuagcaTTATCGTACGATCATAGATCAAT(特别的，下划线的TT之间为硫代磷酸酯键连接)
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、tFNA与siCCR2的协同作用
分别使用tFNA(工作浓度250nmol)、siCCR2(工作浓度250nmol)和实施例1制备的tFNA-siCCR2(工作浓度250nmol)处理RAW264.7细胞，进行荧光定量PCR和Western Blot检测CCR2表达情况。
结果如图1所示，可以看出，本发明复合物tFNA-siCCR2相比于单独的tFNA和siCCR2，能够更加显著地降低CCR2的表达，反映出对CCR2的协同抑制作用。
实验例2、tFNA-siCCR2治疗肝纤维化
四氯化碳(CCl4)腹腔注射6周诱导野生型小鼠肝纤维化，同时尾静脉注射3周(治疗型)、6周(预防型)tFNA-siCCR2药物给予治疗，具体为：治疗型：四氯化碳注射6周诱导肝纤维化，同时从第4周开始连续注射药物3周；预防型：在四氯化碳注射诱导6周的同时给予药物治疗，即造模和给药同时进行。给药剂量：CCl4：CCl4与橄榄油3:1配制CCl4工作液，每只鼠80ul；治疗药物：浓度1000nmol/L，每只鼠100ul。取材后检测Sirius red、α-SMA和CollagenⅠ等纤维化指标，结果如图2所示。
在干预组和治疗组中，利用tFNA-SiCCR2对CCl4诱导的肝硬化小鼠模型进行干预，通过天狼猩红染色，我们发现tFNA-SiCCR2可以明显降低肝纤维化区域面积，并且多重荧光染色显示，CCl4导致的Collagen I和α-SMA的表达上升趋势明显被tFNA-SiCCR2打断。在蛋白水平上，预防组tFNA-SiCCR2可以明显减缓CCl4导致的Collagen I和α-SMA的高表达。而治疗组tFNA-SiCCR2可以显著降低Collagen I和α-SMA的蛋白表达。根据实验结果，我们发现tFNA-SiCCR2可以改善肝脏纤维化，延缓病程的发生发展，从而起到保护肝脏的作用。而应用tFNA-SiCCR2也有望成为临床诊治肝硬化的重要治疗手段。
综上，本发明提供了DNA四面体框架核酸与CCR2抑制剂以摩尔比1:(2～4)的复合而成的复合物，具有协同增效抑制CCR2的作用，并可以明显降低肝纤维化区域面积，减缓、降低CCl4诱导的Collagen I和α-SMA的高表达，从而改善肝脏纤维化，延缓病程的发生发展，保护肝脏，防治肝硬化的发生发展。

Claims (4)

1.一种防治肝硬化的复合物，其特征在于，它由DNA四面体框架核酸和CCR2抑制剂复合而成，所述DNA四面体和CCR2抑制剂的摩尔比为1:(2~4)；
所述复合物是由DNA四面体和CCR2的小干扰RNA通过粘性末端互补配对连接而成；
所述DNA四面体由4条带有粘性末端的单链DNA经碱基互补配对形成，所述DNA四面体的4条带有粘性末端的单链DNA的序列分别如SEQ ID NO.1~4所示；
所述CCR2的小干扰RNA的正义链或反义链带有粘性末端，所述粘性末端与DNA四面体的粘性末端互补配对；
所述CCR2的小干扰RNA的正义链序列如SEQ ID NO.5所示，反义链序列如SEQ ID NO.6所示；
所述防治肝硬化是防治肝纤维化。
2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述DNA四面体和CCR2抑制剂的摩尔比为1:4。
3.权利要求1或2所述的复合物在制备防治肝硬化的药物中的用途，所述防治肝硬化是防治肝纤维化。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述防治肝纤维化的药物是减缓或降低Collagen I、α-SMA蛋白表达的药物。
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