JPH03500124A - 形質導入した線維芽およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 形質導入した線維芽およびそれらの使用！員 胚において、中胚葉は３つの一次第３胚芽層の中央のものであり、そして外胚葉 および内胚葉の間に横たわる。それは、発育の間に、結合組織、すべての体の筋 糸、血液、心臓血管およびリンパ系、尿生殖器の系の大部分および心膜腔、胸膜 腔および腹膜腔の内層を生ずる。結合組織、血管および血液、リンパ系および心 臓を産生ずる中胚集の部分は、間葉と呼ばれる。開業細胞により産生される細胞 の１つの型は線維芽細胞であり、これは細胞質プロセスをもつ星細胞または紡錘 形細胞である。それらは結合系中に存在し、そしてコラーゲン線維を形成するこ とができる。

線維芽は、体中の他の細胞のように、すべての遺伝物質の全体の相補体を含有す る。しかしながら、それらが含をする遺伝子の小さい百分率のみが生物学的に機 能的レベルで発現されるのみである。すなわち、線維夢中の遺伝子の大部分はま ったく発現されないか、あるいはそれらがエンコードするポリペプチドが生物学 的に非機能的であるか、あるいは意味がない、許容されえない量または濃度で産 生されるようなレベルで発現される。

最近開発された方法を使用して、種間の遺伝子の組み換えを達成することが可能 である。異なる生物学的クラスから誘導された遺伝子は複製することができ、そ して選択した微生物中で発現される。したがって、他のクラスの有機体の特性で ある代謝または合成の機能（例えば、ホルモンの合成、タンパク質の合成、窒素 の固定）を特定する微生物の遺伝子牛に、遺伝子を特定のウィルスまたはプラス ミドのレプリコン結合することによって、導入することができる。

１９７０年代の後半まで、クローニングしたＤＮＡ配列を哺乳動物の細胞中に導 入する一般的方法の開発に向かって進歩がなされてきた。しかしながら、現在の 時点において、遺伝物質を線維夢中に安定に導入し、モして線維芽が通常発現し ないか、あるいは生物学的に意味のないレベルで発現する、遺伝物質を発現させ る有効な方法が要求されている。

発明の要約 ここに記載する本発明は、遺伝子操作した開票または結合組織の細胞に関し、と くにこのような細胞中で有意の濃度で通常発現されない遺伝物質を、生物学的に 有意のレベルで発現する、遺伝子操作された線維芽に関する。本発明は、また、 このような遺伝物質を線維夢中に安定に導入する方法および遺伝子操作された線 維芽を使用する方法に関する。

本発明の線維芽は、それらの中に問題の遺伝物質を安定に導入し、そして組み込 まれた遺伝物質を発現する。この問題の遺伝物質は、ここで組み込まれた遺伝物 質と呼ぶ。組み込まれた遺伝物質は、線維夢中に通常存在しないＤＮＡまたはＲ ＮＡ：線維夢中に通常存在するが、生物学的に有意なレベル（すなわち、それが エンコードするポリペプチドの通常の生理学的作用を産生ずるために十分なレベ ル）でそれらの中に発現されないＤＮＡまたはＲＮＡ、線維夢中に通常存在しか つそれが線維夢中で発現されるように修飾されているＤＮＡまたはＲＮＡ、およ び単独であるいはそれらの任意の組み合わせで、線維芽により発現されるように 修飾することができるＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。本発明の線維芽 により発現される組み込まれた遺伝物質は、選択可能なマーカーをエンコードし 、こうして組み込まれた遺伝物質を発現する細胞を同定しかつ選択する手段を提 供する、遺伝物質を包含することができる。

組み込まれた遺伝物質を含有する線維芽は、形質導入された線維芽と呼ぶ。

とくに、線維夢中で生物学的に有意のレベルで通常発現されない、問題のポリペ プチドまたはタンパク質をエンコードする遺伝物質を包含する遺伝物質で線維芽 を安定に形質導入するために、レトロウィルスを使用した。このようにして導入 された遺伝物質は、また、優生な選択可能なマーカーをエンコードする遺伝物質 を包含する。問題のポリペプチドをエンコードするＤＮＡおよび優生な選択可能 なマーカーをエンコードするＤＮＡを包含する遺伝物質を、培養した線維夢中に 導入した。遺伝子が導入された線維芽（すなわち、レトロウィルスのベクターの 使用により形質導入された線維芽）によるこれらの遺伝子の発現は、また、実証 された。

それらが含有する組み込まれた遺伝物質を発現する形質導入゛された線維芽を移 植する方法は、また、本発明の主題である。本発明の形質導入されｔ；線維芽は 、現在非経口的に投与される、予防および治療または処置において有用である、 ポリペプチドまたはタンパク質の構成的供給のｔ；めに使用される。それらは皮 膚の移植片およびダリア細胞または線維芽移植片中で使用することができ、これ らは問題のポリペプチドまたはタンパク質をエンコードするＤＮＡを中枢神経系 中に導入する。

本発明の線維芽および問題のポリペプチドまたはタンパク質のために供給系は、 それらを非常に有用とする、多くの利点が存在する。例えば、問題のポリペプチ ドまたはタンパク質（例えば、ホルモン、酵素、薬物）をエンコードする組み込 まれた遺伝物質を包含する線維芽を使用する皮膚移植片は、エンコードされたポ リペプチドを合成し、こうしてそのポリペプチドのｔ；めの連続的供給系として 働く。このようにして、ホルモンまたは他のポリペプチドを皮膚移植片を受ける 個体の血液流中に拡散される。

重要な利点は、本発明の遺伝子操作された線維芽を使用して、現在静脈内、筋肉 内または皮下に投与されている治療タンパク質（例えば、ホルモン、酵素、凝固 因子）を投与することができる。さらに、一般に分離したポリペプチド（例えば 、インスリン）で必要であるように、個体への投与の前に、ポリペプチドの広範 な（かつしばしば経費のかかる）精製を必要としない。本発明により修飾された 線維芽は、通常産生されるように、ポリペプチドのホルモンを産生ずる。例えば 、インスリンの場合において、遺伝子操作された線維芽は膵臓中につくられるも のと同一の形態でインスリンを産生ずる。

本発明の線維芽を有する移植片の使用に対する他の利点は、移植片の大きさ調節 することによって、体に供給されるポリペプチドの量を調節することができる。

さらに、皮膚移植片の場合において、ポリペプチドの産生を必要としなくなった 場合、それを切除することができる。例えば、ポリペプチド（ホルモン、酵素、 または薬物）の供給は特定の期間のためにのみ必要である場合、処置がもはや必 要でないとき、操作した移植片を除去することができる。

本発明の供給系の他の重要な利点は、それが連続的供給系であるので、ポリペプ チドのホルモンが非常に短い半減期を有するという事５ｉ！Ｊｉ限定ではないと いうことである。例えば、ヒト成長ホルモンの半減期はほぼ１８分、副甲状腺ホ ルモンのそれはほぼ２．５〜５分、そして自然インスリン（純粋なインスリン） のそれはほぼ３〜４分である。

遺伝子はレトロウィルスのベクターを使用して線維夢中に導入することができる ので、それらはレトロウィルスのベクターの制御を「オン」とする（それに付す ）ことができる；このような場合において、問題の遺伝子をレトロウィルスのプ ロモーターから転写される。プロモーターは、ＲＮＡの合成を關始するＲＮＡポ リメラーゼ分子により認識される、特定のヌクレオチド配列である。あるいは、 問題の遺伝物質の転写の原因となる追加のプロモーター要素（組み換えレトロウ ィルス中に組み込まれたプロモーターに加えて）を有するレトロウィルスのベク ターを使用することができる。例えば、外部の因子またはキューにより変調され る追加のプロモーターが存在する構成体を使用することができ、その外部の因子 またはキューを活性化することによって線維芽により産生されるポリペプチドの レベルを制御することができる。例えば、熱衝撃タンパク質が、プロモーターが 温度により調節される遺伝子によりエンコードされるタンパク質である。金属を 含有するタンパク質のメタロチオニンをエンコードする遺伝子のプロモーターは 、カドミウム（ｃｄ”）イオンに対して応答性である。外部のキューにより影響 を受けるこのプロモーターまたは他のプロモーターの組み込みは、また、操作し た線維芽によりポリペプチドの産生を調節することができる。

図面の簡単な説明 第１図は、野生をネズミ白血病ウィルス（レトロウィルス）のゲノムの概略的表 示である。

第２図は、各々が組み換えゲノムを有する、本発明において有用なしトロウィル スのベクターの概略的表示である。第２ａ図はｐＺ　Ｉ　ＰＮｅＯである；第２ ｂ図はｐＬＪである；第２Ｃ図はｐＷｅである；第２ｄ図はｐＥｍである；そし て、ｔｊｇ２ｅ図はｐＩＰである。

第３図は、第２ｂ図に表されるｐＬＪベクターおよびヒト副甲状腺ホルモン遺伝 子を使用する、組み換えレトロウィルスのベクターの構成の概略的表示である。

第４図は、表示する期間における、形質導入された繊維芽により産生されたヒト 副甲状腺ホルモンの量を表すグラフである。ダッシュ線は、組織培養平板上で形 質導入されｒ：ＮＩＨ３Ｔ３により産生を表す。実線は、ラットから誘導されそ して組織培養平板上で形質導入されｔ；繊維芽を表す。

第５図は、形質導入された繊維芽単独（黒くした円）あるいはサイト（ｃｙｔｏ ）３ビーズ上に被−しそして全面生長させた形質導入された繊維芽を注射したラ ットにおいて、表示した期間で、産生されｔ；ヒト副甲状腺ホルモンの量を表す グラフである。

及盟０田！１塁理 問題の遺伝物質を、線維芽生に組み込みそして生ずる遺伝子操作され−た線維芽 生で発現した。記載する方法により線維芽生に組み込まれる遺伝物質は、線維芽 生に通常存在しないＤＮＡまたはＲＮＡ：線維芽生に通常存在するが、生物学的 に有意なレベル（すなわち、それがエンコードするポリペプチドの通常の生理学 的作用を産生ずるために十分なレベル）でそれらの中に発現されないＤＮＡまた はＲＮＡ；線維芽生に通常存在しかつそれが線維芽生で発現されるように修飾さ れているＤＮＡまたはＲＮＡ；および単独であるいはそれらの任意の組み合わせ で、繊維芽により発現されるように修飾することができるＤＮＡまたはＲＮＡで あることができる。二の問題の遺伝物質はここにおいて組み込まれた遺伝物質と 呼ぶ。本発明の繊維芽は組み込まれた遺伝物質を発現する。本発明の繊維芽によ り発現された組み込まれた遺伝物質（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、単独 であるいは選択可能なマーカーをエンコードする遺伝子と組み合わせて、問題の ポリペプチドまたはタンパク質（問題の遺伝物質）をエンコードする遺伝物質で ある。

例えば、ホルモンをエンコードする遺伝物質は、組み換えゲノムを有するウィル スを含有する培地にそれらを暴露することによって（すなわち、それらを感染す ることによって）線維芽生に導入した。使用する培地は、産生体の細胞（例えば 、Ｐｓｉまたは両栄養性の産生体）を増殖した培地を収穫することによって得る 。すなわち、産生体の細胞は、組織培養において、１０％の仔ウシ選択可能なマ ーカー（Ｃ５）およびペニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベツコ 変性イーグル培地（ＤＭＥ）中で全面生長密度に増殖した。新鮮な培地を添力「 シ、そして引き統いて（例えば、はぼ１２時間後）、培地を収穫する。はぼｌＯ ｍＱの培地を全面産生体の細胞のｌｏｃｍの平板から収穫する。使用済みの培地 （またはウィルスのストック）は、０．４５ミクロンのミリポアフィルタ−で濾 過して分離した産生体の！Ｓ胞を除去し、そして直ちに使用して細胞を感染させ るか、あるいは−７０℃において貯蔵する。培地を繊維芽（受容体の繊維芽）の 全面以下（ｓｕｂｃｏｎｆ　Ｉｕｅｎｔ）の平板から除去し、そして８ｍｃｇ／ ｍｆｆのポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するウィルスのストック（例えば 、５ｍ４／１０ｃｍの平板）と急速に置換する。引き続いて（例えば、はぼ１２ 時間後）、これを除去し、そして新鮮な培地とＲ換する。こうして、使用する培 地はウィルスの上澄み液である。感染性ウィルスの組み換えゲノムは、問題の遺 伝物質を包含する。組み換えゲノムは、また、優生な選択可能なマーカーをエン コードする遺伝物質を有することができる。

