JP2000514093A - Ｃｍｖ感染症の治療のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＣＭＶ感染症の治療のための組成物および方法に関する。有効な抗ウイルス剤であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１個の２’−メトキシエトキシ修飾を含有し、キメラオリゴヌクレオチドであってもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＭＶ感染症の治療のための組成物および方法緒言 本出願は、米国特許出願第07/1568,366号(90年８月16日出願、現在は取り下げ 済み);第07/1927,506号(92年11月19日出願、現在は米国特許第5,591,720号とし て発行)；第08/1009,263号（93年１月25日出願、現在は米国特許第5,442,049号 として発行）；および第08/233,711号（94年４月26日出願、現在は米国特許第5, 595,978号として発行）の一部継続出願であり、これらはそれぞれ本出願と同一 の譲受人に譲渡され、その全体を本明細書の一部としてここに引用する。発明の背景 本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計および合成に関し、それを投 与してサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の複製を阻害し、サイトメガロウイルス 感染症を治療することができる。これらの化合物を予防的または治療的に使用し てサイトメガロウイルスによる疾病の重症度を低減することができる。 サイトメガロウイルスは、妊娠期間に始まる全ての年齢のヒトに感染する。Ｃ ＭＶ感染症は広範囲の疾病の原因となり、それらには重度の先天性奇形、青少年 の単核球症候群、および免疫を抑制した患者の胎児の播種性感染症がある。ＣＭ Ｖは一般の人々に潜伏するウイルスとして非常に一般的なものであり、また、細 胞媒介性免疫は宿主防衛においてその増殖を制御するための重要な要素であるた め、ＣＭＶが免疫無防備状態の患者における主要な病原体であることは驚くべき ことではない。ＣＭＶは健康な個体においては通常無害であるが、ＡＩＤＳ患者 においては広範な器官における機能障害の主要な原因となり、患者の免疫系では もはや抑制できなくなる。多くのＡＩＤＳ患者は持続性ＣＭＶウイルス血症を有 する。中には、徴候がない時点でウイルス血症であったり、あるいは軽度の全身 症状であるがカポジ肉腫も有するような患者もいる。他の生命の危険のある日和 見感染をした時点では、ほとんど全ての患者はウイルス血症である。 サイトメガロウイルス網膜炎は免疫無防備状態の患者にとって深刻な問題であ り、多くの場合失明に至る。４０％までのＡＩＤＳ患者が疾病の最終段階でＣＭ Ｖ網膜炎に冒されうるが、治療は困難であり、それは使用できる薬剤が毒性を有 し、高価であり、そして留置カテーテルを介して静脈内投与する場合に最も効果 があるためである。Cohen，J．Science 1995，268，368-9。また、免疫が抑制さ れた患者は非常にＣＭＶ肺炎に感染しやすいが、これはヒトのウイルス性疾患の 中で最も致死性の高いものの一つであり、ＣＭＶによって胃腸出血が起きる。Co henら．ibid。またサイトメガロウイルスはＨＩＶ感染からＡＩＤＳへの進行に おいて役割を担いうるが、これは非トランスフォーム型の共感染Ｔ細胞において ＨＩＶ長末端反復配列（ＬＴＲ）の転写を刺激することによる。ＡＩＤＳ患者か ら得た副腎および脳の組織検査から、観察される副腎炎、脳炎、および末梢神経 障害はＣＭＶ感染によって起こることが示唆されている。 多くの抗ウイルス剤の研究にも関わらず、効果的なＣＭＶの治療はまだ開発さ れていない。インターフェロン、伝達因子、アデニンアラビノシド（Ａｒａ−Ａ ）、アシクログアノシン（アシクロビア、ＡＣＶ）、およびこれらの薬剤の併用 は、ＣＭＶ感染を制御するのに効果がなかった。前臨床および臨床データによれ ば、フォスカーネット（ＰＦＡ）およびガンシクロビル（ＤＨＰＧ）は抗ウイル ス剤として限定された可能性を示している。ＤＨＰＧの研究は、ＣＭＶ網膜炎お よび大腸炎に対して効果を示した。ＤＨＰＧは処理した個体のほとんどに十分寛 容性があると考えられるが、可逆的な好中球減少が発生すること、長期投与によ ってＣＭＶ耐性株が出現すること、そしてＣＭＶ肺炎に対して効果がないことか ら、この化合物の長期間の適用は制限される。より効果が高く、より毒性の低い 治療の化合物および方法の開発が、急性および慢性への使用の両方に必要とされ てい。 本発明はＣＭＶ感染症の治療への別のアプローチ、すなわちアンチセンスオリ ゴヌクレオチドを使用したサイトメガロウイルス遺伝子発現の阻害に向けられる ものである。ＣＭＶを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれら の化合物を使用する治療法は米国特許出願第07/1568,366号（90年８月16日出願 、現在は取り下げ済み）；PCT/US91/05815号（91年８月14日出願）；米国 特許出願第07/927,506号（92年11月19日出願、現在は米国特許5,591,720号とし て発行）；米国特許出願第08/009,263号（93年１月25日出願、現在は米国特許第 5,442,049号として発行）；および、米国特許出願第08/233,711号（94年４月26 日出願、現在は米国特許第5,595,978号として発行）に開示されており、これら はそれぞれ、その全体を本明細書の一部としてここに引用する。この研究の一部 はAndersonら．Antimicrob．Agents and Chemother．1996，40，2004-2011に発 表されている。また、ＣＭＶに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはPariら ，WO95/32213号およびAntimicrob．Agents and Chemother．1995，39，1157-116 1に開示されている。 アンチセンスホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチド薬剤、ＩＳＩＳ ２９２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、フォミバーセン（Fomivirsen））は、Ａ ＩＤＳ患者のＣＭＶ網膜炎の進行の停止に臨床的に有効であることが証明されて いる。フォミバーセンに関する無作為で制御された中枢となる第３相臨床試験は 進行中であり、単独治療、および経口ガンシクロビルとの併用の両方についてフ ォミバーセンの評価が行われている。結果は、制御されていないＣＭＶ網膜炎に 罹患した患者において現在進行されているフォミバーセンのオープンラベル臨床 試験から得られてきた。第１２回ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびそれらの 生物学的適用に関する国際円卓会議（Twelfth International Roundtable on Nu cleosides,Nucleotides and their Biological Applications）、La Jolla、CA 、1996年９月。フォミバーセンを、最初の３週間は週毎、その後は維持のために 隔週毎に硝子体内注射で投与した。進行したＣＭＶ網膜炎に罹患し、他の治療に 失敗した患者に３３０μｇの投与量で薬剤を投与したところ、迅速かつ持続的な 疾患の緩解がみられた。持続的な疾患の緩解は、フォミバーセンを単独で、また はガンシクロビルとの併用治療で投与した患者に観察された。化合物は十分な寛 容性があり、臨床的に許容しうる安全性を有し、処理しやすい局所的な眼部の炎 症性合併症であることと全身性の副作用がないことに特徴があった。 これにも関わらず、より低頻度の投与で患者のクオリティー・オブ・ライフを 向上できるような、改良された薬剤の発見が望まれている。驚くべきことに現在 では、２’−メトキシエトキシ修飾を含むフォミバーセンの類似体は、デオキシ ホスホロチオエート親化合物のフォミバーセン（ＩＳＩＳ ２９２２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）に比較して、網膜において非常に安定である（残留時間が非 常に長くなっている）ことが見出されている。発明の概要 本発明は、ＣＭＶ感染症の治療のための組成物および方法に関する。ＣＭＶの ＩＥ１、ＩＥ２、またはＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を標的とするアンチセンスオ リゴヌクレオチドを含有する組成物を提供する。好ましい態様では、オリゴヌク レオチドが少なくとも１個の２’−メトキシエトキシ修飾を有し、キメラオリゴ ヌクレオチドであってもよい。また、ＣＭＶを標的とするアンチセンスオリゴヌ クレオチドの投与による、ＣＭＶ感染症の阻害およびＣＭＶ感染症（特にＣＭＶ 網膜炎）の治療のための方法も提供する。オリゴヌクレオチドは、単独、または 第２の抗ウイルス剤との併用のいずれで投与してもよい。ある好ましい態様では 、オリゴヌクレオチドを硝子体内に投与する。図の説明 図−１は、オリゴヌクレオチド２７２５〜３２４６のサイトメガロウイルスに 対する抗ウイルス活性を示す棒グラフである。 図−２は、８種のオリゴヌクレオチドの０．０１〜１０μＭの投与量での抗ウ イルス効果を示す折れ線グラフである。 図−３は、３種のオリゴヌクレオチドの０．１〜１０μＭの投与量での抗ウイ ルス効果を示す折れ線グラフである。 図−４は、ＩＳＩＳ ２９２２、およびこの配列の変種で塩基の不一致を有す るもの（ＩＳＩＳ ４４３１、４４３２、４４３６、４４３３）の用量応答曲線 を示す折れ線グラフである。 図−５は、抗ウイルスアッセイにおけるＩＳＩＳ ２９２２、１１９５０、１ ３３１２、および１３３１３の用量応答曲線を示す折れ線グラフである。 図−６は、抗ウイルスアッセイにおけるＩＳＩＳ ２９２２、１３５７８、お よび１３３１２の用量応答曲線を示す折れ線グラフである。 図−７は、抗ウイルスアッセイにおけるＩＳＩＳ ２９２２、１３５７５、１ ３５７６、１３５７７、および１３５７８の用量応答曲線を示す折れ線グラフで ある。 図−８は、抗ウイルスアッセイにおけるＩＳＩＳ ２９２２、１３５７２、１ ３５７３、および１３５７４の用量応答曲線を示す折れ線グラフである。 図−９は、プラーク減少アッセイにおけるＩＳＩＳ ２９２２、１３３１２、 および１３５７８の用量応答曲線を示す折れ線グラフである。 図−１０は、硝子体内注射後、種々の時点でのＩＳＩＳ ２９２２およびＩＳ ＩＳ １３３１２の網膜濃度（μＭ）を示す折れ線グラフである。本発明の詳細な説明 ヒト型ＣＭＶは大型でエンベロープを有するヘルペスウイルスであり、そのゲ ノムは長さ約２４０，０００ヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ分子からなる。このゲ ノムは全てのＤＮＡウイルスの中で最も複雑であり、単純ヘルペスウイルス（Ｈ ＳＶ）のゲノムより約５０％大きい。無傷のウイルスＤＮＡは隣接する長いセグ メント（Ｌ）および短いセグメント（Ｓ）からなり、そのそれぞれは繰返し配列 の相同領域の側面にある独自のＤＮＡ配列の領域を含有する。群としては、ヒト 型ＣＭＶ分離株は少なくとも８０％の配列ホモロジーを有し、そのためサイトメ ガロウイルスを亜群または亜型に分類することはほとんど不可能である。しかし 、種々のＣＭＶのＤＮＡ調製の制限エンドヌクレアーゼのパターンの変化は疫学 的に関連のない株において同定可能ではある。ＣＭＶのプロトタイプの株のＤＮ Ａ（ＡＤ １６９）はシークエンスされており、内輪の見積もりで１７５個の独 自の翻訳のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有することが報告され ている。多くの予想されるＣＭＶ遺伝子産物は、他のヒト型ヘルペスウイルス遺 伝子産物とホモロジーを示す。 ヒトの許容線維芽細胞では、ＣＭＶ遺伝子の発現は遺伝的事象のカスケードに よって調節されており、これは転写および翻訳レベルの両方に作用する。ＣＭＶ 遺伝子発現は、極初期（ＩＥ）、初期、および後期の３段階に分類することがで きる。ウイルスの吸着、侵透、および被覆の解体に続き、一群のウイルス転写物 、 極初期メッセンジャーＲＮＡ（ＩＥ ｍＲＮＡ）が、シクロヘキシミドのような 翻訳阻害剤の存在下でさえも１〜４時間以内に合成される。通常の感染過程では ＩＥ ｍＲＮＡが翻訳され、そのタンパク質産物が初期の転写事象の開始の手段 となる。少なくとも４つのタンパク質がＩＥ ｍＲＮＡから合成され、その１つ は糖タンパク質である。ＩＥ１およびＩＥ２タンパク質は他のＣＭＶ遺伝子に対 する転写活性化因子であり、ＩＥ３タンパク質はインビトロでＮＩＨ ３Ｔ３細 胞を形質転換できるＣＭＶゲノムの領域を含有する。初期タンパク質は、ウイル スのＤＮＡ合成に先立って合成されるｍＲＮＡにコードされる。多くの初期タン パク質は、感染した細胞でのヌクレオチド代謝およびＤＮＡ合成において役割を 果たす。ウイルスのＤＮＡ合成の開始後、後期ｍＲＮＡの転写は最大となり、お そらくこれはテンプレートが大量にあることが必要なことを反映している。後期 ＣＭＶタンパク質にはウイルスエンベロープの糖タンパク質成分、ウイルスのキ ャップシッドタンパク質、そして、成熟ＣＭＶ粒子の集合もしくは構造の恒常性 および／または感染細胞からの集合ウイルス粒子の出現に必要とされる他のタン パク質がある。ＣＭＶ遺伝子発現に対して作用する転写制御に加え、転写後制御 の例がいくつかのＣＭＶタンパク質の生成に影響することが知られている。ｍＲ ＮＡのスプライシングはＨＳＶ遺伝子発現に観察されるのに比べてより一般的で あり、同種のｍＲＮＡの５’非翻訳領域のヌクレオチド配列組成は少なくとも１ つの初期ＣＭＶタンパク質の合成に影響を与えることが報告されている。 ヒト型ＣＭＶゲノムはゲノム構造の点で、ヘルペスウイルスの中で最も複雑で ある。ヒト型ＣＭＶの複製欠損株は２つのウイルス遺伝子、極初期化合物(ＩＥ １またはＩＥ２)およびＤＮＡポリメラーゼについて単離されているだけである 。これらの遺伝子はヒト型ＣＭＶ遺伝子発現に重要な役割を果たすことが知られ ている。それらはアンチセンス化合物の設計のための主要な標的として選択され てきた。治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド設計のための第二の標的 遺伝子は、単純ヘルペスウイルスの遺伝子との類推によって選択されてきた。そ のような遺伝子は単純ヘルペスウイルスの複製に必須であるように、そして／ま たはアンチセンスの阻害に感受性があるように決定されてきた。最近アンチセン ス阻害に感受性があることが見出された単純ヘルペスウイルスの４つの遺伝子産 物 は、ウイルス粒子の被包タンパク質（ＵＬ４８）、リボヌクレオチド還元酵素を 構成する２つのタンパク質（ＵＬ３９、４０）、およびウイルス粒子のホスホト ランスフェラーゼ（ＵＬ１３）である。現在研究されている他の単純ヘルペスウ イルス遺伝子はＤＮＡ複製補助酵素（ＵＬ５、８、９、２９、４２、５２）およ び主要なキャップシッドタンパク質（ＵＬ３６）である。ＣＭＶは、これらの単 純ヘルペスウイルスタンパク質のそれぞれと機能的に類似性がありうると同定さ れているタンパク質をコードする；これらの遺伝子は本発明に関連して、第二の 標的として役立つように選択されたものである。 