JP2022512674A - 人工トランス活性化因子による選択 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)細胞(すなわち、出発細胞)又は細胞の集団(すなわち、細胞の出発集団)中に、少なくとも1つの第1の成分、少なくとも1つの第2の成分及び少なくとも1つの第3の成分を導入すること、並びに
(b)セレクターをコードするヌクレオチド配列を一過性に発現するか、又は一過性に上方制御するゲノム編集された細胞を選択すること
を含み、
第1の成分は、セレクターコードするヌクレオチド配列及び目的のヌクレオチド配列(NOI)を含むドナーレポーターカセットであり、
第2の成分は、操作された転写トランス活性化因子(ETT)ポリペプチド又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ETTポリペプチドは、DNA結合性ドメイン(DBD)及び少なくとも1つの転写活性化因子(TA)ドメインを含み、
第3の成分は、ゲノム標的ヌクレアーゼ及び任意選択で、少なくとも1つの標的とされるゲノム配列を含むガイドRNA(gRNA)を含むヌクレアーゼ系であり、
ETTポリペプチドは、細胞若しくは細胞の集団中に一過性に存在するか、又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、細胞若しくは細胞の集団において一過性に発現され、及び
細胞又は細胞の集団におけるヌクレアーゼ系の存在が、セレクターをコードするヌクレオチド配列(及び任意選択で最小プロモーター)及びNOIの、標的遺伝子座への挿入を可能にし、ETTポリペプチドの一過性存在又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一過性発現が、挿入されたセレクターをコードするヌクレオチド配列の一過性発現又は一過性上方制御を可能にする、方法を提供する。
(a)細胞又は細胞の集団中に、少なくとも1つの第1の成分、少なくとも1つの第2の成分及び少なくとも1つの第3の成分を導入すること、並びに
(b)セレクターをコードするヌクレオチド配列を一過性に発現するか、又は一過性に上方制御するゲノム編集された細胞を選択すること
を含み、
第1の成分は、セレクターをコードするヌクレオチド配列及び目的のヌクレオチド配列(NOI)及び任意選択で、調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターを含むドナーレポーターカセットであり、
第2の成分は、操作された転写トランス活性化因子(ETT)ポリペプチド又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ETTポリペプチドは、DNA結合性ドメイン(DBD)及び少なくとも1つの転写活性化因子(TA)ドメインを含み、
第3の成分は、ゲノム標的ヌクレアーゼ及び任意選択で、少なくとも1つの標的とされるゲノム配列を含むガイドRNA(gRNA)を含むヌクレアーゼ系であり、
ETTポリペプチドは、細胞若しくは細胞の集団中に一過性に存在するか、又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、細胞若しくは細胞の集団において一過性に発現され、及び
細胞又は細胞の集団におけるヌクレアーゼ系の存在が、セレクターをコードするヌクレオチド配列、NOI及び調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターの、標的遺伝子座への挿入を可能にし、任意選択で、モジュレーターが細胞若しくは細胞の集団中に存在する場合、又は任意選択で、モジュレーターが細胞若しくは細胞の集団中に存在しない場合に、ETTポリペプチドの一過性存在又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一過性発現が、挿入されたセレクターをコードするヌクレオチド配列の一過性発現又は一過性上方制御を可能にする、方法を提供する。
(a)細胞又は細胞の集団中に、少なくとも1つの第1の成分、少なくとも1つの第2の成分及び少なくとも1つの第3の成分を導入すること、並びに
(b)セレクターをコードするヌクレオチド配列を一過性に発現するか、又は一過性に上方制御するゲノム編集された細胞を選択すること
を含み、
第1の成分は、セレクターをコードするヌクレオチド配列及び目的のヌクレオチド配列(NOI)及び任意選択で、調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターを含むドナーレポーターカセットであり、
第2の成分は、操作された転写トランス活性化因子(ETT)ポリペプチド又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ETTポリペプチドは、DNA結合性ドメイン(DBD)及び少なくとも1つの転写活性化因子(TA)ドメインを含み、
第3の成分は、ゲノム標的ヌクレアーゼ及び任意選択で、少なくとも1つの標的とされるゲノム配列を含むガイドRNA(gRNA)を含むヌクレアーゼ系であり、
ETTポリペプチドは、細胞若しくは細胞の集団中に一過性に存在するか、又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、細胞若しくは細胞の集団において一過性に発現され、及び
細胞又は細胞の集団におけるヌクレアーゼ系の存在が、セレクターをコードするヌクレオチド配列及びNOI及び任意選択で、調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターの、標的遺伝子座への挿入を可能にし、モジュレーターが細胞若しくは細胞の集団中に存在する場合に、ETTポリペプチドの一過性存在又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一過性発現が、挿入されたセレクターをコードするヌクレオチド配列の一過性発現又は一過性上方制御を可能にする、方法を提供する。
(a)細胞又は細胞の集団中に、少なくとも1つの第1の成分、少なくとも1つの第2の成分及び少なくとも1つの第3の成分を導入すること、並びに
(b)セレクターをコードするヌクレオチド配列を一過性に発現するか、又は一過性に上方制御するゲノム編集された細胞を選択すること
を含み、
第1の成分は、セレクターをコードするヌクレオチド配列及び目的のヌクレオチド配列(NOI)及び任意選択で、調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターを含むドナーレポーターカセットであり、
第2の成分は、操作された転写トランス活性化因子(ETT)ポリペプチド又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ETTポリペプチドは、DNA結合性ドメイン(DBD)及び少なくとも1つの転写活性化因子(TA)ドメインを含み、
第3の成分は、ゲノム標的ヌクレアーゼ及び任意選択で、少なくとも1つの標的とされるゲノム配列を含むガイドRNA(gRNA)を含むヌクレアーゼ系であり、
