CN103304445A - 阳离子聚甘油酯类脂质及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一类全新的阳离子脂质即阳离子聚甘油酯类脂质及其合成方法和应用。所述阳离子聚甘油酯类脂质由聚甘油酯类脂质和含氮小分子化合物偶联合成，每分子含有1个到8个或者更多的含氮基团。本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质的特点是能够分散在水中得到粒径在8到200纳米之间的阳离子脂质体。该阳离子脂质体能够包封大量核酸药物分子，在细胞水平上能够传输大量核酸药物分子到细胞内实现核酸药物分子的功能，并且细胞毒性很小，在动物水平上能够靶向传输大量核酸药物分子到荷瘤小鼠肿瘤部位富集，实现对肿瘤的抑制作用。本发明所述的一类阳离子聚甘油酯类脂质作为核酸药物分子的载体具有广阔的应用前景。

Description

阳离子聚甘油酯类脂质及其合成方法和应用
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一类全新的阳离子脂质即阳离子聚甘油酯类脂质及其合成方法和应用。
二、背景技术
两亲性脂质分子由疏水长链、连接基团和亲水基团构成，能够在水相中通过疏水相互作用形成纳米尺度的载体颗粒。两亲性脂质分子广泛应用于包裹或者偶联小分子、核酸等等药物形成载体-药物颗粒，在临床或者实验中实现药物传输的靶向作用、缓释作用、降低药物毒性的作用和提高药物稳定性的作用。两亲性脂质分子在亲水端含有氨基等各种负载正电荷的基团即成为阳离子脂质分子。相比于其它类型的脂质，阳离子脂质可以有效包裹负载负电荷的药物分子，如核酸和蛋白质。阳离子脂质包裹负载负电荷的药物分子通过的是疏水作用和静电相互作用这两种作用力，所以在包裹负载负电荷的药物分子上，通常比一般两亲性脂质分子具有载药量高、稳定性好、药物传输效率高等等优势。
药物载体的载药量和毒副作用直接影响药物的临床应用剂量。载药量越大，毒副作用越小，药物-载体颗粒越能满足临床需要。对于阳离子脂质包裹负载负电荷的药物来说，每个阳离子脂质分子上负载的正电荷的数量跟载药量密切相关。已有的阳离子脂质分子大都每分子含有1个正电荷基团，如二油酰二甲铵基丙烷（DODAP）、二油酰三甲铵基丙烷（DOTAP）、二油基氧丙基氯化三甲铵（DOTMA）等等。文献报道，使用DODAP制备的脂质体，每1毫克最多能够包裹0.16毫克寡核苷酸【Maurer N, et al. Spontaneous entrapment of polynucleotidesupon electrostatic interaction with ethanol-destabilized cationic liposomes. Biophys J2001;80:2310-26.】。在毒副作用上，人工设计、化工合成的脂质分子制备的脂质体在动物实验水平上常常诱发免疫反映、补体反应、炎症反应等等【Lv H, et al.Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. J Control Release2006;114:100-9.】。为了增大载药量，减少毒副作用，我们设计了另一种策略，选中作为食品添加剂如冰淇淋的主要成分聚甘油酯类作为底物合成一类全新的阳离子脂质。聚甘油酯类在结构上具有的特征是，每个分子亲水端有1个到十几个不等的羟基。这些羟基可以通过化学修饰偶联上各种含氮基团，得到阳离子化的聚甘油酯类。通过控制反应催化条件，可以得到的阳离子化聚甘油酯类脂质，每分子含有从1个到十几个不等的含氮基团。这样的产物，每个脂质分子含有最少1个，最多十几个负载正电荷的基团，使得由其制备的脂质载体，在单位质量脂质的载药量上大大超越已有的阳离子脂质，并且毒副作用小。难能可贵的是，合成这类阳离子脂质的方法实现了单位阳离子脂质上的正电基团数量可调，使得脂质分子在分子结构上可以实现调整去适应不同的药物分子，以优化得到最好的脂质体-药物颗粒组合。整个阳离子化聚甘油酯类脂质形成的脂质库必将广泛应用于药物载体领域，在载药量、毒副作用、粒径大小、可优化性上展现其巨大的潜力。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是提供一类阳离子聚甘油酯类脂质及其合成方法和应用。
本发明的技术方案是，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质，其中的单脂肪酸酯在3～20个甘油缩合而成的线性聚甘油基团的末端羟基发生脂肪酸链取代，其中的二脂肪酸酯在3～20个甘油缩合而成的线性聚甘油基团的两个末端羟基发生脂肪酸链取代，对这样的聚甘油酯进行氨基化修饰，通过反应条件控制使得聚甘油酯分子含有从1个到8个或者更多带正电的含氮基团，从而使得本发明所述的阳离子脂质具有新的分子结构特征和功能特点，是一类全新的生物活性剂传输载体。具体而言，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质是具有下列结构的化合物：
在上述化合物中，R1、R2、R3、R4、R5独立地选自由下列各项组成的组：H，含氮基团和10到22个碳原子的脂肪酸酯基组成的组；其中R1和R2至少有一个是10到22个碳原子的脂肪酸酯基；其中R3、R4、R5有0个或者1个或者多个是含氮基团；其中n是重复单元个数，可以是1、4、8、10、18这几个数字中的一个；其中，10到22个碳原子的脂肪酸酯基可以是下列基团中的一个或者多个组合：十碳酸酯基、十二碳酸酯基、十四碳酸酯基、十六碳酸酯基、十八碳酸酯基、二十二碳酸酯基、油酸酯基、亚油酸酯基、亚麻酸酯基、花生四烯酸酯基、二十碳五烯酸基、二十二碳六烯酸酯基；其中，含氮基团可以是下列基团中的一个或者多个组合：氨基乙氨酰基、N-甲基氨基乙氨酰基、N,N-二甲基氨基乙胺酰基、N-乙基氨基乙氨酰基、N,N-二乙基氨基乙胺酰基、N-丙基氨基乙氨酰基、N,N-二丙基氨基乙胺酰基、氨基丙氨酰基、N,N-二甲基氨基丙胺酰基、N,N-二乙基氨基丙胺酰基、精胺酰基。
在另一个方面，本发明提供脂质体，其特征是本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质分散在水相中形成的粒径大小在8～200nm的均一稳定的表面带有净正电荷的纳米颗粒。其中水相包括但不局限于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、1640细胞培养液、DMEM细胞培养液、Opti-MEM I细胞培养液等等。
在另一个方面，本发明提供阳离子聚甘油酯类脂质体的制备方法，其特征是由以下步骤构成：（1）将3～60μmol的阳离子聚甘油酯脂质溶解在0.5～10ml的体积比为1:1的氯仿/甲醇溶剂中；（2）倒入旋转蒸发仪圆底烧瓶中，真空条件下，55°C水浴恒温旋转蒸发2小时；（3）55°C水浴恒温，通氮气流1小时至有机溶剂完全除去；（4）加入0.5～10ml水相，常压，55°C水浴恒温旋转1小时至得到白色乳液；（5）将白色乳液转移到玻璃离心管中，100w超声输出功率，55°C水浴恒温超声，30分钟至乳液基本透明；（6）在超净台中无菌操作，将基本透明的乳液通过0.22μm滤器滤过除菌，得到空载的阳离子聚甘油酯类脂质体；（7）4°C冰箱保存。其中水相包括但不局限于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、1640细胞培养液、DMEM细胞培养液、Opti-MEM I细胞培养液等等。
在另一个方面，本发明提供阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物，其特征是阳离子聚甘油酯类脂质体跟核酸通过正负电荷静电相互作用形成分散在水相中的纳米颗粒，颗粒粒径大小在25～220nm，均一稳定。其中水相包括但不局限于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、1640细胞培养液、DMEM细胞培养液、Opti-MEM I细胞培养液等等。其中核酸包括但不局限于质粒DNA、罗丹明标记的鲑鱼精DNA、罗丹明标记的鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA、鲱鱼精DNA、具有干扰作用的寡核苷酸、siRNA、编码蛋白质的mRNA、microRNA前体及其成熟体等等。
在另一个方面，本发明提供阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物的制备方法，其特征是由以下步骤构成：（1）取阳离子聚甘油酯类脂质体1～400μl，稀释在水相中，混匀，为溶液一；（2）将核酸稀释在水相中，混匀，为溶液二；（3）将溶液一滴加到溶液二中，混匀，室温放置20分钟，即可得到阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物。其中水相包括但不局限于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、1640细胞培养液、DMEM细胞培养液、Opti-MEM I细胞培养液等等。其中核酸包括但不局限于质粒DNA、罗丹明标记的鲑鱼精DNA、罗丹明标记的鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA、鲱鱼精DNA、具有干扰作用的寡核苷酸、siRNA、编码蛋白质的mRNA、microRNA前体及其成熟体等等。
在另一个方面，本发明提供将核酸传输到细胞的方法，所述方法包括使细胞与包含上式的阳离子脂质的脂质体接触，其中传输的核酸被包封在脂质体中，使得核酸传输进入细胞质中，或者实现核酸分子示踪，或者实现核酸表达蛋白，或者实现核酸干扰mRNA合成与翻译。
在另一个方面，本发明提供将核酸传输给模式动物的方法，所述方法包括，以尾静脉注射或者腹腔注射或者皮下注射等等方法，向模式动物施用包含上式的阳离子脂质的脂质体，其中传输的核酸被包封在脂质体中，实现了核酸向模式动物肿瘤部位的富集，避免了核酸向非肿瘤部位各器官的污染，延长了核酸在模式动物体内的循环时间，对肿瘤生长的关键基因或者蛋白进行抑制作用实现疗效。
本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质与常用的阳离子脂质（诸如DODAP、DOTAP、DOTMA）相比的优势为，常用阳离子脂质每分子含有1个正电荷基团，而本发明阳离子聚甘油酯类脂质是通过调节脂质原料、催化剂和含氮基团的摩尔比，实现了对每分子阳离子脂质产物亲水端正电荷基团数量的可控调节，使得每分子所述阳离子脂质包含从1个到8个或者更多带正电的含氮基团。通过这个可控修饰方案，本发明提供了一类具有修饰梯度的阳离子聚甘油酯类脂质库，以及由这个脂质库合成得到的一类具有修饰梯度的阳离子聚甘油酯类脂质体库。作为脂质类药物载体，这类阳离子聚甘油酯类脂质体具有分布在8～200nm之间的粒径，并且均一稳定。在跟核酸药物分子复合以后得到的阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物则具有分布在25～220nm之间的粒径，颗粒均一稳定，并且由于含氮量高，正电荷多，单位质量的脂质体包封的核酸质量大大高于商品化脂质体Lipofectamine2000的包封量。因为单位质量脂质体包封的核酸质量多，这使得阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物能够传输更多核酸进入细胞质中，在传输包括但不局限于罗丹明标记的鲑鱼精DNA、质粒DNA、siRNA、寡核苷酸、microRNA等等核酸药物分子的过程中，均在示踪荧光强度或者蛋白质表达量或者干扰细胞转录、翻译的水平上，得到了优于商品化脂质体的效果。本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体库的另一个优势是单位质量的阳离子聚甘油酯类脂质体或者阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物，毒性比商品化脂质体或者脂质体-核酸复合物小。这是因为商品化脂质主要由化工合成得到，而本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质库使用的原料是作为冰淇淋等等食品添加剂的聚甘油酯，这类原料作为食品，生物相容性非常好，无毒副作用。本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体库的另一个优势是，由其包裹核酸得到的阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物在血清中具有缓释功能，这是因为本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体具有高含氮基团修饰率，具有更多正电荷跟带有负电荷的核酸分子形成更为稳定的正负电荷静电相互作用，使得阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物在血清中较慢被破坏，相比于商品化脂质体-核酸复合物实现了很好的缓释功能。本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体库的另一个优势是，由其包裹核酸得到的阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物经注射到肿瘤小鼠模型，该复合物具有将核酸药物分子在肿瘤处富集的效应，同时不会导致核酸分子对小鼠其它器官的污染，是非常有效的肿瘤靶向载体。相比于此，直接注射核酸分子，核酸分子药物不仅在肿瘤处浓度低，而且还会进入到肝脏、肾脏等器官，造成对小鼠正常器官的毒副作用。、本发明所述聚甘油酯类阳离子脂质体-核酸复合物可在细胞转染中应用。也可在制备治疗肿瘤药物中应用
本发明的其它特征、目标和优势将通过下面的实施例和附图说明而变得显而易见。
四、附图说明
图1.本发明的一个示范性阳离子聚甘油酯脂质的结构：二氨基乙胺酰十聚甘油二硬脂酸酯。
图2.经过CDI催化法控制修饰率得到的各含氮修饰梯度的乙二胺修饰十二聚甘油单花生四烯酸酯，其各梯度的含氮量以及碳/氮比。
图3.经过CDI催化法控制修饰率得到的各含氮修饰梯度的N,N-二甲基丙二胺修饰二十聚甘油二山嵛酸酯，其各梯度的含氮量以及碳/氮比。