こうして、生物学的に有意のレベルで通常発現されないポリペプチドおよび、必 要に応じて、優生な選択可能なマーカーを発現する繊維芽をつくる。

とくに、Ｐｓｉ　ａｍ細胞中で産生された感染性ウィルスを含有する培地に繊維 芽を暴露する：感染性ウィルスは問題の遺伝物質を有する組み換えゲノムを含有 する。１つの場合における組み換えゲノムは、副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）を エンコードする遺伝物質を包含する。必要に応じて、それは、また、優生な選択 可能なマーカーをエンフードする（例えば、ネオマイシン抵抗性をエンコードす るｎｅｏ遺伝子）を包含することができる。結局、繊維芽は形質導入される−一 すなわち、問題の遺伝物質（この場合において、ｂＰＴＨをエンコードするＤＮ Ａおよび、必要に応じて、ｎｅｏ遺伝子）は線維芽生に安定に導入する。形質導 入された繊維芽はエンコードされたｈＰＴＨを発現しそして、ｎｅ。

遺伝子が存在する場合、それを発現し、選択可能な特性を有する細胞を生ずる。

あるいは、繊維芽は感染性ウィルスを含有する培地への暴露の結果形質導入され 、ここで組み換えゲノムは次の１または２以上をエンコードするＤＮＡ： 低い密度のりボタンバク質のｊ；めの受容体；ヒト成長ホルモン； ヒスチジドナールに対する抵抗性を付与する遺伝子；ヒトアデノシンデアミナー ゼ： インターリューキン２の受容体； ヒトベーターグロブリン８ ヒトアルファーグロブリン： ジヒドロフオレートリダクターゼの突然変異体の形態：マルチドラグ（ｍｕｌ目 ｄｒｕｇ）抵抗性：ヒトからのグルコースセレブロシダーゼ；アデノウィルスか らのＥＩＡ遺伝子； ヒトにおけるＨＬＡのための多くの異なる遺伝子；ヒトアルブミン； ヒトオルニチントランスカルバマリアーゼ；Ｅ、ｃｏｌｉからのベーターガラク トシダーゼ；Ｅ、ｃｏＨにおけるネオマイシンに対する抵抗性；ヒトインスリン ：および モロ４−　（Ｍｏ　１ｏｎｅｙ）ネズミの白血病ウィルスからのエンベロープタ ンパク質。

組み込まれた遺伝物質を発現する繊維芽を、組織培養容器中に全面生長させ；そ れらが増殖した培養容器から除去し；そして体中に導入するか、あるいはそれに 適用する。それらは腹膜腔中に、単独でおよびコラーゲン被覆表面を有するマイ クロキャリヤービーズ上に被覆して（はぼ１００細胞／ビーズ）導入された。あ るいは、それらは皮膚移植片の１成分として、例えば、米国特許第４．４８５． ０９６号、その教示をここに引用によつて加える、に記載されているような方法 を使用して適用することができる。

組み込まれｌ二遺伝物質を発現する線維芽は、また、中枢神経系中に導入するこ とができる。これは、例えば、本発明の遺伝子操作された線維芽（すなわち、問 題の遺伝子を導入した線維芽）を定位的投与により脳の特定の領域に直接導入す ることによって実施することができる。それは、また、腰椎穿刺によるか、ある いは直接室中に脳を髄液中に導入し、これは髄膜に沿って線維芽を接種するであ ろう。

いったん体中に導入するか、あるいはそれに適用すると、形質導入された線維芽 は問題の遺伝物質によりエンコードされたホルモン、酵素または薬物を連続的に 供給する。記載する実施例において、エンコードされた産生物はｈＰＴＨである 。

このようにして供給されたホルモン、酵素または薬物の量は、必要に応じて変更 または調節することができる。これは、例えば、それらの産生に影響を及ぼす外 部のキューまたは因子を使用することによって；適用された移植片の大きさまた は体中に導入された線維芽の量を制御することによって；あるいは移植片を除去 することによって実施される。

線維芽は被検体から皮膚のバイオプシー（例えば、体の任意の区域からの小さい パンチバイオプシー）により得る。生ずる組織を組織培養培地中に入れ、そして 小さい片に分離する（例えば、メスを使用して組織を掻き裂くことによって）。

組織の小さい塊を組織培養フラスコの湿潤表面上に配置する；はぼ１０片を各フ ラスコ中に配置する。フラスコを逆さにし、密閉し、そして室温において一夜放 置する。室温において２４時間後、フラスコを倒立させる；組織の塊はフラスコ の底に固定して止まり、そして新鮮な培地［例えば、１０％のＦＢＳおよびペニ シリンおよびストレプトマイシンを有するハム（Ｈａ　ｍ）のＦ１２培地］を添 加する。次いで、これを３７℃においてほぼ１週間インキュベーションする。こ の時点で、新鮮な培地を添加し、そして引き続いて数日毎に交換する。培養にお いてさらに２週後、１層の線維芽が出現する。１層をＩ・リブシン処理し、そし て引っ掻いてより大きい全長の中に入れる。線維芽をほぼ５０世代の間培養する ことができる：はぼその時に、それらは発症（ｃ　ｒ　ｉ　ｓ　ｉ　ｓ）と呼ぶ ものを行い、そして引き続いて非常によく増殖しない。線維芽を引っ掻いて・よ り大きいフラスコにいれる（その上に再配置する）とすぐに、それらは後述する プロトコルに従い感染する。

レトロウィルスのベクター レトロウィルスはＲＮＡウィルスである；すなわち、ウィルスのゲノムはＲＮＡ である。しかしながら、このゲノムはＤＮＡ中間体に転写され、この中間体は感 染された細胞の染色体のＤＮＡ中に非常に、効率よく組み込まれる。この組み込 まれたＤＮＡ中間体をプロウィルスと呼ぶ。

第１図に示すように、レトロウィルスのゲノムおよびプロウィルスのＤＮＡは３ つの遺伝子を有する：ｇａｇ、ｐｏ１およびｅｎｖ、これらは２つの長い末端の 反復（ＬＴＲ）配列により７ランキングされている。

ｇａｇ遺伝子は内部の構造（ヌクレオカプシド）タンパク質をエンコードする； ｐａｌ遺伝子はＲＮＡ指令ＤＮＡポリメラーゼ（逆トランスクリプターゼ）をエ ンコードする：そしてｅｎｖ遺伝子はウィルスのエンヴエロープ糖タンパク質を エンコードする。５′および３′のＬＴＲはヴイリオンＲＮＡの転写およびポリ アデニル化を促進する。

５°　ＬＴＲに隣接して、ゲノムの逆トランスクリプターゼため（ｔＲＮＡプロ モーター結合部位）およびウィルスのＲＮＡの粒子中への効率よい泡膜のため（ Ｐｓｉ部位）に必要な配列が存在する。Ｍｕｌｌｉｇ包膜（また泡膜染性ヴイリ オン中へのレトロウィルスのＲＮＡのパッケージング）に必要な配列がウィルス のゲノムから失われる場合、ゲノムのＲＮＡの泡膜を防止するｃｉｓ欠損が生ず る。しかしながら、生ずる突然変異体はすべてのヴイリオンのタンパク質の合成 をなお指令することができる。ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）および共同研究者 らは、これらのＰｓｉ配列が欠失されているレトロウィルスのゲノム、ならびに 染色体中に安定に組み込まれた突然変異体を含有する細胞系を記載しｎｏｕｙｅ 　（編）、１５５　１７３　（１９８３）；Ｃｏｎｅ、Ｒ，Ｄ。

物の教示をここに引用によって加える。

ムリガン（Ｍｕ　Ｉ　１　ｉｇａｎ）８よび共同研究者が記載するＰｓｉ２細胞 系らは、捕食のモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウィルス（Ｍｏ−Ｍｕ ＬＶ）である、ｐＭＯＶ−Ｐｓｉ−でＮＩＨ３Ｔ３線維芽でトランスフェクショ ンすることによってつくった。ｐＭＯＶ−Ｐｓｉ−はウィルスの遺伝子産生物を 発現するが、ウィルスのゲノムの泡膜に必要であるＰｓｉ配列を欠く。ｐＭＯＶ −Ｐｓｉ〜は、マウス（および関連する１歯類）の細胞のみ上に存在する受容体 を認識する捕食のウィルスのエンヴエロープ糖タンパク質を発現する。

他の細胞系は、Ｐｓｉ−２一様パッケージング細胞系である、Ｐｓｉａｍ系であ る。これらのＰｓｉ−ａｍ細胞系は修飾したＰｓｉ−ゲノムを含有し、ここで捕 食のエンヴエロープ糖タンパク質は両栄養性ウィルス４０７０Ａから誘導された エンヴエロープ配列で置換されている。

Ｈａｒｔ　ｌｅｙ、Ｊ、Ｗ、およびＷ、Ｐ、Ｒｏｗｅ、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ、上９：１９−２５　（１９７６）、結局、それｓｉ　ａｍ細胞 系をつくために使用したレトロウィルスは非常に広い哺乳動物の宿主範囲（両栄 養性宿主の範囲）を有し、そしてヒト細胞の感染に使用することができる。組み 換えゲノムがＰｓｉパッケージング配列を有する場合、Ｐｓｉ　ａｍ細胞系は組 み換えレトロウィルスのゲノムを感染性レトロウィルスの粒子中にパッケージン グすることができる。

Ｃｏｎｅ、Ｒ，Ｄ、およびＲ，Ｃ，Ｍｕ　Ｉ　Ｉ　ｉｇａｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉ ｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃ ｅｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８１　：６３４９−６３５３　（１９８４）。

レトロウィルスのゲノムは、新しい遺伝子を細胞中に導入することができるベク ターとして使用するため、コーン（Ｃｏｎｅ）８よびムリガン（Ｍｕ　ｌ　ｌ　 ｉｇａｎ）により修飾された。第２図に示すように、ｇａｇｓＰＯｌおよ、びｅ ｎｖ遺伝子はすべて除去し、モしてｎｅｏ遺伝子をエンコードするＤＮＡセグメ ントをそれらの場所に挿入した。ｎｅｏ遺伝子は優生な選択可能なマーカーとし て働く。組み換えゲノムの部分を残すレトロウィルスの配列は、ＬＴＲ，ｔＲＮ Ａ部位およびＰｓｉパッケージング部位を包含する。Ｃｅｐｋｏ、Ｃ，ｅｔ　ａ ｌ−１立見±１．３７：　１０５３−１０６２　（１９８４）。

本発明の形質導入された繊維芽の産生に使用した追加のベクターの構成は第２図 に表されており、そして下に詳述する。

測的には、このベクターは２つの遺伝子を発現することができる二問題の遺伝子 および選択可能なマーカーとしてｎｅｏ遺伝子。

問題の遺伝子をＢａｍＨＩ中に５’　ＬＴＲに対してちょうど末梢にクローニン グし、切り継ぎ供与体部位および切り継ぎ受容体部位によりフランキングされて いる。２つの転写体はプロウィルスの転写から生ずる：未処理転写体は問題の遺 伝子を発現するが、「処理しｔ；」転写体はｎｅＯ遺伝子の発現を生ずるであろ う。

０（１９８７）に記載されている。このベクターは２つの遺伝子を発現すること ができる：問題の遺伝子および優生な選択可能なマーカー、例えば、ｎｅｏ遺伝 子。問題の遺伝子は直接の向きにＢａｍＨＩ／Ｓｍａ１／５ａｉｌクローニング 部位中に５’　ＬＴＲに対してちょうど末梢にクローニングするが、ｎｅｏ遺伝 子を内部のプロモーター（ＳＶ４０から）（これはクローニング部位より遠い３ °である）（クローニング部位の３′に位置する）に対して末梢に配置する。ｐ ＬＪからの転写は２つの部位において開始する：　ｌ）５’　ＬＴＲ，これは問 題の遺伝子の発現する原因となる、および２）内部のＳＶ４０プロモーター、こ れはｎｅｏ遺伝子の発現の原因である。

６）、簡潔的には、このベクターは２つの遺伝子の発現を誘導する：優生な選択 可能なマーカー、例えば、Ｎｅｏ、これは５’　ＬＴＲからちょうど下流に存在 する、および問題の遺伝子、これは高いレベルの構成的発現を行うことができる 内部のプロモーターからちょうど下流中にクローニングすることができる。いく つかの異なる内部のプロモーター、例えば、ニワトリからのベーターアクチンプ ロモーター（Ｃｈｏｕｄｏｒｙ、Ｐ、Ｖ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃ３ＨＳｙｍｐｏｓｉ ａ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌ、１．１０４７　（１９８ ６））、およびヒトからのヒストンＨ４プロモーター（）（ａｎｌｙ％　Ｓ、Ｍ 。

ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ ｙ％旦：３８０　（１９８５））を使用した。ｎｅｏ遺伝子の発現は、５°ＬＴ Ｈにおいて開始する転写からであるｉ問題の遺伝子の発現は、内部のプロモータ ーにおいて開始した転写からである。

Ｌミニ。この簡単なベクターにおいて、野生型ウィルスのｇａｇ％ｐｏ１および ｅｎｖの全体の解読配列を、発現された唯一の遺伝子である、問題の遺伝子で置 換する。ｐＥｍベクターの成分は後述する。５°フランキング配列、５’　ＬＴ Ｒおよび４００ｂｐの連続的配列ＣＢＡＭＨ１部位まで）はｐＺＩＰからである 。３°フランキング配列およびＬＴＲは、また、ｐＺＩＰからである；しかしな がら、３″ＬＴＲから１５０ｂｐ上流のｃｌａ部位はＢＡＭＨＩでリンカ−され ており、そしてベクター中に存在するＢａｍＨ１クローニング部位の他の半分を 形成する。

ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲ１断片はプラスミドの主鎖を形成 する。このベクターはモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウィルスの菌株 からクローニングした配列から誘導する。類似のベクターは、骨髄増殖性肉腫ウ ィルスから誘導された配列から構成した。

ＰＩＰ。このベクターは内部のプロモーターから誘導される単一の遺伝子を発現 することができる。これらの構成を下に要約する。５°フランキング配列、５’ 　ＬＴＲおよび１４００ｂｐの連続的配列を包含するベクターの５″区画（ｇａ ｇ領域中のｘｈｏ部位まで）は、野生型モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）白血病ウィ ルスの配列から誘導する。５ｈｉｎｎｉｃｋ　ｅｔ　ａｔ、、Ｎａｔｕｒｅ、２ ９３：５４３　（１９８１）。

２つの間の差は、５ａｃｌｌリンカ−がｇａｇ遺伝子のＡＴＧに直ぐに隣接する Ｈａｅ１１１１１１＠部位中にクローニングする。３１７ランキング配列、３° ＬＴＲおよび３°連続的配列を包含するベクターの３°区画（ｅｎｖ解読領域中 のｃｌａ１部位まで）はｐＺＩＰからである。しかしながら、２つの修飾が存在 する：１）ｃｌａ１部位はＢａｍＨＩに結合されている、および２）エンハンサ −を含む３’　ＬＴＲ中の小さい配列（Ｐｖｕｌｌ〜Ｘｂａ　Ｉ）が欠失されて いる。ベクターの５′および３°の架橋は、いくつかのプロモーターの１つであ る：各１つはｘｈｏｆ／ＢａｍＨＩ断片上に含有され、そして各々はほとんどの 組織中の高いレベルの構成的発現を行うことができる。これらのプロモーターは 、ニワトリからのベーターアクチンプロモーター（Ｃｈｏｕｄｏｒｙ、Ｐ。

トからのヒストンＨ４プロモーター（Ｈａｎｌｙ％　Ｓ、Ｍ、　ｅｔ　ａ２２か らのＨｉｎｄｌｌｆ／ＥｃｏＲＩ断片である。問題の遺伝子は、ＢａｍＨ１部位 中に部位−の向きに、内部のプロモーターからちょうど下流にクローニングした 。

ＲＯベクター。このベクターはベクターの異種群を表し、ここで問題の遺伝子は 転写に必要なすべての配列（すなわち、プロモーター／エンハンサ−、イントロ ンをもつおよびもたない解読配列、およびポリアデニル化シグナル）を含有し、 そしてその転写が正常のレトロウィルスの転写のそれに反対の方向である向きに レトロウィルス中に導入する。これは導入された遺伝子の調節において含まれる ｃｉｓ−作用要素のより多くを含むことを可能とする。事実上、前述の遺伝子の いずれをもＲＯベクターであるように適合することができる。１つの例はコーン （Ｃ。

ｎｅ）らにより記載され、ここで全体のベータグロブリン遺伝子を逆向きでｐＺ ｉｐのＢａｍＨ１部位中に部位−ニングする。Ｃｏｎｅ、Ｒ。

Ｄ、およびＲ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆｔｈｅ　 Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ８１　：　６３４９−６３５３　（１９８４）、ＲＯベクターを構成し、ここで 問題の遺伝子はｐｌｐのＸｈｏｌ／ＢａｍＨ１部位中にクローニングした（本質 的に内部のプロモーターを置換する）。

問題の遺伝子が挿入されたベクター、ならびに構成体を発現について試験したと き得られた結果を表１に示す。

表１　問題の遺伝子を含有するベクター表１ 機能のタンパク質　ベクター ｐＺｉｐ　ｐＬＪ　ｐＷｅ　ｐＥ＋ｅ　ｐｌＰ　ｐＲ。

ヒト成長ホルモン　３　３　３ ヒトＰＴＨ３３３３ ＬＤＬのヒト受容体　３３ ヒトアルブミン　３　２　１ ヒトオルニチントランスカルバミリアーゼ　１１ヒトアデノシンデアミナーゼ　 ３ インターリユーキン２の受容体　３３ ヒトベータグロブリン　３ ヒトアルフアグロブリン　３ 突然変異体ジヒドロ７オレートリダクターゼ　３　３　３マルチドラグ抵抗性　 ３ ヒトグルコースセレブロシダーゼ　３ ネオマイシン　３　３３３３ アデノウイルスからのＥＩＡ遺伝子　３Ｅ、ｃｏｌｉからのヒスチジノール″３ １：、ｃｏｌｉからの一ガラクトシダーゼ　３ヒトからのＨＬＡ　３ ヒトインスリン　３ モロネ−ＭＬＶ力）らの工ンヴエロープ　１３１構成した、発現について試験せ ず ２構成した、試験のとき発現なし ３構成した、検出された発現 選択可能なマーカーを包含するベクターは、第２ａ図、第２ｂ図および第２ｃ図 に表されている。第２ａ図において、ｐＺＩＰ　ｎｅｏ　ＳＶＸ、セプコ（Ｃｅ ｐｋｏ）により記載されている、を表す。Ｃｅｐｋｏ。

Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、、３７：１０５３　１０６２（１９８４）。

ここで、既知の技術を使用して、それらの間に問題の遺伝子が挿入された、切り 継ぎ供与体（ｓｐｌｉｃｅ　ｄｏｎｏｒ）および切り継ぎアクセブ）（ａｃｃｅ ｐｔ）、ＳＤおよびＳＡと記載する、が存在する。挿入した遺伝子の発現は未九 理のメツセージにおけるＬＴＲに基づく：処理したメツセージはネオマイシンの 発現の原因である。

第２ｂ図には、ベクターｐＬＪが表されている。ｐＬＪにおいて、問題の遺伝物 質は５″ＬＴＲ直後に挿入されている。この遺伝物質の発現はＬＴＲから転写さ れ、そしてｎｅｏ遺伝子の発現は内部のＳ’Ｖ４０プロモーターから転写される 。

第２ｃ図において、ｐＷｅが表されている。ＬＴＲプロモーターおよび転写体は ネオマイシンの発現の原因となり、そして内部のプロモーターは問題の遺伝子の 発現の原因となる。この型のベクターにおいて有用なプロモーターは、ニワトリ のベーターアクチン、ヒトヒストン、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、ｔｈｙｌ （Ｔ細胞において使用する組織特異的プロモーター）およびラットアルブミンか ら誘導されたプロモーターを包含する。

選択可能なマーカーをもたないベクターは、また、線維弁を問題の遺伝物質で形 質導入するｔ；めに使用することができる。ベクターは、このようなマーカーが 存在する、前述のベクターの基本的な筒素化されたものである。ベクターｐＥｍ はは第２ｄ図に表されている：表されているように、ベクターの主要な成分は５ ′および３’　ＬＴＲ，および２つのＬＴＲの間に挿入された問題の遺伝物質で ある。ｐｌｐは、内部のプロモーターが存在する、ｌ系列の有用なベクターを表 す。第２ｅ図に表されるように、内部のプロモーターをフランキングする各末端 においてＬＴＲが存在する；これらのベクターにおいて有用なプロモーターは、 ニワトリのベーターアクチン、ヒトヒストン、単純＾、ルペスチミジンキナーゼ およびｔｈｙｌを包含する。

線維夢中の遺伝物質の導入および遺伝物質の発現の評価組み換えゲノムを有する 組み換え両栄養性レトロウィルスを産生ずる細胞系を使用して、線維弁を感染さ せる。前述したように、組み換えゲノムは種々の成分を包含することができるが 、一般に２つのＬＴＲおよび、ｇａｇの代わりに、ｐｏ＋およびｅｎｖ配列、第 ２プロモーター配列および、ある場合において、選択可能なマーカーをエンコー ドする遺伝子（例えば、ｎｅｏ）から構成される。

問題の遺伝物質を線維夢中に導入するために使用するウィルスのストックを、前 述したように、収穫し、８　ｐ　ｇ／ｍＱ　（ｍｅ　ｇ／ｍｌ２）のポリブレン （Ａｌｄｒｊｃｈ）を補充し、そして線維弁の培養物に添加する。

ウィルスの力価が高い（例えば、はぼ１０’ｃ　ｆ　ｕ／ｍ！！　）である場合 、事実上すべての線維弁は感染され、そして選択（例えば、組み換えゲノムを包 含するベクターが導入された線維弁の選択）は必要ではない。力価が非常に低い 場合、選択可能なマーカー、例えば、ｎｅｏまたはｈｉｓを有するレトロウィル スのベクターを使用することが必要である。選択可能なマーカーを使用する場合 、ウィルスの発現後、細胞を全面生長させ、そして選択的培地に分割する（例え ば、選択可能なマーカーがｎｅｏである場合、培地はＧ４１８を含有し、選択可 能なマーカーがｈｉＳである場合、培地はヒシツジノールを含有しそしてヒスチ ジンを含有しない）。

ｎｅｏ遺伝子がトランスポゾンＴｎ５から誘導されたバクテリアの遺伝子であり 、これはバクテリア細胞中でネオマイシン抵抗性をエンコードし、モして哺乳動 物細胞中で抗生物質Ｇ４１８に対する抵抗性をエンコードする。このｎｅｏ遺伝 子は優生な選択可能なマーカーとして作用する；哺乳動物細胞中のその存在はそ の細胞をＧ４１８の存在下に増殖するものに変換する。（それが存在しない場合 、細胞はＧ４１８の存在下に死亡する。）結局、哺乳動物細胞中のこの遺伝子の 存在はＧ４１８を含有する培地中で細胞を培養することによって決定することが できる。

この組み換えゲノムを有する組み換えレトロウィルスは、ｎｅｏウィルスと呼ぶ 。

ｎｅｏ遺伝子を有する組み換えレトロウィルスのベクターは、また、クローニン グ部位を有する。結局、問題の遺伝物質はベクター中に導入し、線維夢中に組み 込み、そして組み換えレトロウィルスで形質導入された線維弁により発現するこ とができる（組み込まれた遺伝物質を有する線維弁と呼ぶ）。

ＢａｍＨＩクローニング部位において、問題の遺伝物質を挿入することができる 。問題の遺伝物質は、線維夢中に通常存在しないＤＮＡ：線維夢中に通常存在す るが、生物学的に有意なレベル（すなわち、それをエンコードするポリペプチド の通常の生理学的作用を生成するために十分なレベル）でそれらの中に発現され ないＤＮＡまたはＲＮＡ１線維芽中に通常存在しかつそれが線維夢中で発現され るように修飾されているＤＮＡまたはＲＮＡ、および単独であるいはそれらの任 意の組み合わせで、線維弁により発現されるように修飾することができるＤＮＡ まｊ；はＲＮＡであることができる。

副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）をエンコードする遺伝子のコピーを、次の方法で 、この部位（例えば％ＰＬ’）中にクローニングした：ｐＬＪプラスミドをＢａ ｍＨＩで消化し、引き続いて酵素の仔つシ腸ホスファターゼで処理する。この後 、直線のベクターをアガロースゲルで分画し、そして、ガラスピーズを使用して 、精製した。さらに、ヒトＰＴＨ遺伝子を含有するＢａｍＨＩ断片を、ｐＢＲ３ ２２中にクローニングしたヒトＰＴＨの完全なｃＤＮＡを含有するする、へンデ イイ（Ｈｅｎｄ、ｙ）らが記載するプラスミドから調製した、Ｈｅｎｄｙ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａ ｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、ヱ８　：　７３６５−７３ ６９　（１９８１）。

１７ｂｐの５′非非翻訳列、すべての解読配列および３１ｂｐの３′非非翻訳列 を含有する、ＰＴＨｃＤＮＡの下位（ｓ　ｕ　ｂ）断片を、最初のプラスミドを ＤｄｅｌおよびＨｉｎｆｌで消化し、モして６００ｂｐの断片を分離することに よって分離した。この断片の末端をＤＮＡポリメラーゼで処理し、リセスド（ｒ ｅｃｅｓｓｅｄ）末端中に充填した。