ETTポリペプチドは、細胞若しくは細胞の集団中に一過性に存在するか、又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、細胞若しくは細胞の集団において一過性に発現され、及び
細胞又は細胞の集団におけるヌクレアーゼ系の存在が、セレクターをコードするヌクレオチド配列及びNOI及び任意選択で、調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターの、標的遺伝子座への挿入を可能にし、モジュレーターが細胞若しくは細胞の集団中に存在しない場合に、ETTポリペプチドの一過性存在又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一過性発現が、挿入されたセレクターをコードするヌクレオチド配列の一過性発現又は一過性上方制御を可能にする、方法
を提供する。
(a)細胞又は細胞の集団中に、少なくとも1つの第1の成分、少なくとも1つの第2の成分及び少なくとも1つの第3の成分を導入すること、並びに
(b)セレクターをコードするヌクレオチド配列を一過性に発現するか、又は一過性に上方制御するゲノム編集された細胞を選択すること
を含み、
第1の成分は、セレクターをコードするヌクレオチド配列及び目的のヌクレオチド配列(NOI)及び任意選択で、調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターを含むドナーレポーターカセットであり、
第2の成分は、操作された転写トランス活性化因子(ETT)ポリペプチド又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ETTポリペプチドは、DNA結合性ドメイン(DBD)及び少なくとも1つの転写活性化因子(TA)ドメインを含み、
第3の成分は、ゲノム標的ヌクレアーゼ及び任意選択で、少なくとも1つの標的とされるゲノム配列を含むガイドRNA(gRNA)を含むヌクレアーゼ系であり、
細胞又は細胞の集団におけるヌクレアーゼ系の存在が、セレクターをコードするヌクレオチド配列及びNOI及び任意選択で、調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターの、標的遺伝子座への挿入を可能にし、モジュレーターが細胞又は細胞の集団中に存在する場合に、細胞又は細胞の集団におけるモジュレーターの一過性存在が、挿入されたセレクターをコードするヌクレオチド配列の一過性発現又は一過性上方制御を可能にする、方法を提供する。
(a)細胞又は細胞の集団中に、少なくとも1つの第1の成分、少なくとも1つの第2の成分及び少なくとも1つの第3の成分を導入すること、並びに
(b)セレクターをコードするヌクレオチド配列を一過性に発現するか、又は一過性に上方制御するゲノム編集された細胞を選択すること
を含み、
第1の成分は、セレクターをコードするヌクレオチド配列及び目的のヌクレオチド配列(NOI)及び任意選択で、調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターを含むドナーレポーターカセットであり、
第2の成分は、操作された転写トランス活性化因子(ETT)ポリペプチド又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ETTポリペプチドは、DNA結合性ドメイン(DBD)及び少なくとも1つの転写活性化因子(TA)ドメインを含み、
第3の成分は、ゲノム標的ヌクレアーゼ及び任意選択で、少なくとも1つの標的とされるゲノム配列を含むガイドRNA(gRNA)を含むヌクレアーゼ系であり、
細胞又は細胞の集団におけるヌクレアーゼ系の存在が、セレクターをコードするヌクレオチド配列及びNOI及び任意選択で、調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターの、標的遺伝子座への挿入を可能にし、モジュレーターが細胞又は細胞の集団中に存在しない場合に、細胞又は細胞の集団におけるモジュレーターの一過性存在が、挿入されたセレクターをコードするヌクレオチド配列の一過性発現又は一過性上方制御を可能にする、方法を提供する。
得る(Phillips-Cremins & Corces、2013年)(図1A)。この選択戦略は、導入遺伝子発現カセットの、ゲノムの中立領域(例えば、アデノ随伴ウイルス組込み部位1[AAVS1])への標的化組込みにとって有用であり、隣接遺伝子調節及びエピジェニックランドスケープを撹乱せずに持続的治療用導入遺伝子発現が達成され得る(Lombardoら、2011年)。ゲノムの他のあり得る中立領域として、レンチウイルスベクターの共通組込み部位(CIS)(例えば、Biffiら、2013年によって同定されるもの)又は将来ゲノムの「セーフハーバー」若しくは中立区域として定義される可能性がある他の領域があり得る。
「ゲノム編集された細胞」という用語は、細胞のゲノムにおいてヌクレオチド配列が挿入、欠失、破壊又は置換される遺伝子工学の種類を指す。「ゲノム編集された細胞」、「編集された細胞」、「遺伝子編集された細胞」、「標的化された遺伝子療法」及び「遺伝子編集」という用語は、本明細書において同義的に使用され得る。遺伝子編集は、ポリヌクレオチド中の所望の部位を標的にできる操作されたヌクレアーゼ(本明細書において第3の成分と呼ばれることもある)を使用して達成され得る。このようなヌクレアーゼは、所望の位置で部位特異的二本鎖切断を作出することができ、これは、次いで、非相同末端結合(NHEJ)又は相同組換え(HR)によって修復され、標的化された突然変異をもたらし得る。このようなヌクレアーゼは、ウイルスベクターを使用して標的細胞に送達され得る。遺伝子編集は、細胞自身の修復経路を得て、標的遺伝子座を修正、破壊又は付加する。例えば、配列を修正する遺伝子編集では、相同性修復のための鋳型配列が提供され、細胞自身の修復経路が、突然変異を消去し、それを正しい配列と置き換える。例えば、配列を付加する遺伝子編集では、相同性修復のための鋳型配列が提供され、細胞自身の修復経路にカセットが組み込まれ、部位特異的な方法でNOIの発現を可能にする。例えば、遺伝子を破壊する遺伝子編集では、相同性修復のための鋳型配列が提供され、細胞自身の修復経路が突然変異、挿入又は遺伝子欠失され、遺伝子の機能を無能にする。
第2の成分がETTポリペプチドである場合には、ETTポリペプチドは、細胞又は細胞の集団中に一過性に存在する。理論に捉われようとは思わないが、ETTポリペプチドの一過性存在は、この第2の成分の細胞内分解のために生じる。
本発明の方法は、セレクターをコードするヌクレオチド配列を一過性に発現する、又は一過性に上方制御するゲノム編集された細胞を選択することを含む。
一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。好ましくは、細胞は、ヒト細胞である。
造血幹及び/又は前駆細胞の集団は、組織試料から得ることができる。
