CN109517173A - 一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料及其制备方法与应用。该制备方法包括以下步骤：（1）将丙酮与含有巯基的酸在室温下搅拌反应；（2）反应结束后，加入聚醚酰亚胺和活化剂，溶于有机试剂，搅拌反应，再通过酰胺化反应键合二氢卟酚e6和羧基聚乙二醇，得含有缩硫酮键的活性氧敏感型的支化聚醚酰亚胺材料。本发明的支化聚醚酰亚胺材料具有良好的生物相容性和可降解性。该材料包载siRNA，自组装形成纳米颗粒，在特定波长光源激发下产生大量活性氧破坏内涵体结构，活性氧敏感的缩硫酮键断裂，颗粒崩解，加速内涵体逃逸和胞内释放siRNA，在肿瘤治疗领域具有巨大的临床应用潜能。

Description

一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及聚醚酰亚胺领域，具体涉及一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料及其制备方法与应用。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是一种基因转录后的调控方式，在细胞内通过双链RNA特异性的识别及降解同源的mRNA，从而实现对特定基因表达的下调。与常规肿瘤治疗手段相比，RNA干扰技术具有高特异性、高稳定性等优势。目前主要的RNA干扰技术有miRNA及siRNA等。miRNA是由基因组DNA转录、经核酸酶剪切形成的小的非编码RNA。siRNA是人工合成的双链RNAi分子，其长度在21至23bp左右。
近年来，RNA干扰技术已经在肿瘤治疗领域取得了巨大进展，已有近十种小干扰RNA(siRNA)药物开展临床试验。阳离子聚合物和脂质被广泛用于构建siRNA的载药体系。但是siRNA的治疗过程中面临着许多问题，存在siRNA对靶基因的下调效率有限，内源性RNA竞争，生物分布及靶向性等现象。越来越多的研究发现，内涵体逃逸和细胞内快速释放在siRNA治疗中起到关键作用。解决这些问题的关键就在于开发更加安全和高效的siRNA载体，被细胞摄取后，在胞内充分释放包载的siRNA，从而提高靶基因的下调效率。
活性氧敏感型纳米载体作为抗肿瘤药物载体，被广泛用于实现胞内药物快速释放的目的。在本次设计中，我们基于活性氧敏感的缩硫酮键合成了一种支化聚醚酰亚胺材料用做纳米载体输送光敏剂二氢卟酚e6(Ce6)和siRNA，在特定波长光源激发下产生大量活性氧破坏内涵体结构，加速内涵体逃逸，同时活性氧敏感的缩硫酮键断裂，颗粒崩解，促进胞内释放siRNA，在肿瘤治疗领域具有巨大的临床应用潜能。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料及其制备方法。
本发明的含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料按照下述方法合成：首先合成含有缩硫酮的3,3’-(丙烷-2,2-二烯基(磺胺基))二丙酸(PSPA)，在交联剂作用下，支化聚醚酰亚胺(bPEI)与PSPA初步反应，再通过酰胺化反应键合光敏剂Ce6以及mPEG45-COOH，生成缩硫酮键连接的红光激活的活性氧敏感型支化聚醚酰亚胺材料。
本发明的另一个目的是提供一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料作为siRNA运输载体应用于抗肿瘤治疗。
本发明所提供的纳米颗粒，是由上述活性氧敏感型支化聚醚酰亚胺材料制成。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将丙酮与含有巯基的酸在室温下搅拌反应，反应结束后，洗涤、干燥；
(2)在步骤(1)干燥产物中加入聚醚酰亚胺和活化剂，溶于有机试剂，搅拌反应，通过酰胺化反应键合二氢卟酚e6和羧基聚乙二醇，反应结束后透析，得红光激活的活性氧敏感型支化聚醚酰亚胺材料。
优选的，步骤(1)所述含有巯基的酸为3-巯基丙酸。
优选的，步骤(1)所述洗涤的溶剂为己烷、水和乙醚中的一种以上。
优选的，步骤(1)所述丙酮与含有巯基的酸的摩尔比为1-6:1，进一步优选为2:1。