ＢａｍＨＩリンカ−を平滑末端にＴ４　ＤＮＡリガーゼで結合した。上からの結 合混合物をＢａｍＨｒで消化して、真性のＢａｍＨＩ制限断片を発生させｔ；。

次いで、これはｐＢＲ３２２のＢａｍ１（１部位中にサブクローニングし、これ をベクターの構成においてｈＰＴＨ源として使用する。

等しい量のｐＬＪ直線の主鎖およびＢａｍＨＩ　ＰＴＨ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガ ーゼの存在下に、−緒に添加しｔ；。生ずる混合物を２つの断片の結合のｔ；め に適当な条件下に維持した。結合混合物を使用して、バクテリアのＨＢＩＯＩを 形質転換し、次いでこれをカナマイシンを含有する寒天上に配置した。Ｍａｎｉ ａｔｉｓ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｒｙｓ　ｐｐ２５０　２５１％　５０４；Ｂｏ ｌｉｖａｒ、Ｆ、およびＫ。

ＢａｃｋｍａｎＳＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌＲ。

Ｗｕ、（編）、Ｖｏｌ、６８、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ニューヨーク （１９７９）。生ずるコロニーを組み換えプラスミドについて分析した。

副甲状腺ホルモンは、体におけるカルシウムの調節において１つの役割を有する ポリペプチドである。ｈＰＴＨ遺伝子はヒト線維夢中に存在するが、それは生物 学的に有意のレベルでそれらの細胞中で発現されない。副甲状腺ホルモン、例え ば、ｈＰＴＨ，またはこのような細胞により通常生物学的に有意のレベルでつく られない他の物質をつくることができる線維弁は、個体に移植し、そしてホルモ ン、または他の物質のための連続的供給系として働く。

この物質はｈＰＴＨを参照して記載するが、記載する方法を使用して、任意の遺 伝子を線維夢中に導入することができ、そして細胞によるその発現は同様な方法 で評価することができる。説明するように、表１に列挙したタンパク質または機 能をエンコードするＤＮＡはレトロウィルスのベクター中にクローニングし、そ して多くの場合において、同様な方法で線維夢中に導入し、そして形質導入した 細胞により発現することができる理解すべきである。

ｈＰＴＨをエンコードするＤＮＡおよび選択可能なマーカーをエンコードするＤ ＮＡ　（例えば、ｎｅｏ遺伝子）を含有する、組み換えウィルス構成体を産生す るＰｓｉ　ａｍ細胞系を使用して、前述したように、ウィルスのストックを産生 じた。ウィルスのストックを収穫した；ｈＰＴＨ遺伝子を含有するウィルスで形 質導入すべき線維弁を、このストックとともにインキュベーションした。この場 合において、選択可能なマーカーを使用して、Ｇ４１８を含有する培地上で培養 することによって、形質導入した線維弁を同定および選択する。ウィルスの力価 が十分に高い場合、本質的にすべての線維弁が、選択可能なマーカーおよび適当 な培地を使用して、感染および選択されることは必要ではない。

本発明により方法でｈＰＴＨをエンコードするＤＮＡで形質導入した、ウィスタ ー（Ｗｉｓｔａｒ）ラットからの倍数（ｄ　ｉ　ｐ　１　ｏ　ｉ　ｄ）線維弁は 、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マリイランド州ロックビレ ）に受け入れ番号ＣＲＬ９５１４で受託された。ｈ　ＰＴＨ遺伝子を有する組み 携えレトロウィルスで形質導入された線維弁がｈｐＴＨ遺伝子を発現する能力は 、生体外および生体内の両者で、評価した。

生体外の評価は次のようにして実施した：ｈＰＴＨ遺伝子を含有するウィルスで 感染させ、そしてネオマイシン中でウィスタ＝（Ｗｉｓｔａｒ）ラットから確立 した線維弁（ＦＷＲ）の二次培養により選択した、ＮｒＨ３Ｔ３細胞によるｈＰ ＴＨの生体外産生を評価した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ニワトリ胚から誘導し、そ して生体外の選択的培養によ永久分裂のを与える。ＦＷＲ細胞をラット（Ｗｉ　 ｓ　ｔ　ａ　ｒ）のシンジエネイツク薗株から体外移植組織から誘導した。細胞 は制限した半減期を有し、そして二次培養物と呼ぶ。

両者の型の細胞は、前述したように、ウィルスで前に感染させそして選択された ものであった。選択後、細胞の各型をｌｏＣｍの皿に接種し、そして全面生長さ せた。次いで、新鮮な培地（１０％のＣ５尾ペニシリンおよびストレプトマイシ ンを有するＤＭＥ）を添加した；この時点を引き続いて時間ゼロと呼ぶ。引き続 く時間において、培地のアリコートを収穫し、そして凍結した。２４時間の終わ りにおいて、すべての培地を細胞から除去し、そしてインキュベーター中に戻し た；１２時間後、追加のアリコートを組織培養物中のヒトＰＴＨの不安定性の分 析のｔ；めに取った。

アリコートをｈＰＴＨの存在について、完全なｈＰＴＨを測定するラジオイムノ アッセイ（Ｎｉｃｈｏｌｓ）を使用して分析した。技術は次の文献に記載されて いる：血清中のヒトの完全な副甲状腺ホルモンの定量的決定のためのＡＩ　ｌｅ ｇｒｏ■完全なＰＴＨ／イムノアッセイ系（Ａｌｌｅｇｒｏ＠Ｉｎｔａｃｔ　ｈ ＰＴＨ／Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｑｕａｎｔ ｉｔａｔｉｖｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｎｔａｃ ｔ　Ｐａｒａｒｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ）　、（Ｎｉ ｃｈｏｌｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カリフォルニア州す ンジュアンカピストラノ）（３６Ｂ−２１７０、有効７／８６改訂）、その教示 をここに引用によって加える。アッセイはほぼｌｎｇ／ｒ１２血清の感度を有し 、そしてそれはラットｈＰＴＨと交差反応しないことにおいてヒトＰＴＨに対し て特異的であることが示された。実験の結果を、ＲＩＡにより測定したｈＰＴＨ の経時的産生としてプロットする。結果を第４図に示す。

感染させそして選択したウィスター（Ｗｉ　ｓ　ｔ　ａ　ｒ）う・ノドの線維弁 をサイトデックス（Ｃｙｔｏｄｅ、ｘ）ビーズ上に接種した後、同一の分析を、 まｔ；、実施した。細胞をビーズ上で全面以下であるとき、新鮮な培地を添加し た；アリコートを取り、そしてＰＴＨの産生速度を測定しｔ；。これらの条件下 に、産生速度は組織培養プラスチック上の組織培養物中で測定したものの２倍で あった。両者の場合において、評価期間の終わりにおいて、細胞をトリプシン処 理により収穫し、そして計数した。

生体内評価は次のようにして実施した：はぼ２ＸｌＯ’の操作しｔ；線維弁を、 シンジエネイツクラ・シトの腹膜腔中に、単独であるいはサイトテックス３マイ クロキヤリヤのビーズ上で全面生長後、注射した。リン酸塩緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ ）またはビーズ単独のみを、類似する量で、腹膜腔中に注射しｔ；ラットを対照 として使用した。対照ラットにＰＢＳ単独を腹腔内（ＩＰ）に注射した。第２の 対照には、ヒトＰＴＨを発現する２Ｘ１０’ＦＷＲ細胞をＩＰ注射した：それら をＰＢＳ中の懸濁液で投与した。他の細胞ラットに、３００ｍｇのサイトデック ス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）３ビーズ単独（すなわち、細胞をもたない）を与えた。第 ４のラットには、２Ｘ１０’細胞に相当する、ＦＷＲＰＴＨ細胞で被覆したサイ トデツクス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）のほぼ１５０ｍｇを与えｔ；。第５のラットには 、ＦＷＲ線維芽（はぼ２〜３×１０’細胞）で被覆しＩ；ビーズのほぼ２００ｒ ｎｇを投与しｔ；。注射時間はＴ−０と呼ぶ。

形質導入された線維弁の移植は、ｈＰＴＨについて特異的なイムノアッセイを使 用して、受容体の血液中のｈＰＴＨの存在を決定することによって評価した。

すべての動物において、第１測定はＴ−３時間（注射後３時間）において得た。

これはほぼｌ／２ｍ１２の血液を動物の各々の尾の静脈を通して得ることによっ て実施した。次いで、血液を凝固させ、そして血清を前述のニコルスのラジオイ ムノアッセイによりｈＰＴＨについて分析した。これを反復した；種々の時間に おいて、はぼ１／２ｍ４の血液を、ラットの尾の静脈切開により採取し、モして ｈＰＴＨについて分析した。

これらの決定の結果を表中に示す。また、これらの動物における血清カルシウム レベルの結果を表に示す。

この評価の結果を第５図に表す。形質導入された線維弁の単独の注射後３時間以 内に、６ピコグラム（ｐｇ）のｈＰＴＨが受容体の血清の１ｍＱにつき検出され た。（正常のヒト血清ＰＴＨレベルはｌＯ〜５０ｐｇ／ｍＱの範囲である。）ビ ーズ上の形質導入された線維弁の単独の注射後３時間以内に、ｌ　２０　ｐ　ｇ ／ｍａまたはｌ　７５　ｐ　ｇ／ｍＱ血清のｈＰＴＨレベルが検出された。表に また示すように、ｈＰＴＨ遺伝子を含有する形質導入された線維弁を注射したラ ットは高カルシウム血症とならなかった。生体外の実験はｈＰＴＨがラットの組 織中で活性であることを示唆するので、これは期待されない。１つの可能な説明 は、反調節機構が活性化された（すなわち、カルシトニン）ことである。

結局、形質導入された線維弁は、線維弁により通常生物学的に有意のレベルで分 泌されない副甲状腺ホルモンを分泌しそして、さらに、それらはこのホルモンを 生理学的（またはそれより大きい）濃度で分泌することができることが実証され た。ヒト副甲状腺ホルモンを分泌する線維弁の移植（ここで、腹膜腔中への）は 、レトロウィルスにより線維弁へ与えられた表現型の変化（すなわち、ｈＰＴＨ の分泌）は受容体において系統的に検出されることを実証した。同様な方法にお ける、形質導入された線維弁を上皮小体切除へ投与するこきは、さらに、産生さ れたｈＰＴＨの有効性をさらに実証する。

こうして、本発明の１つの実施態様において、線維弁はレトロウィルスのベクタ ーを使用して形質導入し、ここで組み換えゲノムは問題のＤＮＡおよび、必要に 応じて、優生な選択可能なマーカーをエンフードするＤＮＡを包含する。形質導 入されｔ；線維弁を分離し、そして十分な数に増殖する。それらを受容体中に移 植すること（例えば、腹膜腔中に、中枢神経系中に）により導入する。あるいは 、線維弁を同様に形質導入し、分離し、増殖させ、次いでマトリックスに接合ま たは結合する。このアプローチは、長期（数週以上）の移植を望むとき、とくに 有用である。使用するマトリックスは、記載するように、支持体、例えば、マイ クロキャリヤーのビーズ、とくにコラーゲン被覆しＩ；マイクロキャリヤーのビ ーズであることができる。マトリックスは事実上任意の適当な大きさの固体のマ トリックスであることができる。形質導入された線維弁を含有する皮膚移植片を 適用することができる。

ｈＰＴＨ以外のポリペプチドをエンコードする遺伝物質の導入ｈＰＴＨ以外のポ リペプチドをエンコードする遺伝子は、また、レトロウィルスのベクターにより 線維夢中に導入することができる。例えば、ヒト成長ホルモン（ＨＧ）ｆ）をエ ンコードする遺伝子まｔ；はインスリンをエンコードする遺伝子は、線維夢中に 導入することができる。このような遺伝子は、単独であるいは選択可能なマーカ ー、例えば、ｎｅｏ遺伝子と組み合わせて、線維夢中に導入することができる。

ＨＧＨは通常視床下部によってのみ分泌される。インスリンは血液流中のグルコ ースレベルを調節するポリペプチドである。

これらの遺伝子、ならびに他の遺伝子（例えば、上に列挙したもののあるもの） を、ｈＰＴＨ遺伝子について前述したのと同一の方法で線維夢中に導入し、そし て生ずる形質導入された線維弁を体の適当な部位上に移植することができる。

