CN109692333B - Mth2蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用 - Google Patents

Mth2蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及MTH2蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用，属于分子生物学和生物医药领域。MTH2蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用。本发明提供了结直肠癌的新的治疗靶点，该靶点可有效用于结直肠癌发展判断、治疗方案选择和/或预后评估，从而为本领域提供了一种新颖的结直肠癌诊断剂和/或治疗剂，具有临床应用前景。

Description

MTH2蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用
技术领域
本发明涉及MTH2蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用，属于分子生物学和生 物医药领域。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是由于结肠粘膜上皮在环境和遗传等 多种致癌因素作用下发生的恶性癌变，是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在世界 范围内，发病率居于恶性肿瘤第三位，死亡率居第四位，每年约有120万新发病 例，严重威胁人类健康。结直肠癌在亚洲发病率较高，尤其是中国，主要与年龄、 家族史、不健康的饮食及生活习惯等危险因素有关。
无论在正常代谢活动中还是在外源性刺激下，细胞会产生大量的ROS，可以 损伤DNA，RNA和游离核苷酸。鸟嘌呤因具有最低氧化电势，其氧化产物8-oxoG 是细胞内含量最丰富的氧化碱基。含有8-oxoG的核苷酸可以掺入DNA或RNA中， 由于8-oxoG以同等效率与A和C配对，故引起复制水平和转录水平错配。
MTH2(MutT homolog 2)又称为NUDT15(nudix hydrolase 15)属于哺乳动 物Nudix水解酶超家族。MTH2可以降解8-oxodGTP，8-oxoGTP，8-oxodGDP和 8-oxoGDP，阻止氧化的鸟嘌呤掺入DNA或RNA中，减少复制和转录水平的错配。 体内外实验研究发现在mutT缺陷大肠杆菌中表达MTH2的cDNA显著降低其自发 突变率，在293T细胞中敲减MTH2后加入外源性8-oxo-dGTP增加了A：T到C：G 颠换突变，因此MTH2可以维持氧化应激下DNA复制和转录的保真性。然而目前 还没有报道研究肿瘤组织中MTH2的表达。
发明内容
本发明的一个方面提供了MTH2蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用。
本发明基于以下发现：
我们首次发现MTH2蛋白在CRC组织中表达量增高，并与CRC进展和预后有 关。MTH2蛋白表达量与结直肠癌AJCC分期和淋巴结转移有关。MTH2高表达组的 CRC患者进行手术治疗后总的生存率更低。我们研究发现MTH2表达与CRC进展和 预后有关，抑制MTH2蛋白表达导致细胞活力下降，因此MTH2蛋白是一个潜在的 结直肠癌治疗的新靶点。在此基础上完成了本发明。
本发明的第二个方面，提供了MTH2蛋白的抑制剂在制备预防和/或治疗结直 肠癌的药物中的用途。
所述药物包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成 分为MTH2蛋白的抑制剂。
所述MTH2蛋白的抑制剂选自MTH2蛋白的抗体和/或MTH2蛋白的结合蛋白。
本发明的第三个方面，提供了MTH2基因的抑制剂在制备预防和/或治疗结直 肠癌的药物中的用途。
所述药物包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成 分为MTH2基因的抑制剂。
所述MTH2基因的抑制剂选在MTH2基因特异性的RNAi、MTH2基因特异性的microRNA、或抑制MTH2基因启动子的抑制剂中的一种或多种。
本发明的第四个方面，提供了一种预防和/或治疗结直肠癌的药物，包括药 学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：MTH2蛋白的抑制剂和/或MTH2基因 的抑制剂。
所述MTH2蛋白的抑制剂选自MTH2蛋白的抗体和/或MTH2蛋白的结合蛋白； 所述MTH2基因的抑制剂选在MTH2基因特异性的RNAi、MTH2基因特异性的 microRNA、或抑制MTH2基因启动子的抑制剂中的一种或多种。
术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且 可被人和/或动物所接受的量。
术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副 反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药 学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