ＣＭＶにおける極初期転写の分子生物学は、真核細胞における転写ユニットの ものと同じくらい十分に明らかになっている。つまり、主要な極初期転写物（Ｉ Ｅ１）の合成はｍＲＮＡのキャップ部位の多くの５’反復単位によって制御され ている。これらの反復は、細胞特異的、かつ分化特異的に作用することが知られ ている多くの転写応答分子に感受性がある。ＩＥ１のｍＲＮＡは大量にあるＲＮ Ａで、長さ１．９ｋｂであり、ＰＡＧＥ−ＳＤＳにおいて見かけの分子量が７２ ｋＤａで移動するタンパク質をコードする。このタンパク質はウイルス粒子内に 見出されており、それ自身の発現とＩＥ２遺伝子産物の発現を制御する。極初期 転写の初期段階では、ＩＥ１ ｍＲＮＡのみが細胞ＲＮＡポリメラーゼによって 合成される。この感染の初期段階でＩＥＩ ｍＲＮＡのプロセシングによって少 量のＩＥ２ ｍＲＮＡが生成される。ある時間が経つと、ＩＥ１タンパク質のレ ベルが蓄積してＩＥ１遺伝子のプロモーター領域と結合し、ＩＥ１ ｍＲＮＡの 更なる転写を抑制し、これによってＩＥ２遺伝子のより弱い下流プロモーターが ＩＥ２ ｍＲＮＡの更なる合成を制御する。ＩＥ１遺伝子産物は増殖感染の際に ウイルスの転写を増進するか、あるいはまた、潜伏状態からのウイルス遺伝子の 発現を活性化するように作用しうると考えられてきた。ＩＥ１遺伝子のプロモー タの、細胞の種類および分化またはホルモン応答要素はこの提案と一致する。Ｉ Ｅ２タンパク質は、細胞およびウイルス由来の既知の他の転写活性化タンパク質 と同様の方法でＣＭＶの初期および後期遺伝子の多くを転写的に活性化する能力 を有する。従って、ＩＥ２タンパク質はＣＭＶ遺伝子発現の主要なスイッチの一 つであると考えられる。ＣＭＶ遺伝子の他の制御スイッチはＤＮＡポリメラーゼ タンパク質である。後期ウイルス遺伝子の転写はウイルスのＤＮＡ複製の開始ま ではごく低レベルで作用し、その後、テンプレートの有効率の増加により後期遺 伝子は活性化される。このテンプレートの有効率の増加で作用する正確な分子の 状態は明確でないが、ウイルスのＤＮＡポリメラーゼの存在およびゲノムの複製 は観察された作用に必須である。 ＣＭＶ網膜炎は症状の重い感染症で、急速に失明に至ることも珍しくない。４ ０％までのＡＩＤＳ患者は疾病の最終段階でこの症状を有する。Cohenら,ibid。 これは黄白色斑による網膜の混濁化が次第に拡大することを特徴とし、通常、主 要な網膜血管係蹄の近隣で始まる網膜出血を伴う。患者は、中心窩または視神経 に及ぶまで、あるいは網膜剥離が起こるまで、多くの場合無症状である。その後 、急速に進行して失明に至る。 最近使用される両薬剤、すなわち、ガンシクロビル（ＤＨＰＧ）、構造的にア シクロビルに関連するヌクレオシド類似体、（２−アミノ−１，９［［２−ヒド ロキシ−１（ヒドロキシメチル）エトキシ］メチル］−６Ｈ−プリン−６−オン ；９−［（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシ）メチル］グアニン；２’− ノル−２’デオキシグアノシン）；およびフォスカーネット（ジヒドロキシホス フィンカルボン酸オキシド３ナトリウム塩；ホスホノホルメート３ナトリウム； カルボキンリン酸３ナトリウム）は限られた期間だけ有効であり、多くの患者で 、維持療法中に感染が進行する。 ガンシクロビルはＡＩＤＳ患者のＣＭＶ網膜炎の管理に有用であることが証明 されている。導入療法は５ｍｇ／ｋｇで１日２回、１０〜１４日間行う；維持療 法は５ｍｇ／ｋｇで１日１回である。残念ながら、維持療法を施与する際にも疾 病が進行するのが一般的である。全身性のガンシクロビルは静脈内投与するのが 最も一般的である。しかしながら、骨髄の抑制が通常の副作用であり、ジドブジ ン（ＡＺＴ）治療を同時に行っていれば、これが特に問題となる。ガンシクロビ ルの硝子体内投与が代替として使用されてきた。フォスカーネットの全身性投与 （６０ｍｇ／ｋｇで一日３回１４日間の後、維持治療として９０ｍｇ／ｋｇ／日 ）は患者の余命を延長し、またＣＭＶ網膜炎にも有効であることが発見されてい るが、フォスカーネットは全身性ガンシクロビルより寛容性が低い。患者の中に は フォスカーネットとガンシクロビルの両方に不耐性となる者もあり、また両薬剤 に不応答である、もしくは不応答になるＣＭＶ網膜炎を起こす者もいる。 アンチセンスオリゴヌクレオチド剤、ＩＳＩＳ２９２２（フォミバーセン）は 、ＡＩＤＳ患者のＣＭＶ網膜炎の進行を停止する臨床的効果があることが証明さ れている。持続的疾病の緩解はフォミバーセンを単独で、またはガンシクロビル との併用治療で投与された患者にみられた。化合物は十分寛容性があると考えら れたが、より低頻度の投与で患者のクオリティー・オブ・ライフを向上できるよ うに改良された薬剤の発見が望まれる。 アンチセンスデオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ２９２ ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２；フォミバーセン）は、ヒト型ＣＭＶまたはＨＩ Ｖ感染症の治療に現在使用されている化合物との併用での抗ウイルス活性につい て評価が行われてきた。ＩＳＩＳ２９２２の抗ヒト型ＣＭＶ活性はガンシクロビ ル（ＤＨＰＧ）またはフォスカーネットのものと相加的なもので、ＡＺＴまたは ｄｄＣによって負の影響を受けない。 まず、ＣＭＶ網膜炎に罹患した１０人の患者でＩＳＩＳ２９２２（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：２２）の第１相試験を実施した。これらの患者はＨＩＶ陽性の患者で あり、片眼または両眼がＣＭＶ網膜炎であると診断された。患者は、最初にガン シクロビルまたはフォスカーネットのいずれかで導入療法を受けた後のガンシク ロビルまたはフォスカーネットによる維持療法で少なくとも１度は進行しており 、これらの治療薬ではもはや効果的な治療ができなかった。 ３つの投与量（７５μｇ、１５０μｇ、および３００μｇ）が選択され、硝子 体内の組成物濃度を、それぞれ約２μＭ、４μＭ、および８μＭとなるようにし た。投与計画は動物での薬物動態学的研究に基づいて選択したが、週毎の投与に 続き、隔週毎に維持投与するものであった。病変の状態に次いで、慣例的な眼部 の臨床検査および眼底の写真撮影を行った。 ＣＭＶ網膜炎では、最初の効験の終了点は疾病の進行の有無である。進行は以 下のうちの１つとして定義される：新たな病変（直径７５０ミクロン）の出現： 衛星病変を含む、ベースラインにある病変の辺縁の進出（７５０ミクロンの前線 に沿って７５０ミクロン）。進行の臨床的痕跡は眼底写真で確認する。ベースラ インにある病変の辺縁の曖昧さの変化も考慮するが、ただし辺縁の曖昧さが増加 しても、進行を定義する初期事象の少なくとも１つを伴わない限り進行とは解釈 しない。 ガンシクロビルまたはフォスカーネットで進行したこれらの患者１０人のうち ７人で、本発明の組成物による治療により疾病の進行が効果的に停止した。両眼 に感染したある患者は、本発明の組成物による硝子体内治療が成功したが、ガン シクロビル療法だけではうまくいかなかった。この患者群では疾病の自然消失ま たは回復は予期されない。 現在行われている、他のＣＭＶ網膜炎治療がうまくいかなかった進行したＣＭ Ｖ網膜炎患者に対するＩＳＩＳ ２９２２（フォミバーセン）のオープンラベル の非管理臨床試験の結果が最近発表された。ＩＳＩＳ２９２２は、３３０μｇの 投与量で迅速かつ持続的に疾病を緩解する。この持続的疾病の緩解はＩＳＩＳ２ ９２２を単一薬剤治療として、またはガンシクロビルとの併用治療として投与し た患者に観察される。第１２回ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびそれらの生 物学的適用に関する国際円卓会議、La Jolla、CA、1996年９月。 ＣＭＶに向けられた第二のアンチセンス薬剤は、現在臨床試験が始まっている 。この化合物、ＧＥＭ１３２（Hybridon社）は両末端に修飾型ヌクレオチドを有 するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、ヒト型ＣＭＶ遺伝子ＵＬ３ ６およびＵＬ３７のイントロン−エクソン境界を標的とする。硝子体内注射によ る投与を意図するものと考えられる。 第２世代のオリゴヌクレオチド、フォミバーセン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２ ）のヌクレオチド配列を有するが数個の２’−メトキシエトキシ修飾を有するも のが、現在、意外にも眼部において極めて安定であることが発見された。 本発明によれば、ＣＭＶのＩＥ１、ＩＥ２、またはＤＮＡポリメラーゼ遺伝子 を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。ある好ましい態様で は、オリゴヌクレオチドは少なくとも１個の２’−メトキシエトキシ修飾を含有 する。そのような修飾されたオリゴヌクレオチドは２’−デオキシ類似体に比較 して、特に眼の硝子体での安定性が高いことが発見されている。オリゴヌクレオ チド組成物は単独で、またはガンシクロビルもしくはフォスカーネットのような 第２の抗ウイルス剤との併用で投与してもよい。この方法によりＣＭＶ感染症が 阻害される。またこの方法は、ＣＭＶを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオ チドを使用してＣＭＶ感染症、特にＣＭＶ網膜炎を治療する。好ましい態様では 、オリゴヌクレオチドは少なくとも１個の２’−メトキシエトキシ修飾を有する 。別の好ましい態様では、オリゴヌクレオチドを硝子体内に投与する。 本発明のオリゴヌクレオチドおよび医薬組成物は、局所治療または全身治療の いずれが好ましいかによって、そして治療する部位によって、種々の方法で投与 してもよい。投与は局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口、または 非経口でもよい。眼部への投与に好ましい形態は硝子体内投与であり、硝子体内 注射による投与および硝子体内インプラントの使用がある。ある化学修飾、特に １個以上の糖部分の２’位での修飾は、経口投与のためのオリゴヌクレオチドを 安定化するために特に有用であると考えられる。２’−メトキシエトキシ修飾を 有するオリゴヌクレオチドは経口投与に特に好適であると考えられる。非経口投 与には点滴、輸液もしくは注射、皮下、腹膜内および筋肉内注射、例えば吸入法 もしくは通気法のような肺投与、そして髄腔内もしくは心室内投与がある。 局所投与のための製剤には、経皮パッチ、インプラント（特に硝子体内インプ ラント）、軟こう、ローション、クリーム、ジェル、滴剤、坐薬、スプレー、液 体、およびパウダーがありうる。従来の薬剤キャリアー、水性、パウダー、また は油性の基剤、増粘剤などが必要であるか、または好適でありうる。コーティン グしたコンドーム、手袋なども有用でありうる。 経口投与のための組成物には、パウダーもしくは顆粒、水溶性もしくは非水溶 性媒質の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ剤、または錠剤がある。増粘剤 、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が含まれてもよい。 薬剤的に許容しうるキャリアーには生理食塩水および緩衝液があるが、それら に限定されるものではない。好適な薬剤的に許容しうるキャリアーは当該分野で よく知られ、例えばGennaro，Alfonso，編，Remington's Pharmaceutical Scien ces，第１８版（1990）に記載されている。Mack Publishing社，Easton，PAはこ の分野の標準的な参考テキストである。薬剤キャリアーは、意図する投与経路お よび標準的な薬事経験に従って選択してもよい。例えば硝子体内注射に は、オリゴヌクレオチドを緩衝液、好ましくは重炭酸緩衝液で投与するのが好ま しい。静脈内投与には生理食塩水が好ましい。 投薬は治療する疾病状態の重症度および感受性に依存し、治療過程は数日〜数 カ月、または、回復するかもしくは疾病状態が軽減するまで継続される。最適な 投薬計画は、患者の体内における薬剤の蓄積を測定して算定することができる。 通常の技術を有する者は最適な投与量、投薬方法論、および反復率を容易に決定 できる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対力価によって多様で あり、一般的には、インビトロおよびインビボの動物モデルで効果的であること が見出されたＩＣ₅₀（５０％が阻害される濃度）またはＥＣ₅₀（５０％に有効で ある濃度）に基づいて算定することができる。一般に、投与量は体重ｋｇあたり ０．０１μｇ〜１００ｇであり、日毎、週毎、月毎、もしくは年毎に１回以上、 または２〜２０年毎に１回、投与してもよい。 本発明にかかるオリゴヌクレオチドはＣＭＶを標的とする。通常の技術を有す る当業者は、好ましいアンチセンスの標的に関する知識からそのようなオリゴヌ クレオチドを調製してここに開示されるＣＭＶ感染症を調節することができる。 異なる種、および種の中の異なる型に由来するサイトメガロウイルスの核酸配列 には相違点が存在することが予測される。従って、例えば、種々のサイトメガロ ウイルスの種または株の領域はそれぞれの種に対して本質的に同一の機能を果た しており、遺伝情報の発現への干渉により種々の種または株で同様の結果が与え られると考えられる。たとえ種間のヌクレオチド配列の相違が確実に存在しても 、このように考えられる。従って、本明細書に明記するヌクレオチド配列は、記 載される特定の種または株に具象的なものであると理解される。異なる種のサイ トメガロウイルスの相同または類似配列は本発明の範囲内であることは明確に予 期される。 本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドおよび類似体は、周知の固相合 成法によって簡便かつ慣例的に合成してもよい。そのような合成の装置はApplie d Biosystemsを含むいくつかの販売者から販売されている。そのような合成のた めの他の方法のいずれを使用してもよいが、オリゴヌクレオチドの実際の合成は ルーチン操作をする者の技量で十分できるものである。また、周知の通り、 同様の技術を使用してホスホロチオエートおよび２’−修飾型誘導体のようなオ リゴヌクレオチド類似体を調製する。種々の２’−および／または他の修飾をし たホスホルアミダイトは自動化した合成に使用するための市販品として入手でき る。 本発明では、サイトメガロウイルス核酸の選択された配列を標的とするヌクレ オチド塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。核酸標的はＤＮＡ、Ｒ ＮＡ、またはプレ−ＲＮＡであってもよい。本発明においては、選択された核酸 に対するオリゴヌクレオチドの“標的化”は複数段階の過程である。通常この過 程は、機能を調節すべき核酸配列の同定から開始する。これは例えば、その発現 が特定の障害または疾病状態と関係するような細胞遺伝子（または遺伝子から転 写されたｍＲＮＡ）、または感染因子由来の外来の核酸であってもよい。本発明 では、標的はＣＭＶ遺伝子またはＣＭＶ遺伝子から転写されたｍＲＮＡである。 