CN106750273B

CN106750273B - 一种嵌段聚合物肿瘤放疗增敏剂及其制备方法

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Publication number: CN106750273B
Application number: CN201710165579.0A
Authority: CN
Inventors: 葛治伸; 赵凯杰; 尹伟; 柯文冬
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2017-03-20
Filing date: 2017-03-20
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2037-03-20
Also published as: CN106750273A

Abstract

本发明提供了一种式(I)所示的聚合物、其制备方法及其作为肿瘤放疗增敏剂的应用。本发明提供的两亲性嵌段共聚物在水溶液中进行自组装，得到以聚乙二醇为亲水壳层，以聚(谷氨酸‑g‑甲硝唑)为疏水核心的两亲性嵌段聚合物胶束纳米粒子，其可以作为肿瘤放疗增敏剂使用。实验结果表明，本发明提供的两亲性嵌段共聚物作为肿瘤放疗增敏剂可以在体内血液的环境中长时间循环并在肿瘤组织中富集，而且具有十分高效的肿瘤放疗增敏效果，显著优于市售的甘氨双唑钠注射液。

Description

一种嵌段聚合物肿瘤放疗增敏剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及高分子合成技术领域，尤其涉及一种聚合物、其制备方法及其应用。

背景技术

大量实验和临床研究表明人类实体肿瘤生长于一个独特的微环境中，在这里肿瘤细胞代谢异常旺盛并且不断增值，然而肿瘤组织异常的血供系统导致肿瘤细胞的氧气及养分供应不足。这些乏氧细胞对放射治疗有一定的抗性，不仅给肿瘤治疗增加了难度而且还是肿瘤复发的根源。目前，超过50％的肿瘤病人都采用了放射治疗，若用正常组织可耐受的剂量照射，肿瘤治愈率一般只能达到40％左右，但是许多肿瘤即使接受高剂量照射后仍效果欠佳。据计算，对于杀死同样大小的肿瘤，乏氧肿瘤所需的照射剂量大约相当于有氧肿瘤的3倍，由此可见肿瘤中的乏氧细胞对射线有较强的耐受性。同时，高剂量的照射也十分容易造成对正常组织细胞的损伤。因此，如何提高肿瘤中的乏氧细胞对射线的敏感性是提高放射治疗效果的关键。

当前，肿瘤的发病率呈逐年上升趋势。高效的放射增敏剂的研制不仅可以有效的提高肿瘤的治愈率而且还能产生较大的经济效益和社会效益。具有肿瘤放疗增敏活性的小分子放疗增敏剂有很多种，但是目前获得临床应用的却很少。目前在临床中获得应用或者在临床实验阶段的，主要是硝基咪唑类化合物，它们可以将放射治疗时射线对肿瘤乏氧细胞造成的DNA损伤固定并抑制其DNA的修复。其中，2-硝基咪唑类化合物虽然增敏活性较高，但是也具有较高的神经毒性，因而未能获得广泛应用。5-硝基咪唑类化合物也被证明具有较好放射增敏的性能，并且目前唯一获得临床批准的，作为肿瘤放疗增敏剂的甘氨双唑钠已经上市销售，它可以提高实体肿瘤组织内乏氧细胞对射线的敏感性且对正常组织无明显影响。但是甘氨双唑钠在水溶液中的稳定性极差，而且在肿瘤组织中的富集效果不理想。这些缺陷将导致甘氨双唑钠进入机体后，在短时间内就被代谢完全。这些缺点限制了其大规模的应用。

近年来，关于纳米药物的制备和应用越来越引起人们的关注。由于肿瘤组织具有高通透性和滞留效应(EPR效应)，使得聚合物纳米粒子可以在肿瘤组织中高效富集。同时，具有两亲性的聚合物纳米粒子能够在机体内的循环系统中长期稳定的存在。因此，基于以上优点，构筑具有放射增敏性能的聚合物，并通过自组装的方法制备成纳米粒子，能够通过血液循环到达肿瘤组织并在肿瘤组织中富集从而实现更加高效的放疗增敏效果。