所述的药学上可接受的载体包括但不限于：水、盐水、缓冲液、甘油、乙醇、 脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组 合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接 受的载体。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注 射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含 有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无 菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程 度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确 定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力 学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患 者的体重、患者的免疫状况、给药途径等。
本发明的第五个方面，提供了一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞的方法，在 MTH2蛋白抑制剂或MTH2基因抑制剂存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制肿 瘤细胞。其中所述的肿瘤细胞是结直肠癌细胞。
我们检测结直肠癌(CRC)细胞株和结直肠癌(CRC)组织中MTH2的表达， 比较CRC细胞(组织)与正常细胞(组织)表达量的差异，分析MTH2表达量与 临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间 的相关性，明确了敲减MTH2蛋白可使结直肠癌细胞株增殖能力显著下降。
有益效果：本发明提供了结直肠癌的新的治疗靶点，该靶点可有效用于结直 肠癌发展判断、治疗方案选择和/或预后评估，从而为本领域提供了一种新颖的 结直肠癌诊断剂和/或治疗剂，具有临床应用前景。
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅 用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。凡依照本公开内容进行的本领域等 同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为结直肠癌组织(细胞)和配对癌旁组织(细胞)中MTH2蛋白的表达； 图1A是结直肠癌细胞株中MTH2 mRNA表达的相对定量，图1B是结直肠癌细 胞株中MTH2蛋白表达的代表性Western blotting条带，图1C是结直肠癌细胞株 中MTH2蛋白表达的相对定量，图1D是6对结直肠癌组织和配对癌旁组织中 MTH2蛋白表达的代表性Western blotting条带，图1E是20对结直肠癌组织和配 对癌旁组织中MTH2蛋白表达的定量结果，统计方法为Student’st-test。
图2为结直肠癌组织和配对癌旁组织中MTH2蛋白免疫组化代表图
图3为Kaplan-Meier生存曲线
图4为敲减MTH2蛋白抑制SW480和COLO320细胞增殖；图4A为Western blotting验证SW480和COLO320细胞中MTH2蛋白敲减效果，图4B为敲减 MTH2蛋白后SW480和COLO320细胞增殖曲线。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数 和百分比按重量计。
实施例1.
一.材料与方法
1.实验材料
(1)人胚胎肠粘膜细胞CCC-HIE-2(中国医学科学院基础医学研究所基础 医学细胞中心)和6种结直肠癌细胞株SW480、SW620、COLO320、T84(AJCC， USA)，LoVo、HCT116(中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)。
(2)44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织(佳木斯大学附属第一医院 提供)
(3)结肠癌组织芯片——87例癌组织和对应的癌旁正常组织(上海芯超生 物科技有限公司)，病人在结直肠癌根治术前未经过放疗和化疗
(4)抗-MTH2抗体(Abclonal)
2.实验方法
(1)通过qRT-PCR和Western Blotting分别检测6种人结直肠癌细胞株 HCT116，SW480，SW620，LoVo，COLO320，T84和人正常肠粘膜上皮细胞CCC-HIE-2中MTH2 mRNA和蛋白的表达。qRT-PCR具体步骤如下：
①使用TRIzol(Thermo Fisher，USA)提取细胞株中总RNA。
②使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物科技有限公司)将2ug RNA反转录成cDNA。
③使用KAPA
Figure BDA0001442424490000051
FAST Universal qPCR Kits(KAPA，USA)进行定量 PCR，MTH2引物：forward 5’-GAAAGGAGAAGTGGATGTGAC-3’(SEQ ID NO：1)和reverse 5’-GGAACCCACTCCCAACTTTC-3’(SEQ ID NO： 2)，GAPDH引物：forward 5’-CCTCTCCAGAACATCATCC-3’(SEQ ID NO：3)和reverse 5’-GTGTCGCTGTTGAAGTCAG-3’(SEQ IDNO：4)。