图4.8种本发明所述空载的阳离子聚甘油酯类脂质体的光散射粒径和电位。图中横坐标1是空载氨基乙胺酰三聚甘油单癸酸酯脂质体，2是空载二氨基乙胺酰六聚甘油二月桂酸酯脂质体，3是空载三精胺酰六聚甘油单棕榈酸酯脂质体，4是空载五氨基乙氨酰十聚甘油单二十碳五烯酸酯脂质体，5是空载六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯脂质体，6是空载六N-甲基氨基乙胺酰十二聚甘油二亚油酸酯脂质体，7是空载六N,N-二乙基氨基丙胺酰十二聚甘油二硬脂酸酯脂质体，8是空载八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯脂质体。
图5.2种本发明所述空载的阳离子聚甘油酯类脂质体的透射电镜图。图中1是空载六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯脂质体，2是空载八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯脂质体。
图6.8种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-GFP复合物的光散射粒径和电位。图中横坐标1是氨基乙胺酰三聚甘油单癸酸酯脂质体-GFP复合物，2是二氨基乙胺酰六聚甘油二月桂酸酯脂质体-GFP复合物，3是三精胺酰六聚甘油单棕榈酸酯脂质体-GFP复合物，4是五氨基乙氨酰十聚甘油单二十碳五烯酸酯脂质体-GFP复合物，5是六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯脂质体-GFP复合物，6是六N-甲基氨基乙胺酰十二聚甘油二亚油酸酯脂质体-GFP复合物，7是六N,N-二乙基氨基丙胺酰十二聚甘油二硬脂酸酯脂质体-GFP复合物，8是八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯脂质体-GFP复合物。
图7.2种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-GFP复合物的透射电镜图。图中1是六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯脂质体-GFP复合物，2是八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯脂质体-GFP复合物。
图8.4种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体以及商品化脂质体Lipofectamine2000对10μg质粒GFP的包封量。图中横坐标1是三N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物，2是四N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物，3是五N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物，4是六N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物，5是Lipofectamine2000-GFP复合物。
图9.4种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-罗丹明标记鲑鱼精DNA复合物以及商品化脂质体Lipofectamine2000-罗丹明标记鲑鱼精DNA复合物转染HUVEC细胞的激光共聚焦显微镜图。图中1是阴性对照，2是罗丹明标记的鲑鱼精DNA，3是Lipofectamine2000-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物，4是氨基乙胺酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物，5是二氨基乙胺酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物，6是三氨基乙胺酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物，7是四氨基乙胺酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物。
图10.如图9中所述转染实验，经流式细胞仪检测得到每10000个细胞的相对罗丹明荧光强度。图中1是阴性对照，2是罗丹明标记的鲑鱼精DNA，3是Lipofectamine2000-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物，4是氨基乙胺酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物，5是二氨基乙胺酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物，6是三氨基乙胺酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物，7是四氨基乙胺酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物。
图11.4种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-GFP复合物以及商品化脂质体Lipofectamine2000-GFP复合物转染A549细胞的激光共聚焦显微镜图。图中1是阴性对照，2是GFP质粒，3是Lipofectamine2000-GFP复合物，4是三N,N-二甲基氨基丙酰胺二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物，5是四N,N-二甲基氨基丙酰胺二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物，6是五N,N-二甲基氨基丙酰胺二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物，7是六N,N-二甲基氨基丙酰胺二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物。
图12.如图11中所述转染实验，经流式细胞仪检测得到每10000个细胞的相对GFP绿色荧光强度。图中1是阴性对照，2是GFP质粒，3是Lipofectamine2000-GFP复合物，4是三N,N-二甲基氨基丙酰胺二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物，5是四N,N-二甲基氨基丙酰胺二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物，6是五N,N-二甲基氨基丙酰胺二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物，7是六N,N-二甲基氨基丙酰胺二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP复合物。
图13.4种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-siRNA复合物以及商品化脂质体Lipofectamine2000-siRNA复合物转染经LPS刺激的L929细胞24小时后对细胞培养液中肿瘤坏死因子α的蛋白水平进行的Elisa Kits检测。图中1是阴性对照，2是siRNA，3是Lipofectamine2000-siRNA复合物，4是二N-丙基氨基乙胺酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体-siRNA复合物，5是三N-丙基氨基乙胺酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体-siRNA复合物，6是四N-丙基氨基乙胺酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体-siRNA复合物，7是五N-丙基氨基乙胺酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体-siRNA复合物。
图14.如图13中所述转染实验，经LPS刺激的L929细胞24小时后对细胞内肿瘤坏死因子α的转录水平进行Q-PCR检测。图中1是阴性对照，2是siRNA，3是Lipofectamine2000-siRNA复合物，4是二N-丙基氨基乙胺酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体-siRNA复合物，5是三N-丙基氨基乙胺酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体-siRNA复合物，6是四N-丙基氨基乙胺酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体-siRNA复合物，7是五N-丙基氨基乙胺酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体-siRNA复合物。
图15.4种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-ASO复合物以及商品化脂质体Lipofectamine2000-ASO复合物转染经LPS刺激的Raw264.7细胞24小时后对细胞培养液中肿瘤坏死因子α的蛋白水平进行的Elisa Kits检测。图中1是阴性对照，2是ASO，3是Lipofectamine2000-ASO复合物，4是N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物，5是二N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物，6是三N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物，7是四N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物。
图16.如图15中所述转染实验，经LPS刺激的Raw264.7细胞24小时后对细胞内肿瘤坏死因子α的转录水平进行Q-PCR检测。图中1是阴性对照，2是ASO，3是Lipofectamine2000-ASO复合物，4是N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物，5是二N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物，6是三N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物，7是四N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物。
图17.4种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物以及商品化脂质体Lipofectamine2000-pre-mmu-microRNA-16复合物转染经LPS刺激的Raw264.7细胞24小时后对细胞培养液中肿瘤坏死因子α的蛋白水平进行的Elisa Kits检测。图中1是阴性对照，2是pre-mmu-microRNA-16，3是Lipofectamine2000-pre-mmu-microRNA-16复合物，4是三N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物，5是四N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物，6是五N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物，7是六N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物。
图18.7种本发明所述的空载阳离子聚甘油酯类脂质体对Raw264.7、PC12、原代小鼠骨髓干细胞的细胞毒性检测。图中横坐标1是细胞对照，2是Lipofectamine2000，3是空载的氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体，4是空载的二氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体，5是空载的三氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体，6是空载的四氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体，7是空载的五氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体，8是空载的六氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体，9是空载的七氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体。
图19.7种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-鲑鱼精DNA复合物对Raw264.7、PC12、原代小鼠骨髓干细胞的细胞毒性检测。图中横坐标1是细胞对照，2是Lipofectamine2000-鲑鱼精DNA复合物，3是氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体-鲑鱼精DNA复合物，4是二氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体-鲑鱼精DNA复合物，5是三氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体-鲑鱼精DNA复合物，6是四氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体-鲑鱼精DNA复合物，7是五氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体-鲑鱼精DNA复合物，8是六氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体-鲑鱼精DNA复合物，9是七氨基丙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯脂质体-鲑鱼精DNA复合物。