標的化の過程はまた、オリゴヌクレオチドの相互作用が起き、結果として所望の 効果、すなわちタンパク質発現の検出または調節のいずれかが得られるようなこ の遺伝子内の部位の決定を含む。本発明においては、好ましい遺伝子内部位は遺 伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始または停止コドンを 含む領域である。当該分野で周知の通り、翻訳開始コドンは一般に５’−ＡＵＧ （転写されたｍＲＮＡ分子で；相当するＤＮＡ分子では５’−ＡＴＧ）であるた め、翻訳開始コドンは“ＡＵＧコドン”、“スタートコドン”、または“ＡＵＧ スタートコドン”とも呼ばれる。少数の遺伝子はＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’ −ＵＵＧ、または５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５’−ＡＵＡ、 ５’−ＡＣＧ、および５’−ＣＵＧはインビボで機能することが証明されている 。更に、５’−ＵＵＵはインビトロで翻訳開始コドンとして機能する（Brigstoc k ら，Growth Factors 1990，4，45；Gelbertら，Somat．Cell．Mol．Genet．19 90，16，173；GoldおよびStormo：大腸菌およびサルモネラチフィムリウム(Esch erichia coli and Salmonellat yphimurium)：細胞および分子生物学（Celltlla r and Molecular Biology），第２巻，1987，Neidhardtら編，米国微生物学会， Washington，D.C.，p.1303）。従って、それぞれの場合の開始アミノ酸は一般に メチオニン（真核生物の場合）またはホルミルメチオニン（原核生 物の場合）であるが、“翻訳開始コドン”および“スタートコドン”は多くのコ ドン配列を包含しうる。また、遺伝子は代替となるスタートコドンを２個以上含 有しうることが当該分野で知られており、そのうちのいずれか１個が特定の細胞 の型または組織において、または特定の一連の条件下において、翻訳開始に優先 的に使用されて、種々のアミノ末端配列を有する関連ポリペプチドを生成しうる （Markussenら，Development 1995，121，3723；Gaoら，Cancer Res．1995，55 ，743；McDermottら，Gene 1992，117，193；Perriら，J．Biol．Chem．1991，2 66，12536；Frenchら，J．Virol．1989，63，3270；Pushpa-Rekhaら，J．Biol． Chem．1995，270，26993；Monacoら，J．Biol．Chem．1994，269，347;DeVirgil ioら，Yeast 1992，8，1043;Kanagasundaramら，Biochim．Biophys．Acta 1992 ，1171，198;Olsenら，Mol．Endocrinol．1991，5，1246；Saulら，Appl．Envir on．Microbiol．1990，56，3117；Yaoitaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1990 ，87，7090；Rogersら，EMB0 J．1990，9，2273）。 本発明においては、“スタートコドン”および“翻訳開始コドン”とは、そのコ ドンの配列に関わらず、インビボでＣＭＶのＲＮＡ分子の翻訳を開始するのに使 用されるコドンをいう。また当該分野で知られるように、遺伝子の翻訳終止コド ン（または“停止コドン”）は３つの配列、すなわち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡ Ｇ、および５’−ＵＧＡ（相当するＤＮＡ配列はそれぞれ５’−ＴＡＡ、５’− ＴＡＧ、および５’−ＴＧＡである）のうちの１つを有しうる。“開始コドン領 域”および゛“翻訳開始コドン領域”とは、翻訳開始コドンからいずれかの方向 （すなわち５’または３’の方向）にある連続する約２５〜約５０のヌクレオチ ドを包含するｍＲＮＡまたは遺伝子の部分をいう。同様に、“停止コドン領域” および“翻訳終止コドン領域”とは、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すな わち５’または３’の方向）にある連続する約２５〜約５０のヌクレオチドを包 含するｍＲＮＡまたは遺伝子の部分をいう。ｍＲＮＡプロセシング部位、特にス プライス部位またはスプライス連結部もまた好ましい標的部位でありうる。転写 開始部位、または“５’キャップ部位”および５’キャップ領域（これはキャッ プされたｍＲＮＡの５’最末端にある約２５〜約５０の連続するヌクレオチドを 包含する）もまた有効な標的でありうる。標的部位が同定されれば、標的に十分 相補 的である、すなわち十分な特異性で十分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ ドを選択して所望の効果を得る。 本発明においては、“ハイブリダイゼーション”とは、通常は相反する核酸鎖 上、または一本の核酸鎖の２つの領域にある相補的な塩基間の水素結合（ワトソ ン−クリック塩基対合としても知られる）を意味する。グアニンとシトシンは、 それらの間に３つの水素結合が生成されることが知られている相補的な塩基の例 である。アデニンおよびチミンは、それらの間に２つの水素結合が生成される相 補的な塩基の例である。“特異的にハイブリダイズする”とは、標的とオリゴヌ クレオチドまたは類似体との間に安定かつ特異的な結合が生じるに十分な程度の 相補性をいう。当該分野では、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズす るために、その標的核酸配列と１００％相補的である必要はないと理解されてい る。あるオリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズできるのは、そのオリゴ ヌクレオチドの標的への結合がメッセンジャーＲＮＡの正常な機能に干渉して有 効性を失わせ、そして、十分な程度の相補性があるために、特異的結合が必要と される条件下（すなわち、インビボアッセイもしくは治療処置の場合は生理学的 条件下、または、インビトロアッセイの場合はアッセイが行われる条件下）にお いてオリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合が起こらない場合である 。 オリゴヌクレオチドとその相補的な標的との間の関係は、通常“アンチセンス ”と表される。オリゴヌクレオチドはＲＮＡの機能（タンパク質への翻訳、細胞 質への転位、成熟、またはその全生物学的機能に必要な他の活性のいずれか）を 阻害することができる。全てまたは一部の機能を果たすＲＮＡの欠損により、ウ イルスの正常なライフサイクルを制御するゲノムの一部の欠損が起こる。 現在では、ＣＭＶ感染症の緩和に効果的なオリゴヌクレオチドを設計できるこ とが発見されている。オリゴヌクレオチドは約５〜約５０ヌクレオチドユニット の間であるのが好ましく、より好ましくは約８〜約２５ヌクレオチドの間である 。オリゴヌクレオチドを１個以上の塩基、糖、またはバックボーンの位置で修飾 して有効性を向上してもよい。そのような修飾によって、ヌクレアーゼに対する オリゴヌクレオチドの安定性を増加し、そして／または標的へのオリゴヌクレオ チドの結合親和性を向上してもよい。安定性および結合親和性は共に、当業者に よ って日常的かつ容易に測定される。 本発明においては、“オリゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸またはデ オキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーをさす。この用語は、天然存在型の 核塩基、糖、および糖間の共有（バックボーン）結合からなるオリゴヌクレオチ ド、そして同様の機能をする非天然存在型部分を有するオリゴヌクレオチドを含 む。多くの場合そのような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは天然型よ り好ましく、これは、例えば向上された細胞取り込み、向上された標的核酸に対 する親和性、そしてヌクレアーゼ存在下での向上された安定性のような好ましい 特性のためである。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび好ましい修飾につい ての検討は、De Mesmaekerら，Acc．Chem．Res．1995，28，366-374に見い出す ことができる。 本発明に描かれる好ましいオリゴヌクレオチドの特定の例には、修飾されたバ ックボーン、例えばホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホン 酸、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または、短鎖ヘテロ原子も しくはヘテロ環糖間結合を含有するものがある。最も好ましいのはホスホロチオ エートバックボーンを有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーン を有するオリゴヌクレオチド、特にＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃ ）−Ｏ−ＣＨ₂（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンとして知 られる）、ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂、ＣＨ₂-Ｎ（ＣＨ₃）−Ｎ（ＣＨ₃） −ＣＨ₂、およびＯ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−ＣＨ₂バックボーンであり、ここで天 然型ホスホジエステルバックボーンはＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ₂と表される。De Mesmae kerら，Acc．Chem．Res．1995，28，366-374に開示されるアミドバックボーンも 好ましい。またモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドも好ま しい（SummertonおよびWeller，米国特許第5,034,506号）。他の好ましい態様で は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）バックボーンのように、オリゴヌクレオチドのホス ホジエステルバックボーンをポリアミドバックボーンに替え、核塩基を直接また は間接的にポリアミドバックボーンのアザ窒素原子に結合させる（Nielsenら，S cience 1991，254，1497）。 また、オリゴヌクレオチドは１個以上の置換された糖部分を含有してもよい。 好ましいオリゴヌクレオチドは２’位に以下のうちの１つを含有する：ＯＨ、Ｓ Ｈ、ＳＣＨ₃、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ₃ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₃Ｏ（ＣＨ₂)_nＣＨ₃、Ｏ（Ｃ Ｈ₂）_nＮＨ₂、もしくはＯ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（式中ｎは１〜約１０である）；Ｃ₁ からＣ₁₀の低級アルキル、アルコキシアルコキシ（すなわち−Ｏ−アルキル−Ｏ −アルキル）、置換された低級アルキル、アルカリル、もしくはアラルキル；Ｃ ｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ₃；ＯＣＦ₃；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル_;Ｏ−、 Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ₃；ＳＯ₂ＣＨ₃；ＯＮＯ₂；ＮＯ₂；Ｎ₃ ；ＮＨ₂；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルア ミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ開裂基；レポーター基； 挿入基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を向上する基；または、オリゴ ヌクレオチドおよび同様の特性を有する他の置換基の薬力学的特性を向上する基 。好ましい修飾には２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃、 ２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる）がある（Martinら，Helv ．Chim．Acta 1995，78，486）。他の好ましい修飾には２’−メトキシ（２’− Ｏ−ＣＨ₃）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃）、および２’−フ ルオロ（２’−Ｆ）がある。同様の修飾をオリゴヌクレオチドの別の位置、特に ３’末端ヌクレオチドにある糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位に 施してもよい。またオリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の位置にシクロ ブチルのような糖様のものを有してもよい。 また、オリゴヌクレオチドは核塩基（当該分野では多くの場合、単に“塩基” と呼ばれる）の修飾または置換を付加的に、または代替として含有してもよい。 ここで使用するところの“未修飾の”または“天然の”核塩基にはアデニン（Ａ ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が ある。修飾された核塩基には、天然の核酸には稀にしか、あるいは一時的にしか 見られない核塩基、例えばヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−ｍｅピリ ミジン、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも呼ば れ、また当該分野ではしばしば５−ｍｅ−Ｃと表される）、５−ヒドロキシメチ ルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントビオシルＨＭＣ、そし て合成核塩基、例えば２−アミノアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン 、５−ブ ロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザ グアニン、Ｎ⁶（６−アミノヘキシル）アデニン、および２，６−ジアミノプリ ンがある。Kornberg,A.DNA Replication,W.H.Freeman & Co.,San Francisco，19 80，pp75-77；Gebeyehu，G．，ら，Nucl．Acids Res．1987，15，4513。 当該分野で知られる“ユニバーサル”塩基、例えばイノシンを含めてもよい。５ −ｍｅ−Ｃ置換は０．