Western Blotting具体步骤如下：
①细胞加入RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司)，其中RIPA裂解液中 含有1XPMSF(索莱宝)和1X蛋白酶和磷酸酶抑制剂(CST，USA)，冰上 放置30min，4℃12000g离心20min，取上清转移到新的1.5mlEP管中。
②BCA法(Thermo fisher，USA)测定总蛋白浓度。
③12％SDS-PAGE电泳，检测GAPDH表达的上样量为10ug，检测MTH2 表达的上样量为40ug。
④转膜，将PAGE中的蛋白电转移到PVDF膜上(Millipore，USA)。
⑤免疫封闭，使用5％脱脂牛奶封闭2h。
⑥一抗孵育，抗-MTH2抗体的稀释比例为1∶1000，抗-GAPDH抗体稀释比 例为1∶2000，4℃过夜，TBST洗5次，每次5min。
⑦二抗孵育，山羊抗兔IgG-HRP(碧云天生物技术有限公司，1∶2000)，室 温孵育2h，TBST洗5次，每次5min。
⑧曝光，将显示液(Millipore，USA)1∶1混合后均匀滴加到条带上，进行 曝光显色。
(2)通过Western Blotting检测44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织 中MTH2的表达量，分析MTH2蛋白表达量与临床病理资料(如性别、年龄、 位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性。具体实验步骤参照(1)。
(3)通过免疫组化检测87例癌组织和对应的癌旁正常组织(组织芯片)中MTH2的表达量，根据染色的程度和染色面积，将癌组织分为高表达组和低表达 组，分析MTH2表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床 分期、分化程度等)之间的相关性。具体步骤如下：
①组织芯片使用二甲苯脱蜡2d，100％、95％、85％、75％乙醇梯度水化各 2min，PBS水化10min。
②抗原修复(pH6.0柠檬酸修复液)微波修复30min，冷却至室温。
③山羊血清(北京中衫金桥生物科技有限公司)封闭30min。
④一抗孵育，抗-MTH2抗体的稀释比例为1∶100，4℃过夜，PBS洗5min X 3次。
⑤二抗孵育，使用PV-6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物，室温孵育20分钟， PBS洗5minX 3次。
⑥DAB(中衫金桥)显色
⑦苏木素复染、梯度脱水、透明封片。
(4)首先使用实验室已筛选出的siMTH2(靶序列为5’- GGATGTGACTCATGATTCA-3’(SEQ ID NO：5))分别敲减SW480和COLO320 细胞株中mRNA表达水平，然后进行WesternBlotting验证敲减效果，最后通过 CCK-8实验检测在SW480和COLO320细胞株中分别瞬时敲减MTH2对细胞活 力的影响。具体步骤如下：
①SW480细胞和COLO320细胞铺96孔板，每孔1X104个细胞。
②12h后，使用RNAiMAX(Thermo Fisher，USA)转染50nM siMTH2和 siControl，每组6个复孔。
③分别在转染后24h、48h和72h，使用CCK-8试剂盒(全式金)检测450nm 处吸光度。
3.组织芯片中MTH2蛋白表达高低评分标准：
(1)染色强度：0(无)；1(弱)；2(中)；3(强)
(2)染色面积：0(0％)；1(1-25％)；2(26-50％)；3(51-75％)；4(76-100％)；
(3)最终得分是染色强度X染色面积：低表达(0-6)；高表达(7-12)
4.统计方法
软件SPSS statistics version 19.
(1)Student’s t-test比较两组均值；
(2)Pearson’X2或者Fisher’s exact test比较MTH2蛋白与CRC临床病理资 料相关性；
(3)Kaplan-Meier analysis计算总的生存率(OS)，the log-rank test比较两 组OS；
二.实验结果
1.结直肠癌细胞株MTH2表达量增加
(1)qRT-PCR结果表明结直肠癌细胞株HCT116，SW480，SW620，LoVo， COLO320中MTH2 mRNA表达水平显著高于CCC-HIE-2(Student’s t-test，P＜ 0.05，图1A)。
(2)Western blotting结果表明结直肠癌细胞株中MTH2蛋白表达水平同样 显著高于CCC-HIE-2(Student’s t-test，P＜0.05，图1B-图1C)。
2.结直肠癌组织中MTH2表达量增加
(1)我们首先进行Western blotting检测20对人结直肠癌组织和配对癌旁正 常组织中MTH2蛋白表达，结果表明癌组织中MTH2表达显著高于正常组织 (Student’s t-test，P＜0.001，图1D-图1E)。
(2)我们然后进行免疫组化检测组织芯片(87对人结直肠癌组织和配对癌 旁组织)中MTH2蛋白表达，再次证明癌组织中该蛋白表达上调(图2)。癌旁 正常组织MTH2蛋白免疫染色很弱，癌组织染色程度不同，有弱，中，强。根据 癌组织免疫染色的强度和范围，87个癌组织中MTH2蛋白高表达有49个。
3.MTH2蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性