图20.6种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-鲑鱼精DNA复合物在血清中的释放曲线。图中各图标表示如下：
Figure BDA00003252172400101
图21.4种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸尾静脉注射腹腔右侧植瘤小鼠后2小时进行动物活体成像检测药物分布。图中1是阴性对照，2-1和2-2是Cy5.5标记寡核苷酸，3是N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物，4是二N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物，5是三N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物，6是四N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物。
图22.如图21中所述核酸药物分布实验，复合物经尾静脉注射2小时后小鼠各器官和肿瘤部位Cy5.5的荧光强度。图中1是阴性对照，2是Cy5.5标记寡核苷酸，3是N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物，4是二N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物，5是三N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物，6是四N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物。
图23.4种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-抗VEGF的siRNA复合物尾静脉注射腹腔右侧植瘤小鼠后24小时对各小鼠瘤体VEGF的转录水平进行的Q-PCR检测。图中1是阴性对照，2是抗VEGF的siRNA，3是N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物，4是二N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物，5是三N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物，6是四N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物。
图24.4种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-抗VEGF的siRNA复合物尾静脉注射腹腔右侧植瘤小鼠后48小时对各小鼠瘤体VEGF的蛋白表达水平进行的Elisa Kits检测。图中1是阴性对照，2是抗VEGF的siRNA，3是N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物，4是二N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物，5是三N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物，6是四N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物。
图25.4种本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-抗VEGF的siRNA复合物相隔72小时尾静脉注射腹腔右侧植瘤小鼠两次，在第144小时测量各小鼠瘤体瘤径。图中1是阴性对照，2是抗VEGF的siRNA，3是N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物，4是二N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物，5是三N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物，6是四N-丙基氨基乙胺酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物。
五、具体实施方式
本发明将通过下列各实施举例得以更加详细的描述。下列实施举例是出于举例说明本发明的目的，并不意欲以任何方式限制本发明。本领域技术人员将很容易就从各实施举例中认识到，改变或者修改多种非关键参数，能够产生与本发明基本上相同的结果。
实施举例1：材料来源
所有多聚甘油饱和/不饱和脂肪酸酯均购自中国山东省济南市东润精化科技有限公司；CDI、3,500Da透析袋、Gel60硅胶柱、薄层层析板均购自上海生工生物有限公司；所有细胞均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；所有细胞培养试剂、Lipofectamine2000、各种核酸产品均购自LifeTechnologies；所有含氮小分子化合物、有机溶剂和其它试剂均为国产分析纯。
实施举例2：一N,N-二甲基氨基乙胺酰三聚甘油单硬脂酸酯的合成方法
采用CDI催化法合成一N,N-二甲基氨基乙胺酰三聚甘油单硬脂酸酯。将三聚甘油单硬脂酸酯（4mmol）溶解于氯仿（200ml）中。加入CDI（4mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到活化了的三聚甘油单硬脂酸酯。将活化了的三聚甘油单硬脂酸酯逐滴加入到N,N-二甲基乙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到1.28g（63.1%）纯的产物。1H-NMR（一N,N-二甲基氨基乙胺酰三聚甘油单硬脂酸酯）：δH0.92-0.87（t，3H，CH2 CH 3 ），1.31-1.25（m，28H，14×CH2 CH 2 ），1.65-1.62（m，2H，COCH2 CH 2 ），2.38-2.32（m，2H，COCH2），3.80-3.60（m，11H，3×CHOH，4×O CH 2 CH），4.19-4.15（m，7H，2×OCH 2 CH，3×(CH2)2 CHOH），2.30-2.24（m，6H，N(CH3)2），2.52-2.48（m，2H，(CH3)2NCH 2 ），3.28（m，2H，NHCH 2 ），8.06-8.00（m，H，CONH）。
实施举例3：三N,N-二甲基氨基乙胺酰六聚甘油单硬脂酸酯的合成方法
采用CDI催化法合成三N,N-二甲基氨基乙胺酰六聚甘油单硬脂酸酯。将六聚甘油单硬脂酸酯（5mmol）溶解于氯仿（200ml）中。加入CDI（15mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到活化了的六聚甘油单硬脂酸酯。将活化了的六聚甘油单硬脂酸酯逐滴加入到N,N-二甲基乙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到2.02g（55.4%）纯的产物。1H-NMR（三N,N-二甲基氨基乙胺酰六聚甘油单硬脂酸酯）：δH0.92-0.87（t，3H，CH2 CH 3 ），1.31-1.25（m，28H，14×CH2 CH 2 ），1.65-1.62（m，2H，COCH2 CH 2 ），2.38-2.32（m，2H，COCH2），3.85-3.55（m，24H，4×CHOH，10×OCH 2 CH），4.17-4.11（m，3H，COOCH2，COOCH2 CH），2.30-2.24（m，18H，3×N(CH3)2），2.52-2.48（m，6H，3×(CH3)2NCH 2 ），3.28（m，6H，3×NHCH 2 ），8.06-8.00（m，3H，3×CONH），3.89-3.82（m，3H，3×(CH2)2 CHOH），4.90-4.60（m，2H，2×COOCH(CH2)2），4.48-4.42（m，2H，COOCH 2 CH）。
实施举例4：四N,N-二甲基氨基乙胺酰十聚甘油单油酸酯的合成方法
采用CDI催化法合成四N,N-二甲基氨基乙胺酰十聚甘油单油酸酯。将十聚甘油单油酸酯（2mmol）溶解于氯仿（100ml）中。加入CDI（8mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到活化了的十聚甘油单油酸酯。将活化了的十聚甘油单油酸酯逐滴加入到N,N-二甲基乙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到1.84g（71.3%）纯的产物。1H-NMR（四N,N-二甲基氨基乙胺酰十聚甘油单油酸酯）：δH0.92-0.87（t，3H，CH2 CH 3 ），1.31-1.26（m，20H，10×CH2 CH 2 ），1.65-1.62（m，2H，COCH2 CH 2 ），2.38-2.32（m，2H，COCH2），2.02-1.88（m，4H，2×CH 2 CH=CH），5.4-5.32（m，2H，CH=CH），3.90-3.48（m，49H，7×CHOH，18×OCH 2 CH，6×(CH2)2 CHOH），4.17-4.11（m，3H，COOCH2，COOCH2 CH），2.34-2.22（m，24H，4×N(CH3)2），2.52-2.48（m，8H，4×(CH3)2NCH 2 ），3.28（m，8H，4×NHCH 2 ），8.08-7.96（m，4H，4×CONH），4.90-4.60（m，3H，3×COOCH(CH2)2），4.48-4.42（m，2H，COOCH 2 CH）。
实施举例5：六N,N-二甲基氨基乙胺酰十二聚甘油单花生四烯酸酯的合成方法
采用CDI催化法合成六N,N-二甲基氨基乙胺酰十二聚甘油单花生四烯酸酯。将十二聚甘油单花生四烯酸酯（3mmol）溶解于氯仿（150ml）中。加入CDI（18mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到活化了的十二聚甘油单花生四烯酸酯。将活化了的十二聚甘油单花生四烯酸酯逐滴加入到N,N-二甲基乙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到1.63g（54.7%）纯的产物。1H-NMR（六N,N-二甲基氨基乙胺酰十二聚甘油单花生四烯酸酯）：δH0.92-0.87（t，3H，CH2 CH 3 ），1.31-1.26（m，6H，3×CH2 CH 2 ），1.72-1.68（m，2H，COCH2 CH 2 ），2.10-2.02（m，4H，2×CH=CHCH 2 CH2），2.58-2.50（m，18H，3×CH=CHCH 2 CH=CH，6×(CH3)2NCH 2 ），2.38-2.32（m，2H，COCH2），5.4-5.32（m，8H，4×CH=CH），3.94-3.44（m，57H，7×CHOH，22×OCH 2 CH，6×(CH2)2 CHOH），4.17-4.11（m，3H，COOCH2，COOCH2 CH），2.30-2.18（m，36H，6×N(CH3)2），3.28（m，12H，6×NHCH 2 ），8.08-7.96（m，6H，6×CONH），4.90-4.60（m，5H，5×COOCH(CH2)2），4.48-4.42（m，2H，COOCH 2 CH）。
实施举例6：五N,N-二甲基氨基乙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯的合成方法
采用CDI催化法合成五N,N-二甲基氨基乙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯。将二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯（3.5mmol）溶解于氯仿（150ml）中。加入CDI（17.5mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到活化了的二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯。将活化了的二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯逐滴加入到N,N-二甲基乙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到2.53g（68.2%）纯的产物。1H-NMR（五N,N-二甲基氨基乙胺酰二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯）：δH1.02-0.98（t，3H，CH2 CH 3 ），1.94-1.92（m，2H，CH 2 CH3），2.58-2.50（m，22H，COCH2，5×(CH3)2NCH 2 ，5×CH=CHCH 2 CH=CH），5.46-5.34（m，12H，6×CH=CH），3.94-3.44（m，107H，16×CHOH，38×OCH 2 CH，15×(CH2)2 CHOH），4.17-4.11（m，3H，COOCH2，COOCH2 CH），2.30-2.18（m，32H，5×N(CH3)2，COCH2 CH 2 ），3.28（m，10H，5×NHCH 2 ），8.08-7.96（m，5H，5×CONH），4.90-4.60（m，4H，4×COOCH(CH2)2），4.48-4.42（m，2H，COOCH 2 CH）。
