CN111393632A - 一种缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料及其制备方法与应用。该方法包括：半胱胺盐酸盐和丙酮的混合物用氯化氢饱和然后反应，得到含有缩硫酮键的二胺；将甲氧基聚乙二醇羧基、二环己基碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺反应，将聚乙二醇溶液滴加到含缩硫酮的二胺溶液反应得到mPEG‑TK‑NH2；二氢卟吩e6、二环己基碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺溶于溶剂中反应；活化的Ce6溶液添加到mPEG‑TK‑NH2溶液中搅拌反应，获得缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料。该缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料有生物相容性和可降解性，能增强细胞对载药颗粒的摄取，使得细胞内药物浓度提高，杀死肿瘤细胞，提高化疗疗效。

Description

一种缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及功能材料领域，具体涉及一种缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6 材料及其制备方法与应用。
背景技术
在抗肿瘤纳米载体表面修饰聚乙二醇(PEG)，即聚乙二醇化，是目前应 用最广泛的阻止蛋白吸附和避免血液循环快速清除的策略，可延长血液循环时 间，通过增强通透性和保留(Enhanced permeability and retention effect，EPR) 效应在肿瘤组织富集，可降低药物的毒副作用。聚乙二醇化纳米药物包括脂质 体多柔比星
Figure BDA0002297614460000011
和聚乙二醇-聚乳酸胶束形式的紫杉醇
Figure BDA0002297614460000012
已被批准用于治疗恶性肿瘤，越来越多的聚乙二醇化纳米药物已进入临床试验。
PEG的修饰提高了全身给药后纳米颗粒的肿瘤富集，然而，PEG的存在 也会影响细胞对纳米载体的摄取，导致治疗效率受限。因此，开发一种简便的 策略来实现纳米载体的PEG化和去PEG化是非常必要的。基于肿瘤微环境中 如酸性pH、乏氧、以及某些酶的过表达等情况，许多实现PEG脱壳的纳米颗 粒被开发出来。然而，由于肿瘤的异质性，肿瘤微环境的pH值以及酶在不同 类型肿瘤的不同时期或同一肿瘤不同部位动态表达的差异，肿瘤微环境响应性 纳米颗粒的广泛适用性受到限制。因此，迫切需要开发一种普遍适用的在肿瘤微环境中实现PEG脱壳的药物递送策略。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种缩硫酮键连 接的聚乙二醇化Ce6材料及其制备方法与应用。本发明提供的缩硫酮键连接的 聚乙二醇化Ce6材料用于实现纳米载体PEG化与去PEG化。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料可按照下述方法合成： 通过缩合反应，2,2'-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙-1-胺)(2,2'-(propane-2, 2-diylbis(sulfanediyl))bis(ethan-1-amine))(PDSE)、二氢卟吩e6(Ce6)以 及甲氧基聚乙二醇羧基(mPEG-COOH)反应生成缩硫酮键连接的聚乙二醇化 Ce6材料。反应原料结构式如下所示：
Figure BDA0002297614460000021
本发明提供的一种缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料的制备方法，包括 以下步骤：
(1)将半胱胺盐酸盐和无水丙酮加入氯仿中，混合均匀，得到半胱胺盐 酸盐和无水丙酮的混合溶液，通入干燥的氯化氢气体使混合溶液饱和，搅拌反 应，过滤取沉淀，得到含有缩硫酮键的二胺，将所述含有缩硫酮键的二胺加入 有机溶剂中，混合均匀，得到含有缩硫酮键的二胺溶液；
(2)将甲氧基聚乙二醇羧基、二环己基碳二亚胺(作为催化剂)、N-羟基 琥珀酰亚胺加入有机溶剂中，混合均匀，进行活化反应，得到甲氧基聚乙二醇 琥珀酰亚胺酯(mPEG-NHS)溶液；
(3)将步骤(2)所述甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯溶液滴加至步骤(1) 所述含有缩硫酮键的二胺溶液中，得到混合液，搅拌反应，过滤取滤液，浓缩， 利用反溶剂法得到沉淀，即mPEG-TK-NH2；将所述mPEG-TK-NH2加入有机 溶剂中，混合均匀，得到mPEG-TK-NH2溶液；
(4)将二氢卟吩e6、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺溶于有机溶 剂中进行活化反应，得到Ce6-琥珀酰亚胺酯溶液；