HSCは、通常、フローサイトメトリー手順による低い前方散乱及び側方散乱プロファイルのものである。ミトコンドリア活性を決定することを可能にするローダミン標識によって実証されるように、一部は代謝的に静止状態である。HSCは、ある特定の細胞表面マーカー、例えば、CD34、CD45、CD133、CD90、CD201及びCD49fを含み得る。それらはまた、CD38及びCD45RA細胞表面マーカーの発現を欠く細胞として定義され得る。しかし、これらのマーカーの一部の発現は、HSCの発生段階及び組織特異的状況に左右される。「副集団細胞」と呼ばれる一部のHSCは、フローサイトメトリーによって検出されるようにHoechst 33342色素を排除する。したがって、HSCは、その同定及び単離を可能にする記述的特徴を有する。
CD38は、ヒトHSCの最も確立された、有用な単一陰性マーカーである。
CD34及びCD133は、HSCの最も有用な陽性マーカーである。
分化細胞は、幹細胞又は前駆細胞と比較してより専門化したものになった細胞である。分化は、生物が単一接合体から組織及び細胞種の複雑な系へと変化するにつれて、多細胞生物の発達の際に生じる。分化はまた、成体における共通プロセスであり、成体幹細胞は、組織修復及び正常細胞ターンオーバーの間に分裂し、完全に分化した娘細胞を作出する。分化は、細胞の大きさ、形状、膜電位、代謝活性及びシグナルに対する応答性を著しく変更する。これらの変更は、大きくは、遺伝子発現の高度に制御された改変による。言い換えれば、分化細胞は、特定の遺伝子の活性化及び非活性化に関与する発達プロセスのために、特定の構造を有し、ある特定の機能を発揮する細胞である。本明細書において、分化細胞は、造血系統の分化細胞、例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞、T細胞、B細胞及びNK細胞を含む。例えば、造血系統の分化細胞は、未分化細胞では発現されないか、又はより少ない程度にしか発現されない細胞表面分子の検出によって幹細胞及び前駆細胞から区別され得る。適したヒト系統マーカーの例として、CD33、CD13、CD14、CD15(骨髄)、CD19、CD20、CD22、CD79a(B)、CD36、CD71、CD235a(赤血球)、CD2、CD3、CD4、CD8(T)及びCD56(NK)が挙げられる。
本発明の方法は、細胞又は細胞の集団中に、少なくとも1つの第1の成分、少なくとも1つの第2の成分及び少なくとも1つの第3の成分を導入することを含む。第1の成分、第2の成分及び第3の成分は、個別の、別個の成分である。したがって、本発明の方法によって、少なくとも3つの成分が細胞又は細胞の集団中に導入される。一部の実施形態では、本発明の方法において使用される成分は、これら3種の成分に限定されず、例えば、標的化されるべき特定の遺伝子(単数又は複数)に応じて、さらなる成分が方法において使用されてもよい。
「第1の成分」という用語は、本明細書で使用される場合、セレクターをコードするヌクレオチド配列及び目的のヌクレオチド配列(NOI)を含むドナーレポーターカセットを指す。
「ドナーレポーターカセット」という用語は、「ドナーベクター」、「ドナーDNAベクター」、「ドナープラスミド」及び「ドナーカセット」という用語と同義的に使用され得る。
一部の実施形態では、ドナーレポーターカセットは順次、
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)最小プロモーターに作動可能に連結したセレクターをコードするヌクレオチド配列、
(iii)プロモーターに作動可能に連結したNOI、及び
(iv)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されるETTポリペプチドは、セレクターをコードするヌクレオチド配列が、標的遺伝子座中に挿入される場合に最小プロモーターを活性化する。このドナーレポーターカセットは、SMArT法において使用するのに適している。このドナーレポーターカセットは、NOIを標的遺伝子座中に挿入するのに、及び/又は標的遺伝子座でNOIを修正若しくは破壊するのに適している。
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)任意選択で、スプライシングアクセプター部位(SA)、
(iii)NOI、
(iv)最小プロモーターに作動可能に連結したセレクターをコードするヌクレオチド配列、及び
(v)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されるETTポリペプチドは、セレクターをコードするヌクレオチド配列が標的遺伝子座中に挿入される場合に、最小プロモーターを活性化する。このドナーレポーターカセットは、SMArT法において使用するのに適している。このドナーレポーターカセットは、NOIを標的遺伝子座中に挿入するのに、及び/又は標的遺伝子座でNOIを修正若しくは破壊するのに適している。
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)任意選択で、スプライシングアクセプター部位(SA)、
(iii)NOI、
(iv)任意選択で、2A自己切断ペプチド(2A)又は配列内リボソーム進入部位(IRES)エレメントをコードするヌクレオチド配列、
(v)セレクターをコードするヌクレオチド配列、任意選択で、最小プロモーターに作動可能に連結したセレクターをコードするヌクレオチド配列、及び
(vi)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されるETTポリペプチドは、標的遺伝子座において内因性プロモーターを活性化する。このドナーレポーターカセットは、SMArTER法において使用するのに適している。このドナーレポーターカセットは、NOIを標的遺伝子座中に挿入するのに、及び/又は標的遺伝子座でNOIを修正若しくは破壊するのに適している。
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)任意選択で、プロモーターに作動可能に連結したNOI、
(iii)最小プロモーターに作動可能に連結された、セレクターをコードするヌクレオチド配列であって、最小プロモーターが調節エレメントに作動可能に連結されている、セレクターをコードするヌクレオチド配列、及び
(iv)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
セレクターをコードするヌクレオチド配列が標的遺伝子座中に挿入される場合に、及びモジュレーターが細胞又は細胞の集団に存在する場合に、第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されるETTポリペプチドは、調節エレメントに結合し、最小プロモーターを活性化する。このドナーレポーターカセットは、SMArT-D法において使用するのに適している。このドナーレポーターカセットは、NOIを標的遺伝子座中に挿入するのに、及び/又は標的遺伝子座でNOIを修正若しくは破壊するのに適している。