ポリペプチドをエンコードする遺伝物質の導入における他の優生な選択可能なマ ーカーの使用 ｎｅｏ遺伝子以外の優生な選択可能なマーカーを使用して、遺伝物質を線維夢中 に導入することができる。例えば、Ｈｉｓ　Ｄ遺伝子をこの目的で使用すること ができる。Ｈｉｓ　Ｄ遺伝子サルモネラ属（Ｓａｔｍｏｎｅ　１１　ａ）からバ クテリアの遺伝子である、そしてヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、すなわち、 ヒスチジノールをヒスチジンに転化するポリペプチドをエンコードする。ヒスチ ジンは必須アミノ酸である：ヒスチジノールはヒスチジンのアルコール類似体で あり、そして適切な代謝条件下にヒスチジンに転化することができる。細胞をヒ スチジノールを含有するが、ヒスチジンを欠く培地中で増殖される場合、Ｈｉｓ Ｄ遺伝子はヒスチジノールをヒスチジンに転化することができる。ヒスチジンは それらの機能にとって必須であるので、Ｈｉｓ　Ｄ遺伝子を有する（そしてこう してヒスチジンをつくることができる）は生き残り、そしてその遺伝子を欠くも のは生き残らないであろう。

Ｈｉｓ　Ｄ遺伝子を有するレトロウィルスのベクターを使用して、ケラチノサイ トを感染させた。Ｈｉｓ　Ｄ遺伝子を含有するケラチノサイトは、ヒスチジンを 欠くが、ヒスチジノールを含有する培地中°でこれらの細胞を増殖することによ って選択した。期待するように、Ｈｉｓ　Ｄ遺伝子を有するケラチノサイトはコ ロニーを形成し、そして全面生長した。場合、このような細胞は、ｎｅｏ遺伝子 が含まれるものより非常に高い頻度で発生した。これらの同一技術は、問題のＤ ＮＡを含有する線維弁の選択において有用である。

この仕事の結果として、また、独立の優生な選択可能なマーカー（例えば、ｎｅ ｏ遺伝子およびＨｉｓ　Ｄ遺伝子）を新しい遺伝物質中に導入することができる 。２つの異なるサブユニットを有するポリペプチドの場合において、例えば、別 の優生な選択可能なマーカーを使用して、２つのサブユニットをエンコードする 遺伝情報を導入することができる。

さらに、２またはそれ以上の優生な選択可能なマーカーは、特異的に切断または 処理して活性きさせることが必要なポリペプチド（例えば、インスリンおよび副 甲状腺ホルモン）の場合において、使用することができる。必要な処理する酵素 をエンコードする遺伝子は、このような処理を必要とする副甲状腺ホルモンをエ ンコードする遺伝子と一緒に導入することができる。これは線維弁がその副甲状 腺ホルモンを処理することができるようにするであろう。

問題の遺伝物質の線維夢中に導入するための他のベヒクルまた、レトロウィルス 以外のベヒクルを使用して、線維弁を遺伝子操作または修飾することができる。

問題の遺伝物質を、このような細胞中で新しい遺伝物質を発現することができる 、任意のウィルスにより線維夢中に導入することができる。例えば、ＳＶ４０． ヘルペスウィルス、アデノウィルスおよびヒト乳頭腫ウィルスはこの目的に使用 することができる。

問題の遺伝物質の他の型の細胞中への導入本発明の方法を使用して、また、問題 の遺伝物質を他の型の細胞中に導入することができる。この方法を使用して、問 題の遺伝物質を系中に導入し、ここで細胞を組織から収穫することができ、組織 培養物を固体マトリックス上で増殖させ、そしてレトロウィルスを感染させるこ とができる。問題の遺伝物質は、まｔ；、中枢神経系中に組み込むことができる 。例えば、それは線維夢中に導入するか、あるいはダリア細胞または神経廖細胞 、これらは中枢神経系および末梢神経系の非ニューロンである、中に導入するこ とができる。形質導入された細胞は受容体の動物中に導入することができる。こ れは直接層の特定の領域中への定位的投与により、あるいは脳を髄液中に導入す ることによって実施することができる。中枢神経系において、ダリア細胞は、乏 突起膠細胞、星状細胞、脳室上衣細胞および小ダリア細胞を包含する。末梢神経 系において、それらは神経節細胞の衛星細胞および末梢神経線維の神経線維鞘（ またはシュヴアン）細胞を包含する。

問題の遺伝物質、例えば、プリンサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）酵素のハイポキ サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）は、ＨＰＲＴ の遺伝欠損を補正する目的でダリア細胞中に導入することができ、この欠損はレ ッシューナイハン症候群、すなわち、多数のＣＮＳ異常性をもつ破壊的な遺伝病 を生ずる。それは、また、中枢神経系中に導入して、例えば、変性病（例えば、 神経増殖因子をエンコードする遺伝物質を導入することにより）、パーキンソン 病（例えば、ＤＯＰＡ合成酵素をエンコードする遺伝物質を導入することにより ）および「異常の」遺伝子により引き起こされる遺伝疾患（例えば、繰うつ病） を処置または防止することができ、ここで異常な遺伝子は置換し、その機能を補 正するか、あるいは反対作用するか、あるいはエンコードされた産生物の産生を 変更することができる。

問題の遺伝物質は、また、内皮細胞中に導入することができ、ここで内皮細胞は 漿液の膜を覆い、そして心臓、血管、リンパ節および前眼房をライニングする。

問題の遺伝物質、例えば、ｈＰＴＨはこのような細胞中に導入して、血流中への その供給を促進することができる。

組み込まれた遺伝物質を有する線維弁および他の細胞の使用本発明により、線維 弁が通常線維夢中で生物学的に有意のレベルで産生されないポリペプチドおよび タンパク質を産生じ、そしてそれらを血流まｔ；は体の他の区域、例えば、中枢 神経系中に分泌するような方法で、線維芽を遺伝子操作することができる。この ようにして形成した線維芽は、連続的な薬物の供給系として働いて、必要な物質 の周期的投与（摂取、注射などにより）を必要とする現在の養生法を置換するこ とができる。

例えば、現在の時点で、膵臓から分離し、高度に精製し、次いでインスリンの産 生または利用が障害されるものにより体中に注射しなくてはならないインスリン を、本発明により、連続的に供給することができる。

このようにして、インスリンは連続的薬物供給系を経て体中に導入するすること ができ、そして、結局、インスリンの毎日の注射の必要性はな遺伝子操作された 線維芽は、また、凝固因子の産生に使用することができる。血友病は凝固に参加 する因子ＩＩＩと呼ばれるタンパク質を欠く。因子ＩＩＩは、現在、注射により 投与される。因子ＩＩＩをエンコードする遺伝子を有する線維芽を使用して皮膚 移植片を作り、ここで遺伝子は因子ＩＩＩを産生する；皮膚移植片として、組織 は因子を血流中に分泌するであろう。

問題の遺伝物質を線維芽および他の型の細胞中に組み込むことは、遺伝病処置お よび後天性の病気の処置においてとくに価値がることがある。

遺伝病の場合において、このアプローチを使用して、代謝シンク（ｓｉｎｋ）と して使用することができる、遺伝的に修飾された線維芽および他の細胞を提供す る。すなわち、このような線維芽は潜在的に毒性の物質を分解する働きをするで あろう。例えば、これは尿サイクルの疾患の処置において使用することができる であろう。体により通常産生される産生物（例えば、酵素またはホルモン）は産 生されないか、あるいは不十分の量でつくられる遺伝病の処置において、本発明 の線維芽することができる。ここで、失われるか、あるいは不適切に産生される 物質をエンフードする遺伝子で形質導入された線維芽を使用して、それを十分な 量で産生ずることができる。例えば、これはアルファーｌ抗トリプシンを産生に おいて使用することができる。それは、また、因子ＶＩＩＩおよび因子！Ｘの産 生物において使用することができ、こうして血友病の処置において宵月であろう 。

遺伝子操作された線維芽（すなわち、問題の遺伝物質で形質導入された線維芽） を使用して処置を与えることができる、多くの後天性病気が存在する。例えば、 慢性病において普通に存在し、そしてしばしば慢性病腎臓疾患（例えば、血液透 析患者において）に関連する、貧血の処置において、このような細胞を使用する ことができる。この場合において、エリスロポイエチンをエンコードする遺伝子 を中に組み込んで有する線維芽は、骨髄腫を刺激して赤血球生成（すなわち、赤 血球の産生）により貧血を補正するであろう。

本発明の線維芽を使用して、また、活性化として低い投与量の組織プラスミノゲ ン活性化剤を投与することができる。この場合において、ＴＰＡをエンコードす る組み込まれた遺伝物質を有する線維芽を、血栓の防止を望む個体中に移植する 。これは、例えば、普通の疾患、例えば、冠状動脈の病気、脳血管の病気、末梢 血管の閉塞、静脈（例えば、表面）の血栓症、例えば、肺動脈の塞栓、または深 い静脈の血栓に対する予防として有用であろう。カルシトニンをエンコードする ＤＮＡを含有する線維芽は、現在カルシトニンを皮下投与する、バグエツト病、 骨の代謝の進行性の、慢性疾患の処置において使用することができる。

遺伝子操作された線維芽を有する皮膚移植片のための他の用途は、産児調節であ る。試験は、現在、受胎能の調節において黄体化ホルモン遊離促進ホルモン（Ｌ 　ＨＲＨ）と呼ぶポリペプチドホルモンを使用するアンダーウェイ（ｕｎｄｅｒ ｗａｙ）である。ＬＨＲＨの連続的投与は無菌の個体を生ずる：投与を停止する とき、個体は再び出産可能である。

ＬＨＲＨの注射または経口的薬物処置を取るよりむしろ、ＬＨＲＨを連続的に分 泌する小さい移植片を有して同一の効果を与える。受胎能を再び獲得しようとす る場合において、この移植は切除することができるであろう：ポリペプチドのホ ルモンの供給は停止するであろう。

インターリューキン（例えば、ＩＬ−１，ＩＬ−２、ＩＬ−３）を産生および分 ｉするように遺伝子操作された線維芽は、いくつかの場合において使用すること ができる。例えば、現在使用されている治療のあるもの（例えば、化学的治療） の結果は、しばしば骨髄の直接の抑制により引き起こされる、好中球減少の誘発 （血液中の異常に低い数の好中球おいて使用される、事実上すべての化学的治療 剤、ならびにＡＺＴは好中球減少を生ずる。この条件は多数の生命に危険を及ぼ す感染を生ずる。

これらの場合において、例えば、ＩＬ−３をエンコードする遺伝物質を含有する 線維芽の移植によりＩＬ−３の投与を使用して、好中球の計数を増加することが できる。さらに、血小板の産生を刺激するトロンボボイエチンは、血小板の計数 が低い多数の状態の処置において使用することができる。この場合において、ト ロンポボイエチンの遺伝子で形質導入された線維芽は個体に適用することができ る：エンコードされた産生物の産生および分泌は、血小板の産生を刺激する。

組み込まれた遺伝物質を有する線維芽の他の関係する適用は、エイズ（ＡＩＤＳ ）の処置においてである。インターリューキン２およびインターリューキン３は 、免疫系を刺激し、エイズの処置において潜在的に価値がある。それらは、これ らの２つのポリペプチド（これらは現在周期的注射により投与される）を産生ず るように遺伝子操作した線維芽を有する皮膚移植片により供給することができる 。

本発明の他の使用は、酵素欠損病の処置においてである。この場合において、線 維夢中に導入されｔ；遺伝子によりエンコードされる産生物（ポリペプチド）は 分泌されない；むしろ、それは細胞の内側に残留する酵素である。個体が特定の 酵素を欠き、そして種々のアミノ酸または他の代謝物を代謝することができない 、遺伝病の多数の場合が存在する。これらの酵素のＩ；めの正しい遺伝子は、皮 膚移植片中に導入することがでさる；次いで、転写はその代謝の機能を実施する であろう。例えば、作用されたものが酵素のアデノシンデアミナーゼ欠く遺伝病 が存在する。

この酵素はプリンの尿酸への分解において含まれる。皮膚移植片を適用した区域 を血液が通過するとき、失う酵素を血液を解毒するために十分に高いレベルで産 生ずることができる皮膚移植片を、本発明を使用して、産生ずることができるで あろう。

本発明は、まｔ；、獣医学の適用を有する。例えば、そうでなければ、動物の飼 料中に組み込まれ、動物の水に添加するか、あるいは周期的に（例えば、毎日ま たはそれより低い頻度で）注射することによって供給される、物質、例えば、薬 物（例えば、抗生物質）８よびホルモンの供給において、本発明を使用すること ができる。本発明の修飾された線維芽の使用は、修飾された細胞から形成された 組織を動物に適用することができ、そして進行する基準でエンコードされたタン パク質の量を提供し、こうして物質の毎日の／周期的投与の必要性を排除するこ とができるという利点を有する。