(5)将步骤(4)所述Ce6-琥珀酰亚胺酯溶液滴加至步骤(3)所述 mPEG-TK-NH2溶液中，得到混合液，搅拌反应，得到反应混合物，过滤取滤 液，浓缩，利用反溶剂法得到沉淀，即得到所述缩硫酮键连接的聚乙二醇化 Ce6材料(缩硫酮键合的PEG化光敏材料mPEG-TK-Ce6)。
进一步地，步骤(1)所述半胱胺盐酸盐与无水丙酮的摩尔比为1:2-4；所 述无水丙酮与氯仿的体积比为4:1-2；所述搅拌反应的时间为6-10h；所述含有 缩硫酮键的二胺为2,2'-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙-1-胺)；所述有 机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种以上；所述含有缩硫酮键的 二胺溶液的浓度为0.1-0.5g/mL。
步骤(1)所述含有缩硫酮键的二胺为2,2'-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基)) 双(乙-1-胺)。
优选地，步骤(1)所述无水丙酮与氯仿(chloroform)的体积比为4:1。
优选地，步骤(1)所述含有缩硫酮键的二胺溶液的浓度为0.1g/mL。
优选地，步骤(1)所述半胱胺盐酸盐与无水丙酮的摩尔比为1:2.7。
优选地，步骤(1)所述搅拌反应的时间为8h。
进一步地，步骤(2)所述甲氧基聚乙二醇羧基的分子量为2k、4k、5k或 10k；所述甲氧基聚乙二醇羧基与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1-3；所述甲 氧基聚乙二醇羧基和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1-3；所述有机溶剂为四 氢呋喃、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种以上；
优选地，步骤(2)所述甲氧基聚乙二醇羧基与二环己基碳二亚胺的摩尔 比为1:1.1。
优选地，步骤(2)所述甲氧基聚乙二醇羧基和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔 比为1:1.1。
优选地，步骤(2)所述甲氧基聚乙二醇羧基的分子量为2k。
优选地，步骤(2)所述甲氧基聚乙二醇羧基为mPEG-COOH。
优选地，步骤(2)所述有机溶剂为二氯甲烷。
进一步地，步骤(2)所述甲氧基聚乙二醇羧基与有机溶剂的质量体积比 为0.1-0.5：1g/mL。
优选地，步骤(2)所述甲氧基聚乙二醇羧基与有机溶剂的质量体积比为 0.2:1g/mL。
进一步地，步骤(2)所述活化反应的时间为5-7h。
优选地，步骤(2)所述活化反应的时间为6h。
步骤(2)所述甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯为mPEG-NHS。
进一步地，步骤(3)所述甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯溶液与含有缩硫 酮键的二胺溶液的体积比为1:1；所述搅拌反应的时间为20-24h；所述有机溶 剂为二氯甲烷。
进一步地，步骤(3)所述mPEG-TK-NH2溶液的浓度为50-70mg/mL；
优选地，步骤(3)所述mPEG-TK-NH2溶液的浓度为55mg/mL。
优选地，步骤(3)所述搅拌反应的时间为24h。
优选地，步骤(3)所述甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯为mPEG-NHS。
进一步地，步骤(4)所述二氢卟吩e6和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1-4； 所述二氢卟吩e6和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1-4；所述有机溶剂为二氯 甲烷；所述活化反应的时间为5-7h。
优选地，步骤(4)所述二氢卟吩e6和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.1。
优选地，步骤(4)所述活化反应的时间为6h。
进一步地，步骤(4)所述二氢卟吩e6与有机溶剂的质量体积比为10-20： 1mg/mL。
优选地，步骤(4)所述二氢卟吩e6与有机溶剂的质量体积比为16：1mg/mL。
进一步地，在步骤(5)所述混合液中，mPEG-TK-NH2与Ce6-琥珀酰亚 胺酯的的摩尔比为1:1-2；搅拌反应的时间为20-24h。
优选地，在步骤(5)所述混合液中，mPEG-TK-NH2与Ce6-琥珀酰亚胺 酯的的摩尔比为1:1.1。
优选地，步骤(5)所述搅拌反应的时间为24h。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6 材料，缩写为mPEG-TK-Ce6。
本发明提供的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料能够作为PEG化修饰 材料应用制备载药纳米颗粒中。
其中所述纳米颗粒包含疏水性聚合物；所述疏水性聚合物为聚乳酸、聚己 内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或组合。