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)任意選択で、プロモーターに作動可能に連結したNOI、
(iii)最小プロモーターに作動可能に連結された、セレクターをコードするヌクレオチド配列であって、最小プロモーターが調節エレメントに作動可能に連結されている、セレクターをコードするヌクレオチド配列、及び
(iv)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
セレクターをコードするヌクレオチド配列が標的遺伝子座中に挿入される場合に、及びモジュレーターが細胞又は細胞の集団に存在しない場合に、第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されるETTポリペプチドは、調節エレメントに結合し、最小プロモーターを活性化する。このドナーレポーターカセットは、SMArT-D法において使用するのに適している。このドナーレポーターカセットは、NOIを標的遺伝子座中に挿入するのに、及び/又は標的遺伝子座でNOIを修正若しくは破壊するのに適している。
ドナーカセットは相同性アーム(HA)を含む。通常、ドナーカセットは左相同性アーム(左HA)及び右相同性アーム(右HA)を含む。
好ましくは、左相同性アームは約130~約170ヌクレオチドの間の長さである。好ましくは、左相同性アームは約140~約160ヌクレオチドの間の長さである。より好ましくは、左相同性アームは約150ヌクレオチドの長さである。
「標的遺伝子座」という用語は、本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」という用語と同義的に使用され得る。標的遺伝子座は、挿入(又は組込み)、修正、突然変異又は欠失のためのゲノム中の所望の部位である。
「セレクターをコードするヌクレオチド配列」、「レポーター」、「レポーター遺伝子」、「マーカー」及び「セレクター」は、同義的に使用され得る。本明細書で使用される場合、「セレクターをコードするヌクレオチド配列」という用語は、ヌクレオチド配列が挿入されていない、又は配列が間違った部位中に挿入されている細胞から、ヌクレオチド配列がゲノム中の標的遺伝子座(所望の組込み部位)中に挿入されている細胞を選択するために使用され得る任意のヌクレオチド配列を指す。
「調節エレメント」という用語は、本明細書で使用される場合、プロモーターの活性を活性化又は増強可能であるヌクレオチド配列を指す。
用語「モジュレーター」は、本明細書で使用される場合、ETTポリペプチドの活性、特定にはDNA結合活性をモジュレートする、ETTポリペプチド、特定にはDNA結合ドメイン(DBD)に結合することが可能なあらゆる組成物を指す。
用語「NOI」は、用語「GOI」、「目的の遺伝子」又は「修正cDNA(corrective cDNA)」と同義的に使用することができる。
用語「第2の成分」は、本明細書で使用される場合、操作された転写トランス活性化因子(ETT)ポリペプチド又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。
DNA結合ドメイン(DBD)は、二本又は一本鎖DNAを認識する少なくとも1つの構造的なモチーフを含有する。
転写活性化因子(TA)ドメインは、転写を活性化するポリペプチドのための結合部位を含有する。
DBDは、転写活性化因子様エフェクター(TALE)DBD、ジンクフィンガー、触媒的に不活性なCpf1又は触媒的に不活性なCas(dCas)からなる群から選択され、
TAドメインは、VP16、VP64、VP128、VP160、VPR、p65、Rta、HSF1、SAM、及びSunTagからなる群から選択される。
DBDは、TetR又はリバースTetR(rTetR)からなる群から選択され、
TAドメインは、VP16、VP64、VP128、VP160、VPR、p65、Rta、HSF1、SAM、及びSunTagからなる群から選択される。
用語「第3の成分」は、本明細書で使用される場合、ゲノム標的ヌクレアーゼを含むヌクレアーゼ系を指す。ヌクレアーゼ系は、ゲノムDNAを切断及び/又は修復する。細胞又は細胞の集団におけるヌクレアーゼ系の存在は、標的遺伝子座における、セレクターをコードするヌクレオチド配列(及び任意選択で最小プロモーター)の挿入及びNOIの修正又は挿入又は欠失又は突然変異を可能にする。
本明細書で述べられた具体的なポリペプチド及びポリヌクレオチドに加えて、本発明はまた、バリアントの使用も包含する。
一部の実施形態において、ベクターは、第1の成分を含む(すなわちベクターは、ドナーカセットを含む)。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、高い頻度の組込みを有し、非分裂細胞に感染できるため、本発明における使用のために魅力的なベクター系である。そのためこれは、組織培養における哺乳類細胞への遺伝子の送達にとって有用である。
アデノウイルスは、RNA中間体を経由しない二本鎖の直鎖状DNAウイルスである。アデノウイルスの50種を超える様々なヒト血清型があり、これは、遺伝子配列相同性に基づいて6つのサブグループに分類される。アデノウイルスの天然の標的は、呼吸器及び胃腸の上皮であり、一般的に、軽度の症状のみを引き起こす。アデノウイルスベクター系において血清型2及び5(95%の配列相同性を有する)が最も一般的に使用され、通常、若者においては上気道感染症に関連する。
レトロウイルスベクターは、あらゆる好適なレトロウイルス由来であってもよいし、又はそれらから誘導することが可能である。多数の異なるレトロウイルスが同定されている。その例としては、マウス白血病ウイルス(MLV)、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)、マウス乳がんウイルス(MMTV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、Fujinami肉腫ウイルス(FuSV)、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo-MLV)、FBRマウス骨肉腫ウイルス(FBR MSV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(Mo-MSV)、エーベルソンマウス白血病ウイルス(A-MLV)、ニワトリ赤芽球症ウイルス-29(MC29)及びニワトリ赤芽球症ウイルス(AEV)が挙げられる。レトロウイルスの詳細な列挙は、Coffin, J.M. ら(1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 758-63に見出すことができる。
一部の実施形態において、本発明の方法に従って生産又は調製されたゲノム編集された細胞の集団は、医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と共に、対象への投与のために製剤化することができる。好適な担体及び希釈剤は、等張塩類溶液、例えばリン酸緩衝塩類溶液を含み、ヒト血清アルブミンを含有していてもよい。