实施举例7：二N,N-二甲基氨基乙胺酰三聚甘油二亚油酸酯的合成方法
采用CDI催化法合成二N,N-二甲基氨基乙胺酰三聚甘油二亚油酸酯。将三聚甘油二亚油酸酯（5mmol）溶解于氯仿（200ml）中。加入CDI（10mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到活化了的三聚甘油二亚油酸酯。将活化了的三聚甘油二亚油酸酯逐滴加入到N,N-二甲基乙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到1.28g（63.1%）纯的产物。1H-NMR（二N,N-二甲基氨基乙胺酰三聚甘油二亚油酸酯）：δH0.92-0.87（m，6H，2×CH2 CH 3 ），1.31-1.25（m，28H，14×CH2 CH 2 ），1.65-1.62（m，4H，2×COCH2 CH 2 ），2.38-2.32（m，4H，2×COCH2），2.30-2.18（m，20H，2×N(CH3)2，4×CHCHCH 2 CH2），5.42-5.34（m，8H，4×CH=CH），2.58-2.48（m，8H，2×(CH3)2NCH 2 ，2×CH=CHCH 2 CH=CH），3.80-3.60（m，10H，CHOH，(CH2)2 CHOH，4×OCH 2 CH），3.28（m，4H，2×NHCH 2 ），8.06-8.00（m，2H，2×CONH），4.82-4.74（m，2H，2×COOCH(CH2)2），4.48-4.42（m，4H，2×COOCH 2 CH）。
实施举例8：四N,N-二甲基氨基乙胺酰六聚甘油二亚麻酸酯的合成方法
采用CDI催化法合成四N,N-二甲基氨基乙胺酰六聚甘油二亚麻酸酯。将六聚甘油二亚麻酸酯（4mmol）溶解于氯仿（150ml）中。加入CDI（16mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到活化了的六聚甘油二亚麻酸酯。将活化了的六聚甘油二亚麻酸酯逐滴加入到N,N-二甲基乙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到2.47g（61.8%）纯的产物。1H-NMR（四N,N-二甲基氨基乙胺酰六聚甘油二亚麻酸酯）：δH0.98-0.92（m，6H，2×CH2 CH 3 ），1.96-1.90（m，4H，2×CH=CHCH 2CH3），1.31-1.25（m，16H，8×CH2 CH 2 ），1.65-1.62（m，4H，2×COCH2 CH 2 ），2.58-2.48（m，8H，4×CH=CHCH 2 CH=CH），5.42-5.34（m，12H，6×CH=CH），2.38-2.32（m，4H，2×COCH2），3.85-3.55（m，24H，2×CHOH，10×OCH 2 CH，2×(CH2)2 CHOH），4.82-4.58（m，4H，4×COOCH(CH2)2），4.48-4.42（m，4H，2×COOCH 2 CH），2.30-2.16（m，28H，4×N(CH3)2，2×CH=CHCH 2 CH2），2.52-2.48（m，8H，4×(CH3)2NCH 2 ），3.28（m，8H，4×NHCH 2 ），8.06-8.00（m，4H，4×CONH）。
实施举例9：二氨基乙胺酰十聚甘油二硬脂酸酯的合成方法
采用CDI催化法合成二氨基乙胺酰十聚甘油二硬脂酸酯。将十聚甘油二硬脂酸酯（3.5mmol）溶解于氯仿（150ml）中。加入CDI（7mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到活化了的十聚甘油二硬脂酸酯。将活化了的十聚甘油二硬脂酸酯逐滴加入到乙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到3.58g（81.8%）纯的产物。
1H-NMR（二氨基乙胺酰十聚甘油二硬脂酸酯）：δH0.92-0.87（m，6H，2×CH2 CH 3 ），1.31-1.26（m，48H，24×CH2 CH 2 ），1.65-1.62（m，4H，2×COCH2 CH 2 ），2.38-2.32（m，4H，2×COCH2），3.90-3.48（m，47H，6×CHOH，18×OCH 2 CH，5×(CH2)2 CHOH），4.17-4.11（m，6H，2×COOCH2，2×COOCH2 CH），2.34-2.22（m，24H，2×NH2），2.52-2.48（m，8H，2×NHCH 2 ），3.28（m，8H，4×NHCH 2 ），8.08-7.96（m，4H，4×CONH），4.90-4.60（m，3H，3×COOCH(CH2)2），4.48-4.42（m，2H，COOCH 2 CH）。
实施举例10：六N,N-二甲基氨基乙胺酰十二聚甘油二肉豆蔻（即十四碳酸）酯的合成方法
采用CDI催化法合成六N,N-二甲基氨基乙胺酰十二聚甘油二肉豆蔻酸酯。将十二聚甘油二肉豆蔻酸酯（2.5mmol）溶解于氯仿（150ml）中。加入CDI（15mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到活化了的十二聚甘油二肉豆蔻酸酯。将活化了的十二聚甘油二肉豆蔻酸酯逐滴加入到N,N-二甲基乙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到2.37g（70.4%）纯的产物。1H-NMR（六N,N-二甲基氨基乙胺酰十二聚甘油二肉豆蔻酸酯）：δH0.92-0.87（m，6H，2×CH2 CH 3 ），1.31-1.26（m，40H，20×CH2 CH 2 ），1.60-1.52（m，4H，2×COCH2 CH 2 ），2.38-2.32（m，4H，2×COCH2），2.58-2.50（m，18H，6×(CH3)2NCH 2 ），3.94-3.44（m，55H，6×CHOH，22×OCH 2 CH，5×(CH2)2 CHOH），4.14-4.11（m，H，COOCH2 CH），2.30-2.18（m，36H，6×N(CH3)2），3.28（m，12H，6×NHCH 2），8.08-7.96（m，6H，6×CONH），4.90-4.60（m，6H，6×COOCH(CH2)2）。
实施举例11：五N,N-二甲基氨基乙胺酰二十聚甘油二山嵛酸（即二十二碳酸）酯的合成方法
采用CDI催化法合成五N,N-二甲基氨基乙胺酰二十聚甘油二山嵛酸酯。将二十聚甘油二山嵛酸酯（2mmol）溶解于氯仿（150ml）中。加入CDI（10mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到活化了的二十聚甘油二山嵛酸酯。将活化了的二十聚甘油二山嵛酸酯逐滴加入到N,N-二甲基乙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到2.38g（54.8%）纯的产物。1H-NMR（五N,N-二甲基氨基乙胺酰二十聚甘油二山嵛酸酯）：δH1.02-0.98（m，6H，2×CH2CH3），1.31-1.26（m，72H，36×CH2 CH 2 ），1.60-1.52（m，4H，2×COCH2 CH 2 ），2.38-2.32（m，4H，2×COCH2），2.58-2.50（m，10H，5×(CH3)2NCH 2 ），3.94-3.44（m，105H，15×CHOH，38×OCH 2 CH，14×(CH2)2 CHOH），4.17-4.11（m，3H，COOCH2，COOCH2 CH），2.30-2.18（m，32H，5×N(CH3)2，COCH2 CH 2 ），3.28（m，10H，5×NHCH 2 ），8.08-7.96（m，5H，5×CONH），4.90-4.60（m，5H，5×COOCH(CH2)2）。
本领域技术人员将从实施举例2～实施举例11中很容易看出来，本发明所述的各种阳离子聚甘油酯类脂质，都能够通过聚甘油酯类原料脂质在特定摩尔比的CDI催化下跟含有游离氨基的含氮分子反应得到，并且通过一系列相似的分离纯化手段去除杂质，得到纯品。
实施举例12：不同含氮修饰梯度的乙二胺修饰十二聚甘油单花生四烯酸酯
合成方法如实施举例5中所述。采用CDI催化法合成不同含氮修饰梯度的乙二胺修饰十二聚甘油单花生四烯酸酯。将十二聚甘油单花生四烯酸酯（3mmol）溶解于氯仿（150ml）中。加入不同物质的量梯度的CDI（分别是3mmol，12mmol，24mmol，36mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到各梯度活化了的十二聚甘油单花生四烯酸酯。将各梯度活化了的十二聚甘油单花生四烯酸酯逐滴加入到乙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将各梯度反应后溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，分别用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再分别用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到不同含氮修饰梯度的乙二胺修饰十二聚甘油单花生四烯酸酯。将不同含氮修饰梯度的乙二胺修饰十二聚甘油单花生四烯酸酯，以及原料十二聚甘油单花生四烯酸酯进行元素分析含氮量，结果如图2所示。
从图2中可以看出，随着CDI用量的增加，产物脂质的含氮量增加，从约0.998%到约5.303%，换算成每脂质分子负载正电荷量约为每脂质分子负载1到4.5个正电荷。这表明单位原料脂质十二聚甘油单花生四烯酸酯上偶联的乙二胺的量增加，也就是产物脂质亲水端带正电的基团数量增加，产物脂质的正电性增强。同时，随着CDI用量的增加，产物脂质的碳/氮比下降，从约64.04到约12.07。
本领域技术人员将从该实施举例中很容易看出来，通过调节CDI和原料脂质的摩尔比关系，可以得到所述修饰产物含氮量梯度范围内的各种其它含氮量的阳离子脂质产物。
实施举例13：不同含氮修饰梯度的N,N-二甲基丙二胺修饰二十聚甘油二山嵛酸酯
合成方法如实施举例11中所述。采用CDI催化法合成不同含氮修饰梯度的N,N-二甲基丙二胺修饰二十聚甘油二山嵛酸酯。将二十聚甘油二山嵛酸酯（2mmol）溶解于氯仿（150ml）中。加入不同物质的量梯度的CDI（分别是2mmol，8mmol，16mmol，24mmol，32mmol，40mmol），37°C恒温磁力搅拌1小时，得到各梯度活化了的二十聚甘油二山嵛酸酯。将各梯度活化了的二十聚甘油二山嵛酸酯逐滴加入到N,N-二甲基丙二胺（50ml），37°C恒温磁力搅拌24小时。将各梯度反应后溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，分别用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再分别用双蒸水透析3天至pH达到中性。收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物。将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱（Gel60）纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析（TLC）（硅胶，氯仿/甲醇=9:1v/v，用1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察）确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到不同含氮修饰梯度的N,N-二甲基丙二胺修饰二十聚甘油二山嵛酸酯。将不同含氮修饰梯度的N,N-二甲基丙二胺修饰二十聚甘油二山嵛酸酯，以及原料二十聚甘油二山嵛酸酯进行元素分析含氮量，结果如图3所示。
从图3中可以看出，随着CDI用量的增加，产物脂质的含氮量增加，从约1.422%到约8.409%，换算成每脂质分子负载正电荷量约为每脂质分子负载2到13个正电荷。这表明单位原料脂质二十聚甘油二山嵛酸酯上偶联的N,N-二甲基丙二胺的量增加，也就是产物脂质亲水端带正电的基团数量增加，产物脂质的正电性增强。同时，随着CDI用量的增加，产物脂质的碳/氮比下降，从约67.73到约6.994。
本领域技术人员将从该实施举例中很容易看出来，通过调节CDI和原料脂质的摩尔比关系，可以得到所述修饰产物含氮量梯度范围内的各种其它含氮量的阳离子脂质产物。
本领域技术人员将从实施举例12和实施举例13中很容易看出来，通过调节CDI和原料脂质的摩尔比关系，可以在每分子的各种聚甘油酯类原料脂质上修饰1个至不超过该原料脂质羟基数个数的正电荷基团。这是本发明所述阳离子脂质大大区别于已有阳离子脂质每分子含有1个正电荷的显著特征。
实施举例14：六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯脂质体的制备和表征
将六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯（12μmol）溶解在氯仿/甲醇（2ml，1:1，v/v）溶液中，倒入旋转蒸发仪（RV05-ST,IKA Corp.,Werke GmbH&Co.,KG）圆底烧瓶中，真空条件下，55°C水浴恒温旋转蒸发2小时。55°C水浴恒温，通氮气流1小时至有机溶剂完全除去。加入生理盐水（2ml），常压，55°C水浴恒温旋转1小时至得到白色乳液。将白色乳液转移到玻璃离心管中，55°C水浴恒温超声（100w）30分钟至乳液基本透明。在超净台中无菌操作，将基本透明的乳液通过0.22μm滤器（Millipore Corp.,Billerica,MA）滤过除菌，得到空载六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯脂质体，4°C冰箱保存。使用90Plus Particle Size Analyzer（Brookhaven Instruments Corp.,Austin,TX）确定颗粒大小、多分散性和zeta电位。取50μl该空载脂质体滴加到铜网上，室温放置晾干，再滴加2%磷钨酸负染，室温放置晾干。使用透射电子显微镜（TEM,JEM-200CX,JEOL,Tokyo,Japan）观察铜网上空载脂质体的形态和结构。