优选的，步骤(1)所述搅拌反应的时间为1～8h，进一步优选为4h。
优选的，步骤(2)所述羧基聚乙二醇为mPEG2k-COOH。
优选的，步骤(2)所述搅拌反应的时间为1～48h，，进一步优选为24h。
优选的，步骤(2)所述有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺中的一种以上；所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。
由以上所述的制备方法制得的一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料。
以上所述的一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料作为siRNA运输载体应用于制备载药纳米颗粒。
优选的，所述载药纳米颗粒的直径100nm左右。
本发明提供了基于缩硫酮键合成活性氧敏感支化聚醚酰亚胺材料的方法及其键合光敏剂Ce6同时包载siRNA自组装形成的载药纳米颗粒(TKPEI-Ce6/siRNA)的应用。上述支化聚醚酰亚胺材料可按照下述方法合成：将丙酮与3-巯基丙酸在干燥的氯化氢中混合均匀，在室温下搅拌反应4h，反应结束后，用己烷和水洗涤、干燥，将含有缩硫酮键的3,3’-(丙烷-2,2-二烯基(磺胺基))二丙酸(PSPA)与聚醚酰亚胺和活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶于N,N-二甲基甲酰胺，搅拌反应，再通过酰胺化反应键合二氢卟酚e6和羧基聚乙二醇，反应结束后透析，可得活性氧敏感的支化聚醚酰亚胺材料。基于缩硫酮键的活性氧敏感支化聚醚酰亚胺材料纳米载体可促进内涵体逃逸和实现胞内快速释放siRNA。含有大量缩硫酮键的活性氧敏感支化聚醚酰亚胺纳米载体通过酰胺化反应键合光敏剂Ce6。在660nm红光照射下，Ce6产生大量活性氧，破坏内涵体结构从而促进内涵体逃逸。同时，缩硫酮键被活性氧切割断裂生成巯基，颗粒崩解，使颗粒包载的siRNA在胞内快速释放。这种支化聚醚酰亚胺纳米颗粒可用于包载siRNA，在特定波长激光照射下，实现较快的内涵体逃逸和胞内释放，提高基因沉默效率，提高抗肿瘤效果。
本发明中亲水部分是聚乙二醇，为亲水性聚酯，其相对分子量为2000。
本发明中疏水部分是含有大量缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺，为活性氧敏感聚醚酰亚胺，它的优点在于①疏水性，通过疏水-疏水相互作用可包载疏水性药物自组装成纳米颗粒；②可生物降解，并且它的最终降解产物不会对生物体有不良影响；③合成简单且可控；④在特定波长激光照射下，光敏剂产生活性氧，破坏内涵体结构，加速内涵体逃逸，同时缩硫酮键发生断裂生成巯基，颗粒崩解，加速胞内释放药物。
本发明的支化聚醚酰亚胺材料可在水相中自组装形成纳米颗粒并应用于siRNA的运输载体。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明得到的活性氧敏感型支化聚醚酰亚胺材料具有良好的生物相容性和可降解性。基于活性氧敏感的缩硫酮构建的纳米颗粒载体，在660nm红光照射下，光敏剂Ce6产生大量活性氧，破坏内涵体结构，同时缩硫酮断裂，颗粒崩解，使siRNA加速内涵体逃逸和胞内释放，提高基因沉默效率，提高抗肿瘤效果，具有巨大的临床应用潜能。
附图说明
图1为活性氧敏感的缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料TKPEI-Ce6的合成路线图。
图2为活性氧敏感的缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料TKPEI-Ce6的1H NMR。
图3a、图3b为不同投料比时的纳米颗粒粒径及电势图。
图4为不同投料比时的纳米颗粒的凝胶电泳成像图。
图5a、图5b分别为纳米颗粒的粒径及透射电镜图片。
图6为纳米颗粒的稳定性曲线图。
图7为660nm激光照射后纳米颗粒的凝胶电泳图。
图8a、图8b分别为660nm激光照射后纳米颗粒的粒径及透射电镜图片。