本発明は、療法で使用するための本発明の方法に従って生産又は調製されたゲノム編集された細胞の集団を提供する。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞の集団は、遺伝子治療において使用される。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞の集団は、造血幹細胞移植術のために使用することができる。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞の集団は、がん処置のために(例えば骨髄腫又は白血病の処置のために)使用することができる。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞の集団は、組織修復、例えば、皮膚疾患(例えば、真皮の疾患及び表皮水疱症)又は網膜疾患(例えば網膜色素変性症及びレーバー先天性黒内障)における組織の修復のために使用することができる。
一態様において、本明細書において定義される第1の成分、本明細書において定義される第2の成分及び本明細書において定義される第3の成分、及び任意選択で細胞集団を含むキットが提供される。
本明細書における処置への全ての言及は、治癒的、緩和的及び予防的処置を含むことが理解されるものと予想されるが、本発明の状況において、防止への言及は、より一般的には予防的処置に関連する。一部の実施形態において、哺乳動物、特定にはヒトの処置が好ましい。ヒト及び動物の処置はどちらも、本発明の範囲内である。
本発明における使用のためのゲノム編集された細胞の集団は単独で投与できるが、それらは一般的に、特定にはヒト療法のための医薬用担体、賦形剤又は希釈剤と混和して投与されると予想される。
当業者は、余計な実験を行うことなく、対象に投与するためのゲノム編集された細胞の集団の適切な用量を容易に決定することができる。典型的には、医師は、個々の患者につき最も好適と予想される実際の投薬量を決定すると予想され、これは、採用される具体的な薬剤の活性、その薬剤の作用の代謝的安定性及び長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与の様式及び時間、排泄の頻度、薬物の組合せ、特定の状態の重症度、並びに個体が受けている療法などの様々な要因に依存すると予想される。当然ながら、より高い又はより低い投薬量範囲がメリットがある個々の例もあり、このようなものは本発明の範囲内である。
「対象」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを指す。
材料及び方法
ベクター及びヌクレアーゼ
HDRのためのAAV6ドナー鋳型を、これまでに記載されたようにして、トリプルトランスフェクション方法によって生産され、塩化セシウム勾配での超遠心分離法によって精製された、AAV2逆方向末端反復を含有する構築物から生成した(1)。AAVS1遺伝子座(最小CMV.GFP又はSK.GFPレポーターカセットをコードする)について相同性を有するか、又はIL2RGのイントロン1(IL2RG修正cDNA、それに続いてPGK.GFPレポーターカセット又は2A.NGFRセレクターカセットのいずれかをコードする)を標的化するAAV-6ドナー鋳型の設計がこれまでに報告されている(2)。
K562細胞株は、ヒト不死化骨髄性白血病細胞株であり、K562細胞は、赤白血病タイプに属する。
インフォームドコンセントを得た後、Ospedale San Raffaele Bioethical Committeeにより承認されたときに、ヒト臍帯血(CB)から新たに精製するか、又はLonzaから凍結したものを購入するかのいずれかによって、CD34+細胞を得た。CD34+細胞を、これまでに最適化されたプロトコールに従って編集した(2)。簡単に言えば、CD34+細胞5×105個/mlを、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、1μMのSR-1(Biovision)、50μMのUM171(STEMCell Technologies)、培養開始時のみ添加された10μMのPGE2(Cayman)及びヒト早期作用性サイトカイン(SCF 100ng/ml、Flt3-L 100ng/ml、TPO 20ng/ml、及びIL-6 20ng/ml;全てPeprotechから購入)が補充された無血清StemSpan培地(STEMCell Technologies)中で刺激した。予備刺激の3日後、細胞をPBSで洗浄し、P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit及びプログラムEO-100(Lonza)を使用して電気穿孔した。細胞を、2.5~1.25μMのRNPを用いて電気穿孔した。AAV6での形質導入を、電気穿孔の15分後に、1~2×104vg/細胞の用量で実行した。350μg/mlの用量で示される場合、TALE-TA mRNAを利用した。GFPマーカーを発現する細胞のパーセンテージを測定するフローサイトメトリーによって、電気穿孔後の1、2及び7日に、in vitroで、トランス活性化効率を培養細胞から測定した。これまでに記載されたようにして(2)、ベクター配列と標的化された遺伝子座との間のジャンクション上の、及びノーマライザーとして利用される制御配列上のプライマー及びプローブを設計するデジタルドロップレットPCR分析によって、遺伝子編集効率を測定した。
NOD-SCID-IL2Rg-/-(NSG)マウスをJackson Laboratoryから購入し、特定病原体除去(SPF)条件で維持した。動物を含む手順を設計し、San Raffaele病院の動物管理使用委員会(IACUC #749)の承認を受けて実行し、イタリアの法律に従って厚生省(Ministry of Health)及び地方自治体と連絡を取った。
分子分析のために、利用可能な細胞の数に従ってDNeasy Blood & Tissue Kit又はQIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN)を用いてゲノムDNAを単離した。ヌクレアーゼ活性(IL2RGイントロン1、AAVS1)を、製造元の説明書に従って、標的化された遺伝子座のPCRベースの増幅、それに続くT7エンドヌクレアーゼI(NEB)での消化によるミスマッチ感受性エンドヌクレアーゼアッセイによって測定した。消化したDNA断片を分解し、LabChip GX Touch HT(Perkin Elmer)でのキャピラリー電気泳動によって製造元の説明書に従って定量化した。
免疫表現型分析のために(FACSCanto II;BD Pharmingenで実行された)、以下の表Bに列挙した抗体を使用した。対照として、単一の染色された、及びFluorescence Minus Oneで染色された細胞を使用した。フローサイトメトリーのための試料調製物中に、製造元の説明書に従ってLIVE/DEAD Fixable死細胞染色キット(Thermo Fisher)、7-アミノアクチノマイシン(Sigma Aldrich)を含めて、分析物から死細胞を排除した。MoFlo XDPセルソーター(Beckman Coulter)又はFACSAria Fusion(BD Biosciences)を使用してセルソーティングを実行した。