发明内容

本发明的目的提供一种聚合物、其制备方法及其应用，本发明提供的聚合物作为肿瘤放疗增敏剂使用时，具有高效的肿瘤放疗增敏效果。

本发明提供了一种式(I)所示的聚合物：

其中，m和n分别为聚合度。

在一个具体实施例中，40≤m≤250，20≤n≤200。

在一个具体实施例中，100≤m≤120，40≤n≤150。

本发明提供的聚合物含有聚乙二醇单甲醚、谷氨酸、甲硝唑等基团，为两亲性嵌段共聚物，能够在水溶液中自组装形成稳定的胶束纳米粒子，从而可以作为肿瘤放疗增敏剂应用。

本发明还提供了一种肿瘤放疗增敏剂，由上述技术方案所述的聚合物在水溶液中自组装形成。

在一个实施例中，所述聚合物在水溶液中的浓度为1mg/mL～10mg/mL。

在一个实施例中，所述聚合物为10nm～200nm的胶束纳米粒子。

本发明还提供了上述技术方案所述的聚合物的制备方法，包括：

式(II)所示的聚乙二醇-b-聚谷氨酸丙炔酯嵌段聚合物与式(III)所示的叠氮甲硝唑进行点击化学反应得到式(I)所示的聚合物；

其中，m和n分别为聚合度。

本发明中嵌段聚合物的合成方法路线如下所示，以谷氨酸和甲硝唑为主要原料，经过一系列简单的有机反应以及开环聚合反应，最后通过高效的“点击反应”制得嵌段聚合物。

具体过程如下：

(1)首先将谷氨酸和炔丙醇反应，再通过关成环反应得到含炔基的内酸酐单体，进一步以端基为氨基的聚乙二醇作为引发剂，引发开环反应，得到含炔基官能团的两嵌段聚合物聚乙二醇-b-聚谷氨酸丙炔酯。该合成参考文献 Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,9334-9338。其中聚乙二醇和聚谷氨酸丙炔酯嵌段的长度可以通过所采用的聚乙二醇引发剂长度以及开环聚合过程中的投料比和反应时间来控制。在一个实施例中，聚乙二醇的分子量为2000～10000，聚谷氨酸丙炔酯嵌段的聚合度为40～150。

(2)设计叠氮化的甲硝唑小分子。首先通过甲硝唑和对甲苯磺酰氯反应活化甲硝唑中的羟基，进一步通过与叠氮化钠的取代反应，可以得到叠氮化的甲硝唑。

(3)将如上得到的嵌段聚合物聚乙二醇-b-聚谷氨酸丙炔酯和叠氮化的甲硝唑进行点击化学反应，制备得到最终的嵌段聚合物聚乙二醇-b-聚(谷氨酸-g- 甲硝唑)。由于点击化学反应的高效性，我们只要在反应时将甲硝唑过量3倍，就可以将炔基完全接上甲硝唑。

通过嵌段聚合物聚乙二醇-b-聚(谷氨酸-g-甲硝唑)在水溶液中进行自组装，可以得到以聚乙二醇为亲水壳层，以聚(谷氨酸-g-甲硝唑)为疏水核心的两亲性嵌段聚合物胶束纳米粒子。具体的方法是先将聚乙二醇-b-聚(谷氨酸-g- 甲硝唑)溶解在乙腈溶液中，然后迅速加入水中形成稳定的纳米粒子，最后将其中的乙腈溶剂通过减压蒸馏的方法除去。

本发明提供的两亲性嵌段共聚物在水溶液中进行自组装，得到以聚乙二醇为亲水壳层，以聚(谷氨酸-g-甲硝唑)为疏水核心的两亲性嵌段聚合物胶束纳米粒子，其可以作为肿瘤放疗增敏剂使用。实验结果表明，本发明提供的两亲性嵌段共聚物作为肿瘤放疗增敏剂可以在体内血液的环境中长时间循环并在肿瘤组织中富集，而且具有十分高效的肿瘤放疗增敏效果，显著优于市售的甘氨双唑钠注射液。

附图说明

图1为本发明实施例制备的谷氨酸丙炔酯-N-羧基内酸酐的¹H NMR表征图；

图2为本发明实施例制备的聚乙二醇-b-聚谷氨酸丙炔酯嵌段聚合物的¹H NMR表征图；

图3为本发明实施例制备的叠氮甲硝唑的¹HNMR表征图；

图4为本发明实施例制备的两亲性嵌段聚合物聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g- 甲硝唑)的¹H NMR表征图；

图5为本发明实施例制备的两亲性嵌段聚合物聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g- 甲硝唑)的体积排除色谱表征图；

图6为以芘作为荧光探针，聚合物浓度对激发光光谱中波长在339nm和 332nm处的强度的比值图；

图7为浓度为1mg/mL的聚合物纳米粒子溶液的动态光散射图；

图8为增敏剂注射后得到H22肿瘤的生长曲线；

图9为治疗后切下的肿瘤的照片。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的聚合物、其制备方法及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.1谷氨酸丙炔酯的制备

(1)在250mL圆底烧瓶中分别加入事先量好的谷氨酸(4g，27mmol)和丙炔醇(120mL)，并放入磁子，在磁力搅拌器上搅拌0.5h，期间控制油浴温度为40℃。