优选的，疏水性聚合物为聚乳酸(PLA)。
其中所述的疏水性化疗药物为阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、米托蒽醌、 伊立替康、卡莫司汀、帕雷霉素、顺铂或它们的组合。
优选的，疏水性化疗药物为Pt(Ⅳ)。
优选的，所述纳米颗粒的直径为100nm左右。
本发明用所述缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料制备得到的光致ROS 响应的缩硫酮键键合的PEG化纳米药物载体具有良好的生物相容性和可降解 性。该基于ROS敏感的缩硫酮键构建的光敏材料(所述光致ROS响应的缩硫 酮键键合的PEG化纳米药物载体)，能够在660nm光照下，产生ROS诱导缩 硫酮键断裂成两个巯基，使得PEG脱离纳米颗粒，增强细胞对载药颗粒的摄 取，使得细胞内药物浓度提高，杀死肿瘤细胞提高化疗疗效，具有巨大的临床 应用潜能。
本发明提供了基于缩硫酮键合成活性氧响应PEG化光敏材料(缩硫酮键 连接的聚乙二醇化Ce6材料)的方法及其与聚乳酸PLA包载前药Pt(Ⅳ)自 组装形成的载药纳米颗粒(TCNPPt)的应用。该PEG化光敏材料(缩硫酮键 连接的聚乙二醇化Ce6材料)是由2,2'-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙 -1-胺)依次和mPEG45-COOH、Ce6发生缩合反应而得到。上述具有活性氧响 应的PEG化光敏材料表示为mPEG45-TK-Ce6。PLA可以由10-羟基癸酸引发L-丙交酯开环聚合得到。
上述PEG化光敏材料(所述缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料)可按 照下述方法合成：由2,2'-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙-1-胺)与 mPEG45-COOH缩合，再与Ce6发生缩合反应。基于缩硫酮键的活性氧响应PEG 化光敏材料的载药纳米颗粒，由于PEG化可延长颗粒在体内的循环时间，可 实现颗粒在肿瘤区域的富集，而在光照条件下能产生大量ROS，切断连接PEG 与Ce6的缩硫酮键，实现载药颗粒的去PEG化过程，可增强肿瘤细胞对载药 纳米颗粒的摄取，提高胞内药物浓度，从而增强抗肿瘤效果。这种PEG化的 纳米颗粒可用于包载疏水性药物到其内核(疏水核)，PEG脱壳的纳米颗粒， 有利于提高细胞摄取量，实现细胞中药物含量的增加，提高抗肿瘤效果。
近年来，红光和近红外(NIR)光(650-950nm)因其诸多优点用于光热 疗法和光动力疗法，用作刺激响应性药物传递系统的刺激因子。本发明基于活 性氧(ROS)敏感的缩硫酮键合成了一种PEG化光敏材料(缩硫酮键连接的 聚乙二醇化Ce6材料)，其可用于实现包载化疗药物的疏水性聚合物纳米颗粒 的PEG化，延长疏水性聚合物载药颗粒在体内的循环时间，使颗粒在肿瘤组 织中富集。而当肿瘤组织受到660nm红光照射时，键合的光敏剂Ce6能产生 大量的ROS使得连接PEG和Ce6的缩硫酮键断裂，实现去PEG化过程，从 而促进肿瘤细胞对纳米颗粒的摄取和提高化疗效果。
本发明提供的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料，是由两亲性光敏材料 mPEG45-TK-Ce6与疏水聚合物PLA组装而成。
它的优点在于①PEG化的光敏剂Ce6与PLA通过亲水-疏水相互作用自组 装成纳米颗粒，同时进行疏水药物的包载；②可生物降解，并且它的最终降解 产物不会对生物体有不良影响；③合成简单且可控；④在光照条件下能发生活 性氧响应，促使缩硫酮键发生断裂，实现PEG脱壳，导致颗粒表面PEG密度 降低，增加药物摄取。
本发明中，所述缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料可在水相中与PLA 自组装形成纳米颗粒并应用于疏水性抗癌药物的递送。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料具有良好的生物 相容性和可降解性；所述缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料(基于ROS敏 感的缩硫酮键连接的PEG化光敏材料)中的光敏剂Ce6在660nm光照下，能 够产生ROS诱导缩硫酮键断裂成两个巯基，使得PEG从纳米颗粒表面离去， 降低颗粒表面PEG的密度，增强细胞对载药颗粒的摄取，提高细胞内药物浓 度，有效杀死肿瘤细胞提高化疗疗效，具有巨大的临床应用潜能。
附图说明
图1为实施例中活性氧响应的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料 mPEG45-TK-Ce6与疏水聚合物PLA的合成路线图；
图2为mPEG45-TK-NH2 1H NMR核磁共振氢谱图。
图3为mPEG45-TK-Ce61H NMR核磁共振氢谱图。
图4为疏水聚合物PLA1H NMR核磁共振氢谱图。
图5为荧光标记的FITC-PLA1H NMR核磁共振氢谱。