盃！他叉旦鴬 本発明は、ホルモン、酵素および薬物が必要な、ヒトを包含する哺乳動物にこの ような工業的適用性を有する。、倒えば、本発明は、そうでなければ静脈内、中 間体まｔ；は皮下に投与されるホルモンを連続的に供給するために使用すること ができる。本発明は、延長しｔ；期間の間必要である、このような物質、例えば 、ホルモン（例えば、副甲状腺ホルモン、インスリン）の提供においてとくに価 値がある。

同等の実施態様 当業者は口常の実験を使用して、ここに詳しく記載した本発明の特定の実施態様 に対する多くの同等の実施態様を認識するか、あるいは確認することができるで あろう。このような同等の実１Ｍ８様は、以下の請求の範囲の範囲に包含される ことを意図する。

端間（時間） 還才へ可能なマーカーとも２べ７ター Ｇ ヒト　ＰＴＨ（ｐｇ／ｍ１．） 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成２年３月８日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０３０８９ ２、発明の名称 形質導入した線維芽およびそれらの使用３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国マサチュセツツ州０２１４２ケンブリッジ・ナインケン ブリッジセンター（番地なし）名　称　ホワイトヘッド・インスチチュート・フ ォー・バイオメディカル・リサーチ　（ほか１名）４、代理人　〒１０７ 住　所　東京都港区赤坂１丁目９番１５号５、補正書の提出年月日 １９８９年９月２１日 ６、添付書類の目録 （１）　補正書の写しく翻訳文）　１通（２）補正の説明　１通 両栄養性ウィルスは、広い宿主ｉ？ｉ囲を有しかつ相Ｈ＃上ｒメ里矯の面去の物 の教示をここに引用によって加える。

ムリガン（Ｍｕ　］　Ｉ　ｉｇａｎ）および共同研究者らが記載するＰｓｉ２細 胞系は、捕食のモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウィルス（Ｍｏ−Ｍｕ ＬＶ）である、ｐＭＯＶ−Ｐｓｉ−でＮＩＨ３Ｔ３線維芽でトランスフェクショ ンすることによってつくった。ｐＭＯＶ−Ｐｓｉ−はウィルスの遺伝子産生物を 発現するが、ウィルスのゲノムの泡膜に必要であるＰｓｉ配列を欠く。ｐＭＯＶ −Ｐｓｉ−は、マウス（および関連する替歯類）の細胞のみ上に存在する受容体 を認識する捕食のウィルスの工ンヴエローブ糖タンパク質を発現する。

他の細胞系は、Ｐｓｉ−２一様パッケージング細胞系である、Ｐｓｉａｍ系であ る。これらのＰｓｉ−ａｍ細胞系は修飾したＰｓｉ−ゲノムを含有し、ここで捕 食のエンヴエロープ糖タンパク質は両栄養性ウィルス４０７０Ａから誘導された エンヴエロープ配列で置換されている。

らは両栄養性宿主範囲をもつ組み換えウィルスの産生に有用である。Ｐｓｉ　ａ ｍ細胞系をつくために使用したレトロウィルスは非常に広い哺乳動物の宿主範囲 （両栄養性宿主の範囲）を有し、そしてヒト細胞の感染に使用することができる 。細胞の向性は、「ウィルスが完全な複製サイクルを行う、ウィルスおよび細胞 の性質」を呼ぶ、ＷｅｉｓｓｌＲ。

ｅｔ　ａｌ、、ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｖｏｗ、１　（第２版） 、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｓ　ｐ−７３，１９８４゜細胞中で複 製するものである。組み換えゲノムがＰｓｉパッケージング配列を有する場合、 Ｐｓｉ　ａｍ細胞系は組み換えレトロウィルスのゲノムを感染性レトロウィルス の粒子中にパフケージングすることができｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、 、８土：　６３４９−６３５３　（１９８４）。

レトロウィルスのゲノムは、新しい遺伝子を細胞中に導入することができるベク ターとして使用するため、コーン（Ｃｏｎｅ）ｊ−ｉよびムリガン（Ｍｕ　Ｉ　 ］　ｉｇａｎ）により修飾された。

請求の範囲 １、中に組み込んで問題のＤＮＡを宵し、そして問題の組み込まれｔ；ＤＮＡを 発現することができる遺伝子操作された線維芽であって、前記問題のＤＮＡは天 然に産出する線維夢中で通常発現されないタンパク質またはポリペプチドをエン コードする、遺伝子操作された線維芽。

２、組み込まれたＤＮＡは、天然に産出する線維夢中に存在しないＤＮＡ：天然 に産出する線維夢中に通常存在するが、生物学的に有意なレベルでそれらの中で 発現されないＤＮＡ、天然に産出する線維夢中に通常存在しかつそれが遺伝子操 作された線維夢中で発現されるように修飾されているＤＮＡ　；および単独であ る゛いはそれらの任意の組み合わせで、遺伝子操作された線維夢中で発現される ように修飾することができるＤＮＡである、上記第１項記載の遺伝子操作された 線維芽。

３、問題の組み込まれたＤＮ’Ａは少なくとも１つの選択可能なマーカーをエン コードするＤＮＡをさらに含む、上記第２項記載の遺伝子操作された線維芽。

４、少なくとも１つの選択可能なマーカーは優生の選択可能なマーカーである、 上記第３項記載の遺伝子操作された線維芽。

５、優生の選択可能なマーカーは抗生物質抵抗性をエンフードする遺伝子である 、上記第４項記載の遺伝子操作された線維芽。

６、選択したタンパク質または選択したポリペプチドをエンコードする問題の組 み込まれたＤＮＡからなる遺伝子操作されたヒト線維芽であって、前記問題のＤ ＮＡは遺伝子操作された線維芽のゲノム中に安定に組み込まれており、そして前 記遺伝子操作されたヒト線維芽は選択したタンパク質または選択したポリペプチ ドを発現することができる、遺伝子操作されたヒト線維芽。

７、問題の組み込まれｆ：、　Ｄ　Ｎ　Ａは、ホルモン、酵素または薬物である タンパク質またはポリペプチドをエンコードする、上記第６項記載の遺伝子操作 されたヒト線維芽。

８、問題の組み込まれたＤＮＡは、少なくとも１つの優生な選択可能なマーカー をエンコードする問題のＤＮＡをさらに含む、上記第７項記載の遺伝子操作され たヒト線維芽。

９、問題の組み込まれたＤＮＡを含有する遺伝子操作された線維芽であって、前 記組み込まれたＤＮＡは、遺伝子操作された線維夢中に安定に組み込まれており 、モしてａ）天然に産出する線維夢中で生物学的に有意のレベルで通常作られな いポリペプチドおよびｂ）ｎｅｏ遺伝子、前記ｎｅｏ遺伝子はトランスポゾンＴ ｎ５から誘導されるバクテリアの遺伝子である、をエンコードする、遺伝子操作 されｔ；線維芽。

１０、レトロウィルスのベクターにより、遺伝子操作されたヒト線維芽のゲノム 中に安定に組み込まれた選択されたタンパク質またｉマ選択されたポリペプチド をエンコードする問題のＤＮＡを発現することがでとる遺伝子操作されたヒト線 維芽。

１１、問題のＤＮＡを発現する遺伝子操作されたヒト線維芽であって、問題のＤ ＮＡは、レトロウィルスのベクターにより、遺伝子操作されたヒト線維芽のゲノ ム中に安定に組み込まれており、モしてａ）線維夢中で生物学的に有意のレベル で通常作られないホルモンをエンコードする遺伝物質；ｂ）線維夢中で生物学的 に有意のレベルで通常作られない酵素をエンコードする遺伝物質；ｃ）線維夢中 で生物学的に存意のレベルで通常作られない薬物をエンコードする遺伝物質：お よびｄ）少なくとも１つの優生な選択可能なマーカーをエンコードする遺伝物質 がら成る群より選択される、遺伝子操作されたヒト線維芽。

１２、ａ１長い末端反復配列、ｔＲＮＡ塩基配列およびＰｓｉバッキング部位は 両栄養性モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウィルスから誘導される；お よび ｂ１天然に産出する線維夢中で生物学的に有意のレベルで発現されない、少なく とも１つの問題のポリペプチドをエンコードする遺伝物質、から構成された組み 換えゲノムを有する組み換え両栄養性レトロウィルスを中に組み込んで有する線 維芽。

１３、組み換えゲノムは少なくとも１つの選択可能なマーカーをエンフードする 遺伝物質をさらに含む、上記第１３項記載の線維芽。

１４、少なくとも１つの選択可能なマーカーをエンコードする遺伝物質はｎｅｏ 遺伝子である、上記第１３項記載の線維芽。

１５、遺伝物質はヒト副甲状腺ホルモンをエンコードする、上記第１４項記載の 線維芽。

１６、工程 ａ、培養した線維芽を、組み込まれた遺伝物質から構成された組み換えゲノムを 有する感染性組み換えレトロウィルスを含存する培地と接触させ、前記遺伝物質 は天然に産出する線維夢中で生物学的に有意のレベルで発現されないタンパク質 またはポリペプチドをエンコードスル、ソして ｂ１培養した線維芽と感染性組み換えレトロウィルスを含有する培地を、組み換 えレトロウィルスによる線維芽の感染に適当な条件下に、維持する、 からなる、遺伝子操作された線維芽のゲノム中に安定に組み込まれかつ天然に産 出する線維夢中で生物学的に有意のレベルで発現されない、少なくとも１つの問 題のポリペプチドをエンコードする問題の遺伝物質を発現する遺伝子操作された 線維芽を作る方法。

１７、問題の遺伝物質は、生物学的に有意のレベルで天然に産出する線維夢中で 通常発現されないホルモン、酵素または薬物をエンコードする、上記第１６項記 載の方法。

１８、レトロウィルスの組み換えゲノムは、少なくとも１つの優生な選択可能な マーカーをエンコードする遺伝物質をさらに含む、上記第１７項記載の方法。

１９、工程： ａ、培養しｔ：線維芽を、問題の少なくとも１つのタンパク質または少なくとも １つのポリペプチドをエンコードする遺伝物質で形質導入し、そして ｂ１形質導入した線維芽をそれらの増殖に適当な条件下に培養する、からなる、 遺伝子操作された線維芽のゲノム中に安定に組み込まれるておりかつ天然に産出 する線維夢中で生物学的に有意のレベルで発現されない問題の少なくとも１つの タンパク質または少なくとも１つのポリペプチドをエンコードする、問題のＤＮ Ａを発現することができる、遺伝子操作された線維芽を作る方法。

２０、線維芽をホルモン、酵素または薬物をエンコードする遺伝物質で形質導入 して形質導入した線維芽を産生じ、そして形質導入した線維芽を体中に導入する か、あるいは形質導入した線維芽を体の表面に適用することことからなる、ホル モン、酵素または薬物を体に提供する方法。

２１、工程： ａ、線維夢中に組み換えレトロウィルスを組み込み、前記組み換えゲ２）高栄養 性レトロウィルスから誘導された、長い末端反復配列、ｔＲＮＡ結合部位および Ｐｓｉバッキング部位：および３）真核生物由来の少なくとも１つのプロモータ ー；ｂ１生ずる繊維芽を体中に導入するか、あるいは生ずる繊維芽を体の表面に 適用する、 からなる、ホルモン、酵素または薬物を体に提供する方法。

２２、組み換えゲノムは外部のキューにより変調することができる真核生物由来 のプロモーターからさらに構成されている、上記第２１”Ｊ記載の方法。

２３、組み換えゲノムは少なくとも１つの優生な選択可能なマーカーをエンコー ドする遺伝物質からさらに構成されている、上記第２２項記載の方法。

２４、少なくとも１つの優生な選択可能なマーカーは、抗生物の質抵抗性をエン コードする遺伝子あるいは宿主種中の遺伝欠損を補足する遺伝子である、上記第 ２３項記載の方法。