６〜１．２℃で核酸デュープレックスの安定性を向上する ことが証明されており（Sanghvi，Y．S．アンチセンスの研究および適用(Antise nse Research and Applications),CrookeおよびLebleu編，CRC Press，Boca R． aton，1993，pp．276-278）、現在のところの好ましい塩基置換である。 本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性もし くは細胞取り込みを向上する１個以上の部分または複合体のオリゴヌクレオチド への化学結合が含まれる。そのような部分には以下の様な脂質部分があるが、そ れらに限定されるものではない：コレステロール部分、コレステリル部分（Lets ingerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1989，86，6553）、コール酸（Manohara nら，Bioorg．Med．Chem．Let．1994，4，1053）、チオエーテル（例えばヘキシ ル−Ｓ−トリチルチオール。Manoharanら，Ann．N．Y．Acad．Sci．1992，660， 306；Manoharanら，Bioorg．Med．Chem．Let．1993，3，2765）、チオコレステ ロール（Oberhauserら，Nucl．Acids Res．1992，20，533）、脂肪族鎖（例えば ドデカンジオールまたはウンデシル残基。Saison−Behmoarasら，EMBO J．1991 ，10，111；Kabanovら，FEBS Lett．1990，259，327；Svinarchukら，Biochimie 1993，75，49）、リン脂質（例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール またはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセ ロ−３−Ｈ−ホスホネート。Manoharanら，Tetrahedron Lett．1995，36，3651 ；Sheaら，Nucl．Acids Res．1990，18，3777）、ポリアミンもしくはポリエチ レングリコール鎖（Manoharanら，Nucleosides & Nucleotides 1995，14，969） 、あるいはアダマンタン酢酸（Manoharanら，Tetrahedron Lett．1995，36，365 1）のような脂質部分、パルミチル部分（Mishraら，Biochim．Biophys．Acta 19 95，1264，229）、または、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カル ボニル−オキシコレス テロール部分（Crookeら，J．Pharmacol．Exp．Ther．1996，277，923）。 親油性部分を含有するオリゴヌクレオチド、およびそのようなオリゴヌクレオチ ドを調製する方法は当該分野で知られており、例えば、米国特許第5,138,045号 、第5,218,105号、および第5,459,255号に記載されている。 本発明のオリゴヌクレオチドはプロドラッグとして提供されてもよく、これは 、一般的には体内において、開裂して活性のあるオリゴヌクレオチドを生成する 部分を１つ以上含有する。プロドラッグ法の一例はImbachらのWO94/26764に記載 されている。 所定のオリゴヌクレオチドの全ての位置が一様に修飾される必要はなく、実際 に、１個より多くの前述の修飾が単一のオリゴヌクレオチド中に、またはオリゴ ヌクレオチド中の単一のヌクレオシド内にでも、組み込まれていてもよい。また 、本発明にはキメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドも含まれる。 本発明においては、“キメラの”オリゴヌクレオチド、または“キメラ”とは、 ２個以上の化学的に異なる領域を含有し、それぞれが少なくとも１個のヌクレオ チドからなるオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドはある領 域を少なくとも１つ含有するが、その領域ではオリゴヌクレオチドが修飾されて 、それによってオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解に対する耐性が向上し、 細胞取り込みが増加し、そして／または標的核酸への結合親和性が向上する。オ リゴヌクレオチドの更なる領域はＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリ ッドを開裂できる酵素の基質として作用してもよい。例として、ＲＮアーゼ Ｈ は細胞エンドヌクレアーゼで、ＲＮＡ：ＤＮＡデュープレックスのＲＮＡ鎖を開 裂する。従って、ＲＮアーゼ Ｈの活性化によりＲＮＡ標的の開裂が起こり、そ れによって遺伝子発現のアンチセンスの阻害効果が大いに向上される。その結果 、キメラオリゴを使用した場合には、同一の標的領域へハイブリダイズするホス ホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドに比較して、より短いオリゴヌクレ オチドで多くの場合同様の結果が得られる。ＲＮＡ標的の開裂はゲル電気泳動法 によって、必要であれば当該分野で知られる核酸ハイブリダイゼーション法と合 わせて、慣例的に検出することができる。一般的に、キメラオリゴヌクレオチド は“ギャップのある”オリゴヌクレオチド（または“ギャップマー”）であり、 デ オキシヌクレオチドの領域（“ギャップ”。好ましくは少なくとも４個の連続す るデオキシヌクレオチドを含有する）の両側に、修飾されたヌクレオチド（好ま しくは２’−糖修飾を有するヌクレオチド）の領域がある。好ましい態様では、 隣接する領域（または“ウィング”）は２’−アルコキシまたは２’アルコキシ アルコキシ修飾、より好ましくは２’−メトキシエトキシを含有する。好ましい 態様では、バックボーンは全てホスホロチオエートであるか、または“ウィング ”がホスホジエステルで“ギャップ”がホスホロチオエートであってもよい。他 の好ましい態様では、キメラオリゴヌクレオチドは“ウィングのある”オリゴヌ クレオチド（または“ウィングマー”もしくは半キメラ）であってもよく、デオ キシ“ギャップ”、好ましくは少なくとも４個の連続するデオキシヌクレオチド があり、５’または３’側のいずれかに修飾されたヌクレオチドの領域が隣接す る。この場合も隣接する領域（または“ウィング”）は好ましくは２’−アルコ キシまたは２’アルコキシアルコキシ修飾、より好ましくは２’−メトキシエト キシを含有し、バックボーンは全てホスホロチオエートであるか、または“ウィ ング”がホスホジエステルで“ギャップ”がホスホロチオエートであってもよい 。他のキメラオリゴヌクレオチドの構造も本発明に包含される。これらは糖、塩 基またはバックボーンの他の修飾を、好ましくはオリゴヌクレオチドのウィング に含有してもよい。 好ましい態様によれば、ｍＲＮＡはＣＭＶの複製を阻害するのに十分な程度に 干渉される。従って、ＣＭＶのｍＲＮＡ部分と相互作用できるオリゴヌクレオチ ドが包含される。疾病を有する疑いのある動物を本発明に従って調製したオリゴ ヌクレオチドと接触させる。特に、本発明はサイトメガロウイルス感染症の処置 に、予防的または治療的に有効であると考えられる。 サイトメガロウイルス感染症を有する動物を本発明にかかるオリゴヌクレオチ ドを投与して治療する。通常の技術を有する者は、最適な投与量、投与の方法論 、および反復率を動物の体重と状態に従って容易に決定できる。最適な投与計画 は薬剤の体内蓄積の測定から算定することができ、例えば、動物でもヒトでも、 血漿中、または適当であれば標的組織中の薬剤濃度を測定して算定してもよい。 通常の技術を有する者は最適な投与量、投与の方法論、および反復率を容易に決 定 できる。最適な投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対力価によって異なって もよく、一般的に、インビトロおよびインビボの動物実験におけるＥＣ₅₀または ＩＣ₅₀に基づいて算定できる。例えば、所定の化合物の分子量（オリゴヌクレオ チド配列および化学構造から得られる）と、例えばＩＣ₅₀のような有効量（実験 に基づいて得られる）から、投与量（ｍｇ／ｋｇ）は慣例的に算出される。 ヒト型ＣＭＶに相補的なアンチセンス化合物は、種々のアッセイで有効性、 安定性、および毒性について試験されてきた。以下の記載は例証であり、本発明 を制限することを意図するものではない。ＣＭＶのＩＥ１、ＩＥ２、およびＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を標的とするアンチ センスオリゴヌクレオチドの設計およびスクリーニング ｍＲＮＡ配列内の選択された標的には、ｍＲＮＡの安定性、プロセシング、お よび／または翻訳効率を制御することが知られているｍＲＮＡの領域がある。 これらの標的部位には５’キャップ部位および翻訳開始制御部位がある。ＩＥ１ 、ＩＥ２、およびＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の標的配列を表−１に示す： 表−１において、略語Ｉ／Ｅはイントロン／エクソン連結部を意味し、またＡ ＵＧ領域はＩＥ２のｍＲＮＡの翻訳開始領域であり、その転写はＩＥ２の特定の プロモーター領域によって制御される。略語“ｎｕｃ ｓｉｇ”はＩＥ２タンパ ク質の核局在化シグナルを意味する。 ヒト型ＣＭＶに相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、抗ウイルス活性を試験 した。これらのオリゴヌクレオチドの配列および遺伝子標的を表−２に示す。 試験したオリゴヌクレオチドのうち、８個はヒト型ＣＭＶのＤＮＡポリメラー ゼをコードするｍＲＮＡに相補的であり、残りはＣＭＶの主要な極初期プロモー ターから転写されたＲＮＡに相補的であった。このゲノム領域からの２つの主要 なタンパク質産物（ＩＥ１およびＩＥ２）は共通のプロモーターから転写される メッセンジャーＲＮＡから合成されるので、これらの化合物のうちの８個はＩＥ １およびＩＥ２ ｍＲＮＡの両方に相補的である。３個の化合物はＩＥ１および ＩＥ２ ｍＲＮＡにのみ相補的である。３個の化合物はＩＥ１ ｍＲＮＡにのみ 相補的であり、残りの５個はＩＥ２ ｍＲＮＡに特異的である。 ５μＭのスクリーニング濃度で、全てのホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドは未処理の細胞に比較してウイルスの複製を低下させることが証明された（図 −１）。５個のオリゴヌクレオチドはこの濃度で９０％より高いウイルスの阻害 を示した。これらのオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ２９１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：８；ＩＳＩＳ ２９１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９；ＩＳＩＳ ２ ９２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０；ＩＳＩＳ ２９２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：２１；Ｉ：ＳＩＳ ２９２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）は本発明の好まし い態様である。 用量応答試験では、非特異的効果およびアンチセンスオリゴヌクレオチドによ るＣＭＶの複製の配列特異的阻害の間で差異が認められた。化合物ＩＳＩＳ ２ ９２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、ＩＳＩＳ ２８８２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：１２）、ＩＳＩＳ ２９１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、ＩＳＩＳ ２ ９１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、およびＩＳＩＳ ３３００（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：２４、Ｐ＝Ｓ／２’−Ｏ−Ｍｅ）は全て、ＣＭＶに非相補的なランダ ム化したオリゴヌクレオチドより低い投与量でＣＭＶの複製阻害を示した（図− ２）。これらのオリゴヌクレオチドは好ましい。ＩＳＩＳ ２９１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、ＩＳＩＳ ２９１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、およ びＩＳＩＳ ２９２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）はＩＥ２ ＲＮＡ配列に相 補的である。ＩＳＩＳ ２８８２(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２)およびＩＳＩＳ ３３００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、Ｐ＝Ｓ、2’−Ｏ−Ｍｅ)は、ＩＥＩおよ びＩＥ２転写物の５’キャップ領域に相補的である。ランダム化したコントロー ルオリゴヌクレオチドに比較したＩＳＩＳ ２９１９およびＩＳＩＳ ２９２２ の活性は、独立した用量応答試験で確認した（図−３）。極初期遺伝子およびＤＮＡポリメラーゼを標的とした更なるオリゴヌクレオチド 一連の２１個のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、抗ＣＭＶ活性につ いて試験した。これらのオリゴヌクレオチドを表−３に示し、、比較のためにＩ ＳＩＳ−２９２２およびネガティブコントロールのオリゴヌクレオチド（ＩＳＩ Ｓ ３３８３）も示す。 この試験で、ネガティブコントロールが活性を示す投与量の１／３（またはそ れ未満）でＣＭＶを阻害するオリゴヌクレオチド（この表でＩＣ₅₀＝１μＭ以下 ）が好ましい。ＩＳＩＳ ２９２２およびＩＳＩＳ ３２４６オリゴヌクレオチド配列の化学修 飾 キメラオリゴヌクレオチドを合成したが、このオリゴヌクレオチドの中心にあ るヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドであるが、隣接する領域は２’− Ｏ−メチル化したヌクレオチドである。これらのキメラオリゴヌクレオチドはホ スホロチオエートバックボーン、およびＩＳＩＳ ２９２２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：２２）と同一のヌクレオチド配列を有する。キメラオリゴヌクレオチドは、 ＥＬＩＳＡアッセイでＣＭＶに対して活性があった。ＩＳＩＳ ４３２５はどち らかの側に５個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが隣接する１１個の２’−デオ キシヌクレオチドを有するが、そのＩＣ₅₀は０．５μＭであった。