(2)用滴液漏斗滴加14mL三甲基氯硅烷，30min滴完，继续搅拌2天。观察颜色变化，由白色逐渐变为暗黄色最终为红褐色。

(3)在1L烧杯中倒入900mL无水乙醚，放在磁力搅拌器上搅拌。将反应混合液逐滴滴加到无水乙醚中，观察现象，发现有白色固体析出。抽虑后放入真空干燥箱中干燥过夜即可得到谷氨酸丙炔酯，为白色固体，产率为82％。

1.2谷氨酸丙炔酯-N-羧基内酸酐的制备

(1)在25mL圆底烧瓶中加入上述制备的谷氨酸丙炔酯(925mg，5mmol) 和二(三氯甲基)碳酸酯(BTC)(600mg，2mmol)，并放入磁子。装好冷凝管(用于回流)。装置抽真空。氮气保护的同时加入15mL无水四氢呋喃，油浴加热搅拌2h，温度控制在70℃，通冷却水。

(2)停止加热，温度降至室温。在100mL烧杯中加入80mL冷的正己烷，将反应液滴入正己烷中，并置于-20℃环境中过夜。

(3)发现烧杯底部出现棕褐色的油状物。将上层正己烷移走，加入50mL 干燥的乙酸乙酯溶解油状物。依次用100mL冰水、100mL冰的饱和碳酸氢钠溶液和100mL冰的NaCl溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥后过滤浓缩备用。产率为50％。谷氨酸丙炔酯-N-羧基内酸酐的¹HNMR表征如图1所示，其中， EA表示未完全干燥除去的溶剂乙酸乙酯。

1.3聚乙二醇-b-聚谷氨酸丙炔酯嵌段聚合物的制备

(1)在10mL圆底烧瓶中加入(200mg,0.4mmol)单端氨基聚乙二醇(分子量5000g/mol)，放入磁子，加入二氯甲烷5滴溶解，另加入5mL甲苯，橡皮塞封口。放入液氮中冷冻并用真空泵除水2h。

(2)除水完毕，将(600mg,2.8mmol)谷氨酸丙炔酯-N-羧基内酸酐用5mL 无水N，N-二甲基甲酰胺溶解并用10mL注射器加入烧瓶中同时通氮气保护。用磁力搅拌器搅拌，室温下反应3天。

(3)将反应液滴加到50mL无水乙醚中，产生沉淀，并放入离心机中离心。移去上清液，用5mL二氯甲烷溶解离心管底部固体，重复上述沉淀操作两次。最后放入真空干燥箱中干燥过夜。计算产率为90％。聚乙二醇-b-聚谷氨酸丙炔酯嵌段聚合物¹H NMR表征如图2示。

1.4叠氮甲硝唑的制备

(1)称取甲硝唑(3.08g，18mmol)置于50mL圆底烧瓶中，另加入三乙胺3 mL(溶于20mL无水二氯甲烷中)，放入磁子置于磁力搅拌器上搅拌。将对甲苯磺酰氯(3.83g，20mmol)溶于10mL无水二氯甲烷，并通过滴液漏斗滴加到悬浊液中。反应装置放于0℃冰水浴中反应5h。

(2)停止反应。加入30mL冰水，搅拌5min后倒入分液漏斗中静置分层。上层水相再用乙酸乙酯萃取(2×30mL)。将有机相合并并用饱和碳酸氢钠溶液 30mL、饱和NaCl溶液30mL洗涤。用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后放于真空干燥箱中过夜。产率为92％。

(3)取上步产物(4.88g，15mmol)和叠氮化钠(1.3g，20mmol)置于100mL 放有磁子的圆底烧瓶中，加入50mL无水N，N-二甲基甲酰胺，装好冷凝管。放入油浴锅中加热搅拌4h，温度为80℃，同时通冷却水。

(4)反应结束，降至室温。倒入400mL水中，用氯仿萃取(3×100mL)，有机相再用100mL水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后放入真空干燥箱中过夜。产率80％。其¹H NMR表征如图3所示。

1.5聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-甲硝唑)的制备

(1)取一10mL封管，放入小磁子，将聚乙二醇-b-聚谷氨酸丙炔酯(700mg，0.028mmol)、甲硝唑叠氮化合物(1g，5mmol)和N，N，N，N，N-五甲基二乙烯三胺(80mg，0.45mmol)溶于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中并加入到封管中。

(2)经过三次冷冻-脱气-充氮气循环后，将称量好的溴化亚铜(64mg，0.45 mmol)加入到封管中，再循环两次。真空条件下封上封管。放入40℃油浴锅中搅拌，反应10h。