アデノ随伴ウイルス組込み部位1(AAVS1)遺伝子座は、目的の遺伝子(GOI)を発現するカセットの標的化された組込みのための最も検証されているゲノムハーバーの1つである(Lombardoら、 2011)。それゆえに、本発明者らは、AAVS1部位における本明細書で開示されたSMArT戦略(図1A)の適用を想定した。この目的に対して、本発明者らは、ΔLNGFR cDNAを含有するドナーDNAの標的化された組込みを、K562赤芽球様細胞株中で最低限に発現されるCMV由来(最小CMV)プロモーターの制御下で実行した。処置した細胞からの単一細胞クローニングを実行することによって、本発明者らは、ΔLNGFRを発現しない本発明者らの構築物の標的化された組込み(すなわちインタクトな5’及び3’ベクター-ゲノムジャンクション)を有するクローン(クローンH1)を同定した(図1B)。
方法
ベクター及びヌクレアーゼ
HDRのためのAAV6ドナー鋳型を、これまでに記載されたようにして、トリプルトランスフェクション方法によって生産され、塩化セシウム勾配での超遠心分離法によって精製された、AAV2逆方向末端反復を含有する構築物から生成した(Wangら、2015)。AAV6ドナー鋳型の設計は、補足の材料のセクションで詳述される。
ヒトK562細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS;Euroclone)、ペニシリン(100IU/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)及び2%グルタミンが補充されたイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM;Corning)中で維持した。K562細胞を、2.5~1.25μMのRNPを用いて電気穿孔した。電気穿孔の後に、AAV6での形質導入を1×104vg/細胞の用量で15分間実行した。
CD34+細胞を凍結した状態でLonzaから購入した。CD34+細胞を、事前に最適化されたプロトコールに従って編集した(Schiroli et alら、2017)。簡単に言えば、CD34+細胞5×105個/mlを、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、1μMのSR-1(Biovision)、50μMのUM171(STEMCell Technologies)、培養の開始時のみ添加された10μMのPGE2(Cayman)、及びヒト早期作用性サイトカイン(SCF 100ng/ml、Flt3-L 100ng/ml、TPO 20ng/ml、及びIL-6 20ng/ml;全てPeprotechから購入)が補充された無血清StemSpan培地(STEMCell Technologies)中で刺激した。予備刺激の3日後に、細胞をPBSで洗浄し、P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit及びプログラムEO-100(Lonza)を使用して電気穿孔した。細胞を、2.5~1.25μMのRNPを用いて電気穿孔した。AAV6での形質導入を、電気穿孔の15分後に、1×104vg/細胞の用量で実行した。150μg/mlの用量で示される場合、GSE56 mRNAを利用し、75又は150μg/mlの用量で示される場合、Ad5-E4orf6/7 mRNAを利用し、215μg/mlの用量で示される場合、GSE56/Ad5-E4orf6/7 mRNAを利用し、150μg/mlの用量で示される場合、tTA mRNAを利用した。in vitroで、電気穿孔後の3日に、GFP/トランケートされたNGFR/CXCR4マーカーを発現する細胞のパーセンテージを測定するフローサイトメトリーによって、又はベクター配列と標的化された遺伝子座との間のジャンクション上の、及びノーマライザーとして利用される制御配列上のプライマー及びプローブを設計するデジタルドロップレットPCR分析によって、遺伝子編集効率を培養細胞から測定した。
NOD-SCID-IL2Rg-/-(NSG)マウスをJackson Laboratoryから購入し、特定病原体除去(SPF)条件で維持した。動物を含む手順を設計し、San Raffaele病院の動物管理使用委員会(IACUC #749)の承認を受けて実行し、イタリアの法律に従って厚生省及び地方自治体と連絡を取った。
分子分析のために、利用可能な細胞の数に従ってDNeasy Blood & Tissue Kit又はQIAamp DNA Micro Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを単離した。デジタルドロップレットPCR分析のために、QX200ドロップレットデジタルPCRシステム(Biorad)を製造元の説明書に従って使用して5-50ngのゲノムDNAを分析した。HDR ddPCRのために、ベクター配列と標的化された遺伝子座との間のジャンクション及び正規化に使用される制御配列(ヒトTTC5遺伝子)におけるプライマー及びプローブを設計した。アニーリング及び伸長のための加熱条件を以下のように調整した:55℃で30秒、72℃で2分。PCR及びddPCR増幅のためのプライマー及びプローブを以下に示す。
免疫表現型分析のために(FACSCanto II;BD Pharmingenで実行された)、本発明者らは以下に列挙した抗体を使用した。対照として、単一の染色された、及びFluorescence Minus Oneで染色された細胞を使用した。フローサイトメトリーのための試料調製物中に、製造元の説明書に従って7-アミノアクチノマイシン(Sigma Aldrich)を含めて、分析物から死細胞を排除した。MoFlo XDPセルソーター(Beckman Coulter)又はFACSAria Fusion(BD Biosciences)を使用してセルソーティングを実行した。
6~10週齢のC57BL/6-Ly5.1及びCd40lg-/-(CD45.2)ドナーマウスをCO2によって安楽死させ、骨髄細胞を大腿骨、脛骨、及び上腕骨から回収した。HSPCを、マウス系統細胞枯渇キット(Miltenyi Biotec)を製造元の説明書に従って使用したLin-選択によって精製した。次いで細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、200ng/mlのB18R組換えタンパク質(eBiovision)及びマウスサイトカインの組合せ(全てPeprotechからの、20ng/mlのIL-3、100ng/mlのSCF、100ng/mlのFlt-3L、50ng/mlのTPO)を含有する無血清StemSpan培地(STEMCell Technologies)中で、細胞106個/mlの濃度で16時間培養した。Lin-を示された比率で混合し、8週齢の致死的に放射線照射したCd40lg-/-マウスに示された用量で移植した。