图6为光敏感的响应载药纳米颗粒的N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺(RNO) 检测体外ROS产生情况图。
图7为光照不同时间mPEG45-TK-Ce6降解1H NMR图。
图8为光照不同时间mPEG45-TK-Ce6降解率曲线图。
图9为光照不同时间mPEG45-TK-Ce6降解GPC测试图。
图10为TCNPPt在光照后的粒径分布图。
图11为TCNPPt在光照后的颗粒稳定性图。
图12为TCNPPt在光照前后的药物释放曲线图。
图13为光照不同时间的TCNPPt对MDA-MB-231细胞的MTT实验结果柱 状图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护 不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人 员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可 以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1、mPEG45-TK-Ce6与PLA的合成与表征
一、缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料(mPEG45-TK-Ce6)与聚乳酸(PLA) 的合成
mPEG45-TK-Ce6由2,2'-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙-1-胺)依 次和mPEG45-COOH、Ce6发生缩合反应得到。
PLA以异辛酸亚锡为催化剂，10-羟基癸酸引发L-丙交酯开环聚合得到。
合成路线如图1所示。
所需组分的制备和预处理
1、缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料的合成
(1)将半胱胺盐酸盐(11.36g，100mmol)和无水丙酮(15.6g，270mmol) 混合溶于4mL氯仿，通入干燥的氯化氢使溶液饱和并在室温下搅拌8小时。 反应后，过滤得到白色固体产物，用氯仿洗涤两次；然后，将产物干燥溶于甲 醇和乙醚的混合液中，于-20℃下重结晶三次，之后将得到的重结晶产物过滤 取滤渣、干燥后溶于20mL 6M NaOH水溶液，搅拌反应脱铵盐(搅拌反应的 时间为12小时)；最后，用5×100mL二氯甲烷(CH2Cl2)萃取，得到ROS响 应的TK键键合物2,2'-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙-1-胺)(缩写为 PDSE)。
(2)将甲氧基聚乙二醇羧基(mPEG45-COOH，1.0mmol，2.0g)、二环己 基碳二亚胺(DCC，1.1mmol，0.23g)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，1.1mmol， 0.13g)溶于10ml CH2Cl2中；活化反应6h后，得到mPEG45-NHS。将 mPEG45-NHS溶液滴加到含PDSE(3.0mmol，0.58g)的10mlCH2Cl2圆底烧 瓶中，室温下搅拌反应24h；然后对反应得到的混合物进行过滤、浓缩，在低温(温度为0℃)搅拌条件下，滴加到乙醚/甲醇(10/1，v/v)冷混合液中沉淀 两次，得到粗产物mPEG45-TK-NH2，然后用柱层析法纯化得到mPEG45-TK-NH2。
(3)将二氢卟吩e6(0.54mmol，0.32g)、二环己基碳二亚胺(DCC，1.78 mmol，0.37g)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，1.78mmol，0.21g)溶于20ml CH2Cl2中，活化反应6h，得到Ce6溶液；然后将所述Ce6溶液逐滴地添加到20mL mPEG45-TK-NH2(0.49mmol，1.1g)的CH2Cl2溶液中搅拌，室温反应24h， 然后将反应混合物过滤取滤液、浓缩以及在温度为0℃的乙醚/甲醇(10/1，v/v) 中沉淀两次，获得ROS敏感的光敏材料mPEG45-TK-Ce6(即所述缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料)。
2、PLA的合成
将无水的10-羟基癸酸(0.4mmol，0.075g)，L-丙交酯(13.9mmol，2.0g) 溶解在无水甲苯(15mL)中。在80℃下搅拌30分钟直至固体完全溶解，然 后向混合物中加入Sn(Oct)2(0.04mmol，16mg)。反应在80℃下进行3小时。 然后加入苯甲酸(0.6mmol，73mg)终止反应，浓缩溶液并沉淀到温度为0℃ 的乙醚/甲醇(10/1，v/v)中两次，得到聚乳酸(PLA)。
二、各个材料的表征
1、PEG化光敏材料mPEG-TK-Ce6(所述缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6 材料)的表征
对上述PEG化光敏材料进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，测定其分子 结构，步骤(2)合成的mPEG45-TK-NH2 1H NMR谱见图2所示，步骤(3)合 成的mPEG45-TK-Ce6 1H NMR谱见图3。