(3)将封管放入液氮中冻住终止反应。反应混合液用四氢呋喃稀释，过硅胶柱除去铜盐，浓缩除去大部分溶剂。

(4)将剩余液体滴加到50mL无水乙醚中产生沉淀，离心，移去上清液，二氯甲烷溶解，重复上述操作两次。最后放入真空干燥箱中干燥过夜，得到最终产品。产率96％。两亲性嵌段聚合物聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-甲硝唑)的¹H NMR谱图表征如图4所示，体积排除色谱表征如图5所示。

1.6自组装制备聚合物纳米粒子

称取聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-甲硝唑)(1mg，0.033mmol)(以下简称聚合物)于2mL离心管中，加入0.5mL乙腈，超声溶解。10mL样品瓶中加入1 mL磷酸盐缓冲液，放入小磁子，开始搅拌。用移液枪将聚合物溶液迅速加入到样品瓶中，然后浓缩除去乙腈，得到浓度为1mg/mL的聚合物纳米粒子溶液。

按照1.6公开的方法分别获得浓度为1、2、3、4、5mg/mL的聚合物纳米粒子溶液；通过以芘作为荧光探针，分别测试上述聚合物纳米粒子溶液在 339nm和332nm激发光强度，并绘制聚合物浓度对激发光光谱中波长在339 nm和332nm处的强度的比值图，可以得到聚合物的临界胶束浓度为9.1×10^-3 mg/mL，结果参见图6，图6为以芘作为荧光探针，聚合物浓度对激发光光谱中波长在339nm和332nm处的强度的比值图，其中溶液中芘的浓度为1× 10^- ⁷M，荧光测试的发射波长为475nm。由图6可知，浓度为1～5mg/mL的聚合物纳米粒子，在进入血液循环且被小鼠血液稀释约10倍后，依然能够保持纳米粒子的状态。

参见图7，图7为浓度为1mg/mL的聚合物纳米粒子溶液的动态光散射图，由图7可知，聚合物纳米粒子的平均粒径为40nm，该尺寸便于纳米粒子在肿瘤组织部位富集。同时，自组装所得的纳米粒子在水溶液中形成的粒子，表面是亲水性的聚乙二醇结构。这些特征都说明此纳米粒子可以在体内血液的环境中长时间循环并在肿瘤组织中富集。

1.8作为增敏剂的应用

通过体外培养H22肝癌细胞，将细胞洗涤后分散于磷酸缓冲溶液中，按照每只老鼠5×10⁶个细胞的量，大腿内侧注射100μL细胞分散液，大约一周之后，得到H22小鼠肝癌细胞的皮下肿瘤模型，在肿瘤大小长至大约200mm³的时候，将所制备的聚合物纳米粒子溶液以及甘氨双唑钠溶液，在相同的甲硝唑当量下，分别通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，然后进行电子枪射线放射治疗，照射相同的剂量(4Gy)。每隔三天重复以上操作，共照射3次，照射完毕，继续饲养观察。每隔一天记录肿瘤体积大小，结果参见图8和图9，图 8为增敏剂注射后得到H22肿瘤的生长曲线，其中NPs和GS中的甲硝唑当量浓度为1.4mg/mL，每次注射100μL，每次的照射剂量为4Gy。NPs在照射前4h注射，GS按照使用说明书在照射前1h注射。分别在第1，4，7日进行放射治疗；图9为治疗后切下的肿瘤的照片。由图8和图9可知，纳米粒子照射组(NPs)的肿瘤相比于照射之前，其体积大小明显缩小，而甘氨双唑钠组(GS)肿瘤体积增大至原来的8倍。注射磷酸盐缓冲溶液的对照组(PBS)，肿瘤体积增大至原来的12倍。通过该实验，充分证明了嵌段聚合物纳米粒子作为肿瘤放疗增敏剂具有十分高效的肿瘤放疗增敏效果，与市场销售的甘氨双唑钠注射液相比，效果显著提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.式(I)所示的聚合物：

其中，m和n分别为聚合度。

2.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，40≤m≤250，20≤n≤200。

3.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，100≤m≤120，40≤n≤150。

4.权利要求1～3任意一项所述的聚合物在制备肿瘤放疗增敏剂中的应用。

5.一种肿瘤放疗增敏剂，由权利要求1～3任意一项所述的聚合物在水溶液中自组装形成。

6.根据权利要求5所述的肿瘤放疗增敏剂，其特征在于，所述聚合物在水溶液中的浓度为1mg/mL～10mg/mL。

7.根据权利要求5所述的肿瘤放疗增敏剂，其特征在于，所述聚合物为10nm～200nm的胶束纳米粒子。

8.权利要求1所述的聚合物的制备方法，包括：

其中，m和n分别为聚合度。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，40≤m≤250，20≤n≤200。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，式(III)所示的叠氮甲硝唑中甲硝唑与式(II)所示的聚乙二醇-b-聚谷氨酸丙炔酯嵌段聚合物中炔基的摩尔比大于3:1。