tTAの一過性の送達がセレクター発現を活性化できるかどうかを評価するために、本発明者らは、K562細胞株におけるIL2RG遺伝子のイントロン1へのSMArT-Dドナー構築物の標的化された組込みを実行した。標的化後の14日に、本発明者らは、mock電気穿孔細胞において検出不能なレベルの基底の発現を観察した。それとは逆に、異なる用量(0.25μg、1μg又は3μg)のtTA mRNAで編集後の9日に電気穿孔した細胞は、効率的なトランス活性化を示した(図2.1B)。
i)編集された細胞は、最小プロモーターの存在により、最小の、ただし検出可能な基底レベルのセレクター発現を示した;
ii)ドキシサイクリンは、組み込みされていない構築物において、組み込まれたものの場合と比べてtTA活性をより効率的に制御した;
iii)ドキシサイクリンウォッシュアウトは、標的化された細胞中でのみ、高いトランス活性化をもたらした(陽性細胞のパーセンテージ及びMFIの両方に関して)。
(i)CXCR4WT構築物で編集され、tTAで一過性にトランス活性化された細胞;
(ii)CXCR4WHIM構築物で編集され、tTAで一過性にトランス活性化された細胞;
(iii)CXCR4WT構築物で編集され、トランス活性化されていない細胞。
(i)CXCR4WT構築物で編集され、tTAで、GSE56の存在下で一過性にトランス活性化された細胞;
(ii)CXCR4WHIM構築物で編集され、tTAで、GSE56の存在下で一過性にトランス活性化された細胞;
(iii)CXCR4WT構築物で編集され、トランス活性化されていないが、GSE56の存在下の細胞。
本発明は、特許請求の範囲及び付随する説明において定義される。便宜上、本発明の他の態様は、番号付けられた条項によって本明細書において提示される。
(a)細胞又は細胞の集団中に、少なくとも1つの第1の成分、少なくとも1つの第2の成分及び少なくとも1つの第3の成分を導入すること、並びに
(b)セレクターをコードするヌクレオチド配列を一過性に発現するか、又は一過性に上方制御するゲノム編集された細胞を選択すること
を含み、
第1の成分は、セレクターをコードするヌクレオチド配列及び目的のヌクレオチド配列(NOI)を含むドナーレポーターカセットであり、
第2の成分は、操作された転写トランス活性化因子(ETT)ポリペプチド又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ETTポリペプチドは、DNA結合性ドメイン(DBD)及び少なくとも1つの転写活性化因子(TA)ドメインを含み、
第3の成分は、ゲノム標的ヌクレアーゼ及び任意選択で、少なくとも1つの標的とされるゲノム配列を含むガイドRNA(gRNA)を含むヌクレアーゼ系であり、
ETTポリペプチドは、細胞若しくは細胞の集団中に一過性に存在するか、又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、細胞若しくは細胞の集団において一過性に発現され、及び
細胞又は細胞の集団におけるヌクレアーゼ系の存在が、セレクターをコードするヌクレオチド配列及びNOIの、標的遺伝子座への挿入を可能にし、ETTポリペプチドの一過性存在又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一過性発現が、挿入されたセレクターをコードするヌクレオチド配列の一過性発現又は一過性上方制御を可能にする、方法。
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)最小プロモーターに作動可能に連結したセレクターをコードするヌクレオチド配列、
(iii)プロモーターに作動可能に連結したNOI、及び
(iv)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
セレクターをコードするヌクレオチド配列が標的遺伝子座中に挿入される場合に、第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されたETTポリペプチドが、最小プロモーターを活性化する、条項1に従う方法。
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)任意選択で、スプライシングアクセプター部位(SA)、
(iii)NOI、
(iv)最小プロモーターに作動可能に連結したセレクターをコードするヌクレオチド配列、及び
(v)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
セレクターをコードするヌクレオチド配列が標的遺伝子座中に挿入される場合に、第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されたETTポリペプチドが、最小プロモーターを活性化する、条項1に従う方法。
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)任意選択で、スプライシングアクセプター部位(SA)、
(iii)NOI、
(iv)任意選択で、2A自己切断ペプチド(2A)又は配列内リボソーム進入部位(IRES)エレメントをコードするヌクレオチド配列、
(v)任意選択で、最小プロモーターに作動可能に連結された、セレクターをコードするヌクレオチド配列、及び
(vi)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されたETTポリペプチドが、標的遺伝子座において内因性プロモーターを活性化する、条項1に従う方法。
Claims (17)
- ゲノム編集された細胞を選択する方法及び/又は細胞の集団におけるゲノム編集された細胞の濃縮のための方法であって、
(a)細胞又は細胞の集団中に、少なくとも1つの第1の成分、少なくとも1つの第2の成分及び少なくとも1つの第3の成分を導入すること、並びに
(b)セレクターをコードするヌクレオチド配列を一過性に発現するか、又は一過性に上方制御するゲノム編集された細胞を選択すること
を含み、
第1の成分は、セレクターをコードするヌクレオチド配列及び目的のヌクレオチド配列(NOI)及び任意選択で、調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターを含むドナーレポーターカセットであり、
第2の成分は、操作された転写トランス活性化因子(ETT)ポリペプチド又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ETTポリペプチドは、DNA結合性ドメイン(DBD)及び少なくとも1つの転写活性化因子(TA)ドメインを含み、
第3の成分は、ゲノム標的ヌクレアーゼ及び任意選択で、少なくとも1つの標的とされるゲノム配列を含むガイドRNA(gRNA)を含むヌクレアーゼ系であり、
ETTポリペプチドは、細胞若しくは細胞の集団中に一過性に存在するか、又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、細胞若しくは細胞の集団において一過性に発現され、及び