图9为660nm激光照射后纳米颗粒的Ellman实验图。
图10为660nm激光照射后纳米颗粒的1H NMR。
图11为660nm激光照射后MDA-MB-231细胞内Cy5荧光强度图。
图12a、图12b为660nm激光照射后MDA-MB-231细胞的qRT-PCR和Western blot图像。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施做进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1、支化聚醚酰亚胺材料的合成与表征
一、活性氧敏感的支化聚醚酰亚胺TKPEI-Ce6的合成
活性氧敏感的支化聚醚酰亚胺是由支化聚乙烯亚胺和含有缩硫酮键的3,3’-(丙烷-2,2-二烯基(磺胺基))二丙酸之间的交联反应合成，然后通过酰胺化反应键合PEG和光敏剂Ce6。
TKPEI-Ce6支化聚醚酰亚胺材料的合成路线如图1所示。
所需组分的制备和预处理。
1、合成含有缩硫酮键的3,3’-(丙烷-2,2-二烯基(磺胺基))二丙酸
丙酮与3-巯基丙酸干燥除水。将无水丙酮(5.8g,98.2mmol)和无水3-巯基丙酸(5.2g,49.1mmol)混合均匀，在干燥的氯化氢中，室温下搅拌4小时，在冰盐混合物中终止反应，得到粗结晶产物。将粗结晶产物用己烷洗涤、过滤、真空干燥，得含有缩硫酮键的3,3’-(丙烷-2,2-二烯基(磺胺基))二丙酸(PSPA)。当无水丙酮与无水3-巯基丙酸的投料摩尔比为1:1时，所得产物较少而且产物中有较多的无水丙酮残留，纯化过程比较复杂并且纯化后得到的产物纯度不高。同理，当无水丙酮与无水3-巯基丙酸的投料摩尔比为3.5:1和6:1时，所得产物中有较多的3-巯基丙酸残留，纯化过程比较复杂并且纯化后得到的产物纯度不高。室温下搅拌1小时就在冰盐混合物中终止反应，所得产物较少，反应产率不高。搅拌反应4h时终止反应，无水丙酮和无水3-巯基丙酸基本反应完全，产物较多。将搅拌反应的时间继续延长至4.5h甚至8h，产物的质量并没有增多。因此将搅拌反应时间定为4h。
2、活性氧敏感的支化聚醚酰亚胺材料的合成
称取PSPA(50.42mg,0.2mmol)，加到圆底烧瓶(50mL)中，再加入无水DMF(4mL)完全溶解后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，69mg,0.6mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC，114.6mg,0.6mmol)。称取支化聚乙烯亚胺(bPE1，1.80g，1mmol)，加到另一圆底烧瓶(50mL)中，再加入无水DMF(4mL)，完全溶解后，将支化聚乙烯亚胺的DMF溶液滴加到PSPA溶液中，反应24h。称取NHS(69mg,0.6mmol)和EDC(114.6mg,0.6mmol)活化的Ce6和mPEG45-COOH加到无水DMF(2mL)，完全溶解后，逐滴滴加至上述混合物后，将粗产物用DMSO(MWCO10,000Da)透析2天，除去DMF和未反应的TK，冻干，可得TKPEI-Ce6。若搅拌反应1h，所得产物非常少。若将搅拌反应时间延长至24.5h甚至48h，所得产物与搅拌反应24h的产物类似。
二、支化聚醚酰亚胺材料TKPEI-Ce6的表征
对上述支化聚醚酰亚胺进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，测定其分子结构，TKPEI-Ce61H NMR谱见图2。如图2所示，活性氧敏感的支化聚醚酰亚胺TKPEI-Ce6的1H NMR图谱字母标记了归属于支化材料的质子氢。其中，1.58ppm的峰归属于缩硫酮键的甲基，2.75-3.05ppm范围内的峰归属于支化聚醚酰亚胺的质子氢以及缩硫酮侧邻的两个亚甲基峰。而3.30ppm归属于聚乙二醇的末端甲基峰，3.66ppm归属于聚乙二醇的质子氢。
实施例2、支化聚醚酰亚胺的纳米颗粒化及应用
一、支化纳米颗粒的制备
活性氧敏感聚合物材料用于纳米载体已被广泛研究。缩硫酮键合成方法简单可控、在活性氧作用下，断裂生成巯基，使纳米载体崩解，快速释放药物，因此是一种安全高效的药物输送载体。