ＩＳＩＳ ４ ３２６はどちらかの側に７個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが隣接する７個の デオキシヌクレオチドを有するが、そのＩＣ₅₀は０．８μＭであった。 同一配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を共有し、全てのヌクレオチドに２’ −Ｏ−メチル修飾を有するいくつかのオリゴヌクレオチドをこのアッセイで試験 したところ、ＩＣ₅₀は２．０μＭ（ホスホロチオエートバックボーン）および＞ ５．０μＭ（ホスホジエステルバックボーン）であることが証明された。これら の値は、ネガティブコントロールのオリゴヌクレオチドで得られたＩＣ₅₀の、そ れぞれ８０％および＞２００％であった。 ＩＳＩＳ ３２４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）の化学修飾のＣＭＶに対す る活性についても試験した。これらのオリゴヌクレオチドはヒト型ＣＭＶのＩＥ ｍＲＮＡの５’キャップ領域を標的とする。オリゴヌクレオチド、修飾、および これらのオリゴヌクレオチドのＩＣ₅₀を、類似するコントロールと共に表−４に 示す。表−４においてＩＣ₅₀が１μＭ以下のオリゴヌクレオチドが好ましい。ＩＳＩ：Ｓ ２９２２（フォミバーセン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、Ｐ＝Ｓ） の抗ウイルス活性 上記のスクリーニングで確定したように、ＩＳＩＳ ２９２２、ヒト型ＣＭＶ に相補的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは抗ウイルス活性を有するこ とが、ＣＭＶ複製のＥＬＩＳＡによるアッセイを使用して発見された。このオリ ゴヌクレオチドは５μＭのスクリーニング濃度で９０％より高いウイルス阻害を 示した。用量応答試験では、非特異的効果およびこのオリゴヌクレオチドによる ＣＭＶの複製の配列特異的阻害の間に差異が認められた。化合物ＩＳＩＳ ２９ ２２はＣＭＶに非相補的なランダム化したオリゴヌクレオチドより低い投与量で ＣＭＶの複製阻害を示した。ランダム化したコントロールオリゴヌクレオチドに 比較したＩＳＩＳ ２９２２の活性は、独立した用量応答試験で確認した。 オリゴヌクレオチド２９２２の抗ウイルス活性とガンシクロビルの抗ウイルス 活性との比較は、同一のＥＬＩＳＡアッセイを使用した用量応答試験で、ウイル スでの感染の後、ガンシクロビルまたはオリゴヌクレオチドのいずれかを添加し て行った。オリゴヌクレオチドは、ヒト型ＣＭＶのＡＤ１６９株０．１μＭに対 するＩＳＩＳ ２９２２のＩＣ₅₀（５０％の阻害に必要な濃度）で有効な抗ウイ ルス活性を示した。この試験におけるガンシクロビルのＩＣ₅₀は３μＭであり、 ＩＳＩＳ ２９２２はガンシクロビルより質量ベースで約３０倍の効力があるこ とが示された。同様の結果が、２９２２およびガンシクロビルの抗ウイルス活性 をヒト型ＣＭＶのＴｏｗｎｅ株で測定した際に得られた。 プラーク減少アッセイで測定したところ、宿主細胞のＩＳＩＳ ２９２２での 処理により、ヒト型ＣＭＶがＮＨＤＦ細胞の単分子層上にプラークを生成する能 力が低減した。１μＭの濃度で、プラーク生成は９９％より高く阻害された。 ＮＨＤＦ細胞における感染性ヒト型ＣＭＶの生成を阻害するＩＳＩＳ ２９２ ２の能力を、生成量減少アッセイを使用して測定した。細胞外および細胞内のウ イルスの生成量を合わせて評価したところ、９０％および９９％の感染性ウイル スの生成阻害が、それぞれ１．２μＭおよび２．２μＭのＩＳＩＳ ２９２２濃 度で生じた。対照的に、ガンシクロビルによる９０％および９９％のＣＭＶ生成 阻害は、それぞれ１６μＭおよ３６μＭの濃度でなければ得られなかった。コン トロールオリゴヌクレオチドは、３μＭまでの投与量で感染性ＣＭＶの生成阻害 を示さなかった。 両極初期ポリペプチドの濃度をウェスタンブロット法で分析し、ＩＳＩＳ ２ ９２２で処理したＣＭＶ感染細胞においては低下することが見出された。両タン パク質は０．３μＭのオリゴヌクレオチドでの処理の後、有意に減少し、１μＭ のオリゴヌクレオチドで処理した細胞では検出されなかった。 ＩＳＩＳ ２９２２の極初期タンパク質の発現を阻害する能力を、ヒト型ＣＭ Ｖ感染細胞の免疫蛍光染色を使用して定性的に確認した。１μＭの濃度のＩＳＩ Ｓ ２９２２での処理の後、感染後２４時間のヒト型ＣＭＶ感染細胞の核の免疫 蛍光特性を示す細胞の数は１０％未満まで減少したが、オリゴヌクレオチドで処 理していないコントロール細胞では７０％以上であった。また、蛍光強度もオリ ゴヌクレオチド処理細胞では減少していた。他の抗ウイルス剤と併用した場合のＩＳＩＳ ２９２２の抗ウイルス活性 ＩＳＩＳ ２９２２をヒト型ＣＭＶまたはＨＩＶ感染症の治療に現在使用され ている化合物と併用した場合の抗ウイルス活性について評価した。ＩＳＩＳ ２ ９２２の抗ヒト型ＣＭＶ活性はガンシクロビル（ＤＨＰＧ）またはフォスカーネ ットのものに相加的なものであり、ＡＺＴまたはｄｄＣによる逆の効果はなかっ た。ＩＳＩＳ ２９２２の配列に関連する配列を有するオリゴヌクレオチドの活性 ＩＳＩＳ ２９２２の配列を有するが、内側の部位に不一致を生じる１個以上 のヌクレオチド置換を有するオリゴヌクレオチドを、ＥＬＩＳＡアッセイで、ヒ ト型ＣＭＶに対して試験した。驚くべきことに、４個までの内部の不一致は抗ウ イルス活性が消失することなく許容されるが、ＩＳＩＳ ２９２２のＲＮＡ補体 とハイブリダイズしたこれらのオリゴヌクレオチドについて測定したＴｍ（融解 温度）はそれぞれの不一致ごとに有意に低下することが見出された。これを図− ４に示す。対照的に、２９２２と同一配列を有するが、それぞれの末端から１個 のヌクレオチドを除去した１９量体（ＩＳＩＳ ４３７６）は、ＥＬＩＳＡアッ セイにおいて５μＭまでの濃度で不活性であった。それぞれの末端から更にヌク レオチドを除去したオリゴヌクレオチド（１７量体）も不活性であった。これら のオリゴヌクレオチドおよびそのＣＭＶに対する活性を表−５に示す。表−５ま たは図−４に示すようにコントロール(ＩＳＩＳ ２９２２)の少なくとも５０％ の活性を示すオリゴヌクレオチドが好ましい。 オリゴヌクレオチドは５’から３’で示す。ハイフンはＩＳＩＳ ２９２２配 列に比較した欠損を示す。太字はＩＳＩＳ ２９２２配列からの変更（不一致） を示す。 抗ウイルス活性はＩＳＩＳ ２９２２活性に対するパーセントとして表現され 、以下の方程式で測定される： ［ＥＣ₅₀（ＩＳＩＳ２９２２）／ＥＣ₅₀（オリゴヌクレオチド）］ｘ１００ Ｔ_mは、ＩＳＩＳ ２９２２に完全に相補的なＲＮＡ鎖に対して測定した。 オリゴヌクレオチド標的配列の２９２２標的から片側またはその反対側へのシ フトも活性に影響を与える。２９２２標的の４塩基下流の（３’末端側への）配 列に相補的な２１量体（ＩＳＩＳ ４３７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）はＥ ＬＩＳＡアッセイで活性を有したが、２９２２より高い投与量が必要であった。 対照的に、２９２２標的配列の４塩基上流の（５’末端側への）配列に相補的な ２１量体（ＩＳＩＳ ４３７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）はＩＳＩＳ ２９ ２２よりかなり低い投与量でも活性を示した。ＩＳＩＳ ２９２２の臨床における有効性 ＩＳＩＳ ２９２２（フォミバーセン）については現在、管理されていないＣ ＭＶ網膜炎に罹患した患者における臨床試験がなされている。フォミバーセンは 硝子体内注射で、最初の３週間は週毎、その後は維持治療として隔週毎に投与す る。進行したＣＭＶ網膜炎に罹患し、他の治療法に失敗した患者に３３０μｇの 薬剤を投与したところ、迅速かつ持続的な疾病の緩解が見られた。疾病の持続的 緩解はフォミバーセン単独、またはガンシクロビルとの併用治療を施与した患者 に見られた。２世代抗ＣＭＶ化合物 フォミバーセンより更に低い頻度で（理想的には一ヶ月間隔で）投与でき、眼 部の炎症作用をわずかしか、または全く起こさないアンチセンス化合物の発見が 望まれていた。理想的には、化合物は十分なヌクレアーゼ耐性を示し、網膜での 半減期が長く、そして最低限の眼部の局所的炎症（例えば毛様体炎）を起こし、 更に十分な抗ウイルス活性を有する。 現在、２世代オリゴヌクレオチドが開発されてきており、ＣＭＶに対する活性 について評価が行われている。これらの化合物（表−６に示す）はＩＳＩＳ ２ ９２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）と同一のヌクレオチド配列を有するが、少 なくとも１個の２’−メトキシエトキシ修飾を有するキメラオリゴヌクレオチド である。特に好ましい２世代化合物はＩＳＩＳ １３３１２である。表−６に示 すように、オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １３３１２の５’末端の７個のヌクレ オチドは、糖の２’位が２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（２’−メトキシエ トキシまたはＭＯＥとも呼ばれる）で修飾されている。中央の７個のヌクレオチ ドはデオキシヌクレオチドであり、残りのヌクレオチドは２’−Ｏ−（２−メト キシ）エチル修飾を有するが、３’−末端の最後のヌクレオチドは合成を容易に するためにデオキシヌクレオチドである。分子中のシトシンは全て５−メチル− シトシンであり、全ての糖間結合はホスホロチオエートである。また、ＩＳＩＳ ２９２２（ＰＳ デオキシ）、そして、２’−メトキシエトキシもしくは２−Ｏ −メチル修飾および／または５’−メチルシトシン修飾されたＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：２２を有する種々の２世代キメラ化合物も示す。ＩＳＩＳ １５１０３およ びＩＳＩＳ １５１０４はＩＳＩＳ １５１０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２） より１塩基短く、また５ｍｅＣを有する２’−メトキシエトキシギャップマーで ある。 ＩＳＩＳ ２９２２の２世代類似体の抗ウイルス活性 ＩＳＩＳ １３３１２は、実施例およびAndersonら,Antimicrob.Agents and Chemother．1996，40，2004-2011に記載される線維芽細胞を使用した細胞培養抗 ウイルスアッセイでＩＣ₅₀が０．３９μＭ（２つの試験結果、０．５および０． ２７μＭの平均）であることが見出された。ＩＳＩＳ １３５７８も、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２およびホスホロチオエートバックボーンを有するが最初の７個 のヌクレオチド（５’末端）および最後の７個のヌクレオチド（３’末端）に２ ’−Ｏ−メチル修飾を、そして全ての２’−Ｏ−メチルシトシンに５−メチル塩 基修飾を有し、そのＩＣ₅₀は約０．１μＭであり、これはこのアッセイでのＩＳ ＩＳ ２９２２、２’−デオキシホスホロチオエート類似体のものと同等である 。ＩＳＩＳ １１９５０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、５−メチルシトシンを有 する２’−デオキシホスホロチオエート）のＩＣ₅₀は約０．１７μＭであり、Ｉ ＳＩＳ １３３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、混合ＰＯ／ＰＳバックボーン を有する２’−ＭＯＥギャップマー）はこのアッセイで不活性であった。ＤＨＰ Ｇ（ガンシクロビル）はこのアッセイで７．５μＭのＩＣ₅₀であった。このアッ セイでＩＣ₅₀が１μＭ以下の化合物が好ましく、ＩＣ₅₀が０．５μＭ以下の化合 物はより好ましい。ＩＳＩＳ １３３１２、ＩＳＩＳ １３５７８、およびＩＳ ＩＳ １１９５０は特に好ましい。図−５にＩＳＩＳ ２９２２、ＩＳＩＳ １ １９５０、ＩＳＩＳ １３３１２、およびＩＳＩＳ １３３１３の用量応答曲線 を示す。ＩＳＩＳ ２９２２、１１９５０、および１３３１２は高い方の投与量 でほぼ完全にウイルスを減少させた。図−６にＩＳＩＳ ２９２２、１３５７８ 、および１３３１２の用量応答曲線を示す。ＩＳＩＳ １３５７８（２’−Ｏ− メチル）およびＩＳＩＳ １３３１２（２’−メトキシエトキシまたは２’−Ｍ ＯＥ）は共に、高い方の投与量でＩＳＩＳ ２９２２（２’−デオキシ）に匹敵 する活性を示した。図−７に“ウィングマー”２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオ チドであるＩＳＩＳ １３５７５、１３５７６、１３５７７、そしてギャップマ ーであるＩＳＩＳ １３５７８の用量応答曲線を示す。高い方の投与量では、い ずれもほぼ完全にウイルスを阻害する。“ウィングマー”２’メトキシエトキシ (２’−ＭＯＥ)オリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ １３５７２、１３５７３、およ び１３５７４の結果を図−８に示す。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の２世代類似体についてもプラーク減少アッセイで 試験した。ＩＳＩＳ ２９２２のＩＣ₅₀は約０.０８μＭであった。ＩＳＩＳ １３５７８のＩＣ₅₀は約０．１μＭであった。ＩＳＩＳ １３３１２のＩＣ₅₀は 約０．３５μＭであり、ＤＨＰＧのIＣ₅₀は約３．８μＭであった。これは図− ９に示す。 ラビットにおける眼部の薬物動態／寛容能の予備実験を実施し、ＩＳＩＳ ２ ９２２とＩＳＩＳ １３３１２を比較した。この実験では、投与量４または１０ μＭのオリゴヌクレオチドをウサギに１回投与し、全体の寛容性および眼部の薬 物動態を評価した。オリゴヌクレオチドを１回の硝子体内注射で投与し（容量０ .０５ｍｌ）、２日後に眼部の試験と組織採集を行った。眼部試験により、賦形 剤コントロールの眼（１２眼）、または４μＭ（１５眼）もしくは１０μＭ（２ ７眼）のＩＳＩＳ １３３１２で処理した眼のいずれにも、肉眼で見える病変は 確認されなかった。４μＭまたは１０μＭのＩＳＩＳ ２９２２を投与した眼に は、眼部の炎症および毛様体炎（毛様体の炎症）の形跡があった。１０μＭのＩ ＳＩＳ ２９２２で処理したウサギでの毛様体炎の発生率は約６０％であった。 このウサギモデルは感受性が極めて高いように設計されており、ＩＳＩＳ ２９ ２２はヒト患者に対処可能な局所的炎症を伴いつつ十分寛容性があることに留意 すべきである。しかし、この実験の結果から、ＭＯＥキメラであるＩＳＩＳ １ ３３１２は、２’デオキシ類似体であるＩＳＩＳ ２９２２より眼の寛容能がか なり向上されるという証拠が得られた。このことで２世代化合物であるＩＳＩＳ １３３１２はその親化合物であるＩＳＩＳ ２９２２にまさる臨床的利点を有 する。 ＩＳＩＳ ２９２２およびＩＳＩＳ １３３１２の網膜濃度を、ウサギへの投 与後４５日まで、間隔をおいて測定した。４μＭおよび１０μＭの投与量（それ ぞれ図−１０に示す“網膜−４”および“網膜−１０”）では共に、処理後≧３ ０日で５〜１０μＭの濃度のオリゴヌクレオチドが網膜において測定された。こ の時点で、ＩＳＩＳ ２９２２（点線）は検出されなかった。 同様の実験をカニクイザルで実施しているが、予備実験の結果はウサギのデー タと一致している。サルでは、１〜７．５μＭの濃度のＩＳＩＳ １３３１２が 投与（１０〜４０μＭの投与量）の２８日後に網膜において検出されている。