实施举例15：八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯脂质体的制备和表征
将八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯（12μmol）溶解在氯仿/甲醇（2ml，1:1，v/v）溶液中，倒入旋转蒸发仪圆底烧瓶中，真空条件下，55°C水浴恒温旋转蒸发2小时。55°C水浴恒温，通氮气流1小时至有机溶剂完全除去。加入生理盐水（2ml），常压，55°C水浴恒温旋转1小时至得到白色乳液。将白色乳液转移到玻璃离心管中，55°C水浴恒温超声（100w）30分钟至乳液基本透明。在超净台中无菌操作，将基本透明的乳液通过0.22μm滤器（MilliporeCorp.,Billerica,MA）滤过除菌，得到空载八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯脂质体，4°C冰箱保存。使用90Plus Particle Size Analyzer（BrookhavenInstruments Corp.,Austin,TX）确定颗粒大小、多分散性和zeta电位。取50μl该空载脂质体滴加到铜网上，室温放置晾干，再滴加2%磷钨酸负染，室温放置晾干。使用透射电子显微镜（TEM,JEM-200CX,JEOL,Tokyo,Japan）观察铜网上空载脂质体的形态和结构。
本领域技术人员将从实施举例14和实施举例15中很容易看出来，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质可以通过旋转蒸发法制备得到无菌的阳离子脂质体储液。事实上，各种常规制备脂质体的方法，如超声法、二次乳化法、反相蒸发法、注入法、冷冻干燥法、冻融法、表面活性剂去除法、高压均质法等等，均适用于本发明所述脂质制备脂质体。图4中表示的是使用90Plus Particle Size Analyzer（Brookhaven Instruments Corp.,Austin,TX）对8种本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体样品进行粒径测定和zeta电位测定的结果。图5是空载六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯脂质体和空载八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯脂质体的透射电镜照片，表示的是这两种脂质体在透射电镜下观察的实际尺寸。事实上，本发明所述脂质制备得到的脂质体，最小粒径能够达到8nm左右，大的粒径在200nm左右，均能够得到粒径均一稳定的脂质体悬液，且zeta电位均为正，证明脂质体表明带有净正电荷，zeta电位的大小跟脂质原料上含氮基团的修饰率相关。
实施举例16：六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯脂质体-核酸复合物的制备和表征
如实施举例14、15中所述方法制备得到六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯脂质体。取一定体积该脂质体分散液冻干后对冻干固体称重，将重量除以体积得到该批次脂质体的浓度。用生理盐水将脂质体稀释到浓度为1mg/ml。取10μl该脂质体，加入40μl无血清DMEM培养液，混匀，为溶液一。将10μg GFP质粒稀释到50μl无血清DMEM培养液中，为溶液二。将溶液一滴加到溶液二中，混匀，室温放置20分钟，得到六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯脂质体-GFP质粒纳米复合物。使用90Plus Particle Size Analyzer（BrookhavenInstruments Corp.,Austin,TX）确定该纳米复合物的大小、多分散性和zeta电位。取50μl该脂质体-GFP纳米复合物滴加到铜网上，室温放置晾干，再滴加2%磷钨酸负染，室温放置晾干。使用透射电子显微镜（TEM,JEM-200CX,JEOL,Tokyo,Japan）观察铜网上脂质体-GFP纳米复合物的形态和结构。
实施举例17：八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯脂质体-GFP质粒复合物的制备和表征
如实施举例14、15中所述方法制备得到八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯脂质体。取一定体积该脂质体分散液冻干后对冻干固体称重，将重量除以体积得到该批次脂质体的浓度。用生理盐水将脂质体稀释到浓度为1mg/ml。取10μl该脂质体，加入40μl无血清DMEM培养液，混匀，为溶液一。将10μg绿色荧光蛋白GFP质粒稀释到50μl无血清DMEM培养液中，为溶液二。将溶液一滴加到溶液二中，混匀，室温放置20分钟，得到八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯脂质体-GFP质粒纳米复合物。使用90PlusParticle Size Analyzer（Brookhaven Instruments Corp.,Austin,TX）确定该纳米复合物的大小、多分散性和zeta电位。取50μl该脂质体-GFP纳米复合物滴加到铜网上，室温放置晾干，再滴加2%磷钨酸负染，室温放置晾干。使用透射电子显微镜（TEM,JEM-200CX,JEOL,Tokyo,Japan）观察铜网上脂质体-GFP纳米复合物的形态和结构。
本领域技术人员将从实施举例16和实施举例17中很容易看出来，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体可以通过正负电荷静电相互作用，跟核酸自发复合得到阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物。事实上，各种常规制备脂质体-质粒DNA复合物的方法，如脂质薄膜在质粒DNA溶液中水合的方法，或者冻干-再水合法等等，均适用于本发明所述脂质体-核酸复合物的制备。事实上，除了如实施举例16和实施举例17所述阳离子脂质体包裹GFP质粒以外，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体还适用于对质粒以外的各种核酸的包裹实验，这些核酸包括但是并不局限于罗丹明标记的鲑鱼精DNA、罗丹明标记的鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA、鲱鱼精DNA、具有干扰作用的寡核苷酸、具有干扰作用的siRNA、编码蛋白质的mRNA、microRNA前体及其成熟体等等，都能有效形成颗粒小、均一稳定的脂质体-核酸纳米复合物。图6中表示的是使用90Plus Particle SizeAnalyzer（Brookhaven Instruments Corp.,Austin,TX）对与图4对应8种脂质体复合形成的脂质体-GFP纳米复合物样品进行粒径测定和zeta电位测定的结果。图7是六N-甲基氨基乙胺酰十聚甘油单亚油酸酯脂质体-GFP复合物和八N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯脂质体-GFP复合物的透射电镜照片，表示的是例举的两种脂质体-质粒DNA复合物在透射电镜下观察的实际尺寸。本发明所述脂质体制备得到的脂质体-核酸复合物，最小粒径能够达到25nm左右，大的粒径在220nm左右，均能够得到粒径均一稳定的脂质体-质粒DNA复合物悬液。如实施举例16和实施举例17得到的脂质体-质粒DNA复合物，其zeta电位为正。事实上，我们改变脂质体和质粒DNA用量的配比，当脂质体过量使得脂质体跟质粒DNA的N/P大于1时，检测脂质体-质粒DNA复合物的zeta电位为正，当质粒DNA过量使得脂质体跟质粒DNA的N/P比小于1时，检测脂质体-质粒DNA复合物的zeta电位为负。
实施举例18：三N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP质粒复合物、四N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP质粒复合物、五N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP质粒复合物、六N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP质粒复合物的包封率测定
使用N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯、二N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯、三N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯、四N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯，如实施举例16和实施举例17所述制备得到脂质体-GFP复合物。为了保证DNA浓度在仪器的检测范围内，每10份同样的脂质体-GFP复合物合并成一个样品。使用超速离心机（BechmanCoulter OptimaTM L-100XP Ultracentrifuge,Beckman,Fullerton,CA,USA）将这些脂质体-GFP复合物超速离心，4°C，60,000rpm，1小时。使用核酸定量仪（Eppendorf BioPhotometer Plus,Eppendorf,Germany）检测上清中未被包封的质粒DNA的浓度。计算得到被脂质体包封的质粒DNA的量。
本领域技术人员将从实施举例18中很容易看出来，通过实施跟实施举例18相似的包封率测定实验，可以得到本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物所包封的核酸的量。事实上，除了如实施举例18中所述使用的GFP质粒以外，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体还适用于对GFP质粒以外的各种核酸的包封率测定实验，这些核酸包括但是并不局限于罗丹明标记的鲑鱼精DNA、罗丹明标记的鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA、鲱鱼精DNA、具有干扰作用的寡核苷酸、具有干扰作用的siRNA、编码蛋白质的mRNA、microRNA前体及其成熟体等等。对于各种核酸，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体均能实现很高的核酸药物包封率。图8中表示的是，每10μg的GFP质粒经过例举的本发明所述阳离子脂质体包封住的GFP质粒的质量。我们使用跟同等质量的商品化脂质体Lipofectamine2000同样对10μg的GFP质粒进行包裹，测定得出同等质量的Lipofectamine2000包封住的GFP质粒的质量为本发明所述阳离子脂质体包封GFP质量的1/3～1/2。这跟本发明所述阳离子脂质的含氮基团修饰率高、单位质量脂质体带正电荷多是正相关的。在对本发明所述阳离子脂质体库的各种脂质体进行包封率测定都发现，本发明所述阳离子脂质体的包封能力更强，使用相同质量的脂质体就能够包封住更多核酸。事实上，在对除了GFP质粒DNA以外的各种核酸的包封率检测实验中，都发现了本发明所述阳离子脂质体对各种核酸具有非常高效的包封效果。所以，本发明所述阳离子脂质体的创新之处在于，通过本发明所述的含氮基团修饰程度梯度增加的策略制备得到的阳离子脂质体能够包裹更多的核酸药物，单位质量的脂质体的包药量比已有脂质体大大增强。
实施举例19：氨基乙氨酰八聚甘油二硬脂酸酯-罗丹明标记鲑鱼精DNA复合物、二氨基乙氨酰八聚甘油二硬脂酸酯-罗丹明标记鲑鱼精DNA复合物、三氨基乙氨酰八聚甘油二硬脂酸酯-罗丹明标记鲑鱼精DNA复合物、四氨基乙氨酰八聚甘油二硬脂酸酯-罗丹明标记鲑鱼精DNA复合物转染HUVEC细胞
将HUVEC细胞以1×106个细胞/孔的密度铺到6孔板中，加入含有10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时至细胞密度达到80%左右。移除培养液，用PBS洗两遍。使用氨基乙氨酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体、二氨基乙氨酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体、三氨基乙氨酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体、四氨基乙氨酰八聚甘油二硬脂酸酯脂质体，将如实施举例16和实施举例17所述制备得到的上述脂质体-罗丹明标记鲑鱼精DNA复合物稀释到800μl无血清DMEM中，加入到6孔板中。37°C细胞培养箱中孵育6小时。移除含有脂质体-GFP复合物的培养液，加入含有10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时。使用激光共聚焦显微镜（Nikon Eclipse Ti,Japan）观察激发光为575nm，发射光为625nm下转染后细胞的红色荧光。用胰酶将细胞消化下来，4°C，1000rpm离心5分钟得到细胞沉淀。用PBS洗涤细胞沉淀，4°C，1000rpm离心5分钟，弃上清。如此洗涤两次。将细胞沉淀重悬在无血清DMEM培养液中。使用流式细胞仪（BDFACSCalibur,BD Biosciences），检测每10000个细胞的相对红色荧光强度。