(1)根据MTH2蛋白免疫组化染色结果，分别将组织芯片中87个人结直肠 癌组织分为高表达组和低表达组，应用Pearson’X2or Fisher’s exact test分析蛋 白表达与年龄，性别，位置，肿瘤大小，AJCC分期，T分期，N分期，M分期， 分化程度，脉管转移的相关性，结果表明MTH2表达量与AJCC分期和N分期 (淋巴结转移)显著相关(P＜0.05，表1)。
表1.MTH2蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性(免疫组化，n＝87)
Figure BDA0001442424490000081
aChi-square test
bFisher’s exact test
*P＜0.05
(2)Western blotting检测44例人结直肠组织中MTH2蛋白的相对表达，应 用Student’s t-test分析这些蛋白表达与CRC临床病理相关性，结果表明MTH2 表达量与AJCC分期，T分期(肿瘤浸润程度)和N分期(淋巴结转移)显著相 关(P＜0.05，表2)。
表2.MTH2蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性(Western Blotting，n＝44)
Figure BDA0001442424490000091
4.MTH2蛋白表达对结直肠癌患者预后影响
根据MTH2蛋白免疫组化染色结果，分别将组织芯片中87个人结直肠癌组 织分为高表达组和低表达组，应用Kaplan-Meier analysis计算CRC患者进行手术 治疗后总的生存率(OS)，同时使用log-rank test比较高表达组和低表达组的OS， 结果表明MTH2高表达组生存率更低(P＝0.021，图3)。
5.敲减MTH2蛋白抑制结直肠癌细胞株增殖能力
CCK-8实验结果表明在SW480和COLO320细胞株中敲减MTH2蛋白72h后， SW480和COLO320细胞活力显著下降，细胞增殖能力下降(图4)。
三.结论
我们首次发现MTH2蛋白在CRC组织中表达量增高，并与CRC进展和预后 有关。
MTH2蛋白表达量与结直肠癌AJCC分期和淋巴结转移有关。MTH2高表达 组的CRC患者进行手术治疗后总的生存率更低。
我们研究发现MTH2表达与CRC进展和预后有关，抑制MTH2蛋白表达导 致细胞活力下降，因此，MTH2蛋白是潜在的结直肠癌治疗的新靶点。
序列表
<110> 蔡, 剑平
<120> MTH2蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用
<130> XDRC17I035
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaaggagaa gtggatgtga c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaacccact cccaactttc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctctccaga acatcatcc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgtcgctgt tgaagtcag 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggatgtgact catgattca 19

Claims (6)

1.MTH2蛋白的抑制剂在制备预防和/或治疗结直肠癌的药物中的用途；所述MTH2蛋白的抑制剂选自MTH2蛋白的抗体和/或MTH2蛋白的结合蛋白。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为MTH2蛋白的抑制剂。
3.MTH2基因的抑制剂在制备预防和/或治疗结直肠癌的药物中的用途；所述MTH2基因的抑制剂选自MTH2基因特异性的RNAi、MTH2基因特异性的microRNA、或抑制MTH2基因启动子的抑制剂中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述药物包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为MTH2基因的抑制剂。
5.一种预防和/或治疗结直肠癌的药物，其特征在于，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：MTH2蛋白的抑制剂和/或MTH2基因的抑制剂；所述MTH2蛋白的抑制剂选自MTH2蛋白的抗体和/或MTH2蛋白的结合蛋白；所述MTH2基因的抑制剂选自MTH2基因特异性的RNAi、MTH2基因特异性的microRNA、或抑制MTH2基因启动子的抑制剂中的一种或多种。
6.一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于：在MTH2蛋白抑制剂或MTH2基因抑制剂存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制肿瘤细胞；其中所述的肿瘤细胞是结直肠癌细胞；所述MTH2基因的抑制剂选自MTH2基因特异性的RNAi、MTH2基因特异性的microRNA、或抑制MTH2基因启动子的抑制剂中的一种或多种。
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