Ｉ ＳＩＳ ２９２２は投与後これまでに検出されていない。 ＩＳＩＳ １３３１２で観察された網膜での思いがけなく長い残留時間により 、この２世代化合物はＣＭＶ網膜炎の治療に、その親化合物であるＩＳＩＳ ２ ９２２にまさる明らかで意外な利点を有する。患者への投与量は、ＩＳＩＳ ２ ９２２に対する現在の効果的なプロトコール（治療開始時は週毎の投与、維持治 療には隔週毎の投与）に比較してかなり減少できることが予想される。例えば、 月１回の治療に減らしても、ＣＭＶ網膜炎患者のクオリティ・オブ・ライフを非 常に向上し、コストの節約および他の利益にもなりうる。 予備実験では、放射能標識した２’−メトキシエトキシオリゴヌクレオチドを 腸管投与した場合、２０％以上の生物学的に利用可能な標識が生成されることが 示している。網膜炎および他のＣＭＶ感染症、特に胃腸の感染症には、経口投与 が非常に好ましい。 以下の非制限的実施例で、本発明について更に例証する。実施例 実施例１ オリゴヌクレオチドの合成およびキャラクタリゼーション オリゴヌクレオチドはヨウ素による酸化を伴う標準的なホスホルアミダイト化 学を使用して、自動化ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystemsモデル380Ｂ）で合 成した。β−シアノエチルジイソプロピル−ホスホルアミダイトはApplied Bios ystems（Foster City，CA）から購入した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオ チドを得るために、標準的な酸化ボトルを０．２Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチ オ−ル−３−オン１，１−ジオキサイド／アセトニトリル溶液で置換して亜リン 酸結合のステップワイズのチオ化を行った。チオ化サイクルの待ち段階を６８秒 まで延長し、次いでキャッピング段階を行った。 ２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成したが、これ には２’−Ｏメチルβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイト（Chem genes，Needham MA）および修飾されていないオリゴヌクレオチドのための標準 的なサイクルを使用し、ただしテトラゾールおよび塩基のパルス伝達後の待ち段 階を３６０秒間に増加した。合成の開始に使用される３’−塩基は一般に、合成 を容易にするために２’−デオキシリボヌクレオチドとした。 ２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃）置換基を有するオ リゴヌクレオチドは、Martin Helv．Chim．Acta 1995，78，486-504の方法に従 って合成してもよい。合成の開始に使用される３’−塩基は、合成を容易にする ために２’−デオキシリボヌクレオチドであってもよい。５−メチル−２’−デ オキシシチジンホスホルアミダイトは市販品で入手できる（Glen Research，Ste rling VA）。２’−メトキシエトキシ置換基を有する５−メチルシトシンを得る ためには、以下の方法に従ってモノマーを合成した。２’−メトキシエトキシ−５−メチルシトシンモノマーの合成 ２，２’−無水［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］ ５−メチルウリジン（リボシルチミン。Yamasa，Choshi，Japanから市販品を 入手可）（７２．０ｇ，０．２７９Ｍ）、炭酸ジフェニル（９０．０ｇ、０．４ ２０Ｍ）、および炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ、０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３ ００ｍＬ）に添加した。混合液を撹拌しつつ加熱還流し、発生する二酸化炭素ガ スを制御された方法で放出させた。１時間後、わずかに暗色となった溶液を減圧 下で濃縮した。得られたシロップをジエチルエーテル（２．５Ｌ）に撹拌しなが ら注入した。生成物はゴム状となった。エーテルをデカントし、残渣を最小量の メタノール（約４００ｍＬ）に溶解した。溶液を新たなエーテル（２．５Ｌ）に 注入し、固いゴム状物質を生成した。エーテルをデカントしゴム状物質を真空オ ーブンで乾燥して（６０℃、１ｍｍＨｇで２４時間）固体を得、粉砕して淡褐色 の粉末とした（５７ｇ、粗収量８５％）。物質を更なる反応のために使用した。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン ２，２’−無水−５−メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、トリス（２ −メトキシエチル）ホウ酸（２３１ｇ、０．９８Ｍ）、および２−メトキシエタ ノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレス加圧容器に添加し、１６０℃に予熱した 油浴に配置した。１５５〜１６０℃で４８時間加熱した後、容器を開け、溶液を 蒸発乾固してＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で破砕した。残渣を熱アセトン（１Ｌ）に 懸濁した。不溶性の塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄して濾液を蒸発 させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ₃ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解して蒸発させた。 シリカゲルカラム（３ｋｇ）を、０．５％Ｅｔ₃ＮＨを含有するＣＨ₂Ｃｌ₂／ア セトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）で充填した。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍＬ ）に溶解し、カラムへの負荷に先だってシリカ（１５０ｇ）に吸収させた。生成 物を充填溶媒で溶出し、１６０ｇ（６３％）の生成物を得た。２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン ２’−Ｏ−メトキシエチル-５−メチルウリジン（１６０ｇ、０．５０６Ｍ） をピリジン（２５０ｍＬ）と共に蒸発させ、乾燥した残渣をピリジン（１．３Ｌ ）に溶解した。第一の塩化ジメトキシトリチル（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を 添加し、混合液を室温で１時間撹拌した。第二の塩化ジメトキシトリチル（９４ ．３ｇ、０．２７８Ｍ）を添加し、反応混液を更に１時間撹拌した。次いでメタ ノール（１７０ｍＬ）を添加して反応を停止させた。ＨＰＬＣは約７０％の生成 物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、ＣＨ₃ＣＮ（２００ｍＬ）で破砕した。残 渣をＣＨＣｌ₃（１．５Ｌ）に溶解し、２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ₃および ２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過 して蒸発させた。２７５ｇの残渣を得た。残渣を３．５ｋｇのシリカゲルカラム で精製したが、カラムは０．５％Ｅｔ₃ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ アセトン（５：５：１）で充填および溶出した。精製画分を蒸発させ、１６４ｇ の生成物を得た。更に約２０ｇを粗画分から得、総収量１８３ｇ（５７％）を得 た。３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ ル−５−メチルウリジン ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン （１０６ｇ、０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦおよび１ ８８ｍＬのピリジンから調製した７５０ｍＬの３：１混合液）、および無水酢酸 （２４．３８ｍＬ、０．２５８Ｍ）を混合し、室温で２４時間撹拌した。反応は ｔｌｃでモニターしたが、最初にｔｌｃサンプルにＭｅＯＨを添加して反応を停 止させた。ｔｌｃでの判断で反応が完了した時点でＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を添加 し、混合液を３５℃で蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ₃（８００ｍＬ）に溶解し、 ２ｘ２００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムおよび２ｘ２００ｍＬの飽和ＮａＣｌ で抽出した。水相を２００ｍＬのＣＨＣｌ₃で逆抽出した。合一した有機相を硫 酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて１２２ｇの残渣を得た（約９０％の生成物） 。 残渣を３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１ ）で溶出した。生成物の精製画分を蒸発させて９６ｇを得た（８４％）。３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ ル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン 第一の溶液を、３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ− ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ、０．１４４Ｍ）をＣＨ₃Ｃ Ｎ（７００ｍＬ）に溶解して調製し、取りおく。トリエチルアミン（１８９ｍＬ 、１．４４Ｍ）を、トリアゾール（９０ｇ、１．３Ｍ）のＣＨ₃ＣＮ（１Ｌ）溶 液に添加し、−５℃に冷却し、オーバーヘッドスターラーを使用して０．５時間 撹拌した。ＰＯＣｌ₃を３０分間にわたって滴下添加し、撹拌した溶液を０〜１ ０℃に保持し、得られた混合液を更に２時間撹拌した。第一の溶液を４５分間に わたって、後者の溶液に滴下添加した。得られた反応混液を低温室で一晩保存し た。反応混液から塩を濾過し、溶液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に 溶解し、不溶性の固体を濾過して除去した。濾液を１ｘ３００ｍＬのＮａＨＣＯ₃ および２ｘ３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して蒸 発させた。残渣をＥｔＯＡｃで破砕し、標記の化合物を得た。２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジ ン ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ チル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ、０．１４１Ｍ）をジ オキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ₄ＯＨ（３０ｍＬ）に混合した溶液を室温で ２時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ ）と共沸した。残渣をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し、２リットルのステンレ ス加圧容器に移した。ＮＨ₃ガスで飽和したＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を添加し、 容器を１００℃で２時間加熱した（ｔｌｃは完全な変換を示した）。容器の内容 物を蒸発乾固し、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解して飽和ＮａＣｌ（２ ００ｍＬ）で１回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させ て標記の化合物８５ｇ（９５％）を得た。Ｎ⁴−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル −５−メチルシチジン ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチ ジン（８５ｇ、０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、無水安息香酸 （３７．２ｇ、０．１６５Ｍ）を撹拌しながら添加した。３時間撹拌後、ｔｌｃ は反応が約９５％完了していることを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ （２００ｍＬ）と共沸した。残渣をＣＨＣｌ₃（７００ｍＬ）に溶解して飽和Ｎ ａＨＣＯ₃（２ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し 、ＭｇＳＯ₄で乾燥して蒸発させ、残渣を得た（９６ｇ）。残渣は、１．５ｋｇ シリカカラムで、溶出溶媒として０．５％のＥｔ₃ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ ヘキサン（１：１）を使用してクロマトグラフィーを行った。純粋な生成物の画 分を蒸発させ、標記の化合物９０ｇ（９０％）を得た。Ｎ⁴−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル −５−メチルシチジン−３’−アミダイト Ｎ⁴−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ ル-５−メチルシチジン（７４ｇ、０．１０Ｍ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（１Ｌ）に溶解し た。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および２−シアノエトキシ −テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ、０．１２３Ｍ）を窒素 雰囲気下で撹拌しながら添加した。得られた混合液を室温で２０時間撹拌した（ ｔｌｃは反応が９５％完了していることを示した）。反応混液を飽和ＮａＨＣＯ₃ （１ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（３ｘ３００ｍＬ）で抽出した。洗浄 水溶液をＣＨ₂Ｃｌ₂（３００ｍＬ）で逆抽出して抽出物を合一し、ＭｇＳＯ₄で 乾燥して濃縮した。得られた残渣は、１．５ｋｇシリカカラムで、溶出溶媒とし てＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を使用してクロマトグラフィーを行った。純 粋画分を合一し、標記の化合物９０．６ｇ（８７％）を得た。 