細胞又は細胞の集団におけるヌクレアーゼ系の存在が、セレクターをコードするヌクレオチド配列及びNOI及び任意選択で、調節エレメントに作動可能に連結した最小プロモーターの、標的遺伝子座への挿入を可能にし、且つ、任意選択で、モジュレーターが細胞若しくは細胞の集団中に存在する場合に、又は任意選択で、モジュレーターが細胞若しくは細胞の集団中に存在しない場合に、ETTポリペプチドの一過性存在又はETTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一過性発現が、挿入されたセレクターをコードするヌクレオチド配列の一過性発現又は一過性上方制御を可能にする、
前記方法。 - ドナーレポーターカセットが順次、
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)最小プロモーターに作動可能に連結したセレクターをコードするヌクレオチド配列、
(iii)プロモーターに作動可能に連結したNOI、及び
(iv)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
セレクターをコードするヌクレオチド配列が標的遺伝子座中に挿入される場合に、第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されたETTポリペプチドが、最小プロモーターを活性化する、
請求項1記載の方法。 - ドナーレポーターカセットが順次、
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)任意選択で、スプライシングアクセプター部位(SA)、
(iii)NOI、
(iv)最小プロモーターに作動可能に連結したセレクターをコードするヌクレオチド配列、及び
(v)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
セレクターをコードするヌクレオチド配列が標的遺伝子座中に挿入される場合に、第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されたETTポリペプチドが、最小プロモーターを活性化する、
請求項1記載の方法。 - ドナーレポーターカセットが順次、
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)任意選択で、スプライシングアクセプター部位(SA)、
(iii)NOI、
(iv)任意選択で、2A自己切断ペプチド(2A)又は配列内リボソーム進入部位(IRES)エレメントをコードするヌクレオチド配列、
(v)セレクターをコードするヌクレオチド配列、ここで、任意選択で、セレクターをコードするヌクレオチド配列は最小プロモーターに作動可能に連結されている、及び
(vi)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されたETTポリペプチドが、標的遺伝子座において内因性プロモーターを活性化する、
請求項1記載の方法。 - ドナーレポーターカセットが順次、
(i)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む左相同性アーム(HA)、
(ii)NOI、ここで、任意選択で、NOIはプロモーターに作動可能に連結されている、
(iii)最小プロモーターに作動可能に連結された、セレクターをコードするヌクレオチド配列であって、最小プロモーターが調節エレメントに作動可能に連結されている、セレクターをコードするヌクレオチド配列、及び
(iv)標的遺伝子座と相同なヌクレオチド配列を含む右相同性アーム(HA)
を含み、
セレクターをコードするヌクレオチド配列が、標的遺伝子座中に挿入される場合に、及びモジュレーターが細胞又は細胞の集団に存在する場合に、第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されたETTポリペプチドが、調節エレメントに結合し、且つ、最小プロモーターを活性化するか、又は
セレクターをコードするヌクレオチド配列が、標的遺伝子座中に挿入される場合に、及びモジュレーターが細胞又は細胞の集団に存在しない場合に、第2の成分のETTポリペプチド又は第2の成分によって発現されたETTポリペプチドが、調節エレメントに結合し、且つ、最小プロモーターを活性化する、
請求項1記載の方法。 - DBDが、転写活性化因子様エフェクター(TALE)DBD、亜鉛フィンガー、触媒的に不活性のCpf1又は触媒的に不活性のCas(dCas)であり、且つ、TAドメインが、VP16、VP64、VP128、VP160、VPR、p65、Rta、HSF1、SAM及びSunTagから成る群から選択される、請求項1~4のいずれか1項記載の方法。
- DBDが、TetR又はリバースTetR(rTetR)であり、且つ、TAドメインが、VP16、VP64、VP128、VP160、VPR、p65、Rta、HSF1、SAM及びSunTagから成る群から選択される、請求項5記載の方法。
- gRNAが、配列番号1~31及びそれと少なくとも75%の同一性を有する配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列のうち1つ以上に結合可能である、請求項1~7のいずれか1項記載の方法。
- 標的遺伝子座が、セーフハーバーである、請求項1~8のいずれか1項記載の方法。
- 標的遺伝子座が、アデノ随伴ウイルス組込み部位1(AAVS1)、レンチウイルスベクターの共通組込み部位(CIS)、IL2RG、gp91phox、HBB、RAG1、CD40LG、TRAC、TRBC、STAT、PRF1、皮膚において発現されるタンパク質(例えば、コラーゲン、ケラチン、ラミニン、デスモコリン、デスモプラチン(desmoplachine)、デスモグレイン、プラコグロビン(placoglobin)、プラコフィリン(placophylline)、インテグリン又はデスモソーム及びヘミデスモソームに関与する他のタンパク質)をコードする遺伝子又は別のセーフハーバーゲノム遺伝子座である、請求項9記載の方法。
- 請求項1~10のいずれか1項に定義される第1の成分、第2の成分及び第3の成分並びに任意選択で細胞集団を含むキット。
- 請求項1~10のいずれか1項記載の方法によって生成されたゲノム編集された細胞の集団。
- 請求項12記載のゲノム編集された細胞の集団を含む医薬組成物。
- 遺伝子療法において使用するための、請求項12記載のゲノム編集された細胞の集団。
- X連鎖重症複合免疫不全症(SCID-X1)の処置又は予防において使用するための、請求項12記載のゲノム編集された細胞の集団。
- 造血幹細胞移植(HSCT)において使用するための、請求項12記載のゲノム編集された細胞の集団。
- 組織修復において使用するための、請求項12記載のゲノム編集された細胞の集団。
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