本领域技术人员将从实施举例19中很容易看出来，通过实施跟实施举例19相似的细胞转染操作，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物均可以实现将模式核酸药物分子罗丹明标记的鲑鱼精DNA传输进入包括但是不局限于NIH/3T3、A549、293T、293A、HUVEC、L929、PC12、Raw264.7、原代肺泡上皮细胞、原代腹腔巨噬细胞、原代骨髓干细胞、原代脂肪干细胞等等各种细胞系和原代细胞。事实上，对于某一特定的细胞，本发明所属阳离子聚甘油酯类脂质体库中会有特定的一些脂质体能够实现对向该细胞内高效传输罗丹明标记的鲑鱼精DNA，这是跟脂质体的含氮水平与细胞对脂质体的耐受程度共同决定的。通常来说，耐受程度低的细胞，在本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体中选取含氮量相对较低的脂质体进行转染实验，能够筛选得到传输效率高的脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物；而对于耐受程度高的细胞，在本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体中选取含氮量相对较高的脂质体进行转染实验，能够筛选得到传输效率高的脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物。图9中表示的是使用激光共聚焦显微镜（Nikon Eclipse Ti,Japan）对例举的脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物转染细胞的荧光图。图10是对细胞的红色荧光进行流式检测的结果。在同等质量用量下，本发明所述脂质体制备得到的脂质体-罗丹明标记的鲑鱼精DNA复合物能够将更多的罗丹明标记的鲑鱼精DNA传输到细胞质中。实施例19中例举脂质体实现向HUVEC细胞传输的罗丹明标记的鲑鱼精DNA的红色荧光强度能够达到Lipofectamine2000的3.5～5.8倍。这是跟本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体具有更高的核酸包封率正相关的。事实上，由于本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体具有更高的核酸包封率，本发明所述阳离子脂质体库中的脂质体传输示踪核酸分子均相当高效。
实施举例20：三N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP质粒复合物、四N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP质粒复合物、五N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP质粒复合物、六N,N-二甲基氨基丙胺酰二十聚甘油单硬脂酸酯-GFP质粒复合物转染A549细胞
将A549细胞以5×105个细胞/孔的密度铺到6孔板中，加入含有10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时至细胞密度达到50%左右。移除培养液，用PBS洗两遍。将如实施举例16和实施举例17所述制备得到的脂质体-GFP复合物稀释到800μl无血清DMEM中，加入到6孔板中。37°C细胞培养箱中孵育6小时。移除含有脂质体-GFP复合物的培养液，加入含有10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时。使用激光共聚焦显微镜（Nikon Eclipse Ti,Japan）观察激发光为488nm，发射光为525nm下转染后细胞自发的绿色荧光。用胰酶将细胞消化下来，4°C，1000rpm离心5分钟得到细胞沉淀。用PBS洗涤细胞沉淀，4°C，1000rpm离心5分钟，弃上清。如此洗涤两次。将细胞沉淀重悬在无血清DMEM培养液中。使用流式细胞仪（BD FACSCalibur,BD Biosciences），检测每10000个细胞的相对绿色荧光强度。
本领域技术人员将从实施举例20中很容易看出来，通过实施跟实施举例20相似的细胞转染操作，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体-质粒DNA复合物均可以实现将质粒DNA传输进入包括但是不局限于NIH/3T3、A549、293T、293A、HUVEC、L929、PC12、Raw264.7、原代肺泡上皮细胞、原代腹腔巨噬细胞、原代骨髓干细胞、原代脂肪干细胞等等各种细胞系和原代细胞，并且实现质粒编码蛋白质的高效表达。事实上，对于某一特定的细胞系，本发明所属阳离子聚甘油酯类脂质体库中会有特定的一些脂质体能够实现对其高效传输质粒和表达质粒编码蛋白质，这是跟脂质体的含氮水平与细胞对脂质体的耐受程度共同决定的。通常来说，耐受程度低的细胞，在本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体中选取含氮量相对较低的脂质体进行转染实验，能够筛选得到表达效率高的脂质体-质粒DNA复合物；而对于耐受程度高的细胞，在本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体中选取含氮量相对较高的脂质体进行转染实验，能够筛选得到表达效率高的脂质体-质粒DNA复合物。图11中表示的是使用激光共聚焦显微镜（Nikon EclipseTi,Japan）对例举的脂质体-GFP复合物转染细胞的荧光图。图12是对细胞的绿色荧光进行流式检测的结果。在同等质量用量下，本发明所述脂质体制备得到的脂质体-GFP复合物对细胞进行转染，所转染细胞能够表达更多的绿色荧光蛋白。实施例20中例举脂质体实现向A549细胞传输GFP质粒表达的绿色荧光蛋白能够达到Lipofectamine2000的1.64～2.32倍。这是跟本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体具有更高的核酸包封率正相关的。事实上，由于本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体具有更高的核酸包封率，能够包封更多的编码蛋白质的基因药物分子，这使得本发明所述阳离子脂质体库中的脂质体传输编码蛋白质的基因药物分子均相当高效。
实施举例21：二N-丙基氨基乙氨酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯-siRNA复合物、三N-丙基氨基乙氨酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯-siRNA复合物、四N-丙基氨基乙氨酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯-siRNA复合物、五N-丙基氨基乙氨酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯-siRNA复合物转染L929细胞
将L929细胞以5×105个细胞/孔的密度铺到6孔板中，加入含有10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时至细胞密度达到80%左右。移除培养液，用PBS洗两遍。siRNA是干扰肿瘤坏死因子α的干扰RNA片段（LifeTechnologies合成）。使用二N-丙基氨基乙氨酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体、三N-丙基氨基乙氨酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体、四N-丙基氨基乙氨酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体、五N-丙基氨基乙氨酰十二聚甘油二十碳五烯酸酯脂质体，将如实施举例16和实施举例17所述制备得到的上述脂质体-siRNA稀释到800μl无血清DMEM中，加入到6孔板中。37°C细胞培养箱中孵育6小时。移除含有脂质体-siRNA复合物的培养液，加入含有10ng/ml的LPS和10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时。收集细胞培养液，使用Elisa Kits测定细胞培养液中肿瘤坏死因子α的浓度。使用TRIzol reagent（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）裂解细胞提取总RNA，逆转录成cDNA。使用Q-PCR仪（Applied Biosystems7300Real-Time PCR System）肿瘤坏死因子α的mRNA表达水平进行PCR扩增。
本领域技术人员将从实施举例21中很容易看出来，通过实施跟实施举例21相似的细胞转染操作，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体-siRNA复合物均可以实现将siRNA传输进入包括但是不局限于NIH/3T3、A549、293T、293A、HUVEC、L929、PC12、Raw264.7、原代肺泡上皮细胞、原代腹腔巨噬细胞、原代骨髓干细胞、原代脂肪干细胞等等各种细胞系和原代细胞。事实上，对于某一特定的细胞，本发明所属阳离子聚甘油酯类脂质体库中会有特定的一些脂质体能够实现对向该细胞内高效传输siRNA。图13中表示的是使用Elisa Kits对例举的脂质体-siRNA复合物转染细胞后肿瘤坏死因子α的蛋白水平。图14是对细胞内肿瘤坏死因子α的mRNA表达水平进行Q-PCR扩增的实验结果。在同等质量用量下，本发明所述脂质体制备得到的脂质体-siRNA复合物对细胞进行转染，能够将siRNA对应的基因的表达水平有效降低。实施例21中例举脂质体实现向经LPS刺激的L929细胞传输siRNA能够达到显著抑制肿瘤坏死因子α在转录和翻译水平表达的目的。这是跟本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体具有更高的核酸包封率正相关的。事实上，由于本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体具有更高的核酸包封率，能够包封更多的干扰核酸分子，这使得本发明所述阳离子脂质体库中的脂质体传输干扰核酸分子抑制基因在转录和翻译水平的表达均相当高效。
实施举例22：N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物、二N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物、三N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物、四N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-ASO复合物转染Raw264.7细胞
将Raw264.7细胞以5×105个细胞/孔的密度铺到6孔板中，加入含有10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时至细胞密度达到80%左右。移除培养液，用PBS洗两遍。ASO是干扰肿瘤坏死因子α的干扰寡核苷酸片段（LifeTechnologies合成）。使用N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体、二N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体、三N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体、四N-乙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体，将如实施举例16和实施举例17所述制备得到的上述脂质体-ASO稀释到800μl无血清DMEM中，加入到6孔板中。37°C细胞培养箱中孵育6小时。移除含有脂质体-ASO复合物的培养液，加入含有10ng/ml的LPS和10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时。收集细胞培养液，使用Elisa Kits测定细胞培养液中肿瘤坏死因子α的浓度。使用TRIzol reagent（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）裂解细胞提取总RNA，逆转录成cDNA。使用Q-PCR仪（Applied Biosystems7300Real-Time PCRSystem）肿瘤坏死因子α的mRNA表达水平进行PCR扩增。
本领域技术人员将从实施举例22中很容易看出来，通过实施跟实施举例22相似的细胞转染操作，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体-ASO复合物均可以实现将ASO传输进入包括但是不局限于NIH/3T3、A549、293T、293A、HUVEC、L929、PC12、Raw264.7、原代肺泡上皮细胞、原代腹腔巨噬细胞、原代骨髓干细胞、原代脂肪干细胞等等各种细胞系和原代细胞。事实上，对于某一特定的细胞，本发明所属阳离子聚甘油酯类脂质体库中会有特定的一些脂质体能够实现对向该细胞内高效传输ASO。图15中表示的是使用Elisa Kits对例举的脂质体-ASO复合物转染细胞后肿瘤坏死因子α的蛋白水平。图16是对细胞内肿瘤坏死因子α的mRNA表达水平进行Q-PCR扩增的实验结果。在同等质量用量下，本发明所述脂质体制备得到的脂质体-ASO复合物对细胞进行转染，能够将ASO对应的基因的表达水平有效降低。实施例22中例举脂质体实现向经LPS刺激的Raw264.7细胞传输ASO能够达到显著抑制肿瘤坏死因子α在转录和翻译水平表达的目的。这是跟本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体具有更高的核酸包封率正相关的。事实上，由于本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体具有更高的核酸包封率，能够包封更多的干扰核酸分子，这使得本发明所述阳离子脂质体库中的脂质体传输干扰核酸分子抑制基因在转录和翻译水平的表达均相当高效。
实施举例23：三N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物、四N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物、五N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物、六N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物转染Raw264.7细胞