制御された孔のガラスカラム（Applied Biosystems）からの開裂、および濃水 酸化アンモニウムでの５５℃、１８時間の脱保護の後、０．５Ｍ ＮａＣｌから ２．５容量のエタノールで２回沈殿し、オリゴヌクレオチドを精製した。ゲル電 気泳動法を、２０％アクリルアミド、８M尿素、４５ｍＭトリス−ホウ酸塩緩衝 液、ｐＨ７．０で行った。オリゴデオキシヌクレオチドおよびホスホロチオエー トオリゴヌクレオチドは、完全長の物質が８０％より多いことを電気泳動で判断 した。実施例２ アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＣＭＶ複製阻害のＥＬＩＳＡ アッセイ ヒト型サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを、Ｃ ＭＶ複製のＥＬＩＳＡを使用したアッセイで、抗ウイルス活性について試験した 。正常なヒト真皮線維芽細胞（Clonetics社、San Diego CA）を血清非含有培養 液（Clonetics）で培養し、９６ウェルのプレートに播種した。細胞が約８０％ の集密度になった時点でオリゴヌクレオチドで前処理する。前処理の約２０時間 後、培養液（オリゴヌクレオチドを含有）を注意深く注出し、加温した線維芽細 胞基礎培養液（ＦＢＭ、Clonetics）で細胞を２回洗浄する。次いで、ウェル当 たり１００μｌのＦＢＭで希釈したＣＭＶストックで細胞を感染させる。プレー トを３７℃でインキュベートする。その後、培養液（ウイルスを含有）を注意深 く注出し、新たなあらかじめ加温したＦＢＭ培養液１００μｌ／ウェルで置換す る。プレートをしばらく３７℃でインキュベートした後、５μｌのオリゴヌクレ オチド（ＦＢＭで希釈）をそれぞれのウェルの培養液に再導入する。２日後、再 度細胞をオリゴヌクレオチドで同様に後処理する。６日目に、プレートをＥＬＩ ＳＡのために調製する。 ＥＬＩＳＡのための調製には、培養液を注意深くプレートから注出し、ウェル 当たり２００μｌの無水エタノールで細胞を固定する。細胞を３０分間室温で固 定し、その後エタノールを除去してプレートを自然乾燥する。ＥＬＩＳＡに先立 ち、２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳでプレートを保護する。保護溶液を除去し、 １００μｌの抗ＣＭＶ抗体（１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで１：２０００に希釈）を 添加する。細胞を抗体中で３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄 する。第二の抗体、ビオチニル化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Bethesda Research Labs、MD）を１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで１：１０００に希釈し、細胞と共に３７ ℃で１時間インキュベートする。次いで細胞を洗浄し、ストレプトアビジン−Ｂ −Ｄ−ガラクトシダーゼ中で３７℃で１時間インキュベートする。クロロフェ ノールレッド−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（２０ｍｇを１０ｍｌの５０ｍＭリ ン酸Ｎａ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂に溶解）で発色し、プレートを１０分間振と うし、５７５ｎｍでの吸光度を測定した。実施例３ プラーク減少アッセイ ６ウエル培養プレートに、血清非含有ＦＧＭを用いて５００，０００細胞／ウ ェルの密度でＮＨＤＦ細胞を播種した。やや集密した単層をオリゴヌクレオチド で一晩前処理し、その後ウイルス感染に先だって３回洗浄を行い、残留するオリ ゴヌクレオチドを除去した。ＦＧＭに混合したヒト型ＣＭＶを、未処理の細胞で 約１００プラーク／ウェルが形成されるのに十分な程度に希釈して細胞に添加し た。２時間吸着させた後、ウイルスを除去し、細胞に１％シープラークアガロー ス（ＦＭＣ）と２Ｘ最少培地の１：１混合物を積層した。重複サンプルを計数し 、平均値を、未処理の細胞で生成されるプラークに対するパーセントとして表し た。実施例４ 生成量減少アッセイ ６ウエル培養プレートに、血清非含有ＦＧＭまたは０．２％ＦＢＳ含有ＦＧＭ を用いて５００，０００細胞／ウェルの密度でＮＨＤＦ細胞を播種した。やや集 密した単層をオリゴヌクレオチドで一晩前処理した。細胞を３回洗浄して残留し たオリゴヌクレオチドを除去した後、ＦＧＭに混合したウイルスを添加し、２時 間吸着させた。次いでウイルスを除去し、細胞に新たなオリゴヌクレオチド含有 培養液を積層した。ウイルスの総生成量を評価するために、感染させた細胞を８ 日間インキュベートし、培養液上清中にかきとって−８０℃で凍結保存した。 回収したサンプルからの感染ウイルス生成量を、ＮＨＤＦ細胞の単層について 標準的なプラークアッセイで重複測定した。吸着の後、１％シープラークアガロ ース（ＦＭＣ）と２Ｘ最少培地の１：１混合物からなるアガロース積層を細胞に 適用した。８日間インキュベートした後、細胞をホルムアルデヒドで固定し、リ ン酸緩衝液に混合したメチレンブルーで一晩染色した。実施例５ ヒト型ＣＭＶ極初期タンパク質の発現のウェスタンブロット測定 ＣＭＶ感染ＮＨＤＦ細胞における極初期タンパク質の定常状態の濃度をウェス タンブロット分析で測定した。６ウェル培養プレートのやや集密したＮＨＤＦ細 胞単層をオリゴヌクレオチドで処理し、上記のように感染させた。感染の４８時 間後、培養液を吸引し、細胞を２００μｌの溶菌緩衝液（２０ｍＭ トリス−Ｈ Ｃｌ、ｐＨ７．５；２０ｍＭ ＫＣ１；５ｍＭ ＥＤＴＡ；１％ トリトンＸ− １００；０．１ｍＭ ロイペプチン；１０μｇ／ｍｌ アプロチニン）中にかき とった。核と挫滅組織片に遠心分離した後（１５，０００ｘｇ、１０分間）、上 清を新たなチューブに移し、１０μｌのサンプルからのタンパク質を電気泳動( 変性ドデシル硫酸ナトリウム、８％ポリアクリルアミドゲルで還元条件下)で分 画した。分画したタンパク質を電気泳動的にニトロセルロースメンブランにトラ ンスファーし、ＩＥ１およびＩＥ２タンパク質の両方に共有されるエピトープを 認識するマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ８１０、Chemicon、Temecula、CA） を使用してＩＥ２ポリペプチドを検出した。アルカリホスファターゼ−ヤギ抗マ ウスＩｇＧを二次抗体として使用し、ＮＢＴおよびＢＣＩＰ（BRL Gibco、Gaith ersburg、MD）にブロットを展開した。実施例６ ＣＭＶに感染したＮＨＤＦ細胞の免疫蛍光染色 ４チャンバー培養スライド（Costar）のウェル中のやや集密したＮＨＤＦ細胞 をオリゴヌクレオチドで一晩（１５〜２０時間）前処理し、３ｐｆｕ／細胞のＭ ．Ｏ．Ｉ．を使用してヒト型ＣＭＶに感染させ、３７℃で更に２４時間処理し、 −２０℃でエタノールで固定した。極初期タンパク質を、ウェスタンブロット分 析に使用したのと同じモノクローナル抗体、ＭＡＢ８１０、およびローダミン− ヤギ抗マウスＩｇＧを使用して検出した。細胞を試験し、Nikonのエピ蛍光顕微 鏡を使用して撮影した。実施例７ 第二世代化合物のＣＭＶ抗ウイルス活性 抗ウイルス活性は本質的に実施例２に記載したように測定したが、ＥＬＩＳＡ アッセイの代わりに、Andersonら,Antimicrob.Agents and Chemother．1996，40 ，2004-2011に記載される、ＤＮＡハイブリダイゼーションを使用するＣＭＶ 検出システム（HYBRIWIX^TM、Diagnostic Hybrids社、Athens、OH）を行った。実施例８ ウサギ硝子体内の毒物学／薬物動態学評価 ダッチベルトウサギにオリゴヌクレオチドを硝子体内注射で単一投与した（注 射量０．０５ｍｌ）。ウサギを３つの処理群に無作為に分別した。第１群はＩＳ ＩＳ ２９２２を、左眼に４μＭ、右眼に１０μＭ投与した。第２群はＩＳＩＳ １３３１２を、左眼に４μＭ、右眼に１０μＭ投与した。第３群はＩＳＩＳ １ ３３１２を左眼に１０μＭ、右眼にコントロールの賦形剤を投与した。３つのウ サギにそれぞれの時点で投薬した。処理または組織採集の日に全ての可能な眼に ついて眼部検査（細隙灯検査および間接検査）を行った。組織の薬物動態のため に、硝子体および網膜を採集して凍結した。オリゴヌクレオチド濃度は公表され ている方法(Leedsら,Anal.Biochem.1996,235,36-43;Leedsら,Drug Metab.and Di sp．，印刷中)に従ってキャピラリーゲル電気泳動法で測定した。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年１０月１３日（１９９９．１０．１３） 【補正内容】 請求の範囲 １． ヒト型サイトメガロウイルスのＩＥ1、ＩＥ２またはＤＮＡポリメラーゼ をコードする核酸を標的とし、少なくとも１個の２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−Ｃ Ｈ₃糖修飾を有し、かつサイトメガロウイルスの複製を阻害しうるアンチセンス オリゴヌクレオチド。 ２． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を有する、請求項１記載のオリゴヌクレオチド 。 ３． ヒト型サイトメガロウイルスのＩＥ１、ＩＥ２またはＤＮＡポリメラーゼ をコードする核酸を標的とし、かつサイトメガロウイルスの複製を阻害しうるア ンチセンスオリゴヌクレオチド。 ４． ｍＲＮＡキャップ部位、ＡＵＧ領域、保存アミノ酸領域、またはＤＮＡポ リメラーゼ遺伝子の塩基６０８−６９７もしくは１１０９−１１５９の間のＣＭ Ｖ挿入領域の少なくとも一部を標的とする、請求項３記載のオリゴヌクレオチド 。 ５． ＩＥ１遺伝子のｍＲＮＡキャップ部位、ＡＵＧ領域またはイントロン／エ クソン連結領域の少なくとも一部を標的とする、請求項３記載のオリゴヌクレオ チド。 ６． ＩＥ２遺伝子のＡＵＧ／キャップ部位、ＡＵＧ領域、ＩＥ２特異的イント ロン／エクソン連結領域、または核局在シグナル領域の少なくとも一部を標的と する、請求項３記載のオリゴヌクレオチド。 ７． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７ 、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９ 、５０、５１、５２、１５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６ １、６２、６３、６４、８９または９０を含有する、請求項３記載のオリゴヌク レオチド。 ８． 少なくとも１個のバックボーン修飾を有する、請求項３記載のオリゴヌク レオチド。 ９． バックボーン修飾がホスホロチオエート修飾である、請求項８記載のオリ ゴヌクレオチド。 １０． 少なくとも１個の２’一糖修飾を有する、請求項３記載のオリゴヌクレ オチド。 １１． 修飾が、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまた は２−フルオロ修飾である、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。 １２． ２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ− ＣＨ₃修飾である、請求項１１記載のオリゴヌクレオチド。 １３． 少なくとも４個の連続するデオキシヌクレオチドを有するキメラオリゴ ヌクレーオチドである、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。 １４． 請求項１、請求項２または請求項３記載のオリゴヌクレオチドを含有す る医薬組成物。 １５． インビトロにおいてヒト型サイトメガロウイルス感染を阻害する方法で あって、サイトメガロウイルスに感染されていると考えられる細胞、組織、また は体液を、ヒト型サイトメガロウイルスのＩＥ１、ＩＥ２、またはＤＮＡポリメ ラーゼをコードする核酸を標的とし、少なくとも１個の２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂− Ｏ−ＣＨ₃糖修飾を有し、かつサイトメガロウイルスの複製を阻害しうるアンチ センスオリゴヌクレオチドと接触させることを含んでなる上記方法。 １６． オリゴヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含有する、請求項１ ５記載の方法。 １７． インビトロにおいてヒト型サイトメガロウイルス感染を阻害する方法で あってサイトメガロウイルスに感染されていると考えられる細胞、組織、または 体液を、ヒト型サイトメガロウイルスのＩＥ１、ＩＥ２、またはＤＮＡポリメラ ーゼをコードする核酸を標的とし、かつサイトメガロウイルスの複製を阻害しう るアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含んでなる上記方法。 １８． インビトロにおいてヒト型サイトメガロウイルス感染を阻害する方法で あって、サイトメガロウイルスに感染されていると考えられる細胞、組織、また は体液を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２および少なくとも１個の２’−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖修飾を有し、かつサイトメガロウイルスの複製を阻害しうる アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含んでなる上記方法。 １９． オリゴヌクレオチドが少なくとも４個の連続するデオキシヌクレオチド を有するキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２２記載の方法。 ２０． サイトメガロウイルス感染症を有する疑いのある患者を治療するための 医薬組成物であって、ヒト型サイトメガロウイルスのＩＥ２をコードする核酸を 標的とし、少なくとも１個の２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖修飾を有し、 かつサイトメガロウイルスの複製を阻害しうるアンチセンスオリゴヌクレオチド を有効量含有する組成物。 ２１． オリゴヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含有する、請求項２ ０記載の組成物。 ２２． オリゴヌクレオチドが、少なくとも４個の連続するデオキシヌクレオチ ドを有するキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２０記載の組成物。 ２３． サイトメガロウイルス網膜炎を有する疑いのある患者を治療するための 医薬組成物であって、ヒト型サイトメガロウイルスのＩＥ１、ＩＥ２、またはＤ ＮＡポリメラーゼをコードする核酸を標的とし、かつサイトメガロウイルスの複 製を阻害しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効量含有する組成物。 ２４． サイトメガロウイルス感染症を有する疑いのある患者を治療するための 医薬組成物であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２および少なくとも１個の２’− Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖修飾を有し、かつサイトメガロウイルスの複製を 阻害しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効量含有する組成物。 ２５． オリゴヌクレオチドが少なくとも４個の連続するデオキシヌクレオチド を有するキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２４記載の組成物。 ２６． 感染症がサイトメガロウイルス網膜炎である、請求項２４記載の組成物 。 ２７． サイトメガロウイルス網膜炎を有する疑いのある患者を治療するための 医薬組成物であって、ヒト型サイトメガロウイルスの核酸を標的とするアンチセ ンスオリゴヌクレオチドを有効量含有する組成物。 ２８． 硝子体内注射用である、請求項２７記載の組成物。 ２９． 少なくとも投与の２８日後に網膜において検出しうるアンチセンスオリ ゴヌクレオチド。 ３０． 該投与が硝子体内注射による、請求項２９記載のオリゴヌクレオチド。 ３１． バックボーン修飾がペプチド核酸修飾である、請求項８記載のオリゴヌ クレオチド。 ３２． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の少なくとも１０塩基部分を含有する、請求 項３１記載のオリゴヌクレオチド。 ３３． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオ チドであって、オリゴヌクレオチドの５’−末端から数えてヌクレオチド１−７ のそれぞれが、２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖修飾を有し、ヌクレオチド ８−１４が２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１５−２０のそれ ぞれが２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖修飾を有し、かつヌクレオチド２１ が２’−デオキシヌクレオチドであるかまたは２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃ 糖修飾を有していてもよく、そしてオリゴヌクレオチド中のすべてのシチジン ヌクレオチドが５−メチルシチジンである、上記ホスホロチオエートオリゴヌク レオチド。 ３４． ヒトにおけるサイトメガロウイルス感染症を予防するための組成物であ って、請求項１または請求項３３記載のオリゴヌクレオチドの有効量を含有して なる組成物。 ３５． Ａ組成物ヒトにおけるサイトメガロウイルス網膜炎を予防するための組 成物であって、請求項１または請求項３３記載のオリゴヌクレオチドの有効量を 含有してなる組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アンダーソン，ケビン・ピー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，ラ・グラン・ヴィア 2772 (72)発明者 チャップマン，シャロン アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 28747，レイク・トクサウェイ，コール ド・マウンテン・ロード 162

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ヒト型サイトメガロウイルスのＩＥ１、ＩＥ２、またはＤＮＡポリメラー ゼをコードする核酸を標的とし、少なくとも１個の２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ− ＣＨ₃糖修飾を有し、かつサイトメガロウイルスの複製を阻害しうるアンチセン スオリゴヌクレオチド。 ２． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を有する、請求項１記載のオリゴヌクレオチド 。 ３． ヒト型サイトメガロウイルスのＩＥ１、ＩＥ２、またはＤＮＡポリメラー ゼをコードする核酸を標的とし、かつサイトメガロウイルスの複製を阻害しうる アンチセンスオリゴヌクレオチド。 ４． ｍＲＮＡキャップ部位、ＡＵＧ領域、保存アミノ酸領域、またはＤＮＡポ リメラーゼ遺伝子の塩基６０８〜６９７もしくは１１０９〜１１５９の間のＣＭ Ｖ挿入領域の少なくとも一部を標的とする、請求項３記載のオリゴヌクレオチド 。 ５． ＩＥ１遺伝子のｍＲＮＡキャップ部位、ＡＵＧ領域、またはイントロン／ エクソン連結領域の少なくとも一部を標的とする、請求項３記載のオリゴヌクレ オチド。 ６． ＩＥ２遺伝子のＡＵＧ／キャップ部位、ＡＵＧ領域、ＩＥ２特異的イント ロン／エクソン連結領域、または核局在シグナル領域の少なくとも一部を標的と する、請求項３記載のオリゴヌクレオチド。 ７． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７ 、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９ 、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１ 、６２、６３、６４、８９、または９０を含有する、請求項３記載のオリゴヌク レオチド。 ８． 少なくとも１個のバックボーン修飾を有する、請求項３記載のオリゴヌク レオチド。 ９． バックボーン修飾がホスホロチオエート修飾である、請求項８記載のオリ ゴヌクレオチド。 １０． 少なくとも１個の２’−糖修飾を有する、請求項３記載のオリゴヌクレ オチド。 １１． 修飾が２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、また は２’−フルオロ修飾である、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。 １２． ２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ− ＣＨ₃修飾である、請求項１１記載のオリゴヌクレオチド。 １３． 少なくとも４個の連続するデオキシヌクレオチドを有するキメラオリゴ ヌクレオチドである、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。 １４． 請求項１、請求項２、または請求項３記載のオリゴヌクレオチドを含有 する医薬組成物。 １５． ヒト型サイトメガロウイルス感染症を阻害する方法であって、サイトメ ガロウイルスに感染されていると考えられる細胞、組織、または体液を、ヒト型 サイトメガロウイルスのＩＥ１、ＩＥ２、またはＤＮＡポリメラーゼをコードす る核酸を標的とし、少なくとも１個の２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖修飾 を有し、かつサイトメガロウイルスの複製を阻害しうるアンチセンスオリゴヌク レオチドと接触させることを含んでなる上記方法。 １６． オリゴヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含有する、請求項１ ５記載の方法。 １７． 方法がインビトロで行われる、請求項１５記載の方法。 １８． 方法がインビボで行われる、請求項１５記載の方法。 １９． ヒト型サイトメガロウイルス感染症を阻害する方法であって、サイトメ ガロウイルスに感染されていると考えられる細胞、組織、または体液を、ヒト型 サイトメガロウイルスのＩＥ１、ＩＥ２、またはＤＮＡポリメラーゼをコードす る核酸を標的とし、かつサイトメガロウイルスの複製を阻害しうるアンチセンス オリゴヌクレオチドと接触させることを含んでなる上記方法。 ２０． 方法がインビトロで行われる、請求項１９記載の方法。 ２１． 方法がインビボで行われる、請求項１９記載の方法。 ２２． ヒト型サイトメガロウイルス感染症を阻害する方法であって、サイトメ ガロウイルスに感染されていると考えられる細胞、組織、または体液を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２および少なくとも１個の２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖 修飾を有し、かつサイトメガロウイルスの複製を阻害しうるアンチセンスオリゴ ヌクレオチドと接触させることを含んでなる上記方法。 ２３． 方法がインビトロで行われる、請求項２２記載の方法。 ２４． 方法がインビボで行われる、請求項２２記載の方法。 ２５． オリゴヌクレオチドが少なくとも４個の連続するデオキシヌクレオチド を有するキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２２記載の方法。 ２６． サイトメガロウイルス感染症を有する疑いのある患者を治療する方法で あって、該患者に、ヒト型サイトメガロウイルスのＩＥ２をコードする核酸を標 的とし、少なくとも１個の２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖修飾を有し、か つサイトメガロウイルスの複製を阻害しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを 有効量含有する医薬組成物を投与することを含んでなる上記方法。 ２７． オリゴヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含有する、請求項２ ６記載の方法。 ２８． オリゴヌクレオチドが少なくとも４個の連続するデオキシヌクレオチド を有するキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２６記載の方法。 ２９． サイトメガロウイルス網膜炎を有する疑いのある患者を治療する方法で あって、該患者に、ヒト型サイトメガロウイルスのＩＥ１、ＩＥ２、またはＤＮ Ａポリメラーゼをコードする核酸を標的とし、かつサイトメガロウイルスの複製 を阻害しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効量含有する医薬組成物を投 与することを含んでなる上記方法。 ３０． サイトメガロウイルス感染症を有する疑いのある患者を治療する方法で あって、該患者に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２および少なくとも１個の２’−Ｏ −ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖修飾を有し、かつサイトメガロウイルスの複製を阻 害しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効量含有する医薬組成物を投与す ることを含んでなる上記方法。 ３１． オリゴヌクレオチドが少なくとも４個の連続するデオキシヌクレオチド を有するキメラオリゴヌクレオチドである、請求項３０記載の方法。 ３２． 感染症がサイトメガロウイルス網膜炎である、請求項３０記載の方法。 ３３． サイトメガロウイルス網膜炎を有する疑いのある患者を治療する方法で あって、該患者に、ヒト型サイトメガロウイルスの核酸を標的とするアンチセン スオリゴヌクレオチドを有効量含有する医薬組成物を硝子体内投与することを含 んでなる上記方法。 ３４． 医薬組成物を硝子体内注射で投与する、請求項３３記載の方法。 ３５． サイトメガロウイルス感染症を有する疑いのある患者を治療する方法で あって、該患者に、有効量のヒト型サイトメガロウイルスのＩＥ１、ＩＥ２、ま たはＤＮＡポリメラーゼを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを第二の 抗ウイルス剤と併用して投与することを含んでなる上記方法。 ３６． 第二の抗ウイルス剤がフォスカーネット、ガンシクロビル、またはアン チセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３５記載の方法。 ３７． サイトメガロウイルス感染症を有する疑いのある患者を治療する方法で あって、該患者に、有効量の第一の抗ウイルス剤を硝子体内投与し、有効量の第 二の抗ウイルス剤を静脈内投与することを含んでなる上記方法。 ３８． 第一および第二の抗ウイルス剤が、独立して、フォスカーネット、ガン シクロビル、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３７記載の 方法。 ３９． 少なくとも投与の２８日後に網膜において検出しうるアンチセンスオリ ゴヌクレオチド。 ４０． 該投与が硝子体内注射による、請求項３９記載のオリゴヌクレオチド。 ４１． バックボーン修飾がペプチド核酸修飾である、請求項８記載のオリゴヌ クレオチド。 ４２． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の少なくとも１０塩基部分を含有する、請求 項４１記載のオリゴヌクレオチド。 ４３． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオ チドであって、オリゴヌクレオチドの５’−末端から数えてヌクレオチド１〜７ のそれぞれが２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖修飾を有し、ヌクレオチド８ 〜１４が２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１５〜２０のそれぞ れが２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖修飾を有し、かつヌクレオチド２１が ２’−デオキシヌクレオチドであるかまたは２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃ 糖修飾を有していてもよく、そしてオリゴヌクレオチド中の全てのシチジンヌク レオチドが５−メチルシチジンである上記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ド。 ４４． ヒトにおけるサイトメガロウイルス感染症を予防する方法であって、該 ヒトに、有効量の請求項１記載のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物を投 与することを含んでなる上記方法。 ４５． ヒトにおけるサイトメガロウイルス感染症を予防する方法であって、該 ヒトに、有効量の請求項４３記載のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物を 投与することを含んでなる上記方法。 ４６． ヒトにおけるサイトメガロウイルス網膜炎を予防する方法であって、該 ヒトに、有効量の請求項１記載のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物を投 与することを含んでなる上記方法。 ４７． ヒトにおけるサイトメガロウイルス網膜炎を予防する方法であって、該 ヒトに、有効量の請求項４３記載のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物を 投与することを含んでなる上記方法。