支化聚醚酰亚胺材料通过静电相互作用包载siRNA，得到TKPEI-Ce6/siRNA纳米颗粒。通过改变支化聚醚酰亚胺材料与siRNA的投料比，筛选粒径、电势等性能比较优良的纳米颗粒，用动态光散射仪(Dynamic light scattering,DLS)检测所得纳米颗粒的粒径与电势，实验结果见图3a、图3b。当TKPEI-Ce6与siRNA的质量比为3:1或是5:1时，所得纳米颗粒的粒径都偏大，分别为400nm和930nm。当TKPEI-Ce6与siRNA的投料比为10:1或者更高时，粒径又偏小，小于100nm。随着质量比的增大，纳米颗粒的电势逐渐增大。当质量比为10:1时，电势约为20mV。当质量比继续增大时，电势基本不变。粒径和电势的变化初步证明，当TKPEI-Ce6与siRNA的质量比为10:1时，纳米颗粒与siRNA稳定地结合。
为了进一步验证这个现象，将所得的纳米颗粒进行凝胶电泳实验，实验结果见图4。当TKPEI-Ce6与siRNA的质量比为10:1时，条带完全消失，证明纳米颗粒与siRNA稳定地结合。
二、支化纳米颗粒的特性
经双乳化法制备、TKPEI-Ce6与siRNA的质量比为10:1时，得到纳米载体，动态光散射仪(Dynamic light scattering,DLS)检测纳米颗粒粒径，见图5a、图5b。TKPEI-Ce6/siRNA的粒径为120nm左右。在透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)下观察，TKPEI-Ce6/siRNA纳米颗粒为一个紧凑的球型形貌，大小在120nm左右，与DLS检测结果一致。
如图6所示，TKPEI-Ce6/siRNA纳米颗粒具较好的稳定性。在含10％胎牛血清或10％PBS溶液中共培养24h后，纳米颗粒粒径均无明显变化。这可能是由于PEG能够为颗粒提供一个惰性的表面，从而提高颗粒的稳定性。
三、TKPEI-Ce6/siRNA纳米颗粒的活性氧敏感性
TKPEI-Ce6/siRNA纳米颗粒用660nm激光(0.1W/cm2,15min)照射15min后，进行凝胶电泳实验。如图7所示，TKPEI-Ce6/siRNA纳米颗粒光照后出现了明显的条带迁移，证明siRNA被释放出来。
此外，光照后的TKPEI-Ce6/siRNA纳米颗粒用动态光散射仪(Dynamic lightscattering,DLS)检测纳米颗粒粒径，尺寸呈多峰分布，证明纳米颗粒结构被破坏，这一结果与TEM图像一致。粒径分布及TEM图像见图8a、图8b。
缩硫酮键可以被活性氧切割断裂，形成巯基，因此可以进一步用Ellman测试检测巯基含量从而定量检测缩硫酮键的降解率。如图9所示，用660nm激光(0.1W/cm2,15min)照射下，随着照射时间的增加，巯基数目逐渐增加。照射15和30分钟后，分别有超过16％和38％的缩硫酮键被裂解。此外，在光照射不同时间后，将TKPEI-Ce6/siRNA纳米颗粒冻干用于1HNMR分析。如图10所示，随着照射时间的增加，1.58ppm处的峰减小，进一步表明TKPEI-Ce6的缩硫酮键在光照射下被有效裂解。
四、支化纳米颗粒的体外细胞实验
1、肿瘤细胞内的siRNA释放
在660nm红光照射下，光敏剂Ce6产生大量ROS，破坏内涵体结构，加快内涵体逃逸，除此之外，产生的ROS还会裂解缩硫酮键，使颗粒崩解，快速释放siRNA。为了区分胞内释放的siRNA与TKPEI-Ce6/siRNA，将Cy5-siRNA和BHQ3-siRNA以1:1的摩尔比制备TKPEI-Ce6/Q-siRNA纳米颗粒。同时使用Cy5-siRNA制备的TKPEI-Ce6/Cy5-siRNA纳米颗粒作为对照组。在TKPEI-Ce6/Q-siRNA纳米颗粒中，Cy5-siRNA的荧光大部分被淬灭。将TKPEI-Ce6/Q-siRNA纳米颗粒与MDA-MB-231细胞温育4h后，洗去未摄取的TKPEI-Ce6/Q-siRNA纳米颗粒，然后用660nm红光(0.1W/cm2)照射15min，继续温育4h后，用FACS检测Cy5的荧光强度。如图11所示，TKPEI-Ce6/Q-siRNA纳米颗粒组的荧光强度基本被淬灭。但是经660nm红光照射后，由于Cy5-siRNA和BHQ3-siRNA的有效分离，细胞内的Cy5的荧光强度显著增强。颗粒浓度越大，Cy5的荧光强度越强。以上实验结果证明，660nm红光照射后，光敏剂Ce6产生大量ROS，除了破坏内涵体结构，加快内涵体逃逸，还会裂解缩硫酮键，使颗粒崩解，快速释放siRNA。