将Raw264.7细胞以5×105个细胞/孔的密度铺到6孔板中，加入含有10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时至细胞密度达到80%左右。移除培养液，用PBS洗两遍。使用pre-mmu-microRNA-16（ABI合成）干扰肿瘤坏死因子α的翻译水平。使用三N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体、四N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体、五N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体、六N,N-二乙基氨基丙胺酰二十聚甘油二花生四烯酸酯脂质体，将如实施举例16和实施举例17所述制备得到的上述脂质体-pre-mmu-microRNA-16稀释到800μl无血清DMEM中，加入到6孔板中。37°C细胞培养箱中孵育6小时。移除含有脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物的培养液，加入含有10ng/ml的LPS和10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时。收集细胞培养液，使用Elisa Kits测定细胞培养液中肿瘤坏死因子α的浓度。
本领域技术人员将从实施举例23中很容易看出来，通过实施跟实施举例23相似的细胞转染操作，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物均可以实现将ASO传输进入包括但是不局限于NIH/3T3、A549、293T、293A、HUVEC、L929、PC12、Raw264.7、原代肺泡上皮细胞、原代腹腔巨噬细胞、原代骨髓干细胞、原代脂肪干细胞等等各种细胞系和原代细胞。事实上，对于某一特定的细胞，本发明所属阳离子聚甘油酯类脂质体库中会有特定的一些脂质体能够实现对向该细胞内高效传输pre-mmu-microRNA-16。图17中表示的是使用Elisa Kits对例举的脂质体-pre-mmu-microRNA-16复合物转染细胞后肿瘤坏死因子α的蛋白水平。在同等质量用量下，本发明所述脂质体制备得到的脂质体-pre-microRNA复合物对细胞进行转染，能够将pre-microRNA对应的基因的翻译水平有效降低。实施例23中例举脂质体实现向经LPS刺激的Raw264.7细胞传输pre-mmu-microRNA-16能够达到显著抑制肿瘤坏死因子α在翻译水平表达的目的。这是跟本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体具有更高的核酸包封率正相关的。事实上，由于本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体具有更高的核酸包封率，能够包封更多的microRNA核酸分子，这使得本发明所述阳离子脂质体库中的脂质体传输microRNA核酸分子抑制基因在翻译水平的表达均相当高效。
本领域技术人员将从实施举例19、实施举例20、实施举例21、实施举例22和实施举例23中很容易看出来，通过实施跟实施举例19、实施举例20、实施举例21、实施举例22和实施举例23相似的细胞核酸药物传输实验，可以实现本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物将核酸传输进入细胞的目的，并且核酸能够有效行使其示踪、表达、干扰等等功能。事实上，除了如实施举例19、实施举例20、实施举例21、实施举例22和实施举例23以外，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体还适用于对各种核酸分子的细胞传输实验，这些核酸包括但是并不局限于罗丹明标记的鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA、鲱鱼精DNA、编码蛋白质的mRNA等等。对于各种核酸，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体均能实现很高的核酸药物细胞传输效率，这跟本发明所述阳离子脂质的含氮基团修饰率梯度升高以及本发明所述阳离子脂质体具有比已有商品化脂质体高的核酸药物包封率是正相关的。
如【VP Torchilin,V.Weissig.Liposomes:A Practical Approach,Chapter10.Oxford University Press,2003.】中所述——由于除了脂质体的性质和核酸片段的性质以外，细胞培养介质、作用时间、表达时间等等各种因素都影响最后的转染结果，所以对于脂质体的转染效果仍不能仅通过理论预测就能够确定，还是只有通过实验才能选择出适宜的阳离子脂质体转染体系——所以，本发明创新之处在于提供了一系列阳离子修饰梯度和脂链梯度的阳离子脂质体，使得对于某一种细胞进行核酸药物传输，只要通过在这个阳离子脂质体库中进行一定范围的筛选，就能够筛选得到最终核酸药物分子传输效率很高的脂质体-核酸复合物。本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体库是一个选择范围广泛的药物传输平台。
实施举例24：阳离子聚甘油酯类脂质体的细胞毒性实验
将Raw264.7、PC12、原代小鼠骨髓干细胞以1×105个细胞/孔铺到96孔板中，加入含有10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时至细胞密度达到90%左右。移除培养液，加入如实施举例14和实施举例15所述制备的空载阳离子聚甘油酯类脂质体，加入到96孔板中，37°C细胞培养箱中孵育6小时。移除培养液，加入5mg/ml的MTT，37°C细胞培养箱中孵育4小时。加入150μl DMSO，室温孵育30分钟。使用Elisa plate reader（Bio-Rad,Microplate Reader3550）测定490nm的光吸收。以未刺激细胞在490nm处的光吸收作为细胞存活率100%，表示各空载阳离子聚甘油酯类脂质体刺激下的细胞存活率。
本领域技术人员将从实施举例24中很容易看出来，通过实施跟实施举例24相似的细胞毒性检测操作，均可以实现对本发明所述的空载阳离子聚甘油酯类脂质体对包括但是不局限于NIH/3T3、A549、293T、293A、HUVEC、L929、PC12、Raw264.7、原代肺泡上皮细胞、原代腹腔巨噬细胞、原代骨髓干细胞、原代脂肪干细胞等等各种细胞系和原代细胞的毒性进行检测和评价。图18中表示的是空载的各修饰梯度氨基丙胺酰二十聚甘油二十二碳六烯酸酯脂质体对Raw264.7、PC12、原代小鼠骨髓干细胞的毒性检测。在同等质量用量下，例举的空载的各修饰梯度氨基丙胺酰二十聚甘油二十二碳六烯酸酯脂质体对细胞具有非常小的毒性，有的脂质体甚至存在较小的对细胞生长的促进作用。这跟本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体是由食品类脂质衍生而来相关。事实上，由于本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体均是由食品类脂质衍生而来，所以均具有非常小的毒性作用或者没有毒性作用，或者对于本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体中修饰率较低的那些脂质体甚至具有较小的促进细胞生长的作用，这跟本发明所属阳离子聚甘油酯类脂质体的原料本身是冰淇淋等等食品的原料、具有良好的生物相容性有关。
实施举例25：阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物的细胞毒性实验
将Raw264.7、PC12、原代小鼠骨髓干细胞以1×105个细胞/孔铺到96孔板中，加入含有10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时至细胞密度达到90%左右。移除培养液，加入如实施举例16和实施举例17所述方法制备的阳离子聚甘油酯类脂质体-鲑鱼精DNA复合物，加入到96孔板中，37°C细胞培养箱中孵育6小时。移除培养液，加入5mg/ml的MTT，37°C细胞培养箱中孵育4小时。加入150μl DMSO，室温孵育30分钟。使用Elisa plate reader（Bio-Rad,MicroplateReader3550）测定490nm的光吸收。以未刺激细胞在490nm处的光吸收作为细胞存活率100%，表示各阳离子聚甘油酯类脂质体-鲑鱼精DNA复合物刺激下的细胞存活率。
本领域技术人员将从实施举例25中很容易看出来，通过实施跟实施举例25相似的细胞毒性检测操作，均可以实现对本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物对包括但是不局限于NIH/3T3、A549、293T、293A、HUVEC、L929、PC12、Raw264.7、原代肺泡上皮细胞、原代腹腔巨噬细胞、原代骨髓干细胞、原代脂肪干细胞等等各种细胞系和原代细胞的毒性进行检测和评价。图19中表示的是各修饰梯度氨基丙胺酰二十聚甘油二十二碳六烯酸酯脂质体-鲑鱼精DNA复合物对Raw264.7、PC12、原代小鼠骨髓干细胞的毒性检测。在同等质量用量下，例举的各修饰梯度氨基丙胺酰二十聚甘油二十二碳六烯酸酯脂质体-鲑鱼精DNA复合物对细胞具有非常小的毒性。这跟本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体是由食品类脂质衍生而来相关。事实上，由于本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体均是由食品类脂质衍生而来，所以在跟核酸（包括但是并不局限于质粒DNA、罗丹明标记的鲑鱼精DNA、罗丹明标记的鲑鱼精DNA、罗丹明标记的鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA、鲱鱼精DNA、具有干扰作用的寡核苷酸、具有干扰作用的siRNA、编码蛋白质的mRNA、microRNA前体及其成熟体等等）复合制得的脂质体-核酸复合物均具有非常小的毒性作用，这跟本发明所属阳离子聚甘油酯类脂质体的原料本身是冰淇淋等等食品的原料、具有良好的生物相容性有关。
实施举例26：阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物的血清释放检测
如实施举例16和实施举例17所述方法制备的阳离子聚甘油酯类脂质体-鲑鱼精DNA复合物，加入到2ml胎牛血清中。37°C中孵育1h，3h，6h，12h，24h，48h，72h。各时间点对血清释放样品超速离心，4°C，60,000rpm，1h。检测上清中鲑鱼精DNA的浓度。计算得到各时间点释放到血清中的DNA/总DNA的百分比。
本领域技术人员将从实施举例26中很容易看出来，通过实施跟实施举例26相似的脂质体-核酸复合物的血清释放检测操作，均可以实现对本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-核酸复合物在血清中的释放曲线。事实上，除了如实施举例26以外，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体还适用于对各种包封各种核酸分子，保护核酸分子不被血清环境降解而失去其分子活性，这些核酸包括但是并不局限于质粒DNA、罗丹明标记的鲑鱼精DNA、罗丹明标记的鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA、鲱鱼精DNA、具有干扰作用的寡核苷酸、编码蛋白质的mRNA、microRNA前体及其成熟体等等。图20中表示的是各修饰梯度的N,N-二丙基氨基乙胺酰十二聚甘油二月桂酸酯脂质体-鲑鱼精DNA复合物在血清中的释放曲线。在同等质量用量下，例举的各修饰梯度N,N-二丙基氨基乙胺酰十二聚甘油二月桂酸酯脂质体-鲑鱼精DNA复合物在血清中具有很好的缓释功能。事实上，本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体因为具有高含氮基团修饰率，跟核酸之间的正负电相互作用更强，所以本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体均具有更高的血清稳定性和在血清中的缓释功能，这对脂质体包封药物的缓释非常有益。
实施举例27：阳离子聚甘油酯类脂质体-Cy5.5标记核酸复合物的肿瘤靶向体内分布检测
使用纤维肉瘤细胞S180对ICR小鼠腹腔右侧皮下植瘤，待肿瘤生长成型至植瘤处略有皮肤溃疡。如实施举例16和实施举例17所述方法制备的阳离子聚甘油酯类脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物，尾静脉注射S180植瘤小鼠。2小时后，使用动物活体成像系统（Biospace Lab,PI-0100）观察Cy5.5标记核酸在小鼠体内的分布。在1小时、2小时、6小时、12小时各时间点，对小鼠主要器官和肿瘤部位中每克组织含有的Cy5.5荧光强度进行组织匀浆后荧光检测。