2、PLA的表征
对上述PLA与FITC-PLA材料(异硫氰酸荧光素标记的PLA)进行核磁 共振氢谱(1HNMR)分析，测定其分子结构，PLA1H NMR谱见图4，FITC-PLA 1H NMR谱见图5。
实施例2、光致ROS响应纳米颗粒制备与应用
一、制备包封Pt(IV)前药的纳米颗粒(TCNPPt)
将上述mPEG45-TK-Ce6(5.0mg)，PLA(5.0mg)和Pt(IV)(0.5mg) 溶解在二甲基亚砜中(DMSO，1.0mL)，然后滴加到超纯水(10.0mL)中搅 拌2小时。将该溶液用超纯水透析24小时，并用0.45μm滤膜过滤，得到所 述包封Pt(IV)前药的纳米颗粒(缩写为TCNPPt)溶液。类似地，通过掺入 FITC标记的PLA(0.2mg)制备得到异硫氰酸荧光素(FITC)标记的包封Pt (IV)前药的纳米颗粒(缩写为FITCTCNPPt)溶液。
二、体外ROS的产生
将上述TCNPPt溶液(2mL)、游离Ce6溶液([Ce6]＝10μg/mL，2mL)、 50mM对亚硝基二甲基苯胺(RNO,100μL)和100mM咪唑(100μL)在20 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中混合，然后在0.05W/cm2的光功率密度下的660 nm激光照射不同的时间段(0，5，10，20min)。溶液在440nm处吸收值间 接反映了ROS的产生量。吸收值越高，表明ROS的产生量越少；吸收值越低， 表明ROS的产生量越多。
图6中的Free Ce6为游离Ce6，如图6所示，660nm照射可以诱导颗粒 中键合的Ce6产生ROS(即活性氧)。
三、纳米颗粒TK键断裂与快速去PEG化性质
1、纳米颗粒TK键断裂性质表征
将上述TCNPPt溶液(5.0mL，[Ce6]＝150μg/mL)照射不同的时间(660nm， 0.05W/cm2，0，5，10和20min)。然后，将样品冻干后用于凝胶渗透色谱(GPC) 和1H NMR分析。
如图7所示，随着预照射时间的增加，mPEG45-TK-Ce6的TK键(峰值为 1.58ppm)的CH3量逐渐减少而2.12ppm的峰值表明来自丙酮(TK键断裂生 成丙酮)的CH3量增加。基于1HNMR光谱，计算TK键的降解率，如图8所 示，发现TK键的降解表现出时间依赖性。
如图9所示，GPC显示随着照射时间的增加，峰值在29.2mL(Ce6)逐 渐增加。在接受0.05W/cm2照射20分钟后，mPEG45-TK-Ce6有39.6％的TK 键断裂。这些结果表明，在660nm激光照射下有效地引起PEG(聚乙二醇) 脱离。
2、去PEG化后颗粒稳定性
如图10所示，测定了有660nm光照射与非光照的TCNPPt的尺寸、形态 和稳定性。将TCNPPt纳米颗粒照射不同的时间(0.05W/cm2下照射0，5，10 和20min)，并且将未照射的纳米颗粒用作对照。PEG的脱离对TCNPPt的大小， 形态和稳定性没有显著影响。TCNPPt纳米颗粒的直径约为120nm，并且光照 后，颗粒的球形形态未发生显著变化。
图11中的L+表示光照。如图11所示，而且，光照前后的TCNPPt纳米颗 粒在10wt％的FBS溶液中具有良好的颗粒稳定性。
3、光照前后体外的药物释放
将所述TCNPPt溶液(2mL，[Pt]＝43.1μg/mL，[Ce6]＝75μg/mL)分散在 磷酸盐缓冲液(PB缓冲液，0.01M，pH 7.4)，并在660nm激光下以0.05W/cm2的功率密度照射不同时间(0，5，10和20min)，然后将样品转移到透析袋 (MWCO＝3500Da)中并悬浮于15mL PB缓冲液(0.01M，pH＝7.4)，置于 37℃摇床上。在预设时间收集透析袋外部PB缓冲液，用等体积的新PB缓冲 液替换外部PB缓冲液。将收集的溶液冻干后送电感耦合等离子体质谱仪 (ICP-MS)分析。
图12中的L+表示光照。如图12，光照对TCNPPt载药纳米颗粒的药物释 放也无明显的影响。
四、光响应纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤效果实验
预照射不同铂的浓度(0.5，1.0，2.0和4.0μM)的FITCTCNPPt载药纳米颗 粒与MDA-MB-231细胞共培养4h后，洗去未被摄取的颗粒，进一步孵育20h 后，用溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑(MTT)试剂测定细胞 活性。同样的方式处理颗粒，与MDA-MB-231细胞共培养4h后，洗去未被 摄取的颗粒，进一步孵育20h后，用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒处理后 流式细胞仪检测。
图13中的L+表示光照。如图13所示，在各个不同铂药浓度实验组，TCNPPt经20min预照射对MDA-MB-231肿瘤细胞的杀伤效果最佳。