2、肿瘤细胞的靶基因沉默效率
660nm红光照射后，光敏剂Ce6产生大量ROS，破坏内涵体结构，加快内涵体逃逸，同时活性氧敏感的TKPEI-Ce6/siRNA纳米颗粒崩解，加快siRNA释放，可以提高基因沉默效率。为了验证这一点，Plk1是许多癌细胞中有丝分裂过程中的关键调节因子，因此将它选为靶基因。将MDA-MB-231细胞与浓度分别为100nm和200nmTKPEI-Ce6/si Plk1纳米颗粒温育4h，洗去未摄取的纳米颗粒。以Lipo/siPlk1作为阳性对照。用660nm红光(0.1W/cm2)照射15min，继续温育24或48h后，分别通过实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)和Westernblot分析Plk1的mRNA和蛋白质表达水平。
如图12a、图12b所示，阳性对照Lipo/siPlk1使PLK1基因表达下调至38.4％。660nm红光照射可以显著下调Plk1基因表达，而且TKPEI-Ce6/siRNA纳米颗粒浓度越高，这种基因沉默效率越高。在不光照的情况下，浓度为100nM和200nM的TKPEI-Ce6/si Plk1纳米颗粒诱导Plk1的mRNA表达下调10.4％和37.2％，而光照组分别达到了44.6％和下调78.2％。此外，Western blot检测到类似的光照后基因沉默效率提高的现象。红光照射后，浓度为200nM的TKPEI-Ce6/siPlk1纳米颗粒组的PLK1蛋白表达显著下调，非光照组则没有明显的下调现象。以上结果证明，660nm红光照射后，光敏剂Ce6产生大量ROS，除了破坏内涵体结构，加快内涵体逃逸，还会裂解缩硫酮键，使颗粒崩解，快速释放siRNA，提高靶基因的沉默效率。

Claims (10)

1.一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将丙酮与含有巯基的酸混合搅拌反应，反应结束后，洗涤、干燥；
（2）在步骤（1）干燥产物中加入聚醚酰亚胺和活化剂，溶于有机试剂中，搅拌反应，再通过酰胺化反应键合二氢卟酚e6和羧基聚乙二醇，反应结束后透析，得含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述含有巯基的酸为3-巯基丙酸。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述洗涤的溶剂为己烷、水和乙醚中的一种以上。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述丙酮与含有巯基的酸的摩尔比为1-6:1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述反应的时间为1~8 h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述羧基聚乙二醇为mPEG2k-COOH。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述搅拌反应的时间为1~48h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺中的一种以上；所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的一种以上。
9.由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料。
10.权利要求9所述的一种含有缩硫酮键的支化聚醚酰亚胺材料作为siRNA运输载体应用于制备载药纳米颗粒。
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