２５、工程： ａ１受胎能を調節しかつ天然に産出する線維夢中で発現されない、少なくとも１ つのホルモンを生物学的に有意のレベルで発現する遺伝子操作され一二線維芽の 移植可能なシートを形成し、そしてｂ１前記移植可能なシートを体に適用する、 からなる、受胎能を制御する方法。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成２年３月８日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０３０８９ ２、発明の名称 形質導入した繊維芽およびそれらの使用３、特許出願人 ４、代理人　〒１０７ 住　所　東京都港区赤坂１丁目９番１５号日本自転車会館 氏名　（６０７８）弁理士小田島平吉 電話　５８５−２２５６ ５、補正書の提出年月日 １９８９年１１月２２日 ６、添付書類の目録 （１）　補正書の写しく翻訳文）　１通（２）補正の説明　１通 明細書 形質導入した繊維芽およびそれらの使用背景 胚において、中胚葉は３つの一次胚芽層の中央のものであり、そして外胚葉およ び内胚葉の間に横たわる。それは、発育の間に、結合組織、すべての体の筋糸、 血液、心臓血管およびリンパ系、尿生殖器の系の大部分および心膜腔、胸膜腔お よび腹膜腔の内層を生ずる。結合組織、血管および血液、リンパ系および心臓を 産生ずる中胚集の部分は、開票と呼ばれる。開業細胞により産生される細胞の１ つの型は繊維芽細胞であり、これは細胞質プロセスをもつ星細胞または紡錘形細 胞である。それらは結合系中に存在し、そしてコラーゲン線維を形成することが できる。

繊維芽は、体中の他の細胞のように、すべての遺伝物質の全体の相補体を含有す る。しかしながら、それらが含有する遺伝子の小さい百分率のみが生物学的に機 能的レベルで発現されるのみである。すなわち、線維夢中の遺伝子の大部分はま ったく発現されないか、あるいはそれらがエンコードするポリペプチドが生物学 的に非機能的であるか、あるいは意味がない、許容されえない量または濃度で産 生されるようなレベルで発現される。

用した。このようにして導入されｔ；遺伝物質は、また、優生な選択可能なマー カーをエンコードする遺伝物質を包含する。問題のポリペプチドをエンコードす るＤＮＡおよび優生な選択可能なマーカーをエンコードするＤＮＡを包含する遺 伝物質を、培養した線維夢中に導入しｔ；。遺伝子が導入された繊維芽（すなわ ち、レトロウィルスのベクターの使用により形質導入された繊維芽）によるこれ らの遺伝子の発現は、ま！；、実証された。

それらが含有する組み込まれた遺伝物質を発現する形質導入された繊維芽を移植 する方法は、また、本発明の主題である。本発明の形質導入されＩ；繊維芽は、 現在非経口的に投与される、予防および治療または処置において有用である、ポ リペプチドまたはタンパク質の構成的供給のために使用される。それらは皮膚の 移植片およびダリア細胞または線維芽移植片中で使用することができ、これらは 問題のポリペプチドまたはタンパク質をエンコードするＤＮＡを中枢神経系中に 導入する。

本発明の繊維芽および問題のポリペプチドまたはタンパク質のために供給系は、 それらを非常に有用とする、多くの利点が存在する。例えば、問題のポリペプチ ドまたはタンパク質（例えば、ホルモン、酵素、薬物）をエンコードする組み込 まれた遺伝物質を包含する繊維芽を使用する皮膚移植片は、エンコードされたポ リペプチドを合成し、こうしてそのポリペプチドのｔ；めの連続的供給系として 働く。このようにして、ホルモンまたは他のポリペプチドを皮膚移植片を受ける 個体の血液流中に拡散される。

１８分、副甲状腺ホルモンのそれはほぼ２．５〜５分、そして自然インスリン（ 純粋なインスリン）のそれはほぼ３〜４分である。

遺伝子はレトロウィルスのベクターを使用して線維夢中に導入することができる ので、それらはレトロウィルスのベクターの制御を「オン」とする（それに付す ）ことができる：このような場合において、問題の遺伝子をレトロウィルスのプ ロモーターから転写される。プロモーターは、ＲＮＡの合成を開始するＲＮＡポ リメラーゼ分子により認識される、特定のヌクレオチド配列である。あるいは、 問題の遺伝物質の転写の原因となる追加のプロモーター要素（組み換えレトロウ ィルス中に組み込まれたプロモーターに加えて）を有するレトロウィルスのベク ターを使用することができる。例えば、外部の因子またはキューにより変調され る追加のプロモーターが存在する構成体を使用することができ、その外部の因子 またはキューを活性化することによって繊維芽により産生されるポリペプチドの レベルを制御することができる。例えば、熱衝撃タンパク質が、プロモーターが 温度により調節される遺伝子によりエンコードされるタンパク質である。金属を 含有するタンパク質のメタロチオニンをエンコードする遺伝子のプロモーターは 、カドミウム（Ｃｄ的）イオンに対して応答性である。外部のキューにより影響 を受けるこのプロモーターまたは他のプロモーターの組み込みは、また、操作し た繊維芽によりポリペプチドの産生を調節することができる。

図面の簡単な説明 第１図は、野生型不ズミ白血病ウィルス（レトロウィルス）のゲノムの概略的表 示である。

第２図は、各々が組み換えゲノムを存する、本発明において宵月なレトロウィル スのベクターの概略的表示である。第２ａ図はｐＺＩＰＮｅＯである；第２ｂ図 はｐＬＪである：第２ｃ図はｐＷｅである：第２ｄ図はｐＥｍである；そして、 第２ｃ図はｐｘｐである。

第３図は、第２ｂ図に表されるｐＬＪベクターおよびヒト副甲状腺ホルモン遺伝 子を使用する、組み換えレトロウィルスのベクターの構成の概略的表示である。

第４図は、表示する期間における、形質導入された繊維芽により産生されたヒト 副甲状腺ホルモンの量を表すグラフである。ダッシュ線は、組織培養平板上で形 質導入されたＮＩＨ３Ｔ３により産生を表す。実線は、ラットから誘導されそし て組織培養平板上で形質導入された繊維芽を表す。

第５図は、形質導入された繊維芽単独（黒くした円）あるいはサイト（ｃｙｔｏ ）３ビーズ上に被覆しそして全面生長させた形質導入された繊維芽を注射しＩ； ラットにおいて、表示した期間で、産生されたヒト副甲状腺ホルモンの量を表す グラフである。

発明の詳細な説明 問題の遺伝物質を、線維夢中に組み込みそして生ずる遺伝子操作された線維夢中 で発現した。記載する方法により線維夢中に組み込まれる遺伝物質は、線維夢中 に通常存在しないＤＮＡ、線維夢中に通常存在するが、生物学的に有意なレベル （すなわち、それがエンコー線維芽は被検体から皮膚のバイオプシー（例えば、 体の任意の区域からの小さいパンチバイオプシー）により得る。生ずる組織を組 織培養培地中に入れ、そして小さい片に分離する（例えば、メスを使用して組織 を掻き裂くことによって）。組織の小さい塊を組織培養フラスコの湿潤表面上に 配置する；はぼ１０片を各フラスコ中に配置する。フラスコを逆さにし、密閉し 、そして室温において一夜放置する。室温において２４時間後、フラスコを倒立 させる；組織の塊はフラスコの底に固定して止まり、そして新鮮な培地［例えば 、１０％のＦＢＳおよびペニシリンおよびストレプトマイシンを有するハム（Ｈ ａ　ｍ）のＦ１２培地］を添加する。次いで、これを３７°Ｃにおいてほぼ１週 間インキュベーションする。この時点で、新鮮な培地を添加し、そして引き統い て数日毎に交換する。培養においてさらに２週後、１層の繊維芽が出現する。１ 層をトリプシン処理し、そして引っ掻いてより大きい全長の中に入れる。繊維芽 をほぼ５０世代の間培養することができる：はぼその時に、それらは発症（ｃ　 ｒ　ｉ　ｓ　ｉ　ｓ）と呼ぶものを行い、そして引き続いて非常によく増殖しな い。繊維芽を引っ掻いてより大きいフラスコにいれる（その上に再配置する）と すぐに、それらは後述するプロトコルに従い感染する。

レトロウィルスのベクター レトロウィルスはＲＮＡウィルスである；すなわち、ウィルスのゲノムはＲＮＡ である。しかしながら、このゲノムはＤＮＡ中間体に転写され、この中間体は感 染されｔ；細胞の染色体のＤＮＡ中に非常に効率よく組み込まれる。この組み込 まれたＤＮＡ中間体をプロウィルスと呼ぶ。

第１図に示すように、 選択可能なマーカーを包含するベクターは、第２ａ図、第２ｂ図および第２Ｃ図 に表されている。第２ａ図において、ｐＺＩＰ　ｎｅｏ　Ｓｖｘ、セプコ（Ｃｅ ｐｋｏ）により記載されている、を表す。Ｃｅｐｋｏ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ−１Ｃｅ ｌｌｂ　３ヱ：１０５３−１０６２　（１９８４）。ここで、既知の技術を使用 して、それらの間に問題の遺伝子が挿入された、切り継ぎ供与体（ｓｐｌｉｃｅ 　ｄｏｎｏｒ）および切り継ぎアクセプト（ａｃｃｅｐｔ）、またはＳＤおよび ＳＡと記載する、が存在する。挿入した遺伝子の発現は未処理のメツセージにお けるＬＴＲに基づく；処理したメツセージはネオマイシンの発現の原因である。

第２ｂ図には、ベクターｐＬＪが表されている。ｐＬＪにおいて、問題の遺伝物 質は５″ＬＴＲ直後に挿入されている。この遺伝物質の発現はＬＴＲから転写さ れ、そしてｎｅｏ遺伝子の発現は内部のＳＶ４０プロモーターから転写される。

　゛ 第２ｃ図において、ｐＷｅが表されている。ＬＴＲプロモーターおよび転写体は ネオマイシンの発現の原因となり、そして内部のプロモーターは問題の遺伝子の 発現の原因となる。この型のベクターにおいて有用なプロモーターは、ニワトリ のベーターアクチン、ヒトヒストン、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、ｔｈｙｌ （Ｔ細胞において使用する組織特異的プロモーター）およびラットアルブミンか ら誘導されたプロモーターを包含する。

選択可能なマーカーをもＩ；ないベクターは、また、繊維芽を問題の遺伝物質で 形質導入するために使用することができる。ベクターは、このようなマーカーが 存在する、前述のベクターの基本的な簡素化されたものである。ベクターｐＥｍ はは第２ｄ図に表されている：表されているように、ベクターの主要な成分は５ ″および３°ＬＴＲ，および２つのＬＴＲの間に挿入された問題の遺伝物質であ る。

請求の範囲 ２、中に組み込まれた問題のＤＮＡを有するヘルパー不合両栄養性レトロウィル スにより形質導入された繊維芽であって、前記問題のＤＮＡは、天然に産出する 線維夢中に存在しないＤＮＡ　；天然に産出する線維夢中に通常存在するが、生 物学的に有意なレベルでそれらの中で発現されないＤＮＡ　；天然に産出する線 維夢中に通常存在しかつそれが形質導入された線維夢中で発現されるように修飾 されているＤＮＡ；および単独であるいはそれらの任意の組み合わせで、形質導 入された線維夢中で発現されるように修飾することができるＤＮＡからなる、形 質導入された繊維芽。

３、問題の組み込まれたＤＮＡは少なくとも１つの選択可能なマーカーをエンコ ードするＤＮＡをさらに含む、上記第２項記載の形質導入された繊維芽。

４、少なくとも１つの選択可能なマーカーは優生の選択可能なマーカーである、 上記第３項記載の形質導入された繊維芽。

５、優生の選択可能なマーカーは抗生物質抵抗性をエンコードする遺伝子である 、上記第４項記載の形質導入された繊維芽。

７、中に組み込まれた問題のＤＮＡを存するヘルパー不合両栄養性レトロウィル スにより形質導入されたヒト繊維芽であって、前記問題のＤＮＡは、ヒト繊維芽 中に存在しないＤＮＡ、ヒト繊維芽中に通常存在するが、生物学的に有意なレベ ルでそれらの中で発現されないＤＮＡ、ヒト繊維芽中に通常存在しかつそれが形 質導入された線維夢中で発現されるように修飾されているＤＮＡ；および単独で あるいはそれらの任意の組み合わせで、ヒト繊維芽中で発現されるように修飾す ることができるＤＮＡからなる、形質導入されたヒト繊維芽。

８、問題の組み込まれｆ：　Ｄ　Ｎ　Ａは、少なくとも１つの優生な選択可能な マーカーをエンコードする問題のＤＮＡをさらに含む、上記第７項記載の形質導 入されたヒト繊維芽。

１０、両栄養性ヘルパー不合レトロウィルスのベクターにより形質導入されたヒ ト繊維芽のゲノム中に安定に組み込まれた選択されたタンパク質または選択され たポリペプチドをエンコードする問題のＤＮＡを発現することができる形質導入 されたヒト繊維芽。