本领域技术人员将从实施举例27中很容易看出来，通过实施跟实施举例27相似的脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物的动物活体成像实验，均可以检测对本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-Cy5.5标记核酸复合物在小鼠体内的分布。事实上，除了如实施举例27所提及植瘤小鼠以外，使用动物活体成像系统，可以对本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体-Cy5.5标记核酸复合物在使用各种注射方式（包括但不局限于原位注射、皮下注射、血管内注射、鼻内灌注等等）情况下由脂质体介导的Cy5.5标记核酸复合物在各种模式动物（包括但不局限于各品系小鼠，各品系大鼠等等）在各种模型下（包括但不局限于正常实验动物，肝脏疾病模型、肺疾病模型、肾疾病模型、心脏疾病模型、脑疾病模型、血液疾病模型、皮肤疾病模型等等）的体内分布情况。图21中表示的是各修饰梯度的N-丙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物经尾静脉注射后2小时在S180植瘤小鼠的体内分布。从图21可以看出，尾静脉注射Cy5.5标记寡核苷酸，在小鼠全身多脏器可以检测到Cy5.5标记寡核苷酸，而使用各修饰梯度的N-丙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体包封Cy5.5标记寡核苷酸进行尾静脉注射，Cy5.5标记寡核苷酸经脂质体传输，在小鼠腹腔植瘤处富集，在其它脏器则检测不到Cy5.5标记寡核苷酸。图22中表示的是各修饰梯度的N-丙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-Cy5.5标记寡核苷酸复合物经尾静脉注射后1小时、2小时、6小时、12小时对Cy5.5标记寡核苷酸在小鼠主要器官的荧光强度检测，同样证明了Cy5.5标记寡核苷酸在各时间点主要分布在肝脏和肾脏，而经过各修饰梯度的N-丙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体包封Cy5.5标记寡核苷酸，Cy5.5标记寡核苷酸经脂质体传输在小鼠腹腔植瘤处富集，在肝脏和肾脏的积聚作用显著减轻，并且在时间上，经过各修饰梯度的N-丙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体包封Cy5.5标记寡核苷酸实现了Cy5.5标记寡核苷酸的缓释作用，使得12小时以后，在植瘤处仍能检测到较高水平的Cy5.5标记寡核苷酸。事实上，经由本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体包裹核酸药物，均能实现一定程度上的药物靶向富集作用和药物缓释作用。
实施举例28：阳离子聚甘油酯类脂质体-抗VEGF的siRNA复合物对小鼠腹腔肿瘤中VEGF表达水平的干扰作用
使用纤维肉瘤细胞S180对ICR小鼠腹腔右侧皮下植瘤，待肿瘤生长成型至植瘤处略有皮肤溃疡。如实施举例16和实施举例17所述方法制备的阳离子聚甘油酯类脂质体-抗VEGF的siRNA复合物，尾静脉注射S180植瘤小鼠。24小时后取各小鼠瘤体，使用Q-PCR技术检测瘤体中VEGF的相对转录表达水平。另一组小鼠在48小时后取各小鼠瘤体，使用Elisa Kits检测瘤体中VEGF的蛋白表达水平。相隔72小时尾静脉注射给药两次，在第144小时取小鼠肿瘤测量瘤径，计算各组瘤径占尾静脉注射生理盐水组小鼠平均瘤径的百分比。
本领域技术人员将从实施举例28中很容易看出来，通过实施跟实施举例28相似的脂质体-siRNA复合物的给药腹腔瘤实验，均可以检测对本发明所述的阳离子聚甘油酯类脂质体-siRNA复合物在对小鼠腹腔瘤中siRNA所干扰的基因表达的水平。图23中表示的是各修饰梯度的N-丙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物经尾静脉注射后24小时在腹腔瘤中VEGF的转录表达水平。从图23可以看出，尾静脉注射抗VEGF的siRNA并不能有效降低肿瘤内VEGF的转录水平，这是因为siRNA并不能在小鼠肿瘤内有效富集。而使用各修饰梯度的N-丙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体包封抗VEGF的siRNA进行尾静脉注射，抗VEGF的siRNA经脂质体传输，在小鼠腹腔植瘤处富集，其直接结果就是有效降低了肿瘤内VEGF的转录水平。图24中表示的是各修饰梯度的N-丙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物经尾静脉注射后48小时在腹腔瘤中VEGF的蛋白表达水平。从图24可以看出，尾静脉注射抗VEGF的siRNA并不能有效降低肿瘤内VEGF的转录水平，这是因为siRNA并不能在小鼠肿瘤内有效富集。而使用各修饰梯度的N-丙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体包封抗VEGF的siRNA进行尾静脉注射，抗VEGF的siRNA经脂质体传输，在小鼠腹腔植瘤处富集，其直接结果就是有效降低了肿瘤内VEGF的蛋白表达水平。图25中表示的是各修饰梯度的N-丙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体-抗VEGF的siRNA复合物相隔72小时尾静脉给药两次以后，在第144小时各荷瘤小鼠肿瘤瘤径的百分比。从图25可以看出，尾静脉注射抗VEGF的siRNA并不能有效降低肿瘤瘤径，这是因为siRNA并不能在小鼠肿瘤内有效富集。而使用各修饰梯度的N-丙基氨基乙氨酰十聚甘油亚麻酸酯脂质体包封抗VEGF的siRNA进行尾静脉注射，抗VEGF的siRNA经脂质体传输，在小鼠腹腔植瘤处富集，其结果就是通过显著降低肿瘤部位VEGF的表达水平，从而有效降低了肿瘤瘤径，抑制了肿瘤生长。肿瘤在发生发展过程中，自身会分泌VEGF使得肿瘤血管得以生长，而肿瘤血管丰富会导致肿瘤自身迅速生长。事实上，由于本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体包裹核酸药物形成的复合物具有很好的肿瘤富集和靶向能力，所以本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体能够包裹各种核酸药物分子，实现核酸药物分子在肿瘤部位的富集，实现对肿瘤生长的抑制作用。这使得本发明所述阳离子聚甘油酯类脂质体是非常好的肿瘤靶向药物载体。

Claims (14)

1.一种聚甘油酯类阳离子脂质，其结构式为：
Figure FDA00003252172300011
其中：R1、R2、R3、R4、R5独立地选自由下列各项组成的组：H，含氮基团和10到22个碳原子的脂肪酸酯基组成的组；其中R1和R2至少有一个是10到22个碳原子的脂肪酸酯基；其中R3、R4、R5有0个或者1个或者多个是含氮基团；其中n是重复单元个数，是1、4、8、10、18这几个数字中的一个。
2.根据权利要求1所述的聚甘油酯类阳离子脂质，其特征是脂肪酸酯基独立地选自由下列各项组成的组：十碳酸酯基、十二碳酸酯基、十四碳酸酯基、十六碳酸酯基、十八碳酸酯基、二十二碳酸酯基、油酸酯基、亚油酸酯基、亚麻酸酯基、花生四烯酸酯基、二十碳五烯酸基、二十二碳六烯酸酯基。
3.根据权利要求1所述的聚甘油酯类阳离子脂质，其特征是含氮基团独立地选自由下列各项组成的组：氨基乙氨酰基、N-甲基氨基乙氨酰基、N,N-二甲基氨基乙胺酰基、N-乙基氨基乙氨酰基、N,N-二乙基氨基乙胺酰基、N-丙基氨基乙氨酰基、N,N-二丙基氨基乙胺酰基、氨基丙氨酰基、N,N-二甲基氨基丙胺酰基、N,N-二乙基氨基丙胺酰基、精胺酰基。
4.根据权利要求1所述的聚甘油酯类阳离子脂质，其特征是当R1是脂肪酸酯基，R2、R3、R4、R5偶联上含氮基团的化学反应优先顺序是，R2优先于R3、R5，R3、R5再优先于R4。
5.根据权利要求1所述的聚甘油酯类阳离子脂质，其特征是当R1、R2是脂肪酸酯基，R3、R4、R5偶联上含氮基团的化学反应优先顺序是，R3、R5优先于R4。
6.一种权利要求1所述聚甘油酯类阳离子脂质的合成方法，其特征是由以下步骤构成：
（1）将0.1～100mmol的多聚甘油脂肪酸酯加入到10～10,000ml的氯仿中，磁力搅拌至溶解；
（2）加入0.1～2,100mmol的CDI，37°C恒温磁力搅拌1小时，得到活化了的多聚甘油脂肪酸酯；
（3）将活化了的多聚甘油脂肪酸酯加入到50～2000ml除水的含氮小分子化合物中，37°C恒温磁力搅拌反应24小时；
（4）将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋中，用饱和碳酸氢钠溶液透析3天，再用双蒸水透析3天至pH达到中性；
（5）收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物；
（6）将粗制产物溶解在氯仿中，使用Gel60硅胶柱纯化该粗制产物，用包含0～3%甲醇的氯仿进行洗脱；
（7）通过硅胶薄层层析，展层剂是氯仿/甲醇=9:1v/v，喷雾1.6%的硝酸/乙醇溶液，加热至120°C，进行显色观察，确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并；
（8）用常压蒸馏法除去溶剂；（9）用甲醇洗涤纯化产物三次；用水洗涤纯化产物三次；冻干，得到纯的化合物。
7.根据权利要求6所述的聚甘油酯类阳离子脂质的合成方法，其特征是多聚甘油脂肪酸酯为三聚甘油单癸酸酯或六聚甘油单癸酸酯或十聚甘油单癸酸酯或十二聚甘油单癸酸酯或二十聚甘油单癸酸酯或三聚甘油二癸酸酯或六聚甘油二癸酸酯或十聚甘油二癸酸酯或十二聚甘油二癸酸酯或二十聚甘油二癸酸酯或三聚甘油单月桂酸酯或六聚甘油单月桂酸酯或十聚甘油单月桂酸酯或十二聚甘油单月桂酸酯或二十聚甘油单月桂酸酯或三聚甘油二月桂酸酯或六聚甘油二月桂酸酯或十聚甘油二月桂酸酯或十二聚甘油二月桂酸酯或二十聚甘油二月桂酸酯或三聚甘油单肉豆蔻酸酯或六聚甘油单肉豆蔻酸酯或十聚甘油单肉豆蔻酸酯或十二聚甘油单肉豆蔻酸酯或二十聚甘油单肉豆蔻酸酯或三聚甘油二肉豆蔻酸酯或六聚甘油二肉豆蔻酸酯或十聚甘油二肉豆蔻酸酯或十二聚甘油二肉豆蔻酸酯或二十聚甘油二肉豆蔻酸酯或三聚甘油单棕榈酸酯或六聚甘油单棕榈酸酯或十聚甘油单棕榈酸酯或十二聚甘油单棕榈酸酯或二十聚甘油单棕榈酸酯或三聚甘油二棕榈酸酯或六聚甘油二棕榈酸酯或十聚甘油二棕榈酸酯或十二聚甘油二棕榈酸酯或二十聚甘油二棕榈酸酯或三聚甘油单硬脂酸酯或六聚甘油单硬脂酸酯或十聚甘油单硬脂酸酯或十二聚甘油单硬脂酸酯或二十聚甘油单硬脂酸酯或三聚甘油二硬脂酸酯或六聚甘油二硬脂酸酯或十聚甘油二硬脂酸酯或十二聚甘油二硬脂酸酯或二十聚甘油二硬脂酸酯或三聚甘油单山嵛酸酯或六聚甘油单山嵛酸酯或十聚甘油单山嵛酸酯或十二聚甘油单山嵛酸酯或二十聚甘油单山嵛酸酯或三聚甘油二山嵛酸酯或六聚甘油二山嵛酸酯或十聚甘油二山嵛酸酯或十二聚甘油二山嵛酸酯或二十聚甘油二山嵛酸酯或三聚甘油单油酸酯或六聚甘油单油酸酯或十聚甘油单油酸酯或十二聚甘油单油酸酯或二十聚甘油单油酸酯或三聚甘油二油酸酯或六聚甘油二油酸酯或十聚甘油二油酸酯或十二聚甘油二油酸酯或二十聚甘油二油酸酯或三聚甘油单亚油酸酯或六聚甘油单亚油酸酯或十聚甘油单亚油酸酯或十二聚甘油单亚油酸酯或二十聚甘油单亚油酸酯或三聚甘油二亚油酸酯或六聚甘油二亚油酸酯或十聚甘油二亚油酸酯或十二聚甘油二亚油酸酯或二十聚甘油二亚油酸酯或三聚甘油单亚麻酸酯或六聚甘油单亚麻酸酯或十聚甘油单亚麻酸酯或十二聚甘油单亚麻酸酯或二十聚甘油单亚麻酸酯或三聚甘油二亚麻酸酯或六聚甘油二亚麻酸酯或十聚甘油二亚麻酸酯或十二聚甘油二亚麻酸酯或二十聚甘油二亚麻酸酯或三聚甘油单花生四烯酸酯或六聚甘油单花生四烯酸酯或十聚甘油单花生四烯酸酯或十二聚甘油单花生四烯酸酯或二十聚甘油单花生四烯酸酯或三聚甘油二花生四烯酸酯或六聚甘油二花生四烯酸酯或十聚甘油二花生四烯酸酯或十二聚甘油二花生四烯酸酯或二十聚甘油二花生四烯酸酯或三聚甘油单花生五烯酸酯或六聚甘油单花生五烯酸酯或十聚甘油单花生五烯酸酯或十二聚甘油单花生五烯酸酯或二十聚甘油单花生五烯酸酯或三聚甘油二花生五烯酸酯或六聚甘油二花生五烯酸酯或十聚甘油二花生五烯酸酯或十二聚甘油二花生五烯酸酯或二十聚甘油二花生五烯酸酯或三聚甘油单二十二碳六烯酸酯或六聚甘油单二十二碳六烯酸酯或十聚甘油单二十二碳六烯酸酯或十二聚甘油单二十二碳六烯酸酯或二十聚甘油单二十二碳六烯酸酯或三聚甘油二二十二碳六烯酸酯或六聚甘油二二十二碳六烯酸酯或十聚甘油二二十二碳六烯酸酯或十二聚甘油二二十二碳六烯酸酯或二十聚甘油二二十二碳六烯酸酯或六聚甘油五硬脂酸酯或十聚甘油十油酸酯。
8.根据权利要求6所述的聚甘油酯类阳离子脂质的合成方法，其特征是含氮小分子化合物为乙二胺或N-甲基乙二胺或N,N-二甲基乙二胺或N-乙基乙二胺或N,N-二乙基乙二胺或N-丙基乙二胺或N,N-二丙基乙二胺或丙二胺或N,N-二甲基丙二胺或N,N-二乙基丙二胺或精氨酸。
9.一种权利要求1所述聚甘油酯类阳离子脂质制备的聚甘油酯类阳离子脂质体，其特征是由权利要求1所述聚甘油酯类阳离子脂质分散在水相中形成的粒径大小在8～200nm的均一稳定的表面带有净正电荷的纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述聚甘油酯类阳离子脂质体的制备方法，其特征是由以下步骤构成：（1）将3～60μmol的阳离子聚甘油酯脂质溶解在0.5～10ml的体积比为1:1的氯仿/甲醇溶剂中；
（2）倒入旋转蒸发仪圆底烧瓶中，真空条件下，55°C水浴恒温旋转蒸发2小时；
（3）55°C水浴恒温，通氮气流1小时至有机溶剂完全除去；
（4）加入0.5～10ml生理盐水，常压，55°C水浴恒温旋转1小时至得到白色乳液；
（5）将白色乳液转移到玻璃离心管中，100w超声输出功率，55°C水浴恒温超声，30分钟至乳液基本透明；
（6）在超净台中无菌操作，将基本透明的乳液通过0.22μm滤器滤过除菌，得到空载的聚甘油酯类阳离子脂质体，4°C冰箱保存。
11.一种权利要求9所述的聚甘油酯类阳离子脂质体制备的聚甘油酯类阳离子脂质体-核酸复合物，其特征是由权利要求9所述聚甘油酯类阳离子脂质体跟核酸通过正负电荷静电相互作用形成分散在水相中的纳米颗粒，颗粒粒径大小在25～220nm，均一稳定。
12.根据权利要求11所述聚甘油酯类阳离子脂质体-核酸复合物的制备方法，其特征是由以下步骤构成：
（1）取如权利要求9所述聚甘油酯类阳离子脂质体1～400μl，分散在细胞培养液中，混匀，为溶液一；
（2）将核酸稀释在细胞培养液中，混匀，为溶液二；
（3）将溶液一滴加到溶液二中，混匀，室温放置20分钟，即可得到聚甘油酯类阳离子脂质体-核酸复合物。
13.一种权利要求11所述聚甘油酯类阳离子脂质体-核酸复合物在细胞转染中的应用。
14.一种权利要求11所述聚甘油酯类阳离子脂质体-核酸复合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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