总之，这些体外抗肿瘤研究结果证实红光诱导的去PEG化作用能够有效 增强肿瘤细胞对纳米颗粒的摄取，从而显着提高抗肿瘤效果。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本 发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等 均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将半胱胺盐酸盐和无水丙酮加入氯仿中，混合均匀，得到半胱胺盐酸盐和无水丙酮的混合溶液，通入干燥的氯化氢气体使混合溶液饱和，搅拌反应，过滤取沉淀，得到含有缩硫酮键的二胺，将所述含有缩硫酮键的二胺加入有机溶剂中，混合均匀，得到含有缩硫酮键的二胺溶液；
（2）将甲氧基聚乙二醇羧基、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺加入有机溶剂中，混合均匀，进行活化反应，得到甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯溶液；
（3）将步骤（2）所述甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯溶液滴加至步骤（1）所述含有缩硫酮键的二胺溶液中，得到混合液，搅拌反应，过滤取滤液，浓缩，利用反溶剂法得到沉淀，即mPEG-TK-NH2；将所述mPEG-TK-NH2加入有机溶剂中，混合均匀，得到mPEG-TK-NH2溶液；
（4）将二氢卟吩e6、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺溶于有机溶剂中进行活化反应，得到Ce6-琥珀酰亚胺酯溶液；
（5）将步骤（4）所述Ce6-琥珀酰亚胺酯溶液滴加至步骤（3）所述mPEG-TK-NH2溶液中，得到混合液，搅拌反应，得到反应混合物，过滤取滤液，浓缩，利用反溶剂法得到沉淀，即得到所述缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料。
2.根据权利要求1所述的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述半胱胺盐酸盐与无水丙酮的摩尔比为1:2-4；所述无水丙酮与氯仿的体积比为4:1-2；所述搅拌反应的时间为6-10h；所述含有缩硫酮键的二胺为2,2'-（丙烷-2,2-二基双（磺胺二基））双（乙-1-胺）；所述有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种以上；所述含有缩硫酮键的二胺溶液的浓度为0.1-0.5 g/mL。
3.根据权利要求1所述的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述甲氧基聚乙二醇羧基的分子量为2k、4k、5k或10k；所述甲氧基聚乙二醇羧基与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1-3；所述甲氧基聚乙二醇羧基和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1-3；所述有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种以上。
4.根据权利要求1所述的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述甲氧基聚乙二醇羧基与有机溶剂的质量体积比为0.1-0.5：1 g/mL；所述活化反应的时间为5-7 h。
5.根据权利要求1所述的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯溶液与含有缩硫酮键的二胺溶液的体积比为1:1；所述搅拌反应的时间为20-24 h；所述有机溶剂为二氯甲烷；所述mPEG-TK-NH2溶液的浓度为50-70 mg/ mL。
6.根据权利要求1所述的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述二氢卟吩e6和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1-4；所述二氢卟吩e6和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1-4；所述有机溶剂为二氯甲烷；所述活化反应的时间为5-7h。
7.根据权利要求1所述的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述二氢卟吩e6与有机溶剂的质量体积比为10-20：1mg/mL。
8.根据权利要求1所述的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料的制备方法，其特征在于，在步骤（5）所述混合液中，mPEG-TK-NH2与Ce6-琥珀酰亚胺酯的的摩尔比为1:1-2；搅拌反应的时间为20-24h 。
9.一种由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料。
10.权利要求9所述的缩硫酮键连接的聚乙二醇化Ce6材料作为PEG化修饰材料制备载药纳米颗粒的应用。
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