１１、問題のＤＮＡを発現する形質導入されたヒト繊維芽であって、問題のＤＮ Ａは、両栄養性ヘルパー不合レトロウィルスのベクターにより形質導入されたヒ ト繊維芽のゲノム中に安定に組み込まれており、モしてａ）線維夢中で生物学的 に有意のレベルで通常作られないホルモンをエンコードするＤＮＡ；　ｂ）線維 夢中で生物学的に有意のレベルで通常作られない酵素をエンコードするＤＮＡ； 　Ｃ）線維夢中で生物学的に有意のレベルで通常作られない薬物をエンコードす るＤＮＡ　：およびｄ）少なくとも１つの優生な選択可能なマーカーをエンコー ドするＤＮＡから成る群より選択される、形質導入されたヒト繊維芽。

１２、組み換えゲノムを有する組み換えヘルパー不含両栄養性レトロウィルスを 中に組み込んで有する形質導入された繊維芽であって、前記組み換えゲノムは、 長い末端反復配列、ｔＲＮＡ塩基配列およびＰｓｉバッキング部位は両栄養性モ ロニー（ＭｏｌｏｎｅＦ）ネズミ白血病ウィルスから誘導される；および問題の ＤＮＡから構成されており、前記問題のＤＮＡは、天然に産出する線維夢中に存 在しないＤＮＡ　：天然に産出する線維夢中に通常存在するが、生物学的に有意 なレベルでそれらの中で発現されないＤＮＡ、天然に産出する線維夢中に通常存 在しかつそれが形質導入された線維夢中で発現されるように修飾されているＤＮ Ａ；および単独であるいはそれらの任意の組み合わせで、形質導入されｔ；線維 夢中で発現されるように修飾することができるＤＮＡからなる、形質導入された 線維弁。

１３、組み換えゲノムは少なくとも１つの選択可能なマーカーをエンコードする ＤＮＡをさらに含む、上記第１２項記載の形質導入された線維弁。

１４、少なくとも１つの選択可能なマーカーをエンコードするＤＮＡはｎｅｏ遺 伝子である、上記第１３項記載の形質導入された線維弁。

１５、ＤＮＡはヒト副甲状腺ホルモンをエンコードする、上記第１４項記載の形 質導入された線維弁。

１６、工程 ａ１培養した線維弁を、組み換えゲノムを有する岡栄養性ヘルパー不合レトロウ ィルスを含有する培地と接触させ、前記ＤＮＡは天然に産出する線維夢中で生物 学的に有意のレベルで発現されないタンパク質またはポリペプチドをエンコード する；そしてす、培養した線維弁と感染性組み換えレトロウィルスを含有する培 地を、組み換えレトロウィルスによる線維弁の感染に適当な条件下に、維持する 、 からなる、形質導入された線維弁のゲノム中に安定に組み込まれかつ天然に産出 する線維夢中で生物学的に有意のレベルで発現されない少なくとも１つの問題の ポリペプチドをエンコードする問題のＤＮＡを発現する形質導入された線維弁を 作る方法。

１７、問題のＤＮＡは、生物学的に有意のレベルで天然に産出する線維夢中で通 常発現されないホルモン、酵素または薬物をエンコードする、上記第１６項記載 の方法。

１ｇ、レトロウィルスの組み換えゲノムは、少なくとも１つの優生な選択可能な マーカーをエンコードするＤＮＡをさらに含む、上記第１７項記載の方法。

１９、工程： ａ１培養した線維弁を、問題の少なくとも１つのタンパク質または少なくとも１ つのポリペプチドをエンコードするＤＮＡを含有する両栄養性ヘルパー不含レト ロウィルスで形質導入し、そしてｂ５形質導入した線維弁をそれらの増殖に適当 な条件下に培養する、からなる、形質導入された線維弁のゲノム中に安定に組み 込まれるておりかつ天然に産出する線維夢中で生物学的に有意のレベルで発現さ れない６問題の少なくとも１つのタンパク質または少なくとも１つのポリペプチ ドをエンコードする、問題のＤＮＡを発現することができる、形質導入された線 維弁を作る方法。

２０、ａ）形質導入した繊維芽細胞を体中に導入するか、あるいはｂ）形質導入 した繊維芽細胞を体の表面に適用することによって、体に問題のＤＮＡを提供す るための、正常の線維夢中に存在する、問題のＤＮＡを含有する両栄養性ヘルパ ー不合組み換えレトロウィルスで形質導入された繊維芽細胞。

２１、両栄養性ヘルパー不含組み換えレトロウィルスで感染した繊維芽細胞であ って、前記組み換えレトロウィルスは、ａ）正常の線維夢中に存在する問題のＤ ＮＡ。

ｂ）両栄養性レトロウィルスから誘導された、長い末端反復配列、ｔＣ）真核生 物由来の少なくとも１つのプロモーター、から構成された組み換えゲノムを有し 、１）感染した繊維芽細胞を体中に導入するか、あるいは２）生ずる繊維芽細胞 を体の表面に適用する、ことによって、体に問題のＤＮＡを提供するための繊維 芽細胞。

２２、組み換えゲノムは外部のキューにより変調することができる真核生物由来 のプロモーターからさらに構成されている、上記第２１項記載の感染した繊維芽 細胞。

２３、組み換えゲノムは少なくとも１つの優生な選択可能なマーカーをエンコー ドするＤＮＡからさらに構成されている、上記第２２項記載の感染した繊維芽細 胞。

２４、少なくとも１つの優生な選択可能なマーカーは、抗生物の質抵抗性をエン コードする遺伝子あるいは宿主種牛の遺伝欠損を補足する遺伝子である、上記第 ２３項記載の感染した繊維芽細胞。

２５、両栄養性ヘルパー不合レトロウィルスで形質導入され、そして受胎能を調 節する少なくとも１つのホルモンを生物学的に有意のレベルで発現する線維弁の 移植可能なシートからなり、前記移植可能なシートは体に適用される。受胎舵装 置。

補正の説明 補正音翻訳文の第１頁は明細書翻訳文の第１頁第１行〜第１頁第１９行の補正で あります。

補正音翻訳文の′Ｍ２頁は明細書翻訳文の第３頁第８行〜第４頁第５行の補正で あります。

補正音翻訳文の第３頁〜第４頁は明細書翻訳文の第５頁第」行〜第６頁第２０行 の補正であります。

補正音翻訳文の第５頁は明細書翻訳文の第１Ｏ頁第１８行〜第１１頁第１７行前 半の補正であります。

補正音翻訳文の第６頁〜第７頁は明細書翻訳文の第１９頁第１行〜第２０頁第２ 行中程の補正であります。

補正音翻訳文の第８頁〜第１２頁は請求の範囲第２項〜第５項、第７項〜第８項 及び第１Ｏ項〜第２５項の補正であります。

なお、請求の範囲第１項、第６項及び第９項は削除されました。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、線維芽中で生物学的に有意のレベルで通常発現されない組み込まれた遺伝物 質を発現することができる線維芽。 ２、組み込まれた遺伝物質は、線維芽中に通常存在しないＤＮＡまたはＲＮＡ； 線維芽中に通常存在するが、生物学的に有意なレベルでそれらの中で発現されな いＤＮＡまたはＲＮＡ；線維芽中に通常存在しかつそれが線維芽中で発現される ように修飾されているＤＮＡまたはＲＮＡ；および単独であるいはそれらの任意 の組み合わせで、線維芽により発現されるように修飾することができるＤＮＡま たはＲＮＡである、上記第１項記載の線維芽。 ３、組み込まれた遺伝物質は少なくとも１つの選択可能なマーカーをエンコード する遺伝物質をさらに含む、上記第２項記載の線維芽。 ４、少なくとも１つの選択可能なマーカーは優生の選択可能なマーカーである、 上記第３項記載の線維芽。 ５、優生の選択可能なマーカーは抗生物質抵抗性をエンコードする遺伝子である 、上記第４項記載の線維芽。 ６、生物学的に有意のレベルでヒト線維芽により通常発現されない組み込まれた 遺伝物質を発現することができるヒト線維芽。 ７、組み込まれた遺伝物質は、ホルモン、酵素または薬物をエンコードする、上 記第６項記載のヒト線維芽。 ８、組み込まれた遺伝物質は、少なくとも１つの優生な選択可能なマーカーをエ ンコードする遺伝物質をさらに含む、上記第７項記載のヒト線維芽。 ９、ａ）線維芽中で生物学的に有意のレベルで通常作られないポリペプチドおよ びｂ）ｎｅｏ遺伝子、前記ｎｅｏ遺伝子はトランスポゾンＴｎ５から誘導される バクテリアの遺伝子である、をエンコードする組み込まれた遺伝物質を含有する 線維芽。 １０、ヒト線維芽中で生物学的に有意のレベルで通常作られないポリペプチドを 発現することができるヒト線維芽。 １１、組み込まれた遺伝物質は、ａ）線維芽中で生物学的に有意のレベルで通常 作られないホルモンをエンコードする遺伝物質；ｂ）線維芽中で生物学的に有意 のレベルで通常作られない酵素をエンコードする遺伝物質；ｃ）線維芽中で生物 学的に有意のレベルで通常作られない薬物をエンコードする遺伝物質；およびｄ ）少なくとも１つの優生な選択可能なマーカーをエンコードする遺伝物質から成 る群より選択される、組み込まれた遺伝物質を発現するヒト線維芽。 １２、ａ、長い末端反復配列、ｔＲＮＡ結合部位およびＰｓｉパッキング部位は 両栄養性モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウイルスから誘導される；お よび ｂ、少なくとも１つの問題のポリペプチドをエンコードする遺伝物質、から構成 された組み換えゲノムを有する組み換え両栄養性レトロウイルスを中に組み込ん で有する線維芽。 １３、組み換えゲノムは少なくとも１つの選択可能なマーカーをエンコードする 遺伝物質をさらに含む、上記第１３項記載の線維芽。 １４、少なくとも１つの選択可能なマーカーをエンコードする遺伝物質はｎｅｏ 遺伝子である、上記第１３項記載の線維芽。 １５、遺伝物質はヒト副甲状腺ホルモンをエンコードする、上記第１４項記載の 線維芽。 １６、工程 ａ、培養した線維芽を、組み込まれた遺伝物質から構成された組み換えゲノムを 有する感染性組み換えレトロウイルスを含有する培地と接触させ、そして ｂ、培養した線維芽と感染性組み換えレトロウイルスを含有する培地を、組み換 えレトロウイルスによる線維芽の感染に適当な条件下に、維持する、 からなる、少なくとも１つの問題のポリペプチドをエンコードする問題の遺伝物 質を発現する線維芽形成を作る方法。 １７、問題の遺伝物質は、生物学的に有意のレベルで線維芽中で通常発現されな いホルモン、酵素または薬物をエンコードする、上記第１６項記載の方法。 １８、レトロウイルスの組み換えゲノムは、少なくとも１つの優生な選択可能な マーカーをエンコードする遺伝物質をさらに含む、上記第１７項記載の方法。 １９、工程： ａ、培養した線維芽を、少なくとも１つのタンパク質または問題の少なくとも１ つのポリペプチドをエンコードする遺伝物質で形質導入し、そして ｂ、形質導入した線維芽をそれらの増殖に適当な条件下に培養する、からなる、 少なくとも１つのタンパク質または問題の少なくとも１つのポリペプチドをエン コードする組み込まれた遺伝物質を発現することができる線維芽を作る方法。 ２０、線維芽をホルモン、酵素または薬物をエンコードする遺伝物質で形質導入 し、そして形質導入した線維芽を体中に導入するか、あるいは形質導入した線維 芽を体の表面に適用することことからなる、ホルモン、酵素または薬物を体に提 供する方法。 ２１、工程： ａ、線維芽中に組み換えレトロウイルスを組み込み、前記組み換えゲノムは、 １）ホルモン、酵素または薬物をエンコードする遺伝物質；２）長い末端反復配 列、ｔＲＮＡ結合部位およびＰｓｉパッキング部位は両栄養性レトロウイルスか ら誘導される；および３）真核生物由来の少なくとも１つのプロモーター；ｂ、 生ずる線維芽を体中に導入するか、あるいけ生ずる線維芽を体の表面に適用する 、 からなる、ホルモン、酵素または薬物を体に提供する方法。 ２２、組み換えゲノムは外部のキュー（ｃｕｅ）により変調することができる真 核生物由来のプロモーターからさらに構成されている、上記第２１項記載の方法 。 ２３、組み換えゲノムは少なくとも１つの優生な選択可能なマーカーをエンコー ドする遺伝物質からさらに構成されている、上記第２２項記載の方法。 ２４、少なくとも１つの優生な選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性をエンコ ードする遺伝子あるいは宿主種中の遺伝欠損を補足する遺伝子である、上記第２ ３項記載の方法。 ２５、工程： ａ、受胎能を調節する少なくとも１つのホルモンを生物学的に有意のレベルで発 現する線維芽の移植可能なシートを形成し、そしてｂ、前記移植可能なシートを 体に適用する、からなる、